JPWO2006106868A1 - 反応容器における不揮発性液体分注方法及び反応容器処理装置 - Google Patents
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Abstract
Description
患者が敗血症に罹りやすいか否か及び/又は敗血症に急速に進行しやすいか否かを決定するために、患者から核酸サンプルを採取し、該サンプル中におけるパターン2対立遺伝子、又はパターン2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子を検出し、パターン2対立遺伝子又はパターン2対立遺伝子と連鎖不平衡であるマーカー遺伝子が検出されれば該患者が敗血症に罹りやすいと判定する(特許文献1参照。)。
比較的に少量のゲノムDNAを用いて数十万箇所に及ぶSNP部位についてタイピングを行なうために、少なくとも一つの一塩基多型部位を含む複数の塩基配列を、ゲノムDNA及び複数対のプライマーを用いて同時に増幅し、増幅した複数の塩基配列を用いて、当該塩基配列に含まれる一塩基多型部位の塩基をタイピング工程により判別する。そのタイピング工程として、インベーダ法又はタックマンPCR法を用いる(特許文献3参照。)。
また、不揮発性液体がノズルの先端外面に付着するなどして不揮発性液体を分注できないこともある。
本発明は反応容器の反応部に反応液の蒸発を防ぐために微量の不揮発性液体を容易に分注できるようにすることを目的とするものである。
制御部118を外部から操作したり検査結果を表示したりするために、制御部118にパーソナルコンピュータ(PC)122を接続してもよい。
平板状の基板10の同じ面の側に試薬収容部14及び不揮発性液体収容部16が凹部として形成されている。以下では不揮発性液体としてミネラルオイルを使用する。不揮発性液体収容部をミネラルオイル収容部と称す。基板10の同じ面の側にはさらに、反応部18も形成されている。試薬収容部14とミネラルオイル収容部16はフィルム20で封止されており、試薬とミネラルオイルをノズルで吸入して他の場所に移送する際には、そのフィルム20を取り除いてノズルで吸入するか、又はそのフィルム20をノズルで貫通可能なものとしておいてノズルを貫通させてノズルで吸入する。
基板10の表面は、フィルム20上から、試薬収容部14、ミネラルオイル収容部16及び反応部18を被う大きさの剥離可能なシール材22で被われている。
多型には変異、欠失、重複、転移等が含まれる。多型の代表的なものはSNPである。
生体サンプルは血液、唾液、ゲノムDNAなどである。
遺伝子増幅試薬の一例はPCR反応試薬である。
直接PCR法とタイピング方法を結びつけたときに、タイピングを目的とする複数のSNP部位について同時に増幅を行なうような自動化システムはこれまで構築されていなかった。
タイピング工程はインベーダ法やタックマンPCR法を使用することができる。その場合、タイピング試薬はインベーダ試薬又はタックマンPCR試薬である。
PCR工程では血液などの生体サンプル2にPCR反応試薬4を添加するか、逆にPCR反応試薬4に生体サンプル2を添加する。
プライマーはPCR反応によるDNA合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは合成したものであってもよく、生物界から単離したものであってもよい。
各レポータープローブはそれに対応したSNPの塩基に応じて2種類のものを用意すれば、そのSNPがホモ接合体であるかヘテロ接合体であるかを判別することができる。
平板状の基板10の同じ面の側にサンプル注入部12、タイピング試薬収容部14、及びミネラルオイル収容部16が凹部として形成されている。基板10の同じ面の側にはさらに、複数のプローブ配置部18も形成されている。
図3A及び図3Bに示されるように、使用時にシール材22が剥がされる。タイピング試薬収容部14とミネラルオイル収容部18を封止しているフィルム20は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部12に外部でPCR反応によりDNAが増幅されたサンプル反応液24がピペット26などにより2〜20μL注入される。その後、この反応容器が検出装置に装着される。
各プローブ配置部18では反応液がプローブと反応して所定のSNPがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板10の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
この反応溶液は核酸抽出操作を施していない生体サンプルをサンプルとして注入し、PCR反応によるDNAの増幅と、インベーダ反応によるSNP検出を共に行なうものである。ただし、核酸抽出操作を施している生体サンプルを注入してもよい。
遺伝子増幅反応部32はPCR反応試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせるものである。
サンプル注入部12は、この反応容器では核酸抽出操作を施していない生体サンプルが注入されるが、使用前の状態ではまだサンプルが注入されない空の状態で提供される。
各プローブ配置部18も図2A及び図2Bの反応容器と同じく、複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持しており、ミネラルオイル収容部16からのミネラルオイルが分注されたときにそのミネラルオイルを保持できる凹部となっている。
基板10aも底面側から蛍光を測定するために、低自蛍光性で光透過性の樹脂、例えばポリカーボネートなどの素材で形成されている。基板10の厚さは1〜2mmである。
図7A及び図7Bに示されるように、使用時にシール材22が剥がされる。タイピング試薬収容部14、ミネラルオイル収容部18及び遺伝子増幅試薬収容部30を封止しているフィルム20は剥がされないでそのまま残っている。
サンプル注入部12にサンプル25がピペット26などにより0.5〜2μL注入される。図2A及び図2Bの反応容器では、注入されるサンプルは外部でPCR反応によりDNAが増幅されたサンプル反応液であるが、この反応容器で注入されるサンプルは核酸抽出操作を施していない生体サンプル、例えば血液である。サンプルは核酸抽出操作を施した生体サンプルであってもよい。サンプル注入後、この反応容器が検出装置に装着される。
このミネラルオイル40の分注の際、本発明によりノズルのチップ内には1回の分注量よりも大量のミネラルオイル40を吸入して保持し、チップ内の空気の量を少なくした状態で分注を行なう。
ノズル28により遺伝子増幅反応部32から回収された反応終了後のPCR反応液38aはPCR終了液注入部31に移送されて注入される。
各プローブ配置部18では反応液がプローブと反応して所定のSNPがあればそのプローブから蛍光が発せられる。蛍光は基板10の裏面側から励起光を照射することにより検出する。
PCR反応試薬は既知のものであり、例えば特許文献3の段落[0046]に記載されているような、プライマー、DNAポリメラーゼ及びTaqStart (CLONTECH Laboratories社製)を含む反応試薬を使用することができる。また、PCR反応試薬にはAmpDirect(島津製作所製)が混入されていてもよい。プライマーは、例えば、特許文献3の表1に記載されているSNP ID1〜20、配列番号を1〜40などを使用することができる。
装置内にヒータとして上下に一対のヒートブロック60と62が配置されて検査試薬キット装着部を構成しており、本発明の反応容器41にサンプルが注入されたものが5枚平行に下側ヒートブロック60上に並べて設置される。これらのヒートブロック60,62は、矢印で示されるY方向に移動することができる。
分注部のノズル28は、図10に示されるように、カバー154の開口156とヒートブロック62の開口150を介してプローブ配置部に反応液を分注する。
図11Bは本発明によるミネラルオイル分注方法であり、チップ70内には1回の分注量よりも大量のミネラルオイル40を吸入して保持しチップ70内の空気の量を少なくして分注を行なう。これにより、所定量のミネラルオイルを吐出することができる。
4 PCR反応試薬
6 インベーダ試薬
8 プローブ配置部
10,10a 基板
12 サンプル注入部
14 タイピング試薬収容部
16 ミネラルオイル収容部
18 プローブ配置部
20 フィルム
22 シール材
28 ノズル
30 遺伝子増幅試薬収容部
31 PCR終了液注入部
32 遺伝子増幅反応部
41 反応容器
60,62 ヒートブロック
64 蛍光検出部
66 送液アーム
70 チップ
112 分注部
118 制御部
150,152 ヒートブロックの開口
Claims (7)
- サンプルに反応を起こさせる反応部、及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部を少なくとも備えた反応容器において前記不揮発性液体をノズルによって前記反応部へ分注する不揮発性液体分注方法であって、
1回の分注量以上の量の不揮発性液体をノズルに吸入して保持した状態で分注を行なうことを特徴とする不揮発性液体分注方法。 - 前記反応容器は、タイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部をさらに備え、前記反応部として複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を備えた遺伝子多型診断用反応容器であり、
前記不揮発性液体をプローブ配置部に分注する請求項1に記載の不揮発性液体分注方法。 - 前記反応容器は、複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに備え、前記反応部として前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備え、
前記不揮発性液体を増幅反応部にも分注する請求項2に記載の不揮発性液体分注方法。 - 前記不揮発性液体はミネラルオイル、植物油、動物油、シリコーンオイル及びジフェニルエーテルからなる群から選ばれた液体である請求項1から3のいずれかに記載の不揮発性液体分注方法。
- サンプルに反応を起こさせる反応部、及び反応液よりも比重の低い不揮発性液体を収容した不揮発性液体収容部を少なくとも備えた反応容器を装着する反応容器装着部と、
吸引及び吐出のためのノズルを移動させて前記反応容器の液の移送を行なう分注部と、
少なくとも前記分注部の分注動作を制御する制御部と、を少なくとも備え、
前記制御部は前記不揮発性液体の分注の際には1回の分注量以上の量の不揮発性液体をノズルに吸入して保持した状態で分注を行なうように前記分注部の動作を制御することを特徴とする反応容器処理装置。 - 前記反応容器は、タイピング試薬を収容したタイピング試薬収容部をさらに備え、前記反応部として複数の多型部位のそれぞれに対応して蛍光を発するプローブを個別に保持した複数のプローブ配置部を備えた遺伝子多型診断用反応容器であり、
前記分注部は不揮発性液体を前記プローブ配置部に分注する請求項5に記載の反応容器処理装置。 - 前記反応容器は、複数の多型部位それぞれをはさんで結合する複数のプライマーを含む遺伝子増幅試薬を収容した遺伝子増幅試薬収容部をさらに備え、前記反応部として前記遺伝子増幅試薬とサンプルとの混合液に対して遺伝子増幅反応を行なわせる増幅反応部をさらに備え、
前記分注部は不揮発性液体を前記増幅反応部にも分注する請求項6に記載の反応容器処理装置。
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