JP2023527150A

JP2023527150A - 核酸の検出のための装置、アッセイ、及び方法

Info

Publication number: JP2023527150A
Application number: JP2022570464A
Authority: JP
Inventors: マリア－ネフェリツァログル; ジャニスシャーチェン; ジェームズポールブロートン; ダニエルトーマスドルザル; サラジェーンシャピロ; クレアルイーズファッシング; カーリージェレンターヘンドリクス; ジーザスチン; ソナルジェイン
Original assignee: マンモスバイオサイエンシズインコーポレイテッド
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-06-27
Also published as: CN115803111A; EP4153357A1; WO2021236850A1; US20240139728A1; EP4153357A4

Abstract

本明細書は、プログラマブルヌクレアーゼ試薬を使用した、試料の調製、任意選択の増幅、及び標的核酸の検出のための合理化されたラテラルフローアッセイのための装置、キット、及び方法を提供する。TIFF2023527150000044.tif116154

Description

相互参照
本願は、２０２０年５月１９日に出願された米国仮出願第６３／０２７，３０９号、２０２０年１１月１３日に出願された米国仮出願第６３／１１３，７９９号、２０２０年１１月１７日に出願された米国仮出願第６３／１１４，９７７号、及び２０２１年４月２８日に出願された米国仮出願第６３／１８１，１３１号の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府支援研究に関する陳述
本発明は、国防総省、国防高等研究計画局（ＤＡＲＰＡ）によって授与された契約番号Ｎ６６００１－２１－Ｃ－４０４８の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。

背景
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して核酸を迅速、高感度、かつ特異的に検出するには、合理化された装置が必要である。ポイントオブニード（ＰＯＮ）の市場に対応できる装置が特に必要である。これらの場合、ラテラルフローアッセイを使用でき、このアッセイでは、１つのアッセイストリップで様々な試薬とプロセス工程を組み合わせる。これにより、順次高感度で迅速な検出手段が得られる。

概要
標的核酸の検出のための方法、システム、及び装置が本明細書に記載される。第１の局面では、装置が提供される。装置は、１つまたは複数の核酸を含む試料を含むように構成されたチャンバと、プログラマブルヌクレアーゼ検出試薬及びレポーターと、チャンバに連結され、ロック構成及びロック解除構成を有するロック機構であって、ロック構成にあるときに、試料を含む試料回収器とチャンバとの間に流体密封シールを形成するように構成されたロック機構と、ロック機構がロック構成にあるときに、そこから１つまたは複数の試薬を放出するように構成された試薬放出機構と、標的核酸が試料の１つまたは複数の核酸中に存在するとき、標的核酸の存在を検出するように構成された検出試薬システムであって、標的核酸の存在は、プログラマブルヌクレアーゼ検出試薬の標的核酸とプログラマブルヌクレアーゼの反応、及びレポーターの少なくとも一部のその後の切断及び放出の際に生成されるシグナルにより示され、装置の少なくとも一部は、ロック機構がロック構成になるとエンクロージャ内に密閉されるように構成される検出試薬システムと、を含む。いくつかの実施形態では、試薬放出機構は、装置のエンクロージャの外側で検出反応を行う場合と比較して、アンプリコンの汚染を少なくとも２倍防止するように構成される。いくつかの実施形態では、検出システムは、装置の一部が体内に密封されているとき、体外に留まるように構成される。いくつかの実施形態では、検出システムは、ラテラルフローアッセイストリップ上または検出チャンバ内に配置される。

別の局面では、標的核酸を検出するための装置が提供され、装置は、試料回収装置によって供給される試料を収容するように構成されたチャンバであって、試料回収装置は、その遠位端に試料回収器を、またその近位端にインターロックを含む、チャンバと、プログラマブルヌクレアーゼと、標的核酸が試料中に存在するとき、標的核酸の存在を検出するように構成された検出システムであって、標的核酸の存在は、標的核酸とプログラマブルヌクレアーゼとの反応及びレポーターの少なくとも一部のその後の切断及び放出の際に生成されるシグナルによって示される、検出システムとを含み、エンクロージャに組み込まれたインターロックは、液密シールを形成するように構成され、プログラマブルヌクレアーゼとレポーターを含む試料回収器と試薬を囲み、インターロックは、エンクロージャ内に封入された試薬を放出して、エンクロージャ外での検出と比較して少なくとも２倍アンプリコンの汚染による反応を防ぐように構成された放出機構を含み、装置の少なくとも一部は、インターロックが係合して液密シールが形成されると、エンクロージャに密閉されるよう構成される。いくつかの実施形態では、「チャイルドセーフティロック」シールが、密閉時にインターロックとエンクロージャとの間に形成される。いくつかの実施形態では、インターロックは、装置の外面の対応するねじ山にねじ込むように構成されたスクリュートップの蓋を含む。いくつかの実施形態では、スクリュートップの蓋は、第１の位置で液密シールを形成するように構成され、スクリュートップの蓋を第２の位置までねじ込み続けると、チャンバ内に配置された１つまたは複数の試薬ブリスターパックに穴が開き、そこで１つまたは複数の試薬をチャンバ内に放出すると、チャンバは密封されたエンクロージャ内にある。いくつかの実施形態では、取り囲まれる試薬はレポーターを含む。いくつかの実施形態では、レポーターはＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、レポーターはチャンバ内に懸濁または固定される。いくつかの実施形態では、レポーターはプログラマブルヌクレアーゼによって切断される。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸は３’末端でグアニンを欠いている。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸のセグメントの３’末端ヌクレオチドはＡ、ＣまたはＴである。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸は一本鎖デオキシリボ核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸は一本鎖デオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸はゲノム一本鎖デオキシリボ核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸は１８から１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸は１８から３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は標的デオキシリボ核酸であり、標的デオキシリボ核酸は２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、装置は電池式である。いくつかの実施形態では、装置は電池式ではない。いくつかの実施形態では、装置は化学加熱要素を含む。いくつかの実施形態では、装置は、試料パッド領域、核酸増幅領域、コンジュゲートパッド領域、検出領域、及び回収パッド領域、またはその任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、１つまたは複数の支持媒体を収容する。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、厚紙、プラスチック、ポリマー、または支持媒体に機械的保護を提供する材料から作製される。支持媒体は、検出可能なフォーマットのシグナルを提示するよう構成される。いくつかの実施形態では、支持媒体は、ラテラルフローアッセイストリップである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３、Ｍａｄ７、Ｍａｄ２、Ｃｓｍ１、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、及びＣａｓＺからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓ系、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓ系である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３ｅである。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、濾過装置を含む。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、溶解工程の後に試料を濾過するように構成された濾過装置を含む。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、増幅チャンバを収容する。いくつかの実施形態では、増幅チャンバは、増幅試薬を含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は、標的核酸の増幅のために構成される。いくつかの実施形態では、増幅は等温増幅を含む。いくつかの実施形態では、等温増幅は、ＬＡＭＰ増幅を含む。いくつかの実施形態では、等温増幅は摂氏６２度で実施される。いくつかの実施形態では、等温増幅は５分以内で行われる。いくつかの実施形態では、装置は、増幅試薬とＤＥＴＥＣＴＲ（商標）試薬の両方を１つのチャンバに含む。そのような実施形態では、装置は、ワンポットＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応用に構成することができ、それにおいてａ）試料の調製、増幅、及び検出、ｂ）試料の調製と検出、及びｃ）増幅と検出は、装置の単一チャンバ内で実行される。いくつかの実施形態では、装置は、装置の別個の領域で増幅及び検出が行われる、ツーポット反応用に構成されている。いくつかの実施形態では、装置は、ワンポット反応用に構成され、増幅、逆転写、増幅及び逆転写、または増幅及びインビトロの転写が、検出と同時に実行される。いくつかの実施形態では、装置は、ツーポット反応用に構成され、逆転写、増幅、及びインビトロの転写の任意の組み合わせが、第１のチャンバ内で第１の反応として実行され、続いて第２のチャンバ内でＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイが実行される。いくつかの実施形態では、反応生成物の検出は、第２のチャンバで検出される。他の実施形態では、反応生成物の検出は、第３のチャンバで検出される。他の実施形態では、増幅はＰＣＲ増幅を含む。他の実施形態では、増幅のための試薬は、リコンビナーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質、ポリメラーゼ、またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、増幅は、１分以下で行われる。他の実施形態では、増幅は摂氏２０度以下の温度で実施される。他の実施形態では、支持媒体は核酸増幅領域を含む。他の実施形態では、装置はラテラルフロー装置である。他の実施形態では、ラテラルフロー装置は、６０分未満で結果を送達することができる。他の実施形態では、増幅は５分以内で行われる。他の実施形態では、エンクロージャはラテラルフローストリップを含む。他の実施形態では、ラテラルフローストリップは複数の層を含む。他の実施形態では、ラテラルフローストリップは、試料調製装置とインターフェースするように構成されている。他の実施形態では、支持媒体はラテラルフローアッセイストリップである。他の実施形態では、エンクロージャは、少なくとも２つのラテラルフローストリップを含み、装置は、標的核酸の多重検出のために構成されている。他の実施形態では、１つ以上のレポーターがラテラルフローストリップに存在する。他の実施形態では、１つ以上のレポーターの第１のレポーターはビオチン－ＦＡＭレポーターであり、１つ以上のレポーターの第２のレポーターはビオチン－ＤＩＧレポーターである。他の実施形態では、装置は、試料中の２つの異なるプログラマブルヌクレアーゼ及び２つの異なる一本鎖レポーターを用いて、少なくとも２つの異なる一本鎖標的核酸を検出するように構成され、試料は、少なくとも２つの異なる一本鎖レポーターのトランス切断に十分な所定の時間の長さ、試薬と接触する。他の実施形態では、装置は、多重化検出用に構成され、複数の個々の標的核酸が、ラテラルフローストリップの検出領域に位置する複数の空間的に分離された検出スポットで同時に検出され、さらに、各検出スポットは、個々の標的核酸に対して相補的である。他の実施形態では、１つまたは複数のレポーターの異なるレポーターが、２つ以上の核酸の異なる標的核酸に対応する。他の実施形態では、装置は、単一のエンクロージャ内に複数の支持媒体を含む。他の実施形態では、複数の支持媒体が単一の試料パッドを共有する。他の実施形態では、試料パッドは、分岐または放射状形成を含む様々な構成で複数の支持媒体に接続される。他の実施形態では、エンクロージャに取り囲まれた試薬は、複数のガイド核酸、複数のプログラマブルヌクレアーゼ、及び複数の一本鎖レポーターを含み、ガイド核酸の１つ、プログラマブルヌクレアーゼの１つ、及び一本鎖レポーターの１つの組み合わせが、１つの標的核酸を検出し、検出領域に検出スポットを設けることができる。他の実施形態では、複数の支持媒体を含み、さらに各支持媒体が複数の検出スポットを含む装置は、単一の反応で少なくとも６、７、８、９、または１０個の異なる標的核酸を検出するように構成される。

本明細書には、標的核酸の検出のためのキットの様々な実施形態が記載されている。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の装置のいずれか、試料回収器、及びその使用説明書を含む。

標的核酸をアッセイするための様々な方法がここに記載されており、方法は、エンクロージャと、エンクロージャを密閉するためのロック機構を含む装置のチャンバに、標的核酸を含む試薬を挿入すること、ロック機構を係合してチャンバをエンクロージャ内に密閉すること、試薬放出機構を使用して少なくとも１つの試薬を放出すること、及び標的核酸の有無を検出すること、を含む。

標的核酸をアッセイする方法が本明細書に記載されており、装置のエンクロージャに位置するチャンバに、標的核酸を含む試薬を挿入することであって、チャンバは、プログラマブルヌクレアーゼを含み、エンクロージャは、試料回収器と装置との間に液密シールを形成するロック機構を含み、エンクロージャは、装置外での検出と比較して、アンプリコンの汚染による反応を２倍防ぐことができる試薬放出機構を含み、及び標的核酸とプログラマブルヌクレアーゼとの反応及びレポーターの放出を介して生成されるシグナルによって示される標的核酸の存在を検出するように構成された検出システムを備える、挿入すること；ロック機構を係合させ、それによって装置を本体に密閉すること；試薬放出機構を使用して少なくとも１つの試薬を放出すること；検出システムで標的核酸の存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、試薬は、本明細書に記載の増幅試薬である。いくつかの実施形態では、試薬は、本明細書に記載のＤＥＴＥＣＴＲ（商標）試薬である。他の実施形態では、標的核酸は、疾患の指標である対象の試料に含まれる疾患のリスクのある対象から得たものである。他の実施形態では、標的核酸は、試料中の疾患の原因となるウイルスまたは細菌または他の作用物質に由来する核酸の一部を含む。他の実施形態では、標的核酸はがんの存在を示す。他の実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘膜試料、腹膜試料、脳脊髄液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽頭滲出液、尿道または膣分泌物、滲出液、浸出液、または組織を含む。他の実施形態では、チャンバはレポーターを含む。他の実施形態では、レポーターはＲＮＡ配列を含む。他の実施形態では、レポーターはＲＮＡレポーターである。他の実施形態では、レポーターはチャンバ内に懸濁または固定される。他の実施形態では、レポーターはプログラマブルヌクレアーゼによって切断される。他の実施形態では、チャンバは、３’末端にグアニンを欠く標的デオキシリボ核酸を含む。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸のセグメントにおける３’末端ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、またはＴである。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸は一本鎖デオキシリボ核酸である。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸は一本鎖デオキシリボ核酸オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸は、ゲノム一本鎖デオキシリボ核酸である。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸は、１８から１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸は、１８から３０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、標的デオキシリボ核酸は、２０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、装置は電池式である。いくつかの実施形態では、装置は電池式ではない。いくつかの実施形態では、装置は化学加熱要素を含む。いくつかの実施形態では、検出システムは、検出可能なフォーマットでデータブルシグナルを提示するように構成された支持媒体を含む。いくつかの実施形態では、支持媒体は、ラテラルフローアッセイストリップである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３、Ｍａｄ７、Ｍａｄ２、Ｃｓｍ１、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、及びＣａｓＺからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓ系、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲＣａｓ系である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３ｅである。

本明細書では、汚染を防止し、スピンスルーアッセイを利用するプログラマブルヌクレアーゼベースの検出のための様々な方法について説明しており、プログラマブルヌクレアーゼベースの検出試薬、増幅試薬、及び試料を含む内容物を含むように構成されたエンクロージャであって、検出試薬は、フィルターによって増幅試薬及び試料を含む混合物から物理的に分離されている、エンクロージャを提供すること、試料の少なくとも一部が増幅試薬によって増幅されるまでエンクロージャを加熱し、試料の一部が増幅された後、エンクロージャを遠心分離すること、試料がプログラマブルヌクレアーゼベースの検出試薬と反応するまでエンクロージャを加熱すること、及びエンクロージャの内容物を視覚化すること、を含む。いくつかの実施形態では、増幅は等温増幅である。いくつかの実施形態では、増幅のためのエンクロージャの内容物の加熱は、摂氏約３７度から６７度に熱される。いくつかの実施形態では、遠心分離の持続時間は約１０秒から３０秒である。いくつかの実施形態では、検出のための内容物のインキュベーションは、摂氏約３７度で行われる。いくつかの実施形態では、内容物の可視化は、内容物から放出される蛍光の可視化を含む。いくつかの実施形態では、視覚化は、肉眼による観察、装置による画像化、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

本明細書では、汚染を防止し、スピンスルーアッセイを利用するプログラマブルヌクレアーゼベースの検出のための様々な装置について説明しており、プログラマブルヌクレアーゼベースの検出試薬、増幅試薬、及び試料を含むエンクロージャであって、検出試薬は、フィルターによって増幅試薬及び試料を含む混合物から物理的に分離され、フィルターは、エンクロージャが遠心分離されるまで検出試薬と混合物との間の分離を維持するように構成され、それにより、増幅試薬による試料の増幅が可能になる、エンクロージャを含み、フィルターは、エンクロージャの遠心分離の際に混合物への検出試薬の移動を容易にするように構成され、エンクロージャは、混合物から生成された１つまたは複数のシグナルを視覚化できるように構成されている。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、蛍光が通過できるように構成された、透明または半透明の材料を含む。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、可視光が通過できるように構成された透明または半透明の材料を含む。

本明細書では、標的核酸を検出するためのシステム、装置、及び方法について説明する。本明細書では、標的核酸の検出のためのシステムについて説明しており、試薬チャンバ；試薬チャンバ内に配置されるプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、プログラマブルヌクレアーゼ；反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーター；ならびに検出領域であって、検出領域は、その上に配置され、放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、検出領域を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸またはその一部に逆相補的な、少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップ。いくつかの実施形態では、システムは、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは試薬チャンバである。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、試料パッドは、コンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動のシリンジポンプである。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、システムは複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの対応する固定に対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口、試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、システムは、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、試薬チャンバは表面を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって表面に固定化される。いくつかの実施形態において、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／またはレポーターは、リンカーによって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試薬チャンバの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、システムは、対照スポットをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと検出スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

本明細書では、標的核酸の検出のためのラテラルフローアッセイストリップシステムについて説明しており、試料パッド；試料パッドに配置されるプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、プログラマブルヌクレアーゼ；切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーター；ならびに試料パッドに流体連結された検出領域であって、検出領域は、その上に配置され、放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、検出領域を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸またはその一部に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、システムは、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通し、試料パッドはコンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは、検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動のシリンジポンプである。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料は、複数の標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、システムは複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの固定捕捉プローブに対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、システムは、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは試料パッドに固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって、試料パッドに固定化される。いくつかの実施形態では、試料パッドに固定化されたプログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、リンカーによって固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試料パッドに固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、システムは、対照スポットをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと検出スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

本明細書では、標的核酸の検出のためのラテラルフローアッセイストリップシステムについて説明しており、試料パッドに配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、Ｉ）Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１４酵素及び２）標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合を介して活性化されるように構成されている、プログラマブルヌクレアーゼ、ならびに切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーターを含む、試料パッド；ならびに試料パッドに流体連結された検出領域であって、検出領域は、その上に配置され、放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、検出領域を含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸またはその一部に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、システムは、検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは試薬チャンバである。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、試料パッドは、コンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは、検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動シリンジポンプである。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素はＣａｓ１２またはＣａｓＰｈｉである。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、システムは複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの対応する固定に対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口、試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、システムは、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、試薬チャンバは表面を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって表面に固定化される。いくつかの実施形態において、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／またはレポーターは、リンカーによって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試薬チャンバの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、システムは、対照スポットをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

本明細書では、標的核酸の検出のためのシステムについて説明しており、試薬チャンバ；試薬チャンバ内に配置されるプログラマブルヌクレアーゼであって、（１）Ｃａｓ１４酵素またはＣａｓ１３酵素及び（２）標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、ガイド核酸を含むプログラマブルヌクレアーゼ；反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーター；ならびに検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップであって、検出領域は、その上に配置され、放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、ラテラルフローアッセイストリップを含む。いくつかの実施形態では、弁が開いているとき、試薬チャンバは検出チャンバに流体接続される。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸またはその一部に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、システムは、検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップをさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは試薬チャンバである。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、試料パッドは、コンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは、検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動シリンジポンプである。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、システムは複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの対応する固定に対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口、試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、システムは、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、試薬チャンバは表面を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／またはレポーターは、リンカーによって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試薬チャンバの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、システムは、対照スポットをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと検出スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、システムは、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

本明細書では、標的核酸の検出のための方法について説明しており、方法は、システムであって、試薬チャンバ；試薬チャンバ内に配置されるプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、プログラマブルヌクレアーゼ；反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーター；ならびに検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップであって、検出領域は、その上に配置され、放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、試料を試薬チャンバと接触させる固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、ラテラルフローアッセイストリップを含む、システムを提供する工程；ならびに固定捕捉プローブの位置で生成された検出可能なシグナルを介して、試料中の標的核酸の存在を同定する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、標的核酸を含む試料を増幅する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸またはその一部に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、方法は、検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは試薬チャンバである。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、試料パッドは、コンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは、検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動のシリンジポンプである。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、方法は複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの対応する固定に対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口、試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、試薬チャンバは表面を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって表面に固定化される。いくつかの実施形態において、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／またはレポーターは、リンカーによって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試薬チャンバの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、対照スポットをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと検出スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、方法は、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

本明細書では、標的核酸の検出のための装置について説明しており試薬チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、プログラマブルヌクレアーゼ；ならびに反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーターを含む、試薬チャンバ；試薬チャンバと流体連通する検出領域であって、検出領域は、その上に配置され、放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、検出領域；ならびに試薬チャンバと検出領域を含むハウジングを含む。いくつかの実施形態では、試薬チャンバと検出領域との間に配置された弁をさらに含み、開位置にある弁は、流体が試薬チャンバから検出領域に通過することを可能にする。いくつかの実施形態では、検出領域は、ハウジング内に位置するラテラルフローアッセイストリップに位置する。いくつかの実施形態では、装置は、ラテラルフローアッセイストリップに位置し、試薬チャンバと検出領域との間に位置する試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、装置は、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１４酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、ガイド核酸は、標的核酸またはその部分に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップをさらに含むいくつかの実施形態では、装置は、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは試薬チャンバである。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、試料パッドは、コンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは、検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動シリンジポンプである。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、装置は、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、装置は複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、装置は、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、装置は、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの対応する固定に対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口、試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、装置は、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、試薬チャンバは表面を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって表面に固定化される。いくつかの実施形態において、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／またはレポーターは、リンカーによって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試薬チャンバの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、対照スポットを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと検出スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、装置は、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

本明細書では、標的核酸の検出のための方法について説明しており、方法は、試薬チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、ガイド核酸の標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、プログラマブルヌクレアーゼ；ならびに切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーター分子であって、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる切断可能な核酸の切断により、切断可能な核酸から検出部分が放出される、レポーター分子を含む、試薬チャンバ；試薬チャンバと流体連通する検出領域であって、検出領域は、放出された検出部分を捕捉するための固定捕捉プローブを含み、検出部分の放出は、固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、検出領域；試薬チャンバと検出領域を含むハウジングを含む、装置を提供する工程；試料を試薬チャンバに導入する工程であって、それによって核酸の切断を介して検出部分を放出させ、検出部分溶液を生成することを可能にする、工程；検出部分溶液を検出領域と接触させる工程；ならびに固定捕捉プローブに対応する位置で生成された検出可能なシグナルを介して、試料における標的核酸の存在を同定する工程を含む。ガイド核酸が、標的核酸またはその一部に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のシステム。いくつかの実施形態では、方法は、検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、増幅試薬をさらに含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は試薬チャンバ内に配置される。いくつかの実施形態では、増幅試薬はＬＡＭＰ試薬である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、試料パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッドは試薬チャンバである。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチン官能化金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップはコンジュゲーションパッドをさらに含み、試料パッドはコンジュゲーションパッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、試料パッドは、コンジュゲーションパッドと検出領域との間に配置される。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションパッドはフロー捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、試料パッド及び／またはコンジュゲーションパッドは、検出領域と流体連通している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、吸収パッドをさらに含む。いくつかの実施形態では、試料パッド、コンジュゲーションパッド、及び／または検出領域は、吸収パッドと流体連通している。いくつかの実施形態では、吸収パッドは、毛細管現象によってラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、試料は標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料が外部圧力によってラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、試料が標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、外部圧力は、ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる。いくつかの実施形態では、ポンプは、手動駆動のシリンジまたは自動シリンジポンプである。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、検出部分は化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、検出部分は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブは、Ｃａｓ酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ酵素は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼは、複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、各ガイド核酸は、対応する標的核酸に対して相補的である。いくつかの実施形態では、方法は複数のレポーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の標識をさらに含み、複数のレポーターの各レポーターは、検出部分及び複数の標識のうちの標識を含む。いくつかの実施形態では、方法は、複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含み、複数の標識の各標識は、複数の異なる固定捕捉プローブの対応する固定に対して相補的である。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、試料入口、試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、試薬チャンバと検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナルは視覚シグナルである。いくつかの実施形態では、検出領域は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットは、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号からなる形状の群から選択される。いくつかの実施形態では、試薬チャンバは表面を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ及び／またはレポーターは、共有結合、非共有結合、または静電力によって表面に固定化される。いくつかの実施形態において、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／またはレポーターは、リンカーによって表面に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼのＣａｓ酵素は、リンカーによって試薬チャンバの表面に固定化される。いくつかの実施形態では、リンカーは、プログラマブルヌクレアーゼのガイド核酸に付着している。いくつかの実施形態では、方法は、対照スポットをさらに含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは、試薬チャンバと対照スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、対照スポットは、試薬チャンバと検出スポットとの間に位置する。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、視覚的に検出可能なシグナルである。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼは、切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている。いくつかの実施形態では、方法は、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含み、複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブは、標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である。いくつかの実施形態では、標的核酸の対応する各セグメントは、重複しないか、部分的に重複するか、または完全に重複する。

参照による援用
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。

本開示の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。

本開示の合理化されたラテラルフロー装置のワークフローを示し、試料の調製、任意の標的核酸の増幅、プログラマブルヌクレアーゼによるＣＲＩＳＰＲベースの検出、ガイド核酸、及びレポーター、ならびに質的結果が含まれる。当該プロセスのすべては、本明細書に開示された単一の合理化されたラテラルフロー装置で生じ得る。本開示の合理化されたラテラルフロー装置の例を示す。本開示の試料調製装置の個々の部分を示す。試料プロセシング装置を使用する試料のワークフローを示す。典型的なレポーターを有するＭｉｌｅｎｉａの市販のストリップのレイアウトを示す。アンプリコンを含む、ＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔ１ストリップのレイアウトを示す。標準的なＣａｓレポーターを含む、ＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔ１ストリップのレイアウトを示す。ＦＡＭ分子（８０４）に結合したビオチン－ｄＴ（８０８）へのＤＮＡリンカーを含む改変Ｃａｓレポーターを示す。図８に記載の改変Ｃａｓレポーターを有するＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔストリップのレイアウトを示す。単一の標的アッセイフォーマット（左）及び多重化アッセイフォーマット（右）の一例を示す。使用前のアッセイ（上）、陽性結果を有するアッセイ（左中央）、陰性結果を有するアッセイ（右中央）、及び失敗した試験（下）の別のバリエーションを示す。つながれたラテラルフローＣａｓレポーターの１つの設計を示す。磁気ビーズを使用するつながれたレポーターを使用する、ＣＲＩＳＰＲ診断のためのワークフローを示す。反応チャンバに到達する前にストレプトアビジン－ビオチンによって濾過される酵素－レポーター系の概略図を示す。ポイントオブニードのＣＲＩＳＰＲ装置での試料の調製のための試料入力モジュールの概略図を示す。ポイントオブニードのＣＲＩＳＰＲ装置での増殖及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）のチャネルの概略的な図表を示す。ポイントオブニードのＣＲＩＳＰＲ装置でのプロセスフローの詳細な工程を示す。装置のワークフローを示す。工程１では、チューブＡ（核酸増幅反応）とＢ（ＣＲＩＳＰＲ酵素試薬）を含む反応カセットを、穿刺及び混合チャンバ、ラテラルフローカセット、及びラテラルフローウィックを含む装置に挿入する。工程２では、装置を閉じてロックする。これにより、反応カセットが下に移動し、穿刺及び混合チャンバからの突起の上に移動する。工程３では、チューブＡとＢの内容物が、穴を開けた後に混ざり合う。混合された試薬は装置の底に流れ、そこでラテラルフローカセットに吸い上げられる。既存のＵＳＴＡＲラテラルフローカセットハードウェアを使用する装置のフォーマットの例を示す。（Ａ）チェイス緩衝液のバルブ（チューブＢ）の内容物をＣＲＩＳＰＲ酵素試薬に置き換え、ＲＴ－ＬＡＭＰ核酸増幅反応を（チューブＡ）に使用した。（Ｂ）ＵＳＴＡＲラテラルフロー装置の隣にある閉じた反応カセット。（Ｃ）装置が閉じているときに、チューブＡとチューブＢが穴を開ける前の反応カセットの側面図。（Ｄ）装置が実行された後のラテラルフローの例示的な読み出し。スピンスルーアッセイの形式を使用する、ＣＲＩＳＰＲ診断のためのワークフローを示す。プロセス全体が密閉されており、増幅チューブを開く必要がないため、汚染の可能性が減少する。ポイントオブニード（ＰＯＮ）５プレックス呼吸パネル用のアッセイの設計を示す。実施形態によるＰＯＮ使い捨て装置を示す。本明細書に記載の多重ラテラルフローストリップの実施形態を示す。本明細書に記載の多重「ＨｏｔＰｏｔ」を伴うワークフローの実施形態を示す。本明細書に記載のＨＲＰ紙ベースの検出の実施形態を示す。本明細書に記載のＨＲＰベースの多重ラテラルフローアッセイの実施形態を示す。本明細書に記載の、ＨＲＰベースの多重ラテラルフローアッセイへの多重Ｃａｓ１３固定化アプローチの実施形態を示す。１週間の隔たりがある２回の反復実験についてのＤＮＡｓｅ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのアッセイの両方の結果を示す。本明細書に記載の、多重Ｃａｓ複合体プローブの使用が、プール強化のシグナル検出を、ラテラルフローアッセイに導くことを示す。個々のｇＲＮＡフォーマットを使用するＤＥＴＥＣＴＲ（商標）Ｃａｓ１２ａベースのアッセイと比較して、被プールガイド（被プールｇＲＮＡ）フォーマットを使用するＧＦ１８４標的の強化されたＣａｓ１２ａベースの検出を示すＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの結果を記す。個々のガイドフォーマットを使用するＣａｓ１３ａベースのアッセイと比較して、被プールガイドフォーマットを使用するＳＣ２標的のＣａｓ１３ａベースの検出の感度の向上を示すＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの結果を記す。被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、ガイドＲＮＡを個別の形式で含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも標的ＲＮＡの開始時のコピー当たりの増幅産物を含有する結晶を多く生成したことを示す、陽性液滴の数をカウントするために使用される、各チャンバに対応する画像を示す。被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、ガイドＲＮＡを個別の形式で含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも標的テンプレートＲＮＡの開始時のコピー当たりのシグナル強度をより多く生成したことを示す、増幅後のシグナル強度の測定を示す。被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、ガイドＲＮＡを個別の形式で含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも標的テンプレートＲＮＡの開始時のコピー当たりのシグナル強度をより多く生成したことを示す、増幅後のシグナル強度の測定を示す。図３４はまた、陽性液滴の数を計数することによって行われた相対的な定量化は、被プールガイドＲＮＡを含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、個々のフォーマットのガイドＲＮＡを含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも、開始時の標的テンプレートＲＮＡのコピーあたりの増幅生成物を含む結晶を多く生成したことを示している。被プールガイド（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１）を含むＣａｓ１３ａＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料は、単一ガイドＲ４６８４、Ｒ４６６７、またはＲ４７８５（ＲＮＡｓｅＰガイド）を個別のフォーマットで含むＣａｓ１３ａＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料ほど、標的の開始時のコピー当たりの標的検出の感度が高くないと呈したことを示している。

詳細な説明
本開示は、迅速なラボ検査のための様々な合理化されたラテラルフロー装置を提供し、これは、装置の官能化された表面と相互作用して検出可能なシグナルを生成することができるプログラマブルヌクレアーゼを使用することによって、標的核酸が試料中に存在するかどうかを迅速に評価することができる。

本開示は、検出されるべき関心対象の核酸を含む試料を分析するための合理化されたラテラルフロー装置を提供する。装置は、試料の調製を実行するように構成することができる。装置は、標的核酸配列の増幅を任意選択に実行するように構成され得る。装置は、試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定するように構成され得る。装置は、試料を受け取り、試料の調製を行い、標的核酸配列を増幅し、試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定するように構成され得る。装置は、試料を受け取り、試料の調製を行い、試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定するように構成され得る。

有利なことに、装置は、試料の汚染を最小限に抑えるように構成することができる。場合によっては、装置は試料を受け取るか取り込むように構成されている。試料の取り込みは、試料を含むスワブを装置に挿入することによって達成することができる。装置は、スワブが挿入されると取り出せないように構成され得る。これにより、試料の逆流や漏れ、及びその後の交差汚染を防ぐことができる。

本明細書中に開示されるラテラルフローアッセイ及び試薬は、本明細書中に開示される疾患のいずれかのコンパニオン診断薬として使用することができ、または、試薬キット、ポイントオブケア診断、もしくは処方箋なしの診断において使用することができる。システムは、ポイントオブケア診断として、または標的核酸を検出し、それによって試料が採取された対象の状態を検出するためのラボ試験として使用され得る。システムは、ラボ、病院、診療所／ラボ（ＰＯＬ）、クリニック、遠隔地域、または自宅など、様々な地域または場所で使用され得る。場合により、本開示は、消費者の遺伝子学的使用のための、または処方箋なしでの使用のための様々な合理化されたラテラルフロー装置を提供する。

本明細書では、試料中の標的核酸の存在を検出するためのラテラルフロー装置及び方法について説明する。試料の標的核酸の存在を検出するための装置及び方法は、関心対象の標的核酸の検出のための迅速なラボ試験で使用することができる。特に、迅速なラボ試験を合理化された単一のシステムで実行することができる、ラテラルフロー装置が本明細書で提供される。標的核酸は、疾患の原因となる、試料中のウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する核酸の一部であり得る。標的核酸は、試料中の任意の生物由来のＲＮＡまたはＤＮＡの一部であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼをＲＮＡまたはＤＮＡにより活性化して、ＲＮＡレポーターのトランス切断活性を開始する。本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼは、場合によっては、標的ＲＮＡに結合して、ＲＮＡレポーターのトランス切断を開始する。場合によっては、本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼは、標的ＤＮＡに結合して、ＲＮＡレポーターのトランス切断を開始する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３は、標的ｓｓＤＮＡに結合して、ＲＮＡ検出核酸のトランス切断を開始する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１４は、標的ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡに結合して、ＤＮＡ検出核酸の切断を開始する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ検出核酸は、レポーターの切断可能な核酸と呼ばれる。

試料中の標的核酸の検出は、試料中の疾患の存在を示すことができ、疾患の影響を受けた環境内の、または疾患を有する個体の近くの個体への疾患の伝染を減らすよう措置を講じるための情報を提供することができる。試料中の標的核酸の検出は、１つまたは複数の疾患を引き起こす細菌に抗生物質耐性を与える、一塩基多型（ＳＮＰ）などの疾患突然変異の存在を示すことができる。

標的核酸の検出は、プログラマブルヌクレアーゼによって促進される。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合後に活性化され得、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を切断し、トランス切断活性を有することができ、これは「付帯的」または「トランス付帯的」切断とも称され得る。トランス切断活性は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる近くの一本鎖核酸の非特異的切断、例えば検出部分を有するレポーターのトランス切断であり得る。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによってレポーターが切断されると、検出部分はレポーターから放出され、支持媒体上に固定化された検出可能なシグナルを生成する。多くの場合、検出部分は、フルオロフォア、染料、ポリペプチド、または核酸のうちの少なくとも１つである。検出部分は、固定化されるべき支持媒体上の捕捉分子に結合する場合がある。検出可能なシグナルを支持媒体上で可視化して、疾患などの状況または状態に関連する標的核酸の存在またはレベルを評価することができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合によって活性化され得る、トランス切断活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（規則的に間の空いた短いパリンドローム反復のクラスタ－ＣＲＩＳＰＲ関連）核タンパク質複合体であり得る。

個体由来の生物学的試料または環境試料を試験して、個体が伝染性疾患を有するかどうかを判定することができる。検出される、疾患の原因となる病原体由来の少なくとも１つの標的核酸はまた、病原体が野生型であること、または抗生物質治療などの治療に対する耐性を与える突然変異を含むことを示すことができる。個体または環境からの試料を本明細書に記載の試薬に適用する。試料と試薬との反応は、キットに備えられた試薬チャンバ内で行ってもよいし、キットに備えられた支持媒体上で行ってもよい。標的核酸が試料中に存在する場合、標的核酸は、ガイド核酸に結合してプログラマブルヌクレアーゼを活性化する。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、レポーターを切断し、支持媒体上に可視化され得る検出可能なシグナルを生成する。標的核酸が試料中に存在しないか、検出の閾値を下回っている場合、ガイド核酸は未結合のままであり、プログラマブルヌクレアーゼは不活化されたままであり、レポーターは未切断のままである。

試料が標的核酸について陽性である場合、検出可能なシグナルについての試験マーカーも可視化することができる。検出領域での結果は、目で、または移動式装置を使用して視覚化することができる。いくつかの場合では、個体は、カメラを有する移動式装置で試験結果を読み取るために移動式アプリケーションを開き、移動式装置のカメラ及び移動式アプリケーションのグラフィックユーザインターフェース（ＧＵＩ）を使用して、ハウジング上の検出領域、バーコード、基準カラースケール、及び基準マーカーを含む支持媒体の画像を得ることができる。移動式アプリケーションは、試験を同定し、画像内の検出領域を可視化し、及び／または分析して疾患の原因となる標的核酸の有無またはレベルを決定することができる。いくつかの実施形態では、移動式アプリケーションは、リモート装置と通信して（例えば、クラウドベースの暗号化通信システムを介して）、画像をリモートの開業医またはクラウドベースの分析ツールに転送して、標的核酸の有無、またはレベルを分析することができる。移動式アプリケーションは、試験の結果を個人に提示し、試験結果を移動式アプリケーションに格納するか、または遠隔装置と通信して試験結果のデータを転送することができる。

本明細書に記載されるそのような合理化されたラテラルフロー装置は、標的核酸の検出、ひいては標的核酸に関連するウイルス感染の検出を、特殊な機器なしで遠隔地または低リソース環境で可能にすることができる。さらに、本明細書に記載のそのような合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、医療クリニックまたは医院において、特殊な機器を用いずに標的核酸、次に標的核酸に関連する病原体及び疾患の検出を可能にし得る。いくつかの場合では、これは、ユーザが家庭または医療提供者のオフィスで迅速に疾患または感染について容易に検査するためのポイントオブケア検査を提供する。１時間未満、例えば１５～６０分で結果をもたらすアッセイは、多くの理由から家庭での試験に特に望ましい。抗ウイルス薬は、最初の４８時間以内に投与された場合に最も効果的であり得、そのため、抗ウイルス薬の有効性を改善するには、迅速かつ正確な結果が所望される場合がある。同様に、在宅での迅速な検査は、不必要な抗生物質の使用を減らし（例えば、診断検査が細菌感染ではなくウイルス感染を示している場合）、及び／または症状が治まった後でも抗生物質をフルコースで服用する際に患者のコンプライアンスを確保することにより、抗生物質の管理を改善し得る。したがって、１時間未満で結果を送達することができる、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置は、最適な時間での抗ウイルス療法の送達を可能にすることができる。さらに、本明細書で提供される合理化されたラテラルフロー装置は、迅速な診断及び結果を提供することができ、患者を自宅に留めるかまたは自宅に送るのに役立ち、包括的な疾患監視を改善し、及び／または感染症の拡大を予防することができる。他の場合では、これは、対象由来の試料中の関心対象の核酸を検出するためにラボで使用することができる試験を提供する。特に、迅速なラボ試験を単一のシステムで実行することができる、合理化されたラテラルフロー装置が本明細書で提供される。いくつかの場合では、これは、発展途上国における疾患の検出において、及び疾患の蔓延もしくは治療の有効性を検出するための、またはウイルス感染の早期検出を提供するための世界的なヘルスケアツールとして有益であり得る。

標的核酸の検出のための合理化されたラテラルフロー装置
本開示は、標的核酸の検出のための合理化されたラテラルフロー装置を提供する。装置の概略図を図２に示す。合理化されたラテラルフロー装置によって実行されるワークフローを図１に示す。装置は、試料から得た核酸が、複数の標的核酸配列の１つまたは複数を含むかどうかを判定するように構成され得る。任意任意で、装置は、複数の標的核酸配列のうちの１つまたは複数を増幅するように構成され得る。合理化されたラテラルフロー装置は、装置で試料から核酸を精製することを含む試料の調製工程を実行する。試料の調製は、核酸ではない種（例えば、脂質、ポリペプチド）の除去を含み得る。試料の調製は、核酸の断片化を含み得る。試料の調製は、細胞の溶解を含み得る。溶解は、化学的溶解を含み得る。溶解は、物理的溶解を含み得る。溶解は、浸透圧溶解を含み得る。溶解はまた、試料を熱にさらすことによっても行うことができる。

合理化されたラテラルフロー装置は、場合によっては装置において増幅を行う。増幅は、等温増幅を含み得る。等温増幅は、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）であってもよい。等温増幅は、６２℃で行うことができる。等温増幅は、少なくとも２分間行うことができる。等温増幅は、５分以内で行うことができる。増幅反応の温度及び検出反応の時間は、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置内で制御または調整することができる。

合理化されたラテラルフロー装置は、オンデバイスで検出を実行することができる。検出は、試料由来の核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することを含んでもよく、標的核酸配列を検出することを含んでもよい。検出は、プログラマブルヌクレアーゼ（例えば、本明細書に開示される任意のＣａｓタンパク質）の使用を含み得る。検出は、ガイド核酸の使用を含み得る。場合によっては、検出はレポーターの使用を含み得る。検出は、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）の反応を含み得る。検出は、合理化されたラテラルフロー装置内のラテラルフローストリップの使用を含んでもよい。ラテラルフローストリップの領域は、試料由来の核酸が標的核酸配列を含む場合に色を変えるように構成され得る。

本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置を使用して、試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも５０００コピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも１０から５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも５０から１００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも１００から１５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも１５０から２００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも２００から２５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも２５０から３００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも３００から３５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも３５０から４００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも４００から４５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも４５０から５００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも５００から５５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも５５０から６００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも６００から６５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも６５０から７００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも７００から７５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも７５０から８００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも８００から８５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも８５０から９００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも９００から９５０のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも９５０から１０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも１０００から１５００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも１５００から２０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも２０００から２５００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも２５００から３０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも３０００から３５００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも３５００から４０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも４０００から４５００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも４５００から５０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも５０から２００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも５０から２０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも１０００から３０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の少なくとも２０００から５０００のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の５０００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の４５００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の４０００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の３５００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の３０００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の２５００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の２０００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の１５００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の１０００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の５００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の１００以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の５０以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。試料から得た核酸が標的核酸配列を含むかどうかを判定することは、標的核酸配列の１０以下のコピーが試料中に存在することが必要であり得る。

本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致する試料は、生物学的試料、環境試料、及び／または農業試料などを含み得る。試料は、血漿、唾液、組織、細胞、細胞溶解物、タンパク質、ウイルス、脂質、代謝産物、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。生物学的試料は、細胞を含み得る。試料は、複数の核酸を含み得る。

本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致する装置には、単回使用の装置が含まれる。いくつかの局面では、装置は電池式であるか、そうでなければ電気式である（例えば、コンセントを介している）。いくつかの局面では、装置はバッテリ電源を必要としない。いくつかの局面では、装置は化学加熱要素を含む。いくつかの局面では、化学加熱要素は、電気のないラテラルフロー装置を可能にする酸化マグネシウムまたは鉄のペレットを含む。

さらに、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置は、「ワンポット」または「ツーポット」反応を実行することができる。ワンポット反応－ａ）試料の調製、増幅、及び検出、ｂ）試料の調製及び検出、またはｃ）増幅及び検出は、同じ領域にある装置内で実行される。ツーポット反応では、増幅と検出は、別々の領域にある装置内で実行される。ツーポット反応では、試料の調製、増幅及び検出、またはそれらの組み合わせが、別々の領域の装置内で実行される。

本明細書では、生物学的試料中の関心対象の標的核酸を検出するためのラテラルフロー装置が開示される。本明細書に詳細に記載されるラテラルフロー装置を使用して、試料中の標的核酸とプログラマブルヌクレアーゼとの反応を監視することができ、それによって当該標的核酸の検出が可能になる。本明細書に開示されるすべての試料及び試薬は、本明細書に開示されるラテラルフロー装置での使用に適合する。本明細書に記載される任意のＣａｓヌクレアーゼなどの任意のプログラマブルヌクレアーゼは、下段に開示されるラテラルフロー装置での使用に適合する。本明細書に開示される支持媒体及びハウジングもまた、本明細書に開示されるラテラルフロー装置と組み合わせた使用に適合する。本開示を通して記載される多重化検出は、本明細書に開示されるラテラルフロー装置内で実行することができる。本明細書に開示される検出及び視覚化のための組成物及び方法もまた、本明細書に記載されるラテラルフロー装置内での使用に適合する。

本明細書に記載のラテラルフロー装置では、任意のプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）反応を監視することができる。例えば、本明細書に開示される任意のプログラマブルヌクレアーゼを使用して、レポーターを切断して検出シグナルを生成することができる。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼはＣａｓ１３である。場合により、Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、またはＣａｓ１３ｅである。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｍａｄ７またはＭａｄ２である。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼはＣａｓ１２である。場合により、Ｃａｓ１２は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅである。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃｓｍ１、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、またはＣａｓＺである。場合により、Ｃｓｍ１は、ｓｍＣｍｓ１、ｍｉＣｍｓ１、ｏｂＣｍｓ１、またはｓｕＣｍｓ１とも呼ばれる。場合によりＣａｓ１３ａは、Ｃ２ｃ２とも呼ばれる。場合によりＣａｓＺは、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、Ｃａｓ１４ｃ、Ｃａｓ１４ｄ、Ｃａｓ１４ｅ、Ｃａｓ１４ｆ、Ｃａｓ１４ｇ、またはＣａｓ１４ｈとも呼ばれる。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。場合により、プログラマブルヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系である。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｓｈ）、リステリア・シーリジェリー（Ｌｓｅ）、レプトトリキア・ブッカリス（Ｌｂｕ）、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｗａ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｃａ）、ハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Ｈｈｅ）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐｐｒ）、ラクノスピラ科（Ｌｂａ）、［ユウバクテリウム］・レクターレ（Ｅｒｅ）、リステリア・ニュヨークネンシス（Ｌｎｙ）、クロストリジウム・アミノフィラム（Ｃａｍ）、プレボテーラ属種（Ｐｓｍ）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃｃａ、ラクノスピラ細菌（Ｌｂａ））、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｚｏ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｉｎ）、プレボテーラ・ブッカエ（Ｐｂｕ）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｐ．）（Ａｓｐ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒａｎ）、プレボテーラ・オーランティアカ（Ｐａｕ）、プレボテーラ・サッカロリティカ（Ｐｓａ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｐｉｎ２）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃｃａ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｇｕ）、プレボテーラ属種（Ｐｓｐ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｉｇ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｉｎ３）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｉ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌｓ）、またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｔ）のうちの少なくとも１つに由来する。Ｃａｓ１３は、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＰｐｒＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、またはＬｓｈＣａｓ１３ａのうちの少なくとも１つである場合がある。

本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、ワンポット反応及びツーポット反応に適合する。ワンポット反応では、増幅、逆転写、増幅と逆転写、または増幅とインビトロ転写、及び検出をラテラルフロー装置内で同時に行うことができる。言い換えれば、ワンポット反応では、逆転写、増幅、及びインビトロ転写の任意の組み合わせを検出と同じ反応で行うことができる。ツーポット反応では、逆転写、増幅、及びインビトロ転写の任意の組み合わせを第１の反応で実施し、第２の反応での検出が続く。ワンポットまたはツーポット反応は、本明細書に開示されるラテラルフロー装置で行うことができる。

本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、濾過装置を含むことができる。いくつかの実施形態では、ラテラルフロー装置は、装置のエンクロージャ内に配置される。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、溶解工程の後に試料を濾過するように構成された濾過装置を含む。いくつかの実施形態では、試料の調製用の濾過装置は、例えば図３及び４に示すように、シリンジに似ているか、またはシリンジと同様の機能要素を含む。例えば、試料調製のための濾過装置は、液体試料を回収するための狭い先端を含み得る。液体試料は、血液、唾液、尿、または任意の他の体液を含むことができる。液体試料はまた、液体組織ホモジネートを含むことができる。液体試料を回収するための先端部は、ガラス、金属、プラスチック、または他の生体適合性材料から製造することができる。先端部は、ラテラルフロー装置の下流に添加される生物学的試料の量を計量する装置として機能し得るガラスキャピラリーと交換することができる。いくつかの試料、例えば血液の場合、キャピラリーは試料調製に必要な唯一の流体装置であり得る。試料調製のための濾過装置の別の機能要素は、このプロセスの下流のプログラマブルヌクレアーゼ反応に適合する溶解緩衝液を含む、ｎＬからｍＬの体積を運ぶことができるチャネルを含み得る。チャネルは、金属、プラスチック、または他の生体適合性材料から製造されてもよい。チャネルは、糞便、頬、または他の生物学的試料収集スワブ全体を保持するのに十分な大きさであり得る。濾過装置は、各タイプの試料中の細胞を溶解し、プログラマブルヌクレアーゼにアクセスできるように核酸を放出する試薬の溶液をさらに含み得る。溶液の活性成分は、カオトロピック剤、界面活性剤、塩であり得、高い浸透圧、イオン強度、及び／またはｐＨであり得る。いくつかの実施形態では、ｐＨは低い値である。カオトロピック剤またはカオトロピックは、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの巨大分子の三次元構造を破壊する物質である。アルカリ緩衝液は、特に環境サンプルの場合、硬い殻を持つ細胞にも使用できる。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの界面活性剤を化学的溶解緩衝液に実施することもできる。細胞溶解はまた、前述の化学的に誘導された細胞溶解に加えて、またはその代わりに、物理的、機械的、熱的または酵素的手段によって実施され得る。シリンジベースの装置は、試料のタイプに応じてより複雑な構築物、例えばナノスケールのバーブ（ｂａｒｂ）、ナノワイヤ、装置の別個のチャンバ内の超音波処理能力、一体型レーザ、一体型ヒーター、例えばペルチェタイプヒーター、または薄膜平面ヒーター、及び／または電気的溶解のためのマイクロキャピラリープローブを含み得る。本明細書に記載の任意の試料をこのワークフローで使用することができる。例えば、試料は、関心対象の状態について検査されている対象から採取された液体試料を含み得る。

いくつかの実施形態では、ラテラルフローストリップは、図３に示されるように、試料調製装置とさらにインターフェースすることができる。図３は、本開示のいくつかの実施形態の試料調製装置の個々の部分を示す。図３Ａは、（ａ）試料回収装置を保持し、試料抽出と別の反応または検出装置への試料の分注との間の工程を調整するインサート、（ｂ）抽出緩衝液を含む単一チャンバを有する単一チャンバ試料抽出装置を示す。図面の図３Ｂは、分注チャンバが、分注される際に核酸をさらに精製する材料で満たされている実施形態を示し、それにおいて、（ａ）インサートが試料回収装置を保持し、試料の抽出と核酸の増幅の「段階」を調整する。ノッチ（赤色、青色及び緑色）の各セットは、先行するセットから９０°オフセットされており、（ｂ）反応モジュールは、独立した反応の発生を可能にする基質によって分離された複数のチャンバを含む。（例えば、ｉ．核酸分離チャンバ、ｉｉ．核酸増幅チャンバ、及びｉｉｉ．ＤＥＴＥＣＴＲ反応チャンバまたは分注チャンバ）。各チャンバは、意図的に９０°回転することなくインサートが次のチャンバに進行するのを防止するノッチ（黒色）を有する。最初の２つのチャンバは、抽出反応と増幅反応との間のインヒビターを除去する材料によって分離されてもよい。図３Ｃは、（ａ）単一の分注チャンバが、抽出された試料または抽出／増幅・抽出／増幅／ＤＥＴＥＣＴＲ反応のみを放出し得、（ｂ）二重の分注チャンバが、抽出／多重増幅生成物を放出することができる、（ｃ）四重の分注チャンバが、多重増幅及び単一のＤＥＴＥＣＴＲまたは４つの単一増幅反応を可能にする、反応／分注チャンバの付加的な実施形態を示す。いくつかの実施形態では、シリンジベースの試料調製装置は、図３Ａ、３Ｂ、及び３Ｃ（ａ）に示されるように、１つのラテラルフローアッセイストリップのみを用いて読み出すように設定される。いくつかの実施形態では、図３Ｃ（ｂ）及び３Ｃ（ｃ）に示されるように、シリンジベースの試料調製装置は、２つ以上のラテラルフローアッセイストリップでの読み出しのためにセットアップされる。このような実施形態では、本明細書に記載のように、試料の多重化は、試料ごとに複数の標的核酸の読み出しを許容することによって可能になり、それぞれの異なるラテラルフローアッセイストリップは、対応して異なる１つの標的核酸を検出することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、単一のラテラルフローアッセイストリップ上で複数の標的核酸を検出することができる。

図４は、本明細書に記載の試料プロセシング装置を使用する試料のワークフローを示す。試料回収装置が、試料プロセシング装置のインサート部分に結合される（Ａ）。インサートは、装置チャンバに入れられ、最初に止まる（上部の下方タブが底部の上方タブと出会う）まで押圧される（Ｂ）。この工程により、試料を核酸抽出試薬と接触させることができる。適切な時間の後、インサートを９０°回転し（Ｃ）、次のノッチのセットまで押し下げる（Ｄ）。これらの作用により、試料が増幅チャンバに移送される。試料回収装置は、もはや試料または増幅生成物と接触していない。適切なインキュベーションの後、インサートを９０°回転し（Ｅ）、次のノッチのセットまで押し下げる（Ｆ）。これらの作用で、試料がＤＥＴＥＣＴＲに放出される（グリーン反応）。インサートを再び９０°回転させ（Ｇ）、押し下げて（Ｈ）反応物を分注する。

本明細書では、ラテラルフローアッセイストリップでの読み出しのためのＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイのための様々な方法、装置、及びシステムについて説明されている。いくつかの実施形態では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）のアッセイは、図５に示されるようにラテラルフローアッセイストリップで読み取られる。図５は、典型的なレポーターを有するＭｉｌｅｎｉａ（商標）の市販のストリップのレイアウトを示す。この概略図は、右の試料適用領域、続いてすぐ左のウィッキング領域、続いて左のビオチンリガンド含有領域、続いて左の抗ウサギ抗体を配置した領域を含む、分析物非依存性万能ディップスティックを示す。試料及び分析物特異的溶液を、ビオチンまたはＦＩＴＣを有する分析物ディテクターと共にインキュベートする。試料をストリップ上で実行する。陽性結果は２つのバンドを示す－左端のバンドは対照バンドからのものであり、抗ＦＩＴＣ抗体被覆金ナノ粒子の抗ウサギ抗体への結合に起因する。右のバンドは検査バンド自体から得たものであり、ビオチンリガンドがビオチン担持分析物検出器と結合することによるものであり、検出器は分析物と複合体を形成し、分析物はＦＩＴＣを担持する別の検出器とさらに複合体を形成し、その後抗ＦＩＴＣ抗体でコーティングされた金粒子に結合する。陰性結果では、コントロールラインにただ１つのバンドが見られる。そのような実施形態では、ワークフローは４つの工程、（１）ラテラルフローアッセイストリップへの試料の適用、（２）試料及び分析物固有の溶液の添加、（３）インキュベーション、及び（４）結果の読み出しを含む。

図６は、ＦＡＭ及びビオチンプライマー（６０４、６０８）を使用することを含む、ＰＣＲアンプリコン（６０６）を有するＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔ１ストリップのレイアウトを示す。この概略図は、上の図の右端にＦＡＭ及びビオチンプライマーを使用したＰＣＲアンプリコンを上部に示す。陽性結果の場合、ストリップは２つのバンドを示す、すなわちこのＰＣＲアンプリコンが試験ラインで固定化された部分に結合し、ＦＡＭ分子（スタートとして示す）が抗ＦＡＭ抗体被覆粒子に結合する。試験ラインの左側には、抗ＦＡＭ抗体被覆ナノ粒子に結合する抗ウサギ抗体を含有するフローコントロールラインがある。陰性結果の場合、ストリップは１つのバンド、すなわち、試験ストリップ上に固定化された抗ウサギ抗体に結合した抗ＦＡＭ抗体被覆ナノ粒子の結合のみを示す。陽性結果のケミストリー（６０２）と陰性結果のケミストリー（６０３）の両方を示すＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔ１ストリップが表示される。試料がＦＡＭ（６０４）及びビオチン（６０８）を含むＰＣＲアンプリコン（６０６）を含む場合、陽性結果が生じる。試料パッド（６１８）に配置された試料は、検査ライン（６０１）及びフローコントロールラインに向かって引き寄せられる。検査ライン（６０１）に配置された、捕捉プローブとして作用するストレプトアビジン（６１４）は、フロー捕捉プローブ（６１０）によって順次捕捉されたＰＣＲアンプリコン（６０６）のビオチン（６０８）末端を捕捉し、これは金ナノ粒子と抗ＦＡＭ抗体を含むコンジュゲート粒子とも知られている。ＰＣＲアンプリコン（６０６）を捕捉しない任意のフロー捕捉プローブ（６１０）は、ラテラルフローアッセイストリップをさらに下に引き込まれ、次に抗ウサギ抗体（６１６）によってフローコントロールラインで捕捉される。陰性結果は、目に見えるシグナルを生成するのに十分なＰＣＲアンプリコンが存在しないときに発生する。ＰＣＲアンプリコン（６０６）を十分に含まない試料が、たとえビオチン（６０８）とＦＡＭ（６０４）であっても、検査ラインで目に見えるシグナルは発生しない。これは、試料パッドのすぐ下流に存在するフロー捕捉プローブ（６１０）が、結合すべきいずれのビオチン標識ＰＣＲ産物をも有さず、したがってビオチンで官能化されたされていないためである。これにより、順次、フロー捕捉プローブが検査ライン（６０１）でストレプトアビジン（６１４）に結合することができなくなる。金ナノ粒子が存在しない場合、検査ラインは色の変化を示さない。

いくつかの実施形態では、ＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔ１ストリップ（商標）は、図７に示されるように、切断可能な核酸（７０６）がＦＡＭ（７０４）とビオチン（７０８）との間に位置する標準的なＣａｓレポーターと共に使用される。陽性結果が上部に示され、Ｃａｓタンパク質が標準的なレポーターを切断し、ストリップ上に配置された抗ウサギ抗体への抗ＦＡＭ抗体被覆ナノ粒子の結合に起因する、唯一のバンドが見られる。陰性結果が下部に示され、完全なレポーターがストリップ上に固定化された部分に結合し、コントロールラインにおいてすべての抗ＦＡＭ抗体被覆ナノ粒子が完全なＣａｓレポーター上のＦＡＭ分子に結合する。標的核酸を含む試料及び水のみを含む対照を実行した結果は、水のみの対照を用いても、偽陽性バンドが試験ラインに現れることを示す。

いくつかの実施形態では、本開示の装置は、図９に示されるように、チャンバ（９０６）及びラテラルフローストリップ（９０２）を含む。図８～９は、ラテラルフローストリップ（９０２）及び対応する適切なレポーター用の特に有利なレイアウトを示す。図８は、ＦＡＭ分子（緑色の星印として示される）に結合したビオチン－ｄＴ（ピンク色の六角形として示される）へのＤＮＡリンカーを含む改変Ｃａｓレポーターを示す。この改変Ｃａｓレポーター全体が、磁気ビーズまたはストリップの上流にある反応チャンバの表面にコンジュゲートする。これは、改変ＣａｓレポーターのＤＥＴＥＣＴＲチャンバ／ビーズの基質への固定化として概略図に示される。Ｃａｓ（黄色のパックマンとして示される）による切断の間、ビオチン－ＦＡＭ分子はＤＮＡリンカーから放出される。他のアッセイフォーマットとは異なり、この特定のアッセイフォーマットは、反応チャンバへのＣａｓ切断反応全体を含む。このアッセイフォーマットでは、試験ラインは実際の試験ラインであり、コントロールラインは真のコントロールラインである。図９は、改変Ｃａｓ酵素及びレポーターを有するＭｉｌｅｎｉａＨｙｂｒｉｄＤｅｔｅｃｔストリップのレイアウトを示す。上部には、陽性結果が示されており、Ｃａｓ反応チャンバでは、Ｃａｓタンパク質が改変ＣａｓレポーターのＤＮＡリンカーセグメントを切断する。ビオチン－ｄＴ／ＦＡＭ分子が放出され、試験ライン上を被覆したストレプトアビジンに結合する試験ストリップを流れ落ちる。抗ＦＡＭ抗体被覆金ナノ粒子は、試験ラインにおいてビオチン－ＤＴ／ＦＡＭレポーターに結合する。さらに、抗ＦＡＭ抗体被覆金ナノ粒子は、フローコントロールラインにおいて抗ウサギ抗体被覆に結合する。下部には、陰性結果が示され、抗ＦＡＭ抗体被覆金ナノ粒子のみが、フローコントロールラインにおいて抗ウサギ抗体被覆に結合する。この特定のレイアウトは、偽陽性を最小限に抑えながら、陽性結果の場合により高いシグナルを生成することによって試験結果を改善する。このアッセイレイアウトでは、レポーターは、ビオチンと、核酸の１つの端部に結合したフルオロフォア（例えば、ＦＡＭ）とを含む。核酸は、ビオチン分子、次いでフルオロフォアに直接コンジュゲートされ得るか、またはフルオロフォア、次いでビオチンに直接コンジュゲートされ得る。ビオチンの代わりに、本明細書に記載されるものを含む他の親和性分子を使用することができる。本明細書に開示されるフルオロフォアのいずれも、レポーターにおいて使用することもできる。レポーターは、溶液に懸濁され得るか、またはＣａｓチャンバの表面に固定化され得る。あるいは、レポーターは、反応チャンバ中で磁気ビーズなどのビーズに固定化され得、それらは、チャンバの下に置かれる磁石によって定位置に保持される。レポーターが活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによって切断されると、切断されたビオチン－フルオロフォアは、ストレプトアビジン（または別の捕捉分子）を含む第１のラインに蓄積する。試料パッド上に存在し、チェイス緩衝液（ｃｈａｓｅｂｕｆｆｅｒ）を使用してストリップ上に流される金ナノ粒子は、抗フルオロフォア抗体でコーティングされ、第１のラインでの金ナノ粒子の結合及び蓄積を可能にする。金ナノ粒子上にコーティングされた抗体（例えば、ウサギ、抗ＦＡＭ）に対する抗体（例えば、抗ウサギ）でコーティングされたナノ粒子が、第２のラインにさらに蓄積する。陰性結果の場合、レポーターは切断されず、ラテラルフローストリップ上を流動しない。したがって、ナノ粒子は、第２のラインでのみ結合して蓄積する。ラテラルフローストリップでの多重化検出は、２つのレポーター（例えば、ビオチン－ＦＡＭレポーター及びビオチン－ＤＩＧレポーター）を有することによって実施することができる。抗ＦＡＭ及び抗ＤＩＧ抗体は、２つの異なる領域でラテラルフローストリップ上にコーティングされる。抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンまたはアビジンを金ナノ粒子上にコーティングする。フルオロフォアは、レポーターの核酸に続いてビオチン－ｄＮＴＰを最初に生成し、次いでフルオロフォアをコンジュゲートすることによって、親和性分子（例えば、ビオチン）に直接コンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ラテラルフローストリップは複数の層を含む。そのような実施形態では、複数の層は、試料パッド層、検出層、及びウィッキング層を含む。

いくつかの実施形態では、上記のラテラルフローストリップは、試料調製装置とさらにインターフェースすることができる。

本明細書に記載の合理化されたラテラルフローストリップを使用した、多重化されたＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイ読み出しのための様々な方法が、本明細書に記載される。図１０は、単一標的アッセイフォーマット（左側）の実施形態と、多重化アッセイフォーマット（右側）の実施形態の両方を示す。一番上の行は、使用前のラテラルフローアッセイストリップを示している。中央の行と下の行は、それぞれ陽性結果と陰性結果を示している。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、複数の検出スポット、ライン、または領域を有する。１番上の行では、図１０の左側に、ラテラルフローアッセイストリップが、標的Ａ用及び標的Ｂ用の２つの検出ラインと共に示されている。

図１１は、使用前のＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイ（上）、陽性結果のアッセイ（中央左側）、陰性結果のアッセイ（中央右側）、及び失敗した試験（下）の別の実施形態を示す。いくつかの実施形態では、試料パッドは抗ビオチンの官能化された金ナノ粒子を含み、金ナノ粒子は抗ビオチン抗体で標識されている。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、ストレプトアビジン捕捉プローブをさらに含むコントロールラインを含む。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、抗ＩｇＧ抗体（ウサギ）をさらに含む試験ラインを含む。いくつかの実施形態では、溶液はＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイ試薬を含み、Ｃａｓ酵素をさらに含み、Ｃａｓ酵素は、ガイド核酸（図示せず）による標的核酸（図示せず）の結合時にレポーターを切断する。いくつかの実施形態では、切断されたレポーター、切断されていないレポーター、またはそれらの組み合わせのいずれかを含む、反応したＤＥＴＥＣＴＲ（商標）溶液は、ラテラルフローアッセイストリップの試料パッドにさらされる。いくつかの実施形態では、陽性結果は、図１１の中央左に示されるように、試験及びコントロールラインの両方における抗ビオチン金ナノ粒子による可視散乱シグナルによって示される。いくつかの実施形態では、陰性結果は、図１１の中央右に示されるように、レポーターの切断がないとき、標的核酸が存在しない場合、抗ビオチン標識金ナノ粒子による可視散乱シグナルによって示される。

ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイのための様々な方法、装置、組成物、及びシステムが本明細書に記載される。図１２は、ラテラルフロー用途のためのつながれたレポーターの一設計を示す。いくつかの実施形態では、図１２の左に示すように、切断可能な核酸配列を含むレポーターは、５’末端でＦＡＭ及びビオチンの両方で標識され、３’末端でアミン基で官能化される。いくつかの実施形態では、アミン官能化３’末端は、図１２中央に示されるように、アミン反応性磁気ビーズにコンジュゲートする。あるいは、いくつかの実施形態では、切断可能な核酸配列を含むレポーターは、図１２左に示されるように、５’末端でＦＡＭ及びビオチンの両方で標識され、３’末端でチオール基で官能化される。いくつかの実施形態では、チオール機能化された３’末端は、図１２中央に示されるように、反応チャンバのチオール反応性表面にコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、ＦＡＭ及びビオチンを含む切断されたレポーター断片は、本明細書に記載の活性Ｃａｓ酵素による切断に続いて、溶液中に放出される。いくつかの実施形態では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイは、合理化されたラテラルフローアッセイのために溶液の磁気ビーズを使用して実施される。図１３は、そのようなワークフローの一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、溶液（１３００）は、図１３に示されるように、磁気ビーズに固定化された他のレポーター断片と共にＦＡＭ及びビオチンをさらに含む、切断されたレポーター断片を含む。いくつかの実施形態では、溶液（１３００）を磁場に置き、図１３の工程Ａに示すように、磁性粒子を固定化ペレット（１３０１）に集める。いくつかの実施形態では、ＦＡＭ及びビオチンで標識されたレポーター断片を含む上澄み溶液（１３０２）は、図１３の工程Ｂに示されるように、その後ピペットによって回収される。いくつかの実施形態では、その後、図１３の工程Ｃに示されるように、上澄み溶液がラテラルフローアッセイストリップの試料パッドに適用される。次に、本明細書に記載されているように、結果が読み出される。

本明細書に記載されるのは、酵素修飾レポーター（１４００）がＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイで使用され、ストレプトアビジン－ビオチン結合を使用して、図１４に示すように反応チャンバに到達する前に切断されたレポーターを濾過する、様々な実施形態である。レポーター（１４００）は、酵素（１４０１）、切断可能な核酸配列（１４０２）、及びビオチン（１４０３）を含む。図１４の上の行は、標的核酸が溶液中に存在するときのＤＥＴＥＣＴＲ（商標）のプロセスを示す。図１４の下段は、標的核酸が溶液中に存在しない場合のＤＥＴＥＣＴＲ（商標）のプロセスを示す。いくつかの実施形態では、標的核酸が溶液中に存在するとき、プログラマブルヌクレアーゼ（１４０７）が活性化され、レポーター（１４００）を切断する。そのような実施形態では、ビオチン（１４０８）で標識された切断されたレポーター断片は、捕捉チャンバまたは紙のストリップ（１４０５）に固定化されたストレプトアビジン（１４０９）によって捕捉される。標的核酸が溶液中に存在する場合、酵素（１４０１）は、酵素基質（１４０６）と共に検出チャンバにさらされると、シグナル放出部分（１４１０）を生成する。いくつかの実施形態では、酵素（１４０１）は、本明細書に記載の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。

試薬とシグナル検出
多数の試薬が、本明細書に開示されるラテラルフロー装置及び方法と一致する。これらの試薬には、緩衝液（溶解緩衝液など）、プログラマブルヌクレアーゼ、レポーター、及びガイド核酸が含まれる。疾患を検出するための本明細書に記載の試薬は、疾患を示す標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸を含む。標的核酸は、本明細書に記載の疾患の原因となる、ウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する核酸の一部を含む単一鎖標的核酸に結合する。ガイド核酸は、抗生物質治療などの治療への耐性をもたらし得る、一塩基多型（ＳＮＰ）などの突然変異を任意選択でさらに含む、細菌または本明細書に記載の疾患の原因となる他の作用因子に由来する核酸の一部を含む、一本鎖標的核酸に、結合することができる。ガイド核酸は、標的核酸に相補的である。多くの場合、ガイド核酸は標的核酸に特異的に結合する。標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または合成核酸であり得る。

本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、ｂ）標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む活性化された複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を反応基質に接触させること、ｃ）反応基質を、切断された反応基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）反応基質の切断発生を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。当該方法は、本明細書に開示された合理化されたラテラルフロー装置で実施することができる。多くの場合、反応基質は酵素核酸であり、試薬は酵素に対応する酵素基質である。反応基質が酵素基質－核酸であり、試薬が酵素基質に対応する酵素である場合もある。

プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸及び標的核酸と複合体化した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合後に活性化され得、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を切断し、トランス切断活性を有することができる。トランス切断活性は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる近くの一本鎖核酸の非特異的切断、例えば検出部分を有するレポーターのトランス切断であり得る。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによってレポーターが切断されると、検出部分はレポーターから放出され、シグナルを生成することができる。シグナルは、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電シグナルであり得る。多くの場合、シグナルは、レポーター切断の前に存在し、レポーターが切断されると変化する。シグナルは、レポーター切断の前には存在せず、レポーターが切断されると存在する。検出可能なシグナルは、支持媒体に位置する検出領域または検出スポットから検出することができる。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、検出部分によって生成される。いくつかの実施形態では、検出可能なシグナルは、検出領域または検出スポットでの検出部分の結合を示す。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合によって活性化され得る、トランス切断活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（規則的に間の空いた短いパリンドローム反復のクラスタ－ＣＲＩＳＰＲ関連）核タンパク質複合体であり得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ核タンパク質複合体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素とも呼ばれ得るガイド核酸と複合体化したＣａｓタンパク質（Ｃａｓヌクレアーゼとも呼ばれる）を含むことができる。ガイド核酸は、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり得る。ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む場合がある。

改変された標的核酸を検出するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、Ｃａｓタンパク質、及びレポーターを含み得る。

Ａ．プログラマブルヌクレアーゼ
ガイド核酸及び標的核酸セグメントと複合体化した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼを含む試薬が、本明細書に記述される。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸及び標的配列と複合体化した場合に活性化することができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸がその標的核酸に結合すると活性化され得、その環境において非標的核酸を非特異的に分解できる。プログラマブルヌクレアーゼは、活性化されるとトランス切断活性を有する。プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（交換可能にＣａｓヌクレアーゼとも呼ばれる）であり得る。ｃｒＲＮＡ及びＣａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ酵素を形成することができる。

いくつかのプログラマブルヌクレアーゼは、本開示の方法及び装置と一致する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、本明細書中に開示される方法及びシステムにおいて使用されるプログラマブルヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素の公知のクラス及びタイプのいずれかを含み得る。本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼには、クラス１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素、例えばＩ型、ＩＶ型またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が含まれる。本明細書に開示されるプログラマブルヌクレアーゼには、クラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素、例えばＩＩ型、Ｖ型及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素も含まれる。本明細書中に開示されるいくつかの装置及びその使用方法に含まれるプログラマブルヌクレアーゼには、Ｖ型またはＶＩ型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素が含まれる。

いくつかの実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、プログラマブルＣａｓ１２ヌクレアーゼである。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素（例えば、Ｃａｓ１２またはＣａｓ１４）は、ＨＮＨドメインを欠く。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素はプログラマブルＣａｓＰｈｉである。本開示のＣａｓ１２ヌクレアーゼは、単一の触媒作用的ＲｕｖＣドメインを介して核酸を切断する。ＲｕｖＣドメインは、ヌクレアーゼ内、またはタンパク質の「ＮＵＣ」ローブ内に存在し、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、認識または「ＲＥＣ」ローブをさらに含む。ＲＥＣローブ及びＮＵＣローブは、架橋ヘリックスによって接続され、Ｃａｓ１２タンパク質は、ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメイン及びウエッジ（ＷＥＤ）ドメインと呼ばれるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）認識のための２つのドメインをさらに含む。（Ｍｕｒｕｇａｎｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌ．２０１７Ｏｃｔ５；６８（１）：１５－２５）プログラマブルＣａｓ１２ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１とも呼ばれる）タンパク質、Ｃａｓ１２ｂタンパク質、Ｃａｓ１２ｃタンパク質、Ｃａｓ１２ｄタンパク質、またはＣａｓ１２ｅタンパク質であり得る。いくつかの場合では、適切なＣａｓ１２タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２７～ＳＥＱＩＤＮＯ：３７のいずれか１つとの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

（表１）Ｃａｓ１２タンパク質配列

あるいは、または組み合わせて（例えば、多重化の間に）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、プログラマブルＣａｓ１４ヌクレアーゼである。本開示のＣａｓ１４タンパク質は、Ｃａｓ１４タンパク質の一次アミノ酸配列に関して連続していないが、タンパク質が生成されて折り畳まれるとＲｕｖＣドメインを形成する３つの部分ＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ－Ｉ、ＲｕｖＣ－ＩＩ及びＲｕｖＣ－ＩＩＩ、本明細書ではサブドメインとも呼ばれる）を含む。天然のＣａｓ１４タンパク質は、標的核酸中の特定の配列での切断を触媒するエンドヌクレアーゼとして機能する。プログラマブルＣａｓ１４ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１４ａタンパク質、Ｃａｓ１４ｂタンパク質、Ｃａｓ１４ｃタンパク質、Ｃａｓ１４ｄタンパク質、Ｃａｓ１４ｅタンパク質、Ｃａｓ１４ｆタンパク質、Ｃａｓ１４ｇタンパク質、Ｃａｓ１４ｈタンパク質、またはＣａｓ１４ｕタンパク質であり得る。いくつかの場合では、適切なＣａｓ１４タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：３８～ＳＥＱＩＤＮＯ：１２９のいずれか１つとの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

（表２）Ｃａｓ１４タンパク質配列

いくつかの実施形態では、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素は、プログラマブルＣａｓ１３ヌクレアーゼである。Ｃａｓ１３タンパク質の一般的な構造は、Ｎ末端ドメイン、及び２つのヘリカルドメインによって分離された２つのＨＥＰＮ（高等真核生物及び原核生物のヌクレオチド結合）ドメインを含む（Ｌｉｕｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ２０１７Ｊａｎ１２；１６８（ｌ－２）：１２１－１３４．ｅｌ２）。ＨＥＰＮドメインはそれぞれ、ａＲ－Ｘ４－Ｈモチーフを含む。Ｃａｓ１３タンパク質全体で共有される特徴としては、ガイド核酸のｃｒＲＮＡが標的核酸に結合すると、タンパク質が立体構造変化を受けてＨＥＰＮドメインを一緒にし、触媒的に活性なＲＮａｓｅを形成することが挙げられる。（Ｔａｍｂｅｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＲｅｐ．２０１８Ｊｕｌ２４；２４（４）：１０２５－１０３６）。したがって、２つの活性化可能なＨＥＰＮドメインは、本開示のプログラマブルＣａｓ１３ヌクレアーゼの特徴である。しかしながら、本開示と一致するプログラマブルＣａｓ１３ヌクレアーゼには、Ｃａｓ１３タンパク質の切断効率を高めるＨＥＰＮドメイン中の突然変異、またはＨＥＰＮドメインを触媒的に不活性化する突然変異を含むＣａｓ１３ヌクレアーゼも含まれる。本開示と一致するプログラマブルＣａｓ１３ヌクレアーゼはまた、触媒成分を有するＣａｓ１３ヌクレアーゼである。

プログラマブルＣａｓ１３ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３ａタンパク質（「ｃ２ｃ２」とも呼ばれる）、Ｃａｓ１３ｂタンパク質、Ｃａｓ１３ｃタンパク質、Ｃａｓ１３ｄタンパク質、またはＣａｓ１３ｅタンパク質であり得る。実施例Ｃ２ｃ２タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０－ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７として示されている。いくつかの場合では、対象Ｃ２ｃ２タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０～ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列との８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なＣ２ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０に示されるＬｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉＣ２ｃ２アミノ酸配列との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なＣ２ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３１に示されるレプトトリキア・ブッカリス（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｂｕｃｃａｌｉｓ）Ｃ２ｃ２アミノ酸配列との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なＣ２ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３３に示されるロドバクター・カプスラータ（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）Ｃ２ｃ２アミノ酸配列との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なＣ２ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３４に示されるカルノバクテリウム・ガリナルム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）Ｃ２ｃ２アミノ酸配列との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、適切なＣ２ｃ２ポリペプチドは、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３５に示されるハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Ｈｅｒｂｉｎｉｘｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｌｙｔｉｃａ）Ｃ２ｃ２アミノ酸配列との少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３１に示されるレプトトリキア・ブッカリス（Ｌｂｕ）Ｃ２ｃ２アミノ酸配列との８０％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、レプトトリキア・ブッカリス（Ｌｂｕ）Ｃ２ｃ２タンパク質（例えば、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３１を参照）である。いくつかの場合では、Ｃ２ｃ２タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０～ＳＥＱＩＤＮＯ：１３１及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３３～ＳＥＱＩＤＮＯ：１３７のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合では、本開示の方法で使用されるＣ２ｃ２タンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｓｈａｈｉｉ（Ｌｓｈ））Ｃ２ｃ２タンパク質ではない。いくつかの場合では、本開示の方法で使用されるＣ２ｃ２タンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３２に示されるＬｓｈＣ２ｃ２ポリペプチドとの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するＣ２ｃ２ポリペプチドではない。他のＣａｓ１３タンパク質配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３０～ＳＥＱＩＤＮＯ：１４７に示される。

（表３）Ｃａｓ１３タンパク質配列

プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ１３であり得る。Ｃａｓ１３は、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄまたはＣａｓ１３ｅであり得る場合もある。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｍａｄ７またはＭａｄ２であり得る。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２であり得る。Ｃａｓ１２は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅであり得る場合もある。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、Ｃｓｍ１、Ｃａｓ９、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、Ｃ２ｃ９、またはＣａｓＺであり得る。Ｃｓｍ１は、ｓｍＣｍｓ１、ｍｉＣｍｓ１、ｏｂＣｍｓ１、またはｓｕＣｍｓ１と呼ばれることもある。Ｃａｓ１３ａは、Ｃ２ｃ２と呼ばれることもある。ＣａｓＺは、Ｃａｓ１４ａ、Ｃａｓ１４ｂ、Ｃａｓ１４ｃ、Ｃａｓ１４ｄ、Ｃａｓ１４ｅ、Ｃａｓ１４ｆ、Ｃａｓ１４ｇ、またはＣａｓ１４ｈと呼ばれることもある。プログラマブルヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。いくつかの場合では、プログラマブルヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る。プログラマブルヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系であり得る場合がある。いくつかの場合、プログラマブルヌクレアーゼは、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｓｈ）、リステリア・シーリジェリー（Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）（Ｌｓｅ）、レプトトリキア・ブッカリス（Ｌｂｕ）、レプトトリキア・ウェイディイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｗａｄｅｕ）（Ｌｗａ）、ロドバクター・カプスラータ（Ｒｃａ）、ハービニクス・ヘミセルロシリティカ（Ｈｈｅ）、パルディバクター・プロピオニシゲネス（Ｐａｌｕｄｉｂａｃｔｅｒｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｇｅｎｅｓ）（Ｐｐｒ）、ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）細菌（Ｌｂａ）、［ユウバクテリウム］・レクターレ（［Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ］ｒｅｃｔａｌｅ）（Ｅｒｅ）、リステリア・ニュヨークネンシス（Ｌｉｓｔｅｒｉａｎｅｗｙｏｒｋｅｎｓｉｓ）（Ｌｎｙ）、クロストリジウム・アミノフィラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）（Ｃａｍ）、プレボテーラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓｐ．）（Ｐｓｍ）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）（Ｃｃａ、ラクノスピラ細菌（Ｌｂａ））、バージイエラ・ズーヘルカム（Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａｚｏｏｈｅｌｃｕｍ）（Ｂｚｏ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｐｉｎ）、プレボテーラ・ブッカエ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｂｕｃｃａｅ）（Ｐｂｕ）、アリスティペス属種（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓｓｐ．）（Ａｓｐ）、リエメレラ・アナティペステイファー（Ｒｉｅｍｅｒｅｌｌａａｎａｔｉｐｅｓｔｉｆｅｒ）（Ｒａｎ）、プレボテーラ・オーランティアカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａａｕｒａｎｔｉａｃａ）（Ｐａｕ）、プレボテーラ・サッカロリティカ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）（Ｐｓａ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｐｉｎ２）、カプノサイトファーガ・カニモルサス（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａｃａｎｉｍｏｒｓｕｓ）（Ｃｃａ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｕｌａｅ）（Ｐｇｕ）、プレボテーラ属種（Ｐｓｐ）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）（Ｐｉｇ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）（Ｐｉｎ３）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｉｔａｌｉｃｕｓ）（Ｅｉ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（Ｌｓ）、またはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔ）のうちの少なくとも１つに由来し得る。Ｃａｓ１３は、ＬｂｕＣａｓ１３ａ、ＬｗａＣａｓ１３ａ、ＬｂａＣａｓ１３ａ、ＨｈｅＣａｓ１３ａ、ＰｐｒＣａｓ１３ａ、ＥｒｅＣａｓ１３ａ、ＣａｍＣａｓ１３ａ、またはＬｓｈＣａｓ１３ａのうちの少なくとも１つである場合がある。ＣＲＩＳＰＲ酵素のトランス切断活性は、ｃｒＲＮＡが標的核酸と複合体化されると活性化され得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素のトランス切断活性は、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを含むガイド核酸が標的核酸と複合体化されると活性化され得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡであり得る。

いくつかの実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼはＣａｓ１２を含み、Ｃａｓ１２酵素は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡに結合して切断する。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼはＣａｓ１３を含み、Ｃａｓ１３酵素は、一本鎖ＲＮＡに結合して切断する。いくつかの実施形態では、プログラム可能なヌクレアーゼはＣａｓｌ４を含み、Ｃａｓｌ４酵素は、二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡの両方に結合して切断する。

Ｂ．ガイド核酸
ガイド核酸は、標的核酸の配列に逆相補的な配列を含み得る。ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡを含み得る。ガイド核酸は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む場合がある。ガイド核酸は、標的核酸に特異的に結合することができる。いくつかの場合では、ガイド核酸は天然に存在せず、むしろ配列の別々のセグメントを別途人工的に組み合わせることによって作製される。多くの場合、人工的な組み合わせは、化学合成によって、遺伝子工学技術によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作によって行われる。標的核酸は、所望の機能を提供するように設計及び作製することができる。いくつかの場合では、ガイド核酸のターゲティング領域は、２０ヌクレオチド長である。ガイド核酸のターゲティング領域は、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０ヌクレオチド長の長さを有し得る。いくつかの例では、ガイド核酸のターゲティング領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、ガイド核酸のターゲティング領域は、正確にまたは約１２ヌクレオチド（ｎｔ）～約８０ｎｔ、約１２ｎｔ～約５０ｎｔ、約１２ｎｔ～約４５ｎｔ、約１２ｎｔ～約４０ｎｔ、約１２ｎｔ～約３５ｎｔ、約１２ｎｔ～約３０ｎｔ、約１２ｎｔ～約２５ｎｔ、約１２ｎｔ～約２０ｎｔ、約１２ｎｔ～約１９ｎｔ、約１９ｎｔ～約２０ｎｔ、約１９ｎｔ～約２５ｎｔ、約１９ｎｔ～約３０ｎｔ、約１９ｎｔ～約３５ｎｔ、約１９ｎｔ～約４０ｎｔ、約１９ｎｔ～約４５ｎｔ、約１９ｎｔ～約５０ｎｔ、約１９ｎｔ～約６０ｎｔ、約２０ｎｔ～約２５ｎｔ、約２０ｎｔ～約３０ｎｔ、約２０ｎｔ～約３５ｎｔ、約２０ｎｔ～約４０ｎｔ、約２０ｎｔ～約４５ｎｔ、約２０ｎｔ～約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ～約６０ｎｔの長さを有する。ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるため、またはハイブリダイズ可能であるため、または特異的に結合できるために、その標的核酸のそれに対して１００％相補的である必要はないことが理解される。ガイド核酸は、標的核酸中の改変可変領域に逆相補的な核酸残基５～２０からの領域に少なくとも１つのウラシルを含む配列を有することができる。ガイド核酸は、いくつかの場合では、標的核酸中の改変可変領域に逆相補的な核酸残基５～９、１０～１４、または１５～２０からの領域に少なくとも１つのウラシルを含む配列を有する。ガイド核酸は、標的核酸中のメチル化可変領域に逆相補的な核酸残基５～２０からの領域に少なくとも１つのウラシルを含む配列を有することができる。ガイド核酸は、いくつかの場合では、標的核酸中のメチル化可変領域に逆相補的な核酸残基５～９、１０～１４、または１５～２０からの領域に少なくとも１つのウラシルを含む配列を有する。

ガイド核酸は、関心対象の感染またはゲノム遺伝子座の株の核酸配列に対してタイリングされたガイド核酸の群から選択することができる。ガイド核酸は、関心対象の株の核酸配列に対してタイリングされたガイド核酸の群から選択することができる。多くの場合、感染症の株のまたは関心対象のゲノム遺伝子座の核酸に対してタイリングされたガイド核酸を、本明細書に記載の方法で使用するためにプールすることができる。多くの場合、これらのガイド核酸は、単一のアッセイで標的核酸を検出するためにプールされる。単一の標的核酸に対してタイリングされるガイド核酸のプールは、本明細書に記載の方法を使用する標的核酸の検出を増強することができる。単一の標的核酸に対してタイリングされるガイド核酸のプールは、本明細書に記載の方法を使用する単一の反応内で標的核酸を広くカバーすることを保証できる。タイリングは、例えば、標的核酸に沿って連続的である。タイリングは、標的核酸に沿って重複することがある。いくつかの例では、タイリングは、標的核酸に沿ったタイリングされたガイド核酸間のギャップを含む。いくつかの例では、ガイド核酸のタイリングは非連続的である。多くの場合、標的核酸を検出するための方法は、標的核酸をガイド核酸のプール及びプログラマブルヌクレアーゼに接触させる工程であって、ガイド核酸のプールのガイド核酸が、標的核酸の核酸に対応するタイリングされたガイド核酸の群から選択される配列を有する、工程、ならびに、レポーターの集団の少なくとも一部のレポーターの切断によって生じるシグナルをアッセイする工程を含む。ガイド核酸のプールは、単一の反応内で標的種の広域スペクトル同定または広域カバーを確保することができる。これは、敗血症など、複数の生物によって引き起こされ得る疾患または適応症において特に有用であり得る。

Ｃ．レポーター
レポーター、及びレポーターを使用して標的核酸を検出する方法も本明細書に開示される。多くの場合、レポーターはタンパク質－核酸である。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、ｂ）標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む活性化された複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、タンパク質－核酸は、酵素－核酸または酵素基質－核酸である。タンパク質－核酸は、固体支持体に結合される場合がある。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などのプログラマブルヌクレアーゼを使用して標的核酸を検出する。例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を基質に接触させること、ｃ）基質を、切断された基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）基質の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素－核酸である。場合によって、基質は酵素基質－核酸である。

タンパク質－核酸の切断は、シグナルを生成する。本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、試料に標的核酸が存在するかどうかを示すこれらのシグナルを検出するために、使用することができる。

一本鎖核酸及び検出部分をさらに含むレポーターを含む試薬が本明細書に記載され、一本鎖核酸は活性化プログラマブルヌクレアーゼによって切断され、それによって第１の検出可能なシグナルを生成することができる。いくつかの場合では、レポーターは、デオキシリボヌクレオチドを含む一本鎖核酸である。他の場合では、レポーターは、リボヌクレオチドを含む一本鎖核酸である。レポーターは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド及び少なくとも１つのリボヌクレオチドを含む一本鎖核酸であり得る。いくつかの場合では、レポーターは、切断部位として機能する内部位置に少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む一本鎖核酸である。いくつかの場合では、レポーターは、内部位置に少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のリボヌクレオチド残基を含む。リボヌクレオチド残基は、連続している場合がある。あるいは、リボヌクレオチド残基は、非リボヌクレオチド残基の間に散在している。いくつかの場合では、レポーターは、リボヌクレオチド残基のみを有する。いくつかの場合では、レポーターは、デオキシリボヌクレオチド残基のみを有する。いくつかの場合では、レポーターは、本明細書に記載のプログラマブルヌクレアーゼによる切断に耐性のヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、合成ヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基及び少なくとも１つの非リボヌクレオチド残基を含む。いくつかの場合では、レポーターは、５～２０、５～１５、５～１０、７～２０、７～１５または７～１０ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも１つのウラシルリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも２つのウラシルリボヌクレオチドを含む。レポーターは、ウラシルリボヌクレオチドのみを有する場合がある。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも１つのアデニンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも２つのアデニンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、アデニンリボヌクレオチドのみを有する。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも１つのシトシンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも２つのシトシンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも１つのグアニンリボヌクレオチドを含む。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも２つのグアニンリボヌクレオチドを含む。レポーターは、改変リボヌクレオチドのみ、非改変デオキシリボヌクレオチドのみ、またはそれらの組み合わせを含むことができる。いくつかの場合では、レポーターは、５～１２ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、レポーターは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。いくつかの場合では、レポーターは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。Ｃａｓ１３を含むプログラマブルヌクレアーゼによる切断の場合、レポーターは５、８または１０ヌクレオチド長であり得る。Ｃａｓ１２を含むプログラマブルヌクレアーゼによる切断の場合、レポーターは１０ヌクレオチド長であり得る。

いくつかの実施形態では、一本鎖レポーターは、第１の検出可能なシグナルを生成することができる検出部分を含む。場合により、レポーターは、シグナルを生成することができるタンパク質を含む。シグナルは、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電シグナルであり得る。いくつかの場合では、検出部分は切断部位の片側に存在する。任意で、クエンチング部分は、切断部位の別の側に存在する。クエンチング部分は、蛍光クエンチング部分である場合がある。いくつかの場合では、クエンチング部分は切断部位に対して５’であり、検出部分は切断部位に対して３’である。いくつかの場合では、検出部分は切断部位に対して５’であり、クエンチング部分は切断部位に対して３’である。クエンチング部分は、レポーターの５’末端に存在する場合がある。検出部分は、レポーターの３’末端に存在する場合がある。いくつかの場合では、検出部分は、レポーターの５’末端に存在する。いくつかの場合では、クエンチング部分は、レポーターの３’末端に存在する。いくつかの場合では、一本鎖レポーターは、第１の検出可能なシグナルを生成することができる一本鎖核酸の少なくとも１つの集団である。いくつかの場合では、一本鎖レポーターは、第１の検出可能なシグナルを生成することができる一本鎖核酸の集団である。任意で、一本鎖レポーターの集団が２つ以上存在する。いくつかの場合では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、３０、４０、５０、または５０超、またはこのリストの範囲にかかる任意の数の、検出可能なシグナルを生成することができる一本鎖レポーターの異なる集団が存在する。

（表４）例示的な一本鎖レポーター

・／５６－ＦＡＭ／：５’６－フルオレセイン（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・／３ＩＡＢｋＦＱ／：３’ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・／５ＩＲＤ７００／：５’ＩＲＤｙｅ７００（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・／５ＴＹＥ６６５／：５’ＴＹＥ６６５（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・／５Ａｌｅｘ５９４Ｎ／：５’ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（ＮＨＳエステル）（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・／５ＡＴＴＯ６３３Ｎ／：５’ＡＴＴＯＴＭ６３３（ＮＨＳエステル）（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・／３ＩＲＱＣ１Ｎ／：３’ＩＲＤｙｅＱＣ－１クエンチャー（Ｌｉ－Ｃｏｒ）
・／３ＩＡｂＲＱＳｐ／：３’ＩｏｗａＢｌａｃｋＲＱ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
・ｒＵ：ウラシルリボヌクレオチド
・ｒＧ：グアニンリボヌクレオチド
・＊この表は、検出部分及びクエンチャー部分に、それらの商品名及びそれらの供給源が特定されていれば言及する。しかしながら、他の供給源からの類似の機能を有する代替物、ジェネリック、または商品名のない部分も使用することができる。

検出部分は、フルオロフォアであり得る。検出部分は、可視スペクトルの蛍光を発するフルオロフォアであり得る。いくつかの実施形態では、検出部分は、可視スペクトルの蛍光を発するフルオロフォアであり得る。いくつかの実施形態では、検出部分は、近ＩＲスペクトルの蛍光を発するフルオロフォアであり得る。いくつかの実施形態では、検出部分は、ＩＲスペクトルの蛍光を発するフルオロフォアであり得る。検出部分は、５００ｎｍ～７２０ｎｍの範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。いくつかの場合では、検出部分は、７００ｎｍ以上の波長で蛍光を発する。他の場合では、検出部分は、約６６０ｎｍまたは約６７０ｎｍで蛍光を発する。いくつかの場合では、検出部分は、５００～５２０、５００～５４０、５００～５９０、５９０～６００、６００～６１０、６１０～６２０、６２０～６３０、６３０～６４０、６４０～６５０、６５０～６６０、６６０～６７０、６７０～６８０、６８０～６９０、６９０～７００、７００～７１０、７１０～７２０、または７２０～７３０ｎｍの範囲で蛍光を発する。検出部分は、６－フルオレセイン、ＩＲＤｙｅ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＴＹＥ６６５、またはＡＴＴＯ（商標）６３３（ＮＨＳＥｓｔｅｒ）と同じ範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。検出部分は、フルオレセインアミダイト、６－フルオレセイン、ＩＲＤｙｅ７００、ＴＹＥ６６５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、またはＡＴＴＯ（商標）６３３（ＮＨＳエステル）であり得る。検出部分は、６－フルオレセイン（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＲＤｙｅ７００（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＹＥ６６５（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはＡＴＴＯ（商標）６３３（ＮＨＳエステル）（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と同じ範囲の蛍光を発するフルオロフォアであり得る。検出部分は、フルオレセインアミダイト、６－フルオレセイン（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＲＤｙｅ７００（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＹＥ６６５（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはＡＴＴＯ（商標）６３３（ＮＨＳエステル）（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり得る。本明細書に記載の検出部分のいずれも、任意の市販の供給源からのものであり得、同様の機能を有する代替物、ジェネリック、または列挙した商品名でない検出部分であってもよい。

検出部分は、試験される試料の種類に基づいて使用するために選択することができる。例えば、赤外線フルオロフォアである検出部分は、尿試料と共に使用される。別の例として、約５２０ｎｍを放出するフルオロフォアを有するＳＥＱＩＤＮＯ：１は、非尿試料での試験に使用され、約７００ｎｍを放出するフルオロフォアを有するＳＥＱＩＤＮＯ：８は、尿試料での試験に使用される。

クエンチング部分は、検出部分をクエンチングする能力に基づいて選択することができる。クエンチング部分は、非蛍光の蛍光クエンチャーであり得る。クエンチング部分は、５００ｎｍ～７２０ｎｍの範囲の蛍光を発する検出部分をクエンチングすることができる。いくつかの場合では、クエンチング部分は、７００ｎｍ以上の波長で蛍光を発する検出部分をクエンチングする。他の場合では、クエンチング部分は、約６６０ｎｍまたは約６７０ｎｍで蛍光を発する検出部分をクエンチングする。いくつかの場合では、クエンチング部分は、５００～５２０、５００～５４０、５００～５９０、５９０～６００、６００～６１０、６１０～６２０、６２０～６３０、６３０～６４０、６４０～６５０、６５０～６６０、６６０～６７０、６７０～６８０、６８０～６９０、６９０～７００、７００～７１０、７１０～７２０、または７２０～７３０ｎｍの範囲で蛍光を発する検出部分をクエンチングする。クエンチング部分は、フルオレセインアミダイト、６－フルオレセイン、ＩＲＤｙｅ７００、ＴＹＥ６６５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４、またはＡＴＴＯ（商標）６３３（ＮＨＳエステル）をクエンチングすることができる。クエンチング部分は、ＩｏｗａＢｌａｃｋＲＱ、ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱまたはＩＲＤｙｅＱＣ－１クエンチャーであり得る。クエンチング部分は、フルオレセインアミダイト、６－フルオレセイン（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩＲＤｙｅ７００（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＹＥ６６５（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ５９４（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、またはＡＴＴＯ（商標）６３３（ＮＨＳエステル）（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をクエンチングすることができる。クエンチング部分は、ＩｏｗａＢｌａｃｋＲＱ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＩｏｗａＢｌａｃｋＦＱ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＩＲＤｙｅＱＣ－１クエンチャー（ＬｉＣｏｒ）であり得る。本明細書に記載のクエンチング部分のいずれも、任意の市販の供給源からのものであり得、同様の機能を有する代替物、ジェネリック、または列挙した商品名でないクエンチング部分であってもよい。

検出部分の放出を示す検出可能なシグナルの発生は、プログラマブルヌクレアーゼによる切断が起こったこと、及び試料が標的核酸を含むことを示す。いくつかの場合では、検出部分は蛍光色素を含む。検出部分は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対を含む場合がある。いくつかの場合では、検出部分は赤外線（ＩＲ）色素を含む。いくつかの場合では、検出部分は紫外線（ＵＶ）色素を含む。代替的にまたは組み合わせて、検出部分はポリペプチドを含む。場合により、検出部分はビオチンを含む。場合により、検出部分は、アビジンまたはストレプトアビジンの少なくとも１つを含む。いくつかの例では、検出部分は、多糖、ポリマー、またはナノ粒子を含む。いくつかの例では、検出部分は、金ナノ粒子またはラテックスナノ粒子を含む。

検出部分は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電シグナルを生成することができる任意の部分であり得る。レポーターは、場合により、核酸の切断により熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電シグナルを生成することができるタンパク質－核酸である。多くの場合、熱量測定シグナルは、レポーターの切断後に生成される熱である。場合により、熱量測定シグナルは、レポーターの切断後に吸収される熱である。電位差測定シグナルは、例えば、レポーターの切断後に生成される電位である。電流測定シグナルは、レポーターの切断後に生成される電子の動きであり得る。多くの場合、シグナルは、比色シグナルまたは蛍光シグナルなどの光学シグナルある。光学シグナルは、例えば、レポーターの切断後に生成される光出力である。場合により、光学シグナルは、レポーターの切断の前後に測定された、吸光度、発光、またはその両方の変化である。場合により、光学シグナルは、レポーターの切断の前後に測定された、吸光度、発光、またはその両方の増加である。場合により、光学シグナルは、レポーターの切断の前後に測定された、吸光度、発光、またはその両方の減少である。多くの場合、圧電シグナルは、プログラマブルヌクレアーゼによるレポーターの切断の前と後での質量の変化である。

多くの場合、タンパク質－核酸は酵素－核酸である。酵素は、酵素－核酸のように存在する場合、立体的に妨げられ得るが、プログラマブルヌクレアーゼによる核酸からの切断により機能的となり得る。多くの場合、酵素は、基質との反応を起こす酵素である。酵素は、インベルターゼであり得る。多くの場合、インベルターゼの基質はスクロース及びＤＮＳ試薬である。

場合により、タンパク質－核酸は基質－核酸である。多くの場合、基質は、酵素との反応を起こす基質である。プログラマブルヌクレアーゼによる切断時の基質の放出は、基質を自由にして酵素と反応させることができる。

タンパク質－核酸は、固体支持体に結合され得る。固体支持体は、例えば、表面である。表面は電極であり得る。固体支持体は、ビーズである場合ある。多くの場合、ビーズは磁気ビーズである。切断により、タンパク質は固体から遊離し、他の混合物と相互作用する。例えば、タンパク質は酵素であり、酵素－核酸の核酸の切断により、酵素はチャンバを通って基質を含む混合物に流入する。酵素が酵素基質と出会うと、比色反応などの反応が起こり、次いでそれは検出される。別の例として、タンパク質は酵素基質であり、酵素基質－核酸の核酸の切断により、酵素はチャンバを通って酵素を含む混合物に流入する。酵素基質が酵素と出会うと、熱量測定反応などの反応が起こり、次いでそれは検出される。

いくつかの実施形態では、レポーターは、順次フルオロフォアにコンジュゲートされる（例えば、核酸－親和性分子－フルオロフォア）親和性分子にコンジュゲートされた核酸、または順次親和性分子にコンジュゲートされる（例えば、核酸－フルオロフォア－親和性分子）フルオロフォアにコンジュゲートされた核酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、核酸を親和性分子にコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、リンカーは、親和性分子をフルオロフォアにコンジュゲートさせる。いくつかの実施形態では、リンカーは、核酸をフルオロフォアにコンジュゲートさせる。リンカーは、当技術分野で公知の任意の適切なリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、レポーターの核酸を親和性分子に直接コンジュゲートさせることができ、親和性分子をフルオロフォアに直接コンジュゲートさせることができ、または核酸をフルオロフォアに直接コンジュゲートさせることができ、フルオロフォアを親和性分子に直接コンジュゲートさせることができる。これに関連して、「直接コンジュゲート」は、互いに直接コンジュゲートした２つの部分の間に、介在する分子、ポリペプチド、タンパク質、または他の部分が存在しないことを示した。例えば、レポーターが親和性分子に直接コンジュゲートされた核酸、及びフルオロフォアに直接コンジュゲートされた親和性分子を含む場合、核酸と親和性分子との間に介在部分は存在せず、親和性分子とフルオロフォアとの間に介在部分は存在しない。親和性分子は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、または任意の類似の分子であり得る。

いくつかの場合では、レポーターは、基質－核酸を含む。基質は、基質－核酸のように存在する場合、その同族酵素から隔離され得るが、切断されると核酸から放出され、放出された基質は同族酵素と接触して検出可能なシグナルを生成し得る。多くの場合、基質はスクロースであり、同族酵素はインベルターゼであり、ＤＮＳ試薬を使用してインベルターゼ活性を監視することができる。

レポーターは、ハイブリッド核酸レポーターであり得る。ハイブリッド核酸は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド及び少なくとも１つのリボヌクレオチドを有する核酸を含む。いくつかの実施形態では、ハイブリッド核酸レポーターの核酸は、任意の長さであり得、ＤＮＡ及びＲＮＡの任意の混合物を有し得る。例えば、いくつかの場合では、より長いＤＮＡ伸長は、数個のリボヌクレオチドによって中断され得る。あるいは、より長いＲＮＡ伸長は、数個のデオキシリボヌクレオチドによって中断され得る。あるいは、核酸中の１つおきの塩基が、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの間で交互に並んでもよい。ハイブリッド核酸レポーターの主な利点は、純粋なＲＮＡ核酸レポーターと比較して安定性が高いことである。例えば、ハイブリッド核酸レポーターは、純粋なＤＮＡレポーターまたは純粋なＲＮＡレポーターと比較して、溶液中、凍結乾燥、またはガラス化においてより安定であり得る。

レポーターは凍結乾燥またはガラス化することができる。レポーターは、溶液に懸濁され得るか、または表面に固定化され得る。例えば、レポーターは、本明細書中に開示されるような装置のチャンバの表面に固定化され得る。いくつかの場合では、レポーターは、本明細書中に開示されるような装置のチャンバ中で、磁気ビーズなどのビーズに固定化され、それらは、チャンバの下に置かれる磁石によって定位置に保持され得る。

さらに、プログラマブル核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素）のガイド核酸（例えば、ｃｒＲＮＡ）に結合する前に、標的核酸を任意選択に増幅することができる。この増幅は、ＰＣＲ増幅または等温増幅であり得る。試料のこの核酸増幅は、標的ＲＮＡの感受性、特異性、または検出の精度の少なくとも１つを改善することができる。核酸増幅のための試薬は、リコンビナーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質、及びポリメラーゼを含み得る。核酸増幅は、転写増幅（ＴＭＡ）であり得る。核酸増幅は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）または環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）であり得る。さらなる場合では、核酸増幅は鎖置換増幅（ＳＤＡ）である。核酸増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）であり得る。核酸増幅は、ループ介在増幅（ＬＡＭＰ）または指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）の少なくとも１つであり得る。核酸増幅は、いくつかの場合では、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＲＮＡ標的を増幅する簡便な方法（ＳＭＡＲＴ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（ＨＩＰ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、または改良多置換増幅（ＩＭＤＡ）によるものである。核酸増幅は、１分以下、２分以下、３分以下、４分以下、５分以下、６分以下、７分以下、８分以下、９分以下、１０分以下、１１分以下、１２分以下、１３分以下、１４分以下、１５分以下、１６分以下、１７分以下、１８分以下、１９分以下、２０分以下、２５分以下、３０分以下、４０分以下、５０分以下、または６０分以下にわたって行うことができる。核酸増幅反応は、約２０～４５℃の温度で行われる場合がある。核酸増幅反応は、約４５～６５℃の温度で行われる場合がある。核酸増幅反応は、２０℃以下、２５℃以下、３０℃以下、３５℃以下、３７℃以下、４０℃以下、４５℃以下、５０℃以下、５５℃以下、６０℃以下、または６５℃以下の温度で行うことができる。核酸増幅反応は、２０℃以上、２５℃以上、３０℃以上、３５℃以上、３７℃以上、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、または６５℃以上の温度で行うことができる。

シグナルが検出される、本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を反応基質に接触させること、ｃ）反応基質を、切断された基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）反応基質の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素－核酸である。場合によって、基質は酵素基質－核酸である。

プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸及び標的核酸と複合体化した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸と標的核酸との結合後に活性化され得、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を切断し、トランス切断活性を有することができる。トランス切断活性は、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる近くの核酸の非特異的切断、例えば検出部分を有するレポーターのトランス切断であり得る。活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによってレポーターが切断されると、検出部分はレポーターから放出され得、シグナルを生成することができる。シグナルは、支持媒体上の検出スポットから検出することができ、検出スポットは、切断されたレポーターの断片の捕捉プローブを含む。シグナルを可視化して、標的核酸が改変を含むかどうかを評価することができる。

多くの場合、シグナルは比色シグナルまたは目で見えるシグナルである。いくつかの場合では、第１の検出シグナルは、検出部分が検出領域内の捕捉分子に結合することによって生成され、ここで第１の検出シグナルは、試料が標的核酸を含有したことを示す。場合により、システムは、２種類以上の標的核酸を検出することができ、システムは、２種類以上のガイド核酸、及び少なくとも第１の検出シグナル及び第２の検出シグナルを直接的または間接的に生成することができる２種類以上のレポーターを含む。いくつかの場合では、検出可能なシグナルは、切断事象によって直接生成される。代替的にまたは組み合わせて、検出可能なシグナルは、シグナル事象によって間接的に生成される。検出可能なシグナルは、蛍光シグナルではない場合がある。いくつかの場合では、検出可能なシグナルは、比色または色ベースのシグナルである。いくつかの場合では、検出された標的核酸は、支持媒体の検出領域上の検出可能なシグナルのその空間的位置に基づいて同定される。いくつかの場合では、第２の検出可能なシグナルは、第１の生成されたシグナルとは空間的に異なる位置に生成される。

いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出する対象方法の検出の閾値は、１０ｎＭ以下である。「検出の閾値」という用語は、検出を行うために試料中に存在しなければならない標的核酸の最小量を説明するために本明細書で使用される。例えば、検出の閾値が１０ｎＭである場合、標的核酸が試料中に１０ｎＭ以上の濃度で存在する場合にシグナルを検出することができる。いくつかの場合では、検出の閾値は、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５ｎＭ以下、０．００１ｎＭ以下、０．０００５ｎＭ以下、０．０００１ｎＭ以下、０．００００５ｎＭ以下、０．００００１ｎＭ以下、１０ｐＭ以下、１ｐＭ以下、５００ｆＭ以下、２５０ｆＭ以下、１００ｆＭ以下、５０ｆＭ以下、１０ｆＭ以下、５ｆＭ以下、１ｆＭ以下、５００アトモル（ａＭ）以下、１００ａＭ以下、５０ａＭ以下、１０ａＭ以下、または１ａＭ以下である。いくつかの場合では、検出の閾値は、１ａＭ～１ｎＭ、１ａＭ～５００ｐＭ、１ａＭ～２００ｐＭ、１ａＭ～１００ｐＭ、１ａＭ～１０ｐＭ、１ａＭ～１ｐＭ、１ａＭ～５００ｆＭ、１ａＭ～１００ｆＭ、１ａＭ～１ｆＭ、１ａＭ～５００ａＭ、１ａＭ～１００ａＭ、１ａＭ～５０ａＭ、１ａＭ～１０ａＭ、１０ａＭ～１ｎＭ、１０ａＭ～５００ｐＭ、１０ａＭ～２００ｐＭ、１０ａＭ～１００ｐＭ、１０ａＭ～１０ｐＭ、１０ａＭ～１ｐＭ、１０ａＭ～５００ｆＭ、１０ａＭ～１００ｆＭ、１０ａＭ～１ｆＭ、１０ａＭ～５００ａＭ、１０ａＭ～１００ａＭ、１０ａＭ～５０ａＭ、１００ａＭ～１ｎＭ、１００ａＭ～５００ｐＭ、１００ａＭ～２００ｐＭ、１００ａＭ～１００ｐＭ、１００ａＭ～１０ｐＭ、１００ａＭ～１ｐＭ、１００ａＭ～５００ｆＭ、１００ａＭ～１００ｆＭ、１００ａＭ～１ｆＭ、１００ａＭ～５００ａＭ、５００ａＭ～１ｎＭ、５００ａＭ～５００ｐＭ、５００ａＭ～２００ｐＭ、５００ａＭ～１００ｐＭ、５００ａＭ～１０ｐＭ、５００ａＭ～１ｐＭ、５００ａＭ～５００ｆＭ、５００ａＭ～１００ｆＭ、５００ａＭ～１ｆＭ、１ｆＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～５００ｐＭ、１ｆＭ～２００ｐＭ、１ｆＭ～１００ｐＭ、１ｆＭ～１０ｐＭ、１ｆＭ～１ｐＭ、１０ｆＭ～１ｎＭ、１０ｆＭ～５００ｐＭ、１０ｆＭ～２００ｐＭ、１０ｆＭ～１００ｐＭ、１０ｆＭ～１０ｐＭ、１０ｆＭ～１ｐＭ、５００ｆＭ～１ｎＭ、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、検出の閾値は８００ｆＭ～１００ｐＭ、１ｐＭ～１０ｐＭ、１０ｆＭ～５００ｆＭ、１０ｆＭ～５０ｆＭ、５０ｆＭ～１００ｆＭ、１００ｆＭ～２５０ｆＭ、または２５０ｆＭ～５００ｆＭの範囲内である。いくつかの場合では、一本鎖標的核酸が試料中で検出される最小濃度は、１ａＭ～１ｎＭ、１０ａＭ～１ｎＭ、１００ａＭ～１ｎＭ、５００ａＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～１ｎＭ、１ｆＭ～５００ｐＭ、１ｆＭ～２００ｐＭ、１ｆＭ～１００ｐＭ、１ｆＭ～１０ｐＭ、１ｆＭ～１ｐＭ、１０ｆＭ～１ｎＭ、１０ｆＭ～５００ｐＭ、１０ｆＭ～２００ｐＭ、１０ｆＭ～１００ｐＭ、１０ｆＭ～１０ｐＭ、１０ｆＭ～１ｐＭ、５００ｆＭ～１ｎＭ、５００ｆＭ～５００ｐＭ、５００ｆＭ～２００ｐＭ、５００ｆＭ～１００ｐＭ、５００ｆＭ～１０ｐＭ、５００ｆＭ～１ｐＭ、８００ｆＭ～１ｎＭ、８００ｆＭ～５００ｐＭ、８００ｆＭ～２００ｐＭ、８００ｆＭ～１００ｐＭ、８００ｆＭ～１０ｐＭ、８００ｆＭ～１ｐＭ、１ｐＭ～１ｎＭ、１ｐＭ～５００ｐＭ、１ｐＭ～２００ｐＭ、１ｐＭ～１００ｐＭ、または１ｐＭ～１０ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、１ａＭ～１００ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、１ｆＭ～１００ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、１０ｆＭ～１００ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、８００ｆＭ～１００ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、試料中の一本鎖標的核酸を検出することができる最小濃度は、１ｐＭ～１０ｐＭの範囲内である。いくつかの場合では、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、複数の非標的核酸などの複数の核酸を含む試料中の標的一本鎖核酸を検出し、標的一本鎖核酸は、１ａＭ、１０ａＭ、１００ａＭ、５００ａＭ、１ｆＭ、１０ｆＭ、５００ｆＭ、８００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、または１ｐＭという低い濃度で存在する。

いくつかの場合では、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試料中の標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料を、トランス切断が起こるかまたは切断反応が完了に達するのに十分な所定の時間にわたって試薬と接触させる。いくつかの場合では、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試料中の標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料を、試薬と６０分以下の間接触させる。場合により、試料を試薬と１２０分以下、１１０分以下、１００分以下、９０分以下、８０分以下、７０分以下、６０分以下、５５分以下、５０分以下、４５分以下、４０分以下、３５分以下、３０分以下、２５分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、または１分以下の間接触させる。場合により、試料を試薬と少なくとも１２０分間、少なくとも１１０分間、少なくとも１００分間、少なくとも９０分間、少なくとも８０分間、少なくとも７０分間、少なくとも６０分間、少なくとも５５分間、少なくとも５０分間、少なくとも４５分間、少なくとも４０分間、少なくとも３５分間、少なくとも３０分間、少なくとも２５分間、少なくとも２０分間、少なくとも１５分間、少なくとも１０分間、または少なくとも５分間接触させる。いくつかの場合では、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、５０分未満、４５分未満、４０分未満、３５分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満、９分未満、８分未満、７分未満、６分未満または５分未満で試料中の標的核酸を検出することができる。

ガイド核酸が標的核酸に結合すると、プログラマブルヌクレアーゼのトランス切断活性を開始することができ、レポーターを切断して検出可能なシグナル（例えば、蛍光）の検出をもたらすことができる。本明細書に記載されるいくつかの方法の試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びレポーターの集団（例えば、タンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸）の少なくとも一部のレポーターの切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み得、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。非限定的な例として、光学（例えば、蛍光、比色など）であるシグナルの変化によって測定すると、プログラマブルヌクレアーゼを使用したレポーターの切断は、少なくとも約５０％の効率で切断することができる。本明細書に記載のいくつかの方法は、試料中の標的核酸を検出する方法であり得、標的核酸を含む試料を、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸と、ガイド核酸及び標的核酸セグメントと複合体を形成したときに活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼと、検出部分を含む一本鎖レポーターとに接触させること、及び支持媒体上の第１の検出可能なシグナルを測定することを含み、ここでレポーターは、活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによって切断され得、それによって第１の検出可能なシグナルを生成し、色の変化によって測定されるように、切断するプログラマブルヌクレアーゼを使用して一本鎖レポーターを切断する。プログラマブルヌクレアーゼを使用した一本鎖レポーターの切断は、本明細書に記載の検出領域またはスポットの色の変化によって測定した場合、少なくとも約５０％の効率で切断することができる。いくつかの場合では、切断効率は、色の変化によって測定された場合、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％である。色の変化は、検出可能な比色シグナルまたは目で認識できるシグナルであってもよい。色の変化は、第１の検出可能なシグナルとして測定することができる。第１の検出可能なシグナルは、標的核酸を含む試料の、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸と、ガイド核酸及び標的核酸セグメントと複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼと、検出部分を含み、レポーターが活性化されたヌクレアーゼによって切断され得る一本鎖レポーターとの接触の５分以内に検出可能になり得る。第１の検出可能なシグナルは、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸を、標的核酸を含む試料と接触させてから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、または１２０分以内に検出可能であり得る。

いくつかの場合では、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試料中のプログラマブルヌクレアーゼ及び一本鎖レポーターで標的一本鎖核酸を検出し、試料は、一本鎖レポーターのトランス切断に十分な所定の時間にわたって試薬と接触される。例えば、プログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を検出するＬｂｕＣａｓ１３ａであり、一本鎖レポーターは、切断により検出される緑色の検出可能部分を有する２つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む。別の例として、プログラマブルヌクレアーゼは、標的核酸を検出するＬｂａＣａｓ１３ａであり、一本鎖レポーターは、切断により検出される赤色の検出可能部分を有する２つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む。

いくつかの場合では、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試料中の２つの異なるプログラマブルヌクレアーゼ及び２つの異なる一本鎖レポーターで２つの異なる標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料は、少なくとも２つの一本鎖レポーターのトランス切断に十分な所定の時間にわたって試薬と接触される。例えば、第１のプログラマブルヌクレアーゼは、第１の一本鎖標的核酸によって活性化され、活性化時に、切断により検出される緑色の検出可能な部分を有する２つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む第１の一本鎖レポーターを切断するＬｂｕＣａｓ１３ａであり、第２のプログラマブルヌクレアーゼは、第２の一本鎖標的核酸によって活性化され、活性化時に、切断により検出される赤色の検出可能な部分を有する２つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む第２の一本鎖レポーターを切断するＬｂａＣａｓ１３ａである。いくつかの場合では、それぞれの一本鎖核酸を切断するための両方のプログラマブルヌクレアーゼ、例えば、切断により検出される緑色の検出可能部分を有する２つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む第１の一本鎖レポーターを切断するためのＬｂｕＣａｓ１３ａ、及び切断により検出される赤色の検出可能部分を有する２つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む第２の一本鎖レポーターを切断するためのＬｂａＣａｓ１３ａの活性化、それに続く黄色シグナルの検出は、第１の一本鎖標的核酸及び第２の一本鎖標的核酸が両方試料中に存在することを示す。

あるいは、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試料中の第１の一本鎖標的核酸の存在を検出する第１のプログラマブルヌクレアーゼ、及び対照として使用される第２のプログラマブルヌクレアーゼを含むことができる。例えば、第１のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される緑色の検出可能部分を有する２つの隣接するウラシルヌクレオチドを含む第１の一本鎖レポーターを切断し、試料中に存在する場合、第１の一本標的鎖核酸によって活性化されるＬｂｕＣａｓ１３ａであり、第２のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される赤色の検出可能部分を有する２つの隣接するアデニンヌクレオチドを含む第２の一本鎖レポーターを切断し、試料中に見られない（かつ、決して見られるとは予想されない）第２の一本鎖標的核酸によって活性化され、対照として役立つＬｂａＣａｓ１３ａである。この場合では、赤色シグナルまたは黄色シグナルの検出は、試験に問題がある（例えば、試料に含有される高レベルの他のＲＮＡｓｅが、第２のプログラマブルヌクレアーゼの活性化なしで一本鎖レポーターを切断している）ことを示すが、緑色シグナルの検出は、試験が正しく作用しており、第１のプログラマブルヌクレアーゼの第１の標的一本鎖核酸が試料中に存在することを単独で示す。

さらなる例として、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試料中の少なくとも２つの異なるプログラマブルヌクレアーゼ及び少なくとも２つの異なる一本鎖レポーターで少なくとも２つの異なる標的一本鎖核酸を検出し、そこで試料は、少なくとも２つの一本鎖ディテクター核酸のトランス切断に十分な所定の時間にわたって試薬と接触される。例えば、第１のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される第１の一本鎖ディテクター核酸を切断し、試料中に存在する場合には敗血症ＲＮＡバイオマーカーからの第１の一本鎖標的核酸によって活性化されるＣａｓ１３ａタンパク質であり、第２のプログラマブルヌクレアーゼは、切断により検出される第２の一本鎖レポーターを切断し、第２の一本鎖標的核酸によって活性化されるＣａｓ１４タンパク質である。

本明細書中に記載される試薬はまた、本明細書中に開示される合理化されたラテラルフロー装置及び方法と適合性である緩衝液を含むことができる。これらの緩衝液は、ウイルスによって引き起こされるものを含む、疾患などの病気の検出のための、本明細書に記載の他の試薬、試料及び支持媒体と適合性である。本明細書中に記載される方法はまた、本明細書中に開示される方法と適合性である緩衝液の使用を含むことができる。適合性のある緩衝液及び緩衝液の成分には、ＨＥＰＥＳ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、グリセロール、ＩｇｅｐａｌＣａ－６３０、ＢＳＡ、及びイミダゾールが含まれ得る。

多くの検出装置及び方法は、本明細書に開示される方法と一致する。例えば、任意の装置は、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電シグナルを測定または検出することができる。多くの場合、熱量測定シグナルは、レポーターの切断後に生成される熱である。場合により、熱量測定シグナルは、レポーターの切断後に吸収される熱である。電位差測定シグナルは、例えば、レポーターの切断後に生成される電位である。電流測定シグナルは、レポーターの切断後に生成される電子の動きであり得る。多くの場合、シグナルは、比色シグナルまたは蛍光シグナルなどの光学シグナルである。光学シグナルは、例えば、レポーターの切断後に生成される光出力である。場合により、光学シグナルは、レポーターの切断の前と後での吸光度の変化である。多くの場合、圧電シグナルは、レポーターの切断の前と後での質量の変化である。場合により、レポーターはタンパク質－核酸である。多くの場合、タンパク質－核酸は酵素－核酸である。

完了したアッセイからの検出領域からの結果は、様々な方法で、例えば血糖値測定器によって検出及び分析することができる。いくつかの場合では、陽性対照スポット及び検出領域内の検出スポットが目に見え、ユーザは結果を読み取ることができる。いくつかの場合では、陽性対照スポット及び検出領域内の検出スポットは、シグナルの種類に応じて画像化装置または他の装置によって視覚化される。多くの場合、画像化装置は、移動式装置上のデジタルカメラなどのデジタルカメラである。移動式装置は、支持媒体の画像を取り込み、実行されているアッセイを識別し、検出領域及び検出スポットを検出し、検出スポットの画像特性を提供し、検出スポットの画像特性を分析し、及び／または結果を提供することができるソフトウェアプログラムまたは移動式アプリケーションを有することができる。代替的に、または組み合わせて、画像化装置は、蛍光、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、または可視波長シグナルを捕捉することができる。画像化装置は、励起源を有して励起エネルギーを供給し、放出されたシグナルを捕捉することができる。いくつかの場合では、励起源は、カメラフラッシュであってよく、任意でフィルターであってもよい。いくつかの場合では、画像化装置を、暗室を作製するために装置の支持媒体上に配置された画像化ボックスと共に使用して、画像化を改善する。画像化ボックスは、画像化前に画像化装置を嵌め込むことができる段ボール箱であってもよい。いくつかの場合では、画像化ボックスは、より集束された励起シグナルの生成を助けるために、またはより集束された放出シグナルを捕捉するために、光学レンズ、ミラー、フィルター、または他の光学素子を有する。多くの場合、画像化ボックス及び画像化装置は、遠隔または低リソース設定でのアッセイの輸送及び使用を容易にするために、小型で、低プロファイルで、手持ち式で、及び／または携帯可能である。

本明細書に記載のアッセイは、移動式アプリケーション（アプリ）またはソフトウェアプログラムによって視覚化及び分析することができる。アプリまたはプログラムのグラフィックユーザインターフェース（ＧＵＩ）を使用して、移動式装置上のカメラを使用して、検出領域、バーコード、基準カラースケール、及び／またはハウジングの基準マーカーを含む支持媒体の画像を個人で撮ることができる。プログラムまたはアプリは、試験種類のバーコードまたは識別可能な標識を読み取り、基準マーカーを配置して試料を配向させ、検出可能なシグナルを読み取り、基準カラーグリッドと比較し、疾患または状況または状態の原因となる遺伝子、ウイルスまたは作用因子の存在を示す標的核酸の有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個人に提示することができる。移動式アプリケーションは、試験結果を移動式アプリケーションに格納することができる。移動式アプリケーションは、遠隔装置と通信し、試験結果のデータを転送することができる。試験結果は、ヘルスケア専門家を含む別の個人によって遠隔装置から遠隔で見ることができる。遠隔ユーザは、結果にアクセスし、情報を使用して、治療、介入、環境の浄化のための措置を推奨することができる。

試料
多くの試料は、本明細書に開示された合理化されたラテラルフロー装置及び方法と一致している。これらの試料は、例えば、試料内の標的核酸を検出するための、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致し、合理化されたラテラルフロー装置は、試料調製領域、試料内の標的核酸の増幅のための任意選択の増幅領域、試料をプログラマブルヌクレアーゼと混合するための領域、及びプログラマブルヌクレアーゼによるレポーターの切断から生じる検出可能なシグナルのアッセイのための検出領域を、合理化されたラテラルフロー装置自体の内部に含み得る。これらの試料は、疾患、病原体、またはウイルスなどの状態または種の検出のための標的核酸を含むことができる。一般に、個体、動物、または環境試料由来の試料を取得して、状態、疾患、ウイルス、病原体、または関心対象のいずれかの変異の存在を確かめられる。個体からの生物学的試料は、血液、血清、血漿、唾液、尿、粘膜試料、腹膜試料、脳脊髄液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽頭滲出液、尿道または膣分泌物、滲出液、浸出液、または組織であり得る。組織試料は、本開示の検出システムに適用する前に分離または液化することができる。環境からの試料は、土壌、空気、または水からのものであり得る。いくつかの例では、環境試料は、関心対象の表面または環境からスワブとして採取されるか、または関心対象の表面から直接採取される。いくつかの例では、未処理の試料を検出システムに適用する。いくつかの例では、試料を、ａ）緩衝液もしくは流体で希釈するか、または検出システムに適用する前に濃縮するか、またはｂ）変更なしに（すなわち、「ニート」に）適用する。場合によっては、試料は２０ｕＬ以下で含まれる。いくつかの場合では、試料は、１ｕＬ以下、５ｕＬ以下、１０ｕＬ以下、１５ｕＬ以下、２０ｕＬ以下、２５ｕＬ以下、３０ｕＬ以下、３５ｕＬ以下、４０ｕＬ以下、４５ｕＬ以下、５０ｕＬ以下、５５ｕＬ以下、６０ｕＬ以下、６５ｕＬ以下、７０ｕＬ以下、７５ｕＬ以下、８０ｕＬ以下、９０ｕＬ以下、１００ｕＬ以下、２００ｕＬ以下、３００ｕＬ以下、４００ｕＬ以下、５００ｕＬ以下、または１ｕＬ～５００ｕＬ、または１ｕＬ～５００ｕＬの任意の値で囲まれた範囲の値のいずれかが含まれる。場合によっては、試料は５００ｕＬ超で含まれる。

いくつかの例では、試料は、単細胞真核生物、植物または植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、動物の細胞、組織、または器官、無脊椎動物由来の細胞、組織または器官、脊椎動物、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、及び哺乳類の細胞、組織、体液、または器官、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、ネコ、ウシ、ヒツジ及びヤギなどの哺乳類由来の細胞、組織、体液または器官から採取される。いくつかの例では、試料は、線虫、原虫、蠕虫またはマラリア寄生虫から採取される。いくつかの場合では、試料は、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、原核細胞または植物細胞からの細胞溶解物由来の核酸を含む。いくつかの場合では、試料は、細胞から発現された核酸を含む。

試料は、本明細書に記載される試薬のガイド核酸に結合することができる少なくとも１つの標的配列を含み得る。いくつかの場合では、標的配列は核酸の一部である。核酸の一部は、ゲノム遺伝子座、転写ｍＲＮＡ、または逆転写ｃＤＮＡに由来し得る。核酸の一部は、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、５～６０、５～５０、５～４０、５～３０、５～２５、５～２０、５～１５、または５～１０ヌクレオチド長であり得る。核酸の一部は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長であり得る。標的配列は、ガイド核酸と逆相補的であり得る。

いくつかの場合では、標的配列は、疾患または状態の原因となる、試料中のウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、性感染症または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、上気道感染症、下気道感染症、または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列は、試料中の、院内感染症または接触感染性疾患由来の核酸の一部である。いくつかの場合では、標的配列はｓｓＲＮＡである。これらの標的配列は、疾患に由来し得、疾患には、これらに限定されないがインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）またはインフルエンザＢウイルス（ＩＢＶ）を含むインフルエンザウイルス、ライノウイルス、風邪ウイルス、呼吸器ウイルス、上気道ウイルス、下気道ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、または呼吸器合胞体ウイルスが含まれ得る。病原体には、ウイルス、真菌、蠕虫、原虫、及び寄生虫が含まれる。病原性ウイルスには、インフルエンザウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。病原体としては、例えば、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘモフィルス・インフルエンザＢ、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｉｎｔｅｒｍｄｉｕｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。多くの場合、標的核酸は、試料中で発見され得る、疾患の原因となるウイルスまたは細菌または他の作用因子に由来する配列を含む。病原性ウイルスには、これらに限定されないがインフルエンザウイルス、ＲＳＶ、コロナウイルス、ｓｓＲＮＡウイルス、呼吸器ウイルス、上気道ウイルス、下気道ウイルス、またはライノウイルスが含まれる。病原体としては、例えば、結核菌、ストレプトコッカス・アガラクティエ、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿レンサ球菌、ヘモフィルス・インフルエンザＢインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、または結核菌が挙げられる。

場合によっては、標的核酸は、がん（例えば、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、または他のがん）または任意の他の疾患の存在を示し得る。いくつかの局面において、標的核酸は、関心対象の特定の表現型（例えば、目または髪の色）を示し得る。いくつかの局面において、標的核酸は、筋ジストロフィーなどのいずれかの遺伝性の障害または疾患を示し得る。いくつかの局面において、本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、ユーザが関心対象の標的についてヘテロ接合対立遺伝子とホモ接合対立遺伝子とを区別することを可能にする試薬を含み得る。いくつかの局面において、本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、複雑な試料（例えば、細胞溶解物、腫瘍生検）から関心対象の標的核酸を検出することができる。いくつかの局面において、本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、精製された試料から得る関心対象の標的核酸を検出することができる。

試料は、疾患の状態を識別するために使用することができる。例えば、試料は、本明細書に記載の任意の試料であり、対象の疾患の状態を特定する際に使用するために対象から得られる。場合によっては、方法は、対象から血清試料を得ること、及び対象の疾患の状態または状況を特定することを含む。場合によっては、方法は、対象から鼻スワブを採取すること、及び対象の疾患の状態または状況を特定することを含む。

いくつかの例では、標的核酸は一本鎖核酸である。代替え的にまたは組み合わせて、標的核酸は二本鎖核酸であり、試薬との接触前または接触の際に一本鎖核酸に調製される。標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、合成核酸、または生物学的試料もしくは環境試料に見られる核酸であり得る。標的核酸には、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合では、標的核酸はｍＲＮＡである。いくつかの場合では、標的核酸は、本明細書に記載のウイルス、寄生虫、または細菌に由来する。いくつかの場合では、標的核酸は、本明細書に記載の遺伝子から転写される。

いくつかの標的核酸は、本明細書に開示される方法及び組成物と一致する。本明細書に記載されるいくつかの方法は、標的核酸集団として様々な濃度または量で試料中に存在する標的核酸を検出することができる。いくつかの場合では、試料は少なくとも２つの標的核酸を有する。いくつかの場合では、試料は、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、または少なくとも１００００個の標的核酸のコピーを有する。いくつかの場合では、方法は、１０^１個の非標的核酸、１０^２個の非標的核酸、１０^３個の非標的核酸、１０^４個の非標的核酸、１０^５個の非標的核酸、１０^６個の非標的核酸、１０^７個の非標的核酸、１０^８個の非標的核酸、１０^９個の非標的核酸、または１０^１０個の非標的核酸あたり少なくとも１つのコピーで存在する標的核酸を検出する。

いくつかの標的核酸集団は、本明細書に開示される方法及び組成物と一致する。本明細書に記載されるいくつかの方法は、様々な濃度または量で試料中に存在する２つ以上の標的核酸集団を検出することができる。いくつかの場合では、試料は少なくとも２つの標的核酸集団を有する。いくつかの場合では、試料は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０個の標的核酸集団を有する。いくつかの場合では、方法は、１０^１個の非標的核酸、１０^２個の非標的核酸、１０^３個の非標的核酸、１０^４個の非標的核酸、１０^５個の非標的核酸、１０^６個の非標的核酸、１０^７個の非標的核酸、１０^８個の非標的核酸、１０^９個の非標的核酸、または１０^１０個の非標的核酸あたり少なくとも１つのコピーで存在する標的核酸集団を検出する。標的核酸集団は、試料中に異なる濃度または量で存在し得る。

上に開示された試料のいずれも、本明細書中に開示されるシステム、アッセイ、及びプログラマブルヌクレアーゼに一致し、本明細書中に開示される疾患のいずれかのコンパニオン診断薬として使用することができ、または、試薬キット、ポイントオブケア診断、もしくは処方箋なしの診断において使用することができる。

応用
Ａ．標的核酸における突然変異の検出
標的核酸中の突然変異の検出に使用することができる、本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。シグナルの検出は、標的核酸の存在を示すことができる。標的核酸は、突然変異を含む場合がある。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を基質に接触させること、ｃ）基質を、切断された基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）基質の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素－核酸で、試薬は酵素基質である。場合によって、基質は酵素基質－核酸で、試薬は酵素である。

本明細書に記載の方法を使用して、標的核酸中の突然変異を同定することができる。本方法を使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼす標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異を同定することができる。遺伝子の発現に影響を及ぼす突然変異は、遺伝子内の標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異、遺伝子の発現に関連するＲＮＡを含む標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異、または遺伝子の発現の調節に関連する核酸、例えば遺伝子のＲＮＡもしくはプロモーター、エンハンサーもしくはリプレッサーの単一ヌクレオチド突然変異を含む標的核酸であり得る。多くの場合、突然変異の状態を使用して、標的核酸の突然変異に関連する疾患を診断または特定する。突然変異を有する標的核酸の検出は、臨床、診断など多くの分野で、研究ツールとして実験室において、及び農業用途に適用可能である。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。突然変異は、ウイルスの変異株をもたらし得る。

Ｂ．疾患の検出
疾患の検出に使用することができる、本明細書に記載の標的核酸をアッセイする方法が本明細書に開示される。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。シグナルの検出は、標的核酸の存在を示すことができる。標的核酸は、突然変異を含む場合がある。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を基質に接触させること、ｃ）基質を、切断された基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）基質の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素－核酸である。場合によって、基質は酵素基質－核酸である。

本明細書に記載の方法を使用して、細菌、ウイルス、または微生物由来の標的核酸中の突然変異を同定することができる。本方法を使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼす標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異を同定することができる。遺伝子の発現に影響を及ぼす突然変異は、遺伝子内の標的核酸の突然変異、遺伝子の発現に関連するＲＮＡを含む標的核酸の突然変異、または遺伝子の発現の調節に関連する核酸、例えば遺伝子のＲＮＡもしくはプロモーター、エンハンサーもしくはリプレッサーの突然変異を含む標的核酸であり得る。場合により、標的核酸突然変異の状態を使用して、細菌、ウイルスもしくは微生物の病原性、または抗生物質治療に対する耐性などの治療耐性を決定する。多くの場合、突然変異の状態を使用して、細菌、ウイルスもしくは微生物における標的核酸の突然変異に関連する疾患を診断または特定する。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。

Ｃ．研究ツール、ポイントオブケア、または処方箋なしとしての検出
本明細書に開示されるのは、研究ツールとして使用することができ、試薬キットとして提供することができる、本明細書に記載の標的核酸（例えば、インフルエンザウイルス由来）をアッセイする方法である。例えば、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。シグナルの検出は、標的核酸の存在を示すことができる。標的核酸は、突然変異を含む場合がある。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする方法は、例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を基質に接触させること、ｃ）基質を、切断された基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）基質の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素－核酸である。場合によって、基質は酵素基質－核酸である。

本明細書に記載の方法を使用して、標的核酸中の単一ヌクレオチド突然変異を同定することができる。本方法を使用して、遺伝子の発現に影響を及ぼす標的核酸の突然変異を同定することができる。遺伝子の発現に影響を及ぼす突然変異は、遺伝子内の標的核酸の単一ヌクレオチド突然変異、遺伝子の発現に関連するＲＮＡを含む標的核酸の突然変異、または遺伝子の発現の調節に関連する核酸、例えば遺伝子のＲＮＡもしくはプロモーター、エンハンサーもしくはリプレッサーの突然変異を含む標的核酸であり得る。多くの場合、突然変異は単一ヌクレオチド突然変異である。

試薬キットまたは研究ツールを使用して、本明細書に開示される任意の数の標的核酸、突然変異、または他の指標を実験室環境において検出することができる。試薬キットは、開放ボックス計装用の試薬パックとして提供することができる。

他の実施形態では、システム、アッセイフォーマット、Ｃａｓレポーター、プログラマブルヌクレアーゼ、または他の試薬のいずれかを、病院、医院の研究室（ＰＯＬ）、またはクリニックなどの分散化した場所で実施され得るポイントオブケア（ＰＯＣ）検査で使用することができる。これらのポイントオブケア検査を使用して、本明細書に開示される適応症のいずれかを診断することができ、または使用して標的核酸（例えば、ＥＧＦＲ）における特定の突然変異の有無を測定することができる。ＰＯＣ検査は、消耗可能な試験カードを含む小型機器として提供することができ、検査カードは、本明細書に開示されるアッセイフォマード（例えば、ラテラルフローアッセイ）のいずれかである。

さらに他の実施形態では、システム、アッセイフォマード、Ｃａｓレポーター、プログラマブルヌクレアーゼ、または他の試薬のいずれかを処方箋なし（ＯＴＣ）で、遠隔地または家庭で使用することができるリーダレスフォーマットで使用して、一連の適応症を診断することができる。ＯＴＣ製品は、消耗可能な試験カードを含むことができ、検査カードは、本明細書に開示されるアッセイフォマード（例えば、ラテラルフローアッセイ）のいずれかである。ＯＴＣ製品では、試験カードは、視覚的にまたは携帯電話を使用して解釈することができる。

Ｄ．標的増幅及び検出
本明細書に開示されるラテラルフロー装置は、増幅のための装置及び試薬の領域を任意に含むことができる。しかし、増幅のための領域または試薬を含まない当該ラテラルフロー装置のバリエーションもまた、本開示と一致する。多くの標的増幅及び検出の方法は、本明細書に開示される方法、組成物、試薬、酵素及びキットと一致する。本明細書に記載されるように、標的核酸は、ＤＮＡ活性化プログラマブルＲＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３）、ＤＮＡ活性化プログラマブルＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２）、またはＲＮＡ活性化プログラマブルＲＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１３）及び本明細書に開示される他の試薬（例えば、ＲＮＡ成分）を使用して検出され得る。標的核酸は、本明細書中に記載されるように、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）を使用して検出され得る。標的核酸は、ＲＮＡ、逆転写ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡアンプリコン、増幅ＤＮＡ、合成核酸、または生物学的試料もしくは環境試料に見られる核酸であり得る。いくつかの場合では、標的核酸は、検出前または検出と同時に増幅される。いくつかの場合では、標的核酸は、増幅前に逆転写される。標的核酸は、標的核酸の配列のループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）によって増幅され得る。いくつかの場合では、核酸は、逆転写と組み合わせたＬＡＭＰ（ＲＴ－ＬＡＭＰ）を使用して増幅される。ＬＡＭＰ増幅は独立して（例えば、オフデバイス、または装置の別のチャンバまたは領域内で）実行されてもよく、またはＬＡＭＰ増幅は、標的核酸の検出のためにＤＥＴＥＣＴＲ（商標）と組み合わされてもよい。ＲＴ－ＬＡＭＰ増幅は独立して実行されてもよく、またはＲＴ－ＬＡＭＰ増幅は、標的核酸の検出のためにＤＥＴＥＣＴＲ（商標）と組み合わされてもよい。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、本明細書中に開示される方法と一致する任意の方法を使用して行われてもよい。

（ａ）増幅及び検出反応混合物
いくつかの実施形態では、ＬＡＭＰ増幅反応は、複数のプライマー、ｄＮＴＰ、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。ＬＡＭＰは、等温条件下で高い特異性でＤＮＡを増幅するために使用され得る。ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡであり得る。いくつかの場合では、ＲＮＡを含む標的核酸は、ＬＡＭＰ増幅の前に逆転写酵素を使用してＤＮＡに逆転写され得る。逆転写反応は、プライマー、ｄＮＴＰ、及び逆転写酵素を含み得る。いくつかの場合では、逆転写反応及びＬＡＭＰ増幅反応を同じ反応で行ってもよい。組み合わせＲＴ－ＬＡＭＰ反応は、ＬＡＭＰプライマー、逆転写プライマー、ｄＮＴＰ、逆転写酵素、及びＤＮＡポリメラーゼを含み得る。いくつかの場合では、ＬＡＭＰプライマーは逆転写プライマーを含み得る。

標的核酸配列を検出するためのＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸、及びプログラマブルヌクレアーゼを含み得る。プログラマブルヌクレアーゼは、活性化されると、本明細書の他の箇所に記載されるように、レポーター（例えば、プログラマブルヌクレアーゼによって核酸が切断されると検出可能になる部分を含む核酸）の配列非依存性切断を示す。プログラマブルヌクレアーゼは、ガイド核酸が標的核酸にハイブリダイズすると活性化される。組み合わせＬＡＭＰＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、複数のプライマー、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、及び基質核酸を含み得る。組み合わせＲＴ－ＬＡＭＰＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、ＬＡＭＰプライマー、逆転写プライマー、ｄＮＴＰ、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、及び基質核酸を含み得る。いくつかの場合では、ＬＡＭＰプライマーは逆転写プライマーを含み得る。ＬＡＭＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）は、同じ試料または反応体積で実施することができる。ＬＡＭＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）は、別個の試料または反応体積または同じ試料体積で、同時に実施することができる。ＲＴ－ＬＡＭＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）は、同じ試料または反応体積で実施することができる。ＲＴ－ＬＡＭＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）は、別個の試料または反応体積または同じ試料体積で、同時に実施することができる。

（ｂ）一塩基多型対立遺伝子の増幅と検出
ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、試料中の特定の一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子の存在を検出することができる。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、本明細書の他の箇所に記載されるように、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸の存在を示す、検出可能なシグナルを生成し得る。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、標的核酸の非存在下、または特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含まないかもしくは異なるＳＮＰ対立遺伝子を含む核酸配列の存在下では、シグナルを生成し得ない。いくつかの場合では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸配列の一部に逆相補的なガイドＲＮＡを含み得る。ガイドＲＮＡ、及び特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸は、プログラマブルヌクレアーゼに結合してそれを活性化し、それによって本明細書の他の箇所に記載されるような検出可能なシグナルを生成し得る。ガイドＲＮＡ、及び特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含まない核酸配列は、プログラマブルヌクレアーゼに結合またはそれを活性化せず、検出可能なシグナルを生成し得ない。いくつかの場合では、特定のＳＮＰ対立遺伝子を含み得るまたは含み得ない標的核酸配列は、例えばＬＡＭＰ増幅反応を使用して増幅され得る。いくつかの場合では、ＬＡＭＰ増幅反応は、逆転写反応、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応、またはその両方と組み合わせてもよい。例えば、ＬＡＭＰ反応は、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応、ＬＡＭＰＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応、またはＲＴ－ＬＡＭＰＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応であってもよい。

ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、本明細書の他の箇所に記載されるように、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸配列の存在下で特異的に検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、ＳＮＰの位置にＧ核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能なシグナルを生成し得るが、ＳＮＰの位置にＣ、Ｔ、またはＡ核酸を含む核酸の存在下では生成し得ない。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、ＳＮＰの位置にＴ核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能なシグナルを生成し得るが、ＳＮＰの位置にＧ、Ｃ、またはＡ核酸を含む核酸の存在下では生成し得ない。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、ＳＮＰの位置にＣ核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能なシグナルを生成し得るが、ＳＮＰの位置にＧ、Ｔ、またはＡを含む核酸の存在下では生成し得ない。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、ＳＮＰの位置にＡ核酸を含む標的核酸の存在下で検出可能なシグナルを生成し得るが、ＳＮＰの位置にＧ、Ｔ、またはＣ核酸を含む核酸の存在下では生成し得ない。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応に加えて、ＳＮＰを有する標的核酸は、同時に、連続して、同時に一緒に試料中に存在するか、または試料中で連続して一緒に、ＬＡＭＰまたはＲＴ－ＬＡＭＰと一緒に実行され得る。例えば、反応は、ＬＡＭＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応、またはＲＴ－ＬＡＭＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を含み得る。ＬＡＭＰ反応と組み合わせてＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を行うと、ＬＡＭＰ反応なしでのＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応と比較して、検出可能なシグナルの増加をもたらし得る。

いくつかの場合では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応で生成される検出可能なシグナルは、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸の存在下では、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含まない核酸の存在下よりも高くなり得る。いくつかの場合では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸の存在下で、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含まない核酸の存在下よりも、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも４０００倍、少なくとも５０００倍、少なくとも６０００倍、少なくとも７０００倍、少なくとも８０００倍、少なくとも９０００倍、少なくとも１万倍、少なくとも５万倍、少なくとも１０万倍、少なくとも５０万倍、または少なくとも１００万倍大きい検出可能なシグナルを生成し得る。いくつかの場合では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含む標的核酸の存在下で、特異的ＳＮＰ対立遺伝子を含まない核酸の存在下よりも１倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、４倍～５倍、５倍～１０倍、１０倍～２０倍、２０倍～３０倍、３０倍～４０倍、４０倍～５０倍、５０倍～１００倍、１００倍～５００倍、５００倍～１０００倍、１０００倍～１万倍、１万倍～１０万倍または１０万倍～１００万倍大きい検出可能なシグナルを生成し得る。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、核酸試料中の疾患または状態に関連するＳＮＰ対立遺伝子の存在を検出することができる。

ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、核酸試料中の疾患または状態に関連するＳＮＰ対立遺伝子の存在を検出することができる。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、核酸試料中の疾患または状態を発症する可能性増加に関連するＳＮＰ対立遺伝子の存在を検出することができる。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、核酸試料中の表現型に関連するＳＮＰ対立遺伝子の存在を検出することができる。例えば、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、白化症、ハンチントン病、筋緊張性ジストロフィー１型、高コレステロール血症、神経線維腫症、多発性嚢胞腎、血友病、筋ジストロフィー、低リン血症性くる病、レット症候群または精子形成不全などの疾患に関連するＳＮＰ対立遺伝子を検出することができる。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、がん、例えば、膀胱がん、脳がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、胆嚢がん、胃がん、白血病、肝臓がん、肺がん、口腔がん、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、精巣がん、甲状腺がん、神経芽細胞腫、またはリンパ腫のリスク増加に関連するＳＮＰ対立遺伝子を検出することができる。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、アミロイドーシス、ヘテロクロマトーシス（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、セリアック病、黄斑変性または高コレステロール血症のリスク増加に関連するＳＮＰ対立遺伝子を検出することができる。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応を使用して、表現型、例えば、目の色、髪の色、身長、皮膚の色、人種、アルコールフラッシング反応、カフェイン消費、深い睡眠、遺伝的体重、乳糖不耐性、筋肉組成、飽和脂肪及び体重、または睡眠運動に関連するＳＮＰ対立遺伝子を検出することができる。

その他の装置の特徴
Ａ．支持媒体
多くの支持媒体は、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置、及び方法と一致する。これらの支持媒体は、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致し、合理化されたラテラルフロー装置は、合理化されたラテラルフロー装置自体内部での試料調製、試料内の標的核酸の任意の増幅、プログラマブルヌクレアーゼとの混合、及びプログラマブルヌクレアーゼによるレポーターの切断から生じる検出可能なシグナルの検出のために、１つ以上の領域を含み得る。これらの支持媒体は、ウイルス感染症からの感染症などの疾患または状態の検出のための本明細書に記載の試料、試薬及び合理化されたラテラルフロー装置と適合性である。本明細書に記載の支持媒体は、試薬と試料との間の相互作用からの結果を提示する方法を提供することができる。支持媒体は、検出可能なシグナルを提示するための媒体を検出可能な形式で提供する。任意で、支持媒体は、検出可能なシグナルを検出領域内の検出スポットに集中させて、アッセイの感受性、特異性または精度を高める。支持媒体は、アッセイの結果を提示し、標的核酸によって標的にされた関心対象の疾患の有無を示すことができる。支持媒体上の結果は、目で、または機械を使用して読み取ることができる。支持媒体は、支持媒体の表面上の切断されたディテクター分子によって生成された検出可能なシグナルを安定化させるのに役立つ。いくつかの例では、支持媒体は、ラテラルフローアッセイストリップである。いくつかの例では、支持媒体はＰＣＲプレートである。ＰＣＲプレートは、９６ウェルまたは３８４ウェルを有することができる。ＰＣＲプレートは、９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのサブセット数のウェルを有することができる。９６ウェルＰＣＲプレートのウェルのサブセット数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５ウェルである。例えば、ＰＣＲサブセットプレートは４ウェルを有することができ、ウェルは９６ウェルＰＣＲプレートからのウェルのサイズである（例えば、ウェルが９６ウェルＰＣＲプレートからのウェルのサイズである、４ウェルＰＣＲサブセットプレート）。３８４ウェルＰＣＲプレートのウェルのサブセット数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、または３８０ウェルである。例えば、ＰＣＲサブセットプレートは２０ウェルを有することができ、ウェルは３８４ウェルＰＣＲプレートからのウェルのサイズである（例えば、ウェルが３８４ウェルＰＣＲプレートからのウェルのサイズである、２０ウェルＰＣＲサブセットプレート）。ＰＣＲプレートまたはＰＣＲサブセットプレートは、蛍光リーダー、可視光リーダー、または他の画像化装置と対にすることができる。多くの場合、画像化装置は、移動式装置上のデジタルカメラなどのデジタルカメラである。移動式装置は、ＰＣＲプレートまたはＰＣＲサブセットプレートの画像を取り込み、実行されているアッセイを識別し、個々のウェル及びその中の試料を検出し、アッセイされた試料を含む個々のウェルの画像特性を提供し、個々のウェルの内容物の画像特性を分析し、結果を提供することができるソフトウェアプログラムまたは移動式アプリケーションを有することができる。

支持媒体は、検出可能なシグナルを提示するための少なくとも１つの特定化されたゾーンまたは領域を有する。領域は、試料パッド領域、核酸増幅領域、コンジュゲートパッド領域、検出領域、及び回収パッド領域のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの例では、領域は完全に重なり合っているか、部分的に重なり合っているか、または連続して領域の縁部のみが接触しており、そこで領域はその隣接領域と流体連通している。いくつかの例では、支持媒体は、他の領域の上流に配置された試料パッドディテクター部分を特異的に標識するための手段を有するコンジュゲートパッド領域、試料パッドの下流に位置する検出領域、及び試料パッドと流体接続する流路を画定する少なくとも１つのマトリックスを有する。いくつかの例では、支持媒体は、上に様々なゾーンまたは領域が配置される拡張ベース層を有する。拡張ベース層は、ゾーンまたは領域に機械的支持を提供することができる。

本明細書では、試料を支持媒体に適用するための領域を提供する試料パッドが記載される。試料は、試料パッドの上のスポイトまたはピペットによって、試料パッド領域の上に試料を注ぐかもしくは分注することによって、または試料を保持する試薬チャンバに試料パッドを浸漬することによって、支持媒体に適用され得る。試料は、試薬が支持媒体上に配置されると生じる試薬との反応の前に試料パッドに適用されても、または試料パッドに適用する前に試薬と反応させてもよい。試料パッド領域は、反応した試薬及び試料を支持媒体の他のゾーンに移送することができる。反応した試薬及び試料の移送は、毛細管現象、拡散、対流、またはポンプによって補助される能動輸送によって行われ得る。いくつかの場合では、支持媒体は、マイクロ流体チャネルと一体化されるかまたはそれに覆われて、流体輸送を促進する。

スポイトまたはピペットは、所定の体積を分注することができる。いくつかの場合では、所定の体積は、約１μｌ～約１０００μｌ、約１μｌ～約５００μｌ、約１μｌ～約１００μｌ、または約１μｌ～約５０μｌの範囲であり得る。いくつかの場合では、所定の体積は、少なくとも１μｌ、少なくとも２μｌ、少なくとも３μｌ、少なくとも４μｌ、少なくとも５μｌ、少なくとも６μｌ、少なくとも７μｌ、少なくとも８μｌ、少なくとも９μｌ、少なくとも１０μｌ、少なくとも２５μｌ、少なくとも５０μｌ、少なくとも７５μｌ、少なくとも１００μｌ、少なくとも２５０μｌ、少なくとも５００μｌ、少なくとも７５０μｌ、または少なくとも１０００μｌであり得る。所定の体積は、５μｌ以下、１０μｌ以下、２５μｌ以下、５０μｌ以下、７５μｌ以下、１００μｌ以下、２５０μｌ以下、５００μｌ以下、７５０μｌ以下、または１０００μｌ以下であり得る。スポイトまたはピペットは、使い捨てであってもよく、または１回使用であってもよい。

任意で、緩衝液または流体を試料パッドに適用して、支持媒体に沿った試料の移動の駆動を補助することもできる。いくつかの場合では、緩衝液または流体の体積は、約１μｌ～約１０００μｌ、約１μｌ～約５００μｌ、約１μｌ～約１００μｌ、または約１μｌ～約５０μｌの範囲であり得る。いくつかの場合では、緩衝液または流体の体積は、少なくとも１μｌ、少なくとも２μｌ、少なくとも３μｌ、少なくとも４μｌ、少なくとも５μｌ、少なくとも６μｌ、少なくとも７μｌ、少なくとも８μｌ、少なくとも９μｌ、少なくとも１０μｌ、少なくとも２５μｌ、少なくとも５０μｌ、少なくとも７５μｌ、少なくとも１００μｌ、少なくとも２５０μｌ、少なくとも５００μｌ、少なくとも７５０μｌ、または少なくとも１０００μｌであり得る。緩衝液または流体の体積は、５μｌ以下、１０μｌ以下、２５μｌ以下、５０μｌ以下、７５μｌ以下、１００μｌ以下、２５０μｌ以下、５００μｌ以下、７５０μｌ以下、または１０００μｌ以下であり得る。いくつかの場合では、緩衝液または流体は、試料対緩衝液または流体の比が少なくとも１：１、少なくとも１：２、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５、少なくとも１：６、少なくとも１：７、少なくとも１：８、少なくとも１：９、または少なくとも１：１０であってもよい。

試料パッドは、適用された反応試薬及び試料の大部分を後続の領域に移送するのを促進する様々な材料から作製することができる。試料パッドは、セルロース繊維フィルター、織メッシュ、多孔性プラスチック膜、ガラス繊維フィルター、酸化アルミニウムでコーティングした膜、ニトロセルロース、紙、ポリエステルフィルター、またはポリマーベースのマトリックスを含み得る。試料パッド領域の材料は親水性であり、低程度の非特異的結合を有し得る。試料パッドの材料は、約５０μｍ～約１０００μｍの厚さ、約５０μｍ～約７５０μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、または約１００μｍ～約５００μｍの範囲であり得る。

試料パッドは、支持媒体上の反応結果の提示を改善するために化学物質で処理することができる。試料パッドを処理して、試料中の核酸の抽出を強化し、反応した試薬及び試料またはコンジュゲートの支持媒体の他の領域への輸送を制御し、または切断された検出部分の、コンジュゲートの表面上のコンジュゲート結合分子もしくは検出領域内の捕捉分子への結合を強化することができる。化学物質は、洗剤、界面活性剤、緩衝剤、塩、増粘剤、またはポリペプチドを含み得る。いくつかの例では、化学物質はウシ血清アルブミンを含む。

支持媒体上にその表面上を被覆されたコンジュゲートを含む領域を、切断されたディテクター分子からのディテクター部分または対照分子に結合することができるコンジュゲート結合分子によって提供するコンジュゲートパッドが本明細書に記載される。コンジュゲートパッドは、切断されたディテクター分子の検出部分へのコンジュゲート結合分子の結合、及びコンジュゲート結合検出部分の大部分の、後続領域への後続的な移動を促進する様々な材料から作製することができる。コンジュゲートパッドは、試料パッドもしくは他のゾーンと同じ材料、または試料パッドとは異なる材料を含み得る。コンジュゲートパッドは、ガラス繊維フィルター、多孔性プラスチック膜、酸化アルミニウムでコーティングした膜、紙、セルロース繊維フィルター、織メッシュ、ポリエステルフィルター、またはポリマーベースのマトリックスを含み得る。コンジュゲートパッド領域の材料は、親水性であり得るか、低程度の非特異的結合を有し得るか、またはコンジュゲートパッド全体にわたって一貫した流体流動特性を有し得る。いくつかの場合では、コンジュゲートパッドの材料は、約５０μｍ～約１０００μｍの厚さ、約５０μｍ～約７５０μｍ、約５０μｍ～約５００μｍ、または約１００μｍ～約５００μｍの範囲であり得る。

コンジュゲートパッド上に配置され、試料が支持媒体に適用されるまでコンジュゲートパッドに固定化されるコンジュゲートが、本明細書中にさらに記載される。コンジュゲートは、ナノ粒子、金ナノ粒子、ラテックスナノ粒子、量子ドット、化学発光ナノ粒子、炭素ナノ粒子、セレンナノ粒子、蛍光ナノ粒子、リポソーム、またはデンドリマーを含み得る。コンジュゲートの表面は、切断された検出分子の検出部分に結合するコンジュゲート結合分子によって被覆され得る。

本明細書に記載のコンジュゲート結合分子は、コンジュゲートの表面を被覆し、検出部分に結合することができる。コンジュゲート結合分子は、レポーターから切断された検出部分に選択的に結合する。いくつかの適切なコンジュゲート結合分子は、抗体、ポリペプチドまたは一本鎖核酸を含む。いくつかの場合では、コンジュゲート結合分子は、色素及び／またはフルオロフォアに結合する。色素またはフルオロフォアに結合するそのようなコンジュゲート結合分子のいくつかは、それらのシグナルをクエンチングすることができる。いくつかの場合では、コンジュゲート結合分子はモノクローナル抗体である。いくつかの場合では、免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、任意のアイソタイプ、可変領域、定常領域、Ｆｃ領域、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ’断片を含む。あるいは、コンジュゲート結合分子は、検出部分に特異的に結合する非抗体化合物である。場合により、コンジュゲート結合分子は、検出部分に結合することができるポリペプチドである。場合により、コンジュゲート結合分子は、ビオチンに結合するアビジンまたはポリペプチドである。場合により、コンジュゲート結合分子は、ディテクター部分結合核酸である。

コンジュゲートの直径は、所望の表面対体積比を提供するように選択されてもよい。いくつかの例では、表面積対体積比が高いと、コンジュゲートの総体積当たり、より多くの使用可能なコンジュゲート結合分子が検出部分に結合することが可能になり得る。いくつかの場合では、コンジュゲートの直径は、約１ｎｍ～約１０００ｎｍ、約１ｎｍ～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、または約１ｎｍ～約５０ｎｍの範囲であり得る。いくつかの場合では、コンジュゲートの直径は、少なくとも１ｎｍ、少なくとも２ｎｍ、少なくとも３ｎｍ、少なくとも４ｎｍ、少なくとも５ｎｍ、少なくとも６ｎｍ、少なくとも７ｎｍ、少なくとも８ｎｍ、少なくとも９ｎｍ、少なくとも１０ｎｍ、少なくとも１５ｎｍ、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも２５ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも３５ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも４５ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも５５ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも６５ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも７５ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも８５ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも９５ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも２００ｎｍ、少なくとも３００ｎｍ、少なくとも４００ｎｍ、少なくとも５００ｎｍ、少なくとも６００ｎｍ、少なくとも７００ｎｍ、少なくとも８００ｎｍ、少なくとも９００ｎｍ、または少なくとも１０００ｎｍであり得る。いくつかの場合では、コンジュゲートの直径は、１ｎｍ以下、２ｎｍ以下、３ｎｍ以下、４ｎｍ以下、５ｎｍ以下、６ｎｍ以下、７ｎｍ以下、８ｎｍ以下、９ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、１５ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、２５ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、３５ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、４５ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、５５ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、６５ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、７５ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、８５ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、９５ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、３００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、７００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、９００ｎｍ以下、または１０００ｎｍ以下であり得る。

コンジュゲート結合分子対コンジュゲートの比は、コンジュゲート結合分子と検出部分との間の所望の結合特性を達成するように調整することができる。いくつかの例では、コンジュゲート結合分子対コンジュゲートのモル比は、少なくとも１：１、少なくとも１：５、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：３０、少なくとも１：４０、少なくとも１：５０、少なくとも１：６０、少なくとも１：７０、少なくとも１：８０、少なくとも１：９０、少なくとも１：１００、少なくとも１：１１０、少なくとも１：１２０、少なくとも１：１３０、少なくとも１：１４０、少なくとも１：１５０、少なくとも１：１６０、少なくとも１：１７０、少なくとも１：１８０、少なくとも１：１９０、少なくとも１：２００、少なくとも１：２５０、少なくとも１：３００、少なくとも１：３５０、少なくとも１：４００、少なくとも１：４５０、または少なくとも１：５００である。いくつかの例では、コンジュゲート結合分子対コンジュゲートの質量比は、少なくとも１：１、少なくとも１：５、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：３０、少なくとも１：４０、少なくとも１：５０、少なくとも１：６０、少なくとも１：７０、少なくとも１：８０、少なくとも１：９０、少なくとも１：１００、少なくとも１：１１０、少なくとも１：１２０、少なくとも１：１３０、少なくとも１：１４０、少なくとも１：１５０、少なくとも１：１６０、少なくとも１：１７０、少なくとも１：１８０、少なくとも１：１９０、少なくとも１：２００、少なくとも１：２５０、少なくとも１：３００、少なくとも１：３５０、少なくとも１：４００、少なくとも１：４５０、または少なくとも１：５００である。いくつかの例では、コンジュゲートあたりのコンジュゲート結合分子の数は、少なくとも１、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１００００である。

コンジュゲート結合分子は、様々な手法によってコンジュゲートに結合され得る。場合により、コンジュゲート結合分子は、受動結合によってコンジュゲートに結合され得る。いくつかのそのような受動結合は、吸着、吸収、疎水性相互作用、静電相互作用、イオン結合、または表面相互作用を含む。いくつかの場合では、コンジュゲート結合分子は、共有結合的にコンジュゲートに結合され得る。場合により、コンジュゲート結合分子のコンジュゲートへの共有結合は、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学またはチオール化学によって促進される。

ユーザまたは検出装置にアッセイ結果を提示するための領域を提供する、支持媒体上の検出領域が本明細書に記載される。検出領域は、コンジュゲート－切断されたディテクター分子からの結合検出部分の、検出部分に特異的な捕捉分子への結合を促進する様々な材料から作製することができる。検出パッドは、他のゾーンと同じ材料、または他のゾーンとは異なる材料を含み得る。検出領域は、ニトロセルロース、紙、セルロース、セルロース繊維フィルター、ガラス繊維フィルター、多孔性プラスチック膜、酸化アルミニウムでコーティングした膜、織メッシュ、ポリエステルフィルター、またはポリマーベースのマトリックスを含み得る。多くの場合、検出領域はニトロセルロースを含み得る。領域パッド領域の材料は、親水性であり得るか、低程度の非特異的結合を有し得るか、または領域パッド全体にわたって一貫した流体流動特性を有し得る。コンジュゲートパッドの材料は、約１０μｍ～約１０００μｍ、約１０μｍ～約７５０μｍ、約１０μｍ～約５００μｍ、または約１０μｍ～約３００μｍの範囲であり得る。

検出領域は、切断された検出分子の検出部分に結合することができる高密度の捕捉分子を有する少なくとも１つの捕捉領域と、高密度の陽性対照捕捉分子を有する少なくとも１つの領域とを含む。捕捉分子または陽性対照捕捉分子の密度が高い捕捉領域は、線、円、楕円、長方形、三角形、プラス記号、または任意の他の形状であり得る。いくつかの例では、検出領域は、２つ以上の高密度の捕捉分子を有する２つ以上の捕捉領域を含み、各捕捉領域は、切断された検出分子の１つのタイプの検出部分またはコンジュゲートに特異的に結合する、他の捕捉領域の捕捉分子とは異なる１つのタイプの捕捉分子を含む。異なる捕捉分子を有する捕捉領域は、完全に重なり合っていてもよく、部分的に重なり合っていてもよく、または互いに空間的に分離していてもよい。いくつかの例では、捕捉領域は重なり合い、個々の捕捉領域によって生成された検出可能なシグナルとは異なる、組み合わされた検出可能なシグナルを生成することができる。通常、陽性対照スポットは、検出スポットのいずれとも空間的に別個である。

本明細書に記載の捕捉分子は、検出部分に結合し、検出領域内の検出スポットに固定化した。いくつかの適切な捕捉分子は、抗体、ポリペプチドまたは一本鎖核酸を含む。いくつかの場合では、捕捉分子は、色素及び／またはフルオロフォアに結合する。色素またはフルオロフォアに結合するそのような捕捉分子のいくつかは、それらのシグナルをクエンチングすることができる。場合により、捕捉分子は、色素に結合する抗体であるか、またはフルオロフォアが、それらのシグナルをクエンチングし得る。いくつかの場合では、捕捉分子はモノクローナル抗体である。いくつかの場合では、免疫グロブリンとも呼ばれる抗体は、任意のアイソタイプ、可変領域、定常領域、Ｆｃ領域、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ’断片を含む。あるいは、捕捉分子は、検出部分に特異的に結合する非抗体化合物である。場合により、捕捉分子は、検出部分に結合することができるポリペプチドである。いくつかの例では、切断された検出分子からの検出部分は、検出部分に結合したコンジュゲートを有し、コンジュゲート－検出部分複合体は、検出領域上の検出部分またはコンジュゲートに対して特異的な捕捉分子に結合し得る。場合により、捕捉分子は、検出部分に結合することができるポリペプチドである。場合により、捕捉分子は、ビオチンに結合するアビジンまたはポリペプチドである。場合により、捕捉分子は、ディテクター部分結合核酸である。

本明細書に記載の検出領域は、高密度の陽性対照捕捉分子を有する少なくとも１つの領域を含む。検出領域内の陽性対照スポットは、アッセイの検証及びアッセイの完了の確認を提供する。陽性対照スポットが本明細書に記載の可視化方法によって検出できない場合、アッセイは有効ではなく、新たなシステムまたはキットを用いて再度行うべきである。陽性対照捕捉分子は、コンジュゲート、コンジュゲート結合分子、または検出部分の少なくとも１つに結合し、検出領域内の陽性対照スポットに固定化される。いくつかの適切な陽性対照捕捉分子は、抗体、ポリペプチドまたは一本鎖核酸を含む。いくつかの場合では、陽性対照捕捉分子は、コンジュゲート結合分子に結合する。色素またはフルオロフォアに結合するそのような陽性対照捕捉分子のいくつかは、それらのシグナルをクエンチングすることができる。場合により、陽性対照捕捉分子は、色素に結合する抗体であるか、またはフルオロフォアが、それらのシグナルをクエンチングし得る。いくつかの場合では、陽性対照捕捉分子はモノクローナル抗体である。いくつかの場合では、抗体は、任意のアイソタイプ、可変領域、定常領域、Ｆｃ領域、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及びＦａｂ’断片を含む。あるいは、陽性対照捕捉分子は、検出部分に特異的に結合する非抗体化合物である。場合により、陽性対照捕捉分子は、コンジュゲート、コンジュゲート結合分子または検出部分の少なくとも１つに結合することができるポリペプチドである。いくつかの例では、検出部分に結合していないコンジュゲートは、コンジュゲート、コンジュゲート結合分子の少なくとも１つに特異的な陽性対照捕捉分子に結合する。

本明細書に記載のキットまたはシステムはまた、プログラマブルヌクレアーゼ、ガイド核酸、または一本鎖レポーターの少なくとも１つの活性を決定するための陽性対照試料を含み得る。多くの場合、陽性対照試料は、ガイド核酸に結合する標的核酸を含む。陽性対照試料を試験試料と同じ方法で試薬と接触させ、支持媒体を使用して可視化する。陽性対照試料の陽性対照スポット及び検出スポットの可視化は、試薬及びアッセイの検証を提供する。

本明細書に記載の標的核酸の検出のためのキットまたはシステムは、試料の試薬プロテアーゼ処理をさらに含むことができる。増幅前または検出可能なシグナルについてアッセイする前に、試料をプロテイナアーゼＫなどのプロテアーゼで処理することができる。多くの場合、プロテアーゼ処理は１５分以下である。時には、プロテアーゼ処理は、１分以下、５分以下、１０分以下、１５分以下、２０分以下、２５分以下、３０分以下である、もしくはそれ以上を超えないか、または１～３０分間の任意の値である。

本明細書に記載の標的核酸の検出のためのキットまたはシステムは、試料中の標的核酸の核酸増幅のための試薬をさらに含む。等温核酸増幅によって、増幅のための特別な機器を用いずに、遠隔地域または低リソース設定においてキットまたはシステムの使用が可能になる。多くの場合、核酸増幅のための試薬は、リコンビナーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、一本鎖ＤＮＡ結合（ＳＳＢ）タンパク質、及びポリメラーゼを含む。場合により、試料の核酸増幅は、標的核酸を検出する際のアッセイの感受性、特異性、または精度の少なくとも１つを改善する。いくつかの場合では、核酸増幅は、支持媒体上の核酸増幅領域において行われる。代わりに、または組み合わせて、核酸増幅を試薬チャンバ内で行い、得られた試料を支持媒体に適用する。場合により、核酸増幅は等温核酸増幅である。いくつかの場合では、核酸増幅は、転写増幅（ＴＭＡ）である。核酸増幅は、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、または他の場合では環状ヘリカーゼ依存性増幅（ｃＨＤＡ）である。さらなる場合では、核酸増幅は鎖置換増幅（ＳＤＡ）である。いくつかの場合では、核酸増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である。いくつかの場合では、核酸増幅は、ループ介在増幅（ＬＡＭＰ）または指数関数的増幅反応（ＥＸＰＡＲ）の少なくとも１つである。核酸増幅は、いくつかの場合では、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ＲＮＡ標的を増幅する簡便な方法（ＳＭＡＲＴ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ヒンジ開始プライマー依存性核酸増幅（ＨＩＰ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、または改良多置換増幅（ＩＭＤＡ）である。多くの場合、核酸増幅は、１分以下、２分以下、３分以下、４分以下、５分以下、６分以下、７分以下、８分以下、９分以下、１０分以下、１１分以下、１２分以下、１３分以下、１４分以下、１５分以下、１６分以下、１７分以下、１８分以下、１９分以下、２０分以下、２５分以下、３０分以下、４０分以下、５０分以下、または６０分以下、または１～６０分の任意の値で行われる。核酸増幅反応は、約２０～４５℃の温度で行われる場合がある。いくつかの場合では、核酸増幅反応は、２０℃以下、２５℃以下、３０℃以下、３５℃以下、３７℃以下、４０℃以下、４５℃以下、または２０°Ｃ～４５℃の任意の値の温度で行われる。いくつかの場合では、核酸増幅反応は、少なくとも２０℃、少なくとも２５℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも３７℃、少なくとも４０℃、少なくとももしくは４５℃、または２０℃～４５℃の任意の値の温度で行われる。

場合によっては、本明細書に記載の方法を実施するための総時間は、３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、または３時間～２０分の任意の値である。多くの場合、未処理または複合体の試料からの核酸検出の方法は、試料を１５分間以下プロテアーゼ処理すること、試料を１５分間以下増幅すること（前増幅とも呼ばれる）、試料をプログラマブルヌクレアーゼ介在検出に供する工程、及びヌクレアーゼ介在検出をアッセイすることを含む。この方法を実施するための総時間は、場合によっては、３時間以下、２時間以下、１時間以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、または３時間～２０分の任意の値である。多くの場合、プロテアーゼ処理はプロテイナーゼＫである。多くの場合、増幅は熱サイクル増幅である。増幅は等温増幅である場合がある。

支持媒体に沿って、またはそれから流れる試料を回収するための領域を提供する、回収パッド領域が本明細書に記載される。多くの場合、回収パッドは検出領域の下流に配置され、吸収材料を含む。回収パッドは、支持媒体の他のより少ない体積の領域から試料を回収及び移動することによって、支持媒体に入る試料の総体積を増加させることができる。この増加した体積を使用して、未結合コンジュゲートを検出領域から洗い流して、バックグラウンドのノイズを低下させ、アッセイ感度を高めることができる。支持媒体の設計が回収パッドを含まない場合、支持媒体において分析される試料の体積は、支持媒体のベッド体積によって決定され得る。回収パッドは、過剰または枯渇した試料の体積のための貯蔵器を提供することができ、支持媒体に沿った試料の流れのためのキャピラリー力を提供するのに役立つことができる。

回収パッドは、高度に吸収性であり、流体を保持することができる様々な材料から調製することができる。多くの場合、回収パッドはセルロースフィルターを含む。いくつかの例では、回収パッドは、セルロース、綿、織メッシュ、ポリマーベースのマトリックスを含む。通常は回収パッドの長さである回収パッドの寸法は、支持媒体によって吸収される全体積を変えるように調整することができる。

本明細書に記載の支持媒体は、支持媒体の縁部の周りにバリアを有することができる。多くの場合、バリアは、試料の支持媒体内での維持または支持媒体内の試料の流れを促進する疎水性バリアである。通常、疎水性バリアにおける試料の輸送速度は、支持媒体の領域を通るよりもはるかに低い。いくつかの場合では、疎水性バリアは、疎水性材料を支持媒体の縁部の周りに接触させることによって調製される。場合によって、疎水性バリアは、ワックス、ポリジメチルシロキサン、ゴム、またはシリコーンのうちの少なくとも１つを含む。

支持媒体上の任意の領域を化学物質で処理して、支持媒体上の検出スポット及び陽性対照スポットの可視化を改善することができる。領域を処理して、試料中の核酸の抽出を強化し、反応した試薬及び試料またはコンジュゲートの支持媒体の他の領域への輸送を制御し、または切断された検出部分の、コンジュゲートの表面上のコンジュゲート結合分子もしくは検出領域内の捕捉分子への結合を強化することができる。化学物質は、洗剤、界面活性剤、緩衝剤、塩、増粘剤、またはポリペプチドを含み得る。いくつかの例では、化学物質はウシ血清アルブミンを含む。いくつかの場合では、化学物質または物理的薬剤は、領域の幅にわたってより均一な流れを有する試料の流れを促進する。いくつかの場合では、化学物質または物理的薬剤は、領域の幅にわたってより均一な試料の混合を提供する。いくつかの場合では、化学物質または物理的薬剤は、アッセイの性能を改善するために流速を速くするか、または遅くするように制御する。場合により、アッセイの性能は、アッセイ時間の短縮、切断活性中時間の延長、コンジュゲートとの結合時間の延長または短縮、感度、特異性、または精度のうちの少なくとも１つによって測定される。

Ｂ．ハウジングまたはエンクロージャ
本明細書に記載される支持媒体は、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置及び方法と一致するいくつかの方法で収納するまたは囲むことができる。支持媒体用のエンクロージャは、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致する。例えば、合理化されたラテラルフロー装置は、流体の流れを１つのチャンバから別のチャンバに導くための支持媒体を含むことができ、合理化されたラテラルフロー装置全体は、本明細書に記載のエンクロージャまたはハウジング内に収容される。典型的には、本明細書に記載の支持媒体は、支持媒体を汚染及び意図的または非意図的な分解から保護するためにエンクロージャ内に収容される。エンクロージャは、２つ以上の部品で作られ、支持媒体を収容するように組み立てることができる。いくつかの例では、単一のエンクロージャが２つ以上の支持媒体を収容することができる。エンクロージャは、厚紙、プラスチック、ポリマー、または支持媒体に機械的保護を提供する材料から作製することができる。多くの場合、エンクロージャ用の材料は不活性であるか、または支持媒体もしくは支持媒体上に配置された試薬と反応しない。エンクロージャは、適所にある場合、試料を受け入れるために試料パッドを曝す上部を有することができ、ラテラルフローアッセイの結果の読み取りを可能にするために、検出領域の上方に開口部または窓を有する。エンクロージャは、区画及び支持媒体のエンクロージャ内の適所での固定を助けるために、支持媒体の周囲及び上に配置されるガイドピンをその内面に有してもよい。いくつかの場合では、エンクロージャは支持媒体全体を収容する。あるいは、支持媒体の試料パッドは収容されず、露出された状態にして試料の受け入れを促進し、支持媒体の残りがエンクロージャ内に収容される。

エンクロージャ及びエンクロージャ内に収容された支持媒体は、小型で、低プロファイルで、携帯可能で、及び／または手持ち式であるようなサイズであり得る。エンクロージャ及び支持媒体の小型のサイズは、遠隔領域及び／または低リソース設定におけるアッセイの輸送及び使用を容易にするであろう。いくつかの場合では、エンクロージャは、３０ｃｍ以下、２５ｃｍ以下、２０ｃｍ以下、１５ｃｍ以下、１０ｃｍ以下、または５ｃｍ以下の長さを有する。いくつかの場合では、エンクロージャは、少なくとも１ｃｍ、少なくとも５ｃｍ、少なくとも１０ｃｍ、少なくとも１５ｃｍ、少なくとも２０ｃｍ、少なくとも２５ｃｍ、または少なくとも３０ｃｍの長さを有する。いくつかの場合では、エンクロージャは、３０ｃｍ以下、２５ｃｍ以下、２０ｃｍ以下、１５ｃｍ以下、１０ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、または１ｃｍ以下の幅を有する。いくつかの場合では、エンクロージャは、少なくとも１ｃｍ、少なくとも２ｃｍ、少なくとも３ｃｍ、少なくとも４ｃｍ、少なくとも５ｃｍ、少なくとも１０ｃｍ、少なくとも１５ｃｍ、少なくとも２０ｃｍ、少なくとも２５ｃｍ、または少なくとも３０ｃｍの幅を有する。いくつかの場合では、エンクロージャは、１０ｃｍ以下、９ｃｍ以下、８ｃｍ以下、７ｃｍ以下、６ｃｍ以下、５ｃｍ以下、４ｃｍ以下、３ｃｍ以下、２ｃｍ以下、または１ｃｍ以下の高さを有する。いくつかの場合では、エンクロージャは、少なくとも１ｃｍ、少なくとも２ｃｍ、少なくとも３ｃｍ、少なくとも４ｃｍ、少なくとも５ｃｍ、少なくとも６ｃｍ、少なくとも７ｃｍ、少なくとも８ｃｍ、少なくとも９ｃｍ、または少なくとも１０ｃｍの高さを有する。典型的には、エンクロージャは長方形の形状である。

いくつかの例では、エンクロージャは、試験タイプの識別、検出範囲の視覚化、及び結果の分析を容易にするために、上部被覆の外面に追加情報を提供する。上部外側エンクロージャは、これらに限定されないが、バーコード、ＱＲコード、識別標識、または他の視覚的に識別可能な標識を含む、識別標識を有することができる。いくつかの例では、識別標識は移動式装置上のカメラによって画像化され、画像を分析して、試験されている疾患を特定する。試験の正確な識別は、結果を正確に視覚化し分析するために重要である。いくつかの例では、上部外側エンクロージャは、検出領域を配向して陽性対照スポットを検出スポットから識別するための基準マーカーを有する。いくつかの例では、上部外側エンクロージャは、色基準ガイドを有する。色基準ガイドを用いて検出領域を画像化すると、基準マーカーを使用して位置決めされた検出スポットを陽性対照スポット及び色基準ガイドと比較して、検出スポットの様々な画像特性、例えばスポットの色、色強度、及びサイズなどを決定することができる。いくつかの場合では、色基準ガイドは、赤色、緑色、青色、黒色、及び白色を有する。いくつかの場合では、検出スポットの画像は、色基準ガイドの少なくとも２つの基準色と比較して、色基準ガイドの少なくとも１つの基準色に正規化され、検出スポットの値を生成することができる。場合によっては、基準色のうちの少なくとも２つとの比較は、標準的な基準スケールとの比較である。いくつかの例では、いくつかの例における検出スポットの画像は、分析の前に変換またはフィルターリングを経る。検出スポットの画像特性の分析は、アッセイによって標的とされる標的核酸の有無及び標的核酸に関連する疾患に関する情報を提供することができる。いくつかの場合では、分析は、試料中の標的核酸の有無の定性的結果を提供する。いくつかの場合では、分析は、試料中に存在する標的核酸のレベルの半定量的または定量的結果を提供する。定量化は、スポット／ウェルに標準のセットを有すること、及び試験試料を標準の範囲と比較することによって実施され得る。より半定量的な手法は、互いに比較される２つのスポット／ウェルの色強度を計算し、一方のスポット／ウェルが他方よりも強いかどうかを評価することによって実施され得る。場合によって、定量化は循環核酸の定量化である。循環核酸は標的核酸を含むことができる。例えば、循環核酸を定量化する方法は、試料の第１のアリコート中の循環核酸の標的核酸をアッセイすること、試料の第２のアリコート中の対照核酸をアッセイすること、及びレポーターの切断によって生成されたシグナルを測定することによって第１のアリコート中の標的核酸標的を定量化することを含む。場合によって、循環ＲＮＡを定量化する方法は、試料の第１のアリコート中の循環ＲＮＡの標的核酸をアッセイすること、試料の第２のアリコート中の対照核酸をアッセイすること、及びレポーターの切断によって生成されたシグナルを測定することによって第１のアリコート中の標的核酸標的を定量化することを含む。多くの場合、出力は蛍光／秒を含む。反応速度は、時には、出力シグナル及び標的核酸濃度について対数線形である。いくつかの例では、シグナル出力は標的核酸濃度と相関する。循環核酸は、ＤＮＡである場合がある。

Ｃ．検出／視覚化装置
多くの検出または視覚化装置及び方法は、本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置及び方法と一致する。検出／視覚化方法は、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致する。例えば、合理化されたラテラルフロー装置は、インキュベーション及び検出チャンバまたは独立型検出チャンバを含むことができ、そこで、検出／可視化のための比色、蛍光、電気化学、または電気化学発光シグナルが生成される。場合により、検出のために生成されるシグナルは、熱量測定、電位差測定、電流測定、光学（例えば、蛍光、比色など）、または圧電シグナルである。頻繁に、熱量測定シグナルは、レポーターの切断後に吸収される熱である。場合により、熱量測定シグナルは、レポーターの切断後に吸収される熱である。電位差測定シグナルは、例えば、レポーターの切断後に生成される電位である。電流測定シグナルは、レポーターの切断後に生成される電子の動きであり得る。多くの場合、シグナルは、比色シグナルまたは蛍光シグナルなどの光学シグナルある。光学シグナルは、例えば、レポーターの切断後に生成される光出力である。場合により、光学シグナルは、レポーターの切断の前と後での吸光度の変化である。多くの場合、圧電シグナルは、レポーターの切断の前と後での質量の変化である。場合により、レポーターはタンパク質－核酸である。多くの場合、タンパク質－核酸は酵素－核酸である。検出／視覚化は、以下でさらに説明するように、様々な方法を使用して分析することができる。完了したアッセイからの検出領域からの結果は、様々な方法で視覚化及び分析することができる。いくつかの場合では、陽性対照スポット及び検出領域内の検出スポットが目に見え、ユーザは結果を読み取ることができる。いくつかの場合では、陽性対照スポット及び検出領域内の検出スポットは、画像化装置によって視覚化される。多くの場合、画像化装置は、移動式装置上のデジタルカメラなどのデジタルカメラである。移動式装置は、支持媒体の画像を取り込み、実行されているアッセイを識別し、検出領域及び検出スポットを検出し、検出スポットの画像特性を提供し、検出スポットの画像特性を分析し、結果を提供することができるソフトウェアプログラムまたは移動式アプリケーションを有することができる。代替的にまたは組み合わせて、画像化装置は、蛍光、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、または可視波長シグナルを捕捉することができる。画像化装置は、励起源を有して励起エネルギーを供給し、放出されたシグナルを捕捉することができる。いくつかの場合では、励起源は、カメラフラッシュであってよく、任意でフィルターであってもよい。いくつかの場合では、画像化装置を、暗室を作製するために支持媒体上に配置された画像化ボックスと共に使用して、画像化を改善する。画像化ボックスは、画像化前に画像化装置を嵌め込むことができる段ボール箱であってもよい。いくつかの場合では、画像化ボックスは、より集束された励起シグナルの生成を助けるために、またはより集束された放出シグナルを捕捉するために、光学レンズ、ミラー、フィルター、または他の光学素子を有する。多くの場合、画像化ボックス及び画像化装置は、遠隔または低リソース設定でのアッセイの輸送及び使用を容易にするために、小型の手持ち式で、携帯可能である。

本明細書に記載のアッセイは、移動式アプリケーション（アプリ）またはソフトウェアプログラムによって視覚化及び分析することができる。アプリまたはプログラムのグラフィックユーザインターフェース（ＧＵＩ）を使用して、移動式装置上のカメラを使用して、検出領域、バーコード、基準カラースケール、及びエンクロージャの基準マーカーを含む支持媒体の画像を個人で撮ることができる。プログラムまたはアプリは、試験種類のバーコードまたは識別可能な標識を読み取り、基準マーカーを配置して試料を配向させ、検出可能なシグナルを読み取り、基準カラーグリッドと比較し、疾患の原因となる遺伝子、ウイルスまたは作用因子の存在を示す標的核酸の有無を判定する。移動式アプリケーションは、試験の結果を個人に提示することができる。移動式アプリケーションは、試験結果を移動式アプリケーションに格納することができる。移動式アプリケーションは、遠隔装置と通信し、試験結果のデータを転送することができる。試験結果は、ヘルスケア専門家を含む別の個人によって遠隔装置から遠隔で見ることができる。遠隔ユーザは、結果にアクセスし、情報を使用して、治療、介入、環境の浄化のための措置を推奨することができる。

スピンスルーフィルター装置
本明細書に記載されるのは、汚染を防止し、図２０に示されるようなスピンスルーアッセイを利用する、プログラマブルヌクレアーゼベースの検出のための様々な装置である。いくつかの実施形態では、スピンスルーフィルター装置は、プログラマブルヌクレアーゼベースの検出試薬、増幅試薬、及び試料を含むエンクロージャであって、検出試薬は、フィルターによって増幅試薬及び試料を含む混合物から物理的に分離され、フィルターは、エンクロージャが遠心分離されるまで検出試薬と混合物との間の分離を維持するように構成され、それにより、増幅試薬による試料の増幅が可能になる、エンクロージャを含み、フィルターは、エンクロージャの遠心分離の際に混合物への検出試薬の移動を容易にするように構成され、エンクロージャは、混合物を生成された１つまたは複数のシグナルを視覚化できるように構成されている。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、蛍光が通過できるように構成された、透明または半透明の材料を含む。いくつかの実施形態では、エンクロージャは、可視光が通過できるように構成された透明または半透明の材料を含む。

多重化
本明細書に記載される合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、いくつかの方法で多重化することができる。これらの多重化方法は、例えば、試料内の標的核酸の検出のための本明細書に開示される合理化されたラテラルフロー装置と一致する。

本開示と一致する方法は、試料中の２つ以上の標的核酸をアッセイする多重化方法を含む。多重化方法は、標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、及びタンパク質－核酸の集団の少なくとも一部のタンパク質－核酸の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。別の例として、試料中の標的核酸をアッセイする多重化方法は、例えば、ａ）標的核酸のセグメントに逆相補的なセグメントを含むガイド核酸と、標的核酸のセグメントに結合するガイド核酸のセグメントを含む複合体を形成する際に、配列非依存性切断を示すプログラマブルヌクレアーゼとを含む複合体に試料を接触させること、ｂ）複合体を基質に接触させること、ｃ）基質を、切断された基質と差次的に反応する試薬に接触させること、及びｄ）基質の切断を示すシグナルについてアッセイすることを含み、ここで、シグナルは試料中の標的核酸の存在を示し、シグナルの非存在は試料中の標的核酸の非存在を示す。多くの場合、基質は酵素－核酸である。場合によって、基質は酵素基質－核酸である。

多重化は、複数の異なる標的核酸が同時に同じ試料から検出されるが、反応が空間的に分離される空間多重化のいずれかであり得る。多くの場合、複数の標的核酸は、同じプログラマブルヌクレアーゼを使用して検出されるが、ガイド核酸は異なる。複数の標的核酸は、異なるプログラマブルヌクレアーゼを使用して検出されることがある。場合によっては、多重化は、単一の反応体積内で複数の異なる標的酸が検出される、単一反応多重化であり得る。多くの場合、少なくとも２つの異なるプログラマブルヌクレアーゼが単一反応多重化で使用される。例えば、多重化は、合理化されたラテラルフロー装置内で複数のカテゴリのレポーターを固定化することによって可能になり得、単一の合理化されたラテラルフロー装置内で複数の標的核酸の検出が可能になる。多重化は、１つのキットまたはシステムにおける複数の標的核酸の検出を可能にする。いくつかの場合では、複数の標的核酸は、ウイルスに対する種々の標的核酸を含む。いくつかの場合では、複数の標的核酸は、少なくとも第１の疾患及び第２の疾患に関連する異なる標的核酸を含む。１つの疾患についての多重化は、試料中の疾患の存在を検出するためのアッセイの感度、特異性、または精度の少なくとも１つを向上させる。いくつかの場合では、複数の標的核酸は、２つ以上の疾患の原因となる種々のウイルス、細菌または病原体に向けられる標的核酸を含む。いくつかの場合では、多重化は、複数の標的核酸間、例えば疾患の原因となる同じ細菌または病原体の異なる遺伝子型、例えば細菌または病原体の野生型遺伝子型、及び抗生物質治療などの治療に対する耐性をもたらし得る一塩基多型（ＳＮＰ）などの突然変異を含む細菌または病原体の遺伝子型を含む標的核酸間の識別を可能にする。例えば、多重化は、第１のプログラマブルヌクレアーゼを使用する微生物種、及び第２のプログラマブルヌクレアーゼを使用する微生物における抗生物質耐性パターンについての単一アッセイを含むアッセイ方法を含む。多重化は、異なるインフルエンザ株、例えばインフルエンザＡ及びインフルエンザＢの複数の標的核酸間の識別を可能にする場合がある。多くの場合、多重化は、例えば野生型遺伝子型及び変異体（例えば、ＳＮＰ）遺伝子型について、異なる遺伝子型を含む標的核酸などの複数の標的核酸間の識別を可能にする。複数のウイルス感染の多重化は、単一の試料から疾患のパネルを試験する能力を提供し得る。例えば、複数の疾患の多重化は、新しい患者の広範なパネル検査または疫学的調査において有益であり得る。多くの場合、多重化は、敗血症または複数の病原体に関連する他の疾患において細菌病原体を同定するために使用される。

さらに、多重化からのシグナルを定量化することができる。例えば、疾患パネルの定量化方法は、試料からの複数のアリコート中の複数の固有標的核酸をアッセイすること、試料の別のアリコート中の対照核酸対照をアッセイすること、及び複数の固有標的核酸の複数のシグナルを、レポーターの切断によって生成されたシグナルを第２のアリコート中で生成されたシグナルと比較して測定することによって定量化することを含む。多くの場合、複数の固有の標的核酸は、試料中の複数のウイルスに由来する。場合により、複数のシグナルの定量化は、複数の固有標的核酸の濃度と、複数のシグナルを生成した複数の固有標的核酸について相関する。疾患パネルは、任意の疾患用であり得る。

本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、試薬及び支持媒体の様々な構成によって多重化することができる。いくつかの場合では、キットまたはシステムは、単一のエンクロージャ内に収容された複数の支持媒体を有するように設計される。場合により、単一のエンクロージャに収容された複数の支持媒体は、単一の試料パッドを共有する。単一の試料パッドは、分岐または放射状構成などの様々な設計で支持媒体に接続されてもよい。あるいは、複数の支持媒体の各々は、それ自身の試料パッドを有する。いくつかの場合では、キットまたはシステムは、エンクロージャ内に収容された単一の支持媒体を有するように設計され、そこで支持媒体は、複数の標的核酸を検出するための複数の検出スポットを含む。場合により、多重化アッセイのための試薬は、複数のガイド核酸、複数のプログラマブルヌクレアーゼ、及び複数の一本鎖ディテクター核酸を含み、ここで、ガイド核酸の１つと、プログラマブルヌクレアーゼの１つと、一本鎖レポーターの１つとの組み合わせが１つの標的核酸を検出し、検出領域上に検出スポットを提供することができる。いくつかの場合では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、及び１つの標的核酸を検出するように構成された一本鎖レポーターの組み合わせは、単一の試薬チャンバ内で少なくとも１つの他の組み合わせと混合される。いくつかの場合では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、及び１つの標的核酸を検出するように構成された一本鎖レポーターの組み合わせは、単一の支持媒体の試薬の組み合わせと混合される。これらの試薬の組み合わせを試料と接触させると、複数の標的核酸についての反応が同じ媒体または試薬チャンバにおいて同時に起こる。この反応させた試料を本明細書に記載の多重化支持媒体に適用する場合がある。

いくつかの場合では、ガイド核酸、プログラマブルヌクレアーゼ、及び１つの標的核酸を検出するように構成された一本鎖ディテクター核酸の組み合わせは、それ自身の試薬チャンバまたはそれ自身の支持媒体に提供される。この場合では、複数の試薬チャンバまたは支持媒体が装置、キットまたはシステムに設けられ、そこで１つの試薬チャンバが、１つの標的核酸を検出するように設計される。この場合では、複数の支持媒体を使用して、ウイルス感染または関心対象の他の疾患のパネルを検出する。

いくつかの例では、多重化された合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、単一の反応で少なくとも２つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化された合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、単一の反応で少なくとも３つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化された合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、単一の反応で少なくとも４つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化された合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、単一の反応で少なくとも５つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化された合理化されたラテラルフロー装置及び方法は、単一の反応で少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化されたキットは、単一のキットで少なくとも２つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化されたキットは、単一のキットで少なくとも３つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化されたキットは、単一のキットで少なくとも４つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化されたキットは、単一のキットで少なくとも５つの異なる標的核酸を検出する。いくつかの例では、多重化装置、システム、流体装置、キット及び方法は、単一の反応で少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の異なる標的核酸を検出する。

製造
支持媒体は、様々な材料及び試薬で組み立てることができる。試薬は、支持媒体用の材料の表面に分注されてもよく、またはコーティングされてもよい。支持媒体の材料は、バッキングカードに積層されてもよく、バッキングカードは、単離されてもよく、または個々の試験ストリップへと切断されてもよい。装置は、完全に手動のバッチ式プロセシング、または完全に自動化されたインライン連続プロセス、または２つのプロセシング手法のハイブリッドによって製造することができる。バッチプロセスは、支持媒体用の各材料のシートまたはロールから開始することができる。支持媒体の個々のゾーンは、分配及び乾燥用に独立して加工されてもよく、最終的な支持媒体は、独立して調製されたゾーンと組み合わせられ、切断されてもよい。バッチプロセシングスキームは、設備コストが高くなり得る、より自動化されたインラインプロセシングよりも設備コストが低く、労働コストが高い可能性がある。いくつかの例では、設備投資が軽減されるので、少量生産の場合はバッチプロセシングが好ましい可能性がある。いくつかの例では、製造時間が短縮されるので、大量生産の場合は自動化されたインラインプロセシングが好ましい可能性がある。両方の手法は、生産レベルに合わせてスケーラブルであり得る。

いくつかの例では、支持媒体は、ディスペンサー、含浸タンク、乾燥オーブン、手動または半自動ラミネーターを備えたＸＹＺ方向運動システムを含む様々な機器、及びラミネーションのためにロールまたはシートストックを適切な長さ及び幅に縮小するための切断方法を使用して調製される。コンジュゲートゾーン用のコンジュゲート結合分子及び検出ゾーン用の捕捉分子を分配するために、ディスペンサーを備えたＸＹＺ方向運動システムを使用することができる。いくつかの実施形態では、ディスペンサーは、接触法または非接触法によって分配することができる。

支持媒体の自動または半自動調製では、支持媒体を、最終的な組み立てられた状態へと整えられる各領域用の膜のロールから調製し、ロールから広げることができる。例えば、支持媒体上の領域に対応する１つの膜で、左から右へ試料パッド領域から回収パッド領域まで、すべて接着性カードストック上で膜を整えることができる。ディスペンサーは、試薬、コンジュゲート、検出分子、及び膜用の他の処理剤を膜上に配置する。分配された流体を低湿度チャンバ内で熱によって、または凍結乾燥によって膜上で乾燥させて、分配された分子を安定化する。膜は、ストリップへと切断され、エンクロージャまたはハウジング内に配置されるか収容され、包装される。

キット
標的核酸の検出に使用するための合理化されたラテラルフロー装置のキットが本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の試薬及び支持媒体の少なくとも１つを含む。試薬は、試薬チャンバ内または支持媒体上に提供され得る。あるいは、キットを用いて、個人が試薬チャンバまたは支持媒体に試薬を入れてもよい。任意で、キットは、緩衝液及びスポイトをさらに含む。試薬チャンバは、試験ウェルまたは容器である。試薬チャンバの開口は、支持媒体を収容するのに十分な大きさであり得る。緩衝剤は、分注を容易にするためにスポイトボトル内に提供されてもよい。スポイトは使い捨てであり、一定量を移送することができる。スポイトを使用して、試料を試薬チャンバ内または支持媒体上に配置することができる。

いくつかの実施形態では、標的核酸を検出するためのキットは、支持媒体、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸、ガイド核酸及び標的核酸セグメントと複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ、ならびに検出部分を含む一本鎖レポーターであって、レポーターが活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第１の検出可能なシグナルを生成することができる、一本鎖レポーターを含み得る。

いくつかの場合では、標的核酸を検出するためのキットは、ＰＣＲプレート、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸、ガイド核酸及び標的核酸セグメントと複合体を形成した場合に活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ、ならびに検出部分を含む一本鎖レポーターであって、活性化されたヌクレアーゼによって切断され、それによって第１の検出可能なシグナルを生成することができる、一本鎖レポーターを含み得る。ＰＣＲプレートのウェルは、標的核酸セグメントを標的とするガイド核酸、ガイド核酸及び標的配列と複合体を形成したときに活性化され得るプログラマブルヌクレアーゼ、ならびに検出部分を含む一本鎖レポーターの少なくとも１つの集団で予め等分することができる。したがって、使用者は、関心対象の生物学的試料を予め等分したＰＣＲプレートのウェルに加え、蛍光リーダーまたは可視光リーダーを用いて検出可能なシグナルを測定することができる。

いくつかの例では、そのようなキットは、バイアル、チューブなどの１つまたは複数の容器を受け入れるように区画化されたパッケージ、キャリア、または容器を含むことができ、容器の各々は、本明細書に記載の方法で使用される別個の要素の１つを含む。適切な容器には、例えば、試験ウェル、ボトル、バイアル、及び試験管が含まれる。一実施形態では、容器は、ガラス、プラスチック、またはポリマーなどの様々な材料から形成される。

本明細書に記載のキットまたはシステムは、包装材料を含む。包装材料の例には、パウチ、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、及び意図された使用形態に適した任意の包装材料が含まれるが、これらに限定されない。

キットは、典型的には、内容物を列挙する標識及び／または使用説明書、及び使用説明書を含む添付文書を含む。典型的には、指示のセットも含まれる。一実施形態では、標識は、容器上に存在するか、または容器に関連付けられている。いくつかの例では、標識を形成する文字、数字または他の字が容器自体に付けられ、成形され、またはエッチングされる場合、標識は容器上に存在し、標識は、それが容器を保持するレセプタクルまたはキャリア内に存在する場合、例えば添付文書として容器に関連付けられる。一実施形態では、標識を使用して、内容物が特定の治療用途に使用されることを示す。標識はまた、本明細書に記載の方法などの内容物の使用のための指示を示す。

成形された製品を包装し、滅菌バリアを維持するためにラッピングまたは箱詰めした後、製品は、加熱滅菌、ガス滅菌、ガンマ線照射または電子ビーム滅菌によって最終滅菌され得る。あるいは、製品は、無菌プロセシングによって調製及び包装されてもよい。

安定性
本明細書では、上記の方法で使用するための試薬の安定な組成物及びプログラマブルヌクレアーゼシステムが開示される。本明細書に記載の試薬及びプログラマブルヌクレアーゼシステムは、冷蔵条件、周囲条件、及び加速条件を含む様々な貯蔵条件で安定であり得る。安定な試薬が本明細書に開示される。安定性は、試薬及びプログラマブルヌクレアーゼシステム自体、または支持媒体上に存在する試薬及びプログラマブルヌクレアーゼシステムについて測定され得る。

いくつかの例では、本明細書で使用される安定とは、所与の貯蔵期間の終わりに約５％ｗ／ｗ以下の総不純物を有する試薬を指す。安定性は、ＨＰＬＣまたは任意の他の公知の試験方法によって評価することができる。安定な試薬は、所与の貯蔵期間の終わりに約１０％ｗ／ｗ、約５％ｗ／ｗ、約４％ｗ／ｗ、約３％ｗ／ｗ、約２％ｗ／ｗ、約１％ｗ／ｗ、または約０．５％ｗ／ｗの総不純物を有し得る。

いくつかの実施形態では、本明細書中で使用される安定とは、所与の貯蔵条件における所与の貯蔵期間の終わりに、約１０％以下の検出活性の喪失を有する試薬及びプログラマブルヌクレアーゼシステムのことを指す。検出活性は、既知の方法を用いて既知の陽性試料によって評価することができる。選択的にまたは組み合わせて、検出活性は、感度、精度、または特異性によって評価することができる。いくつかの実施形態では、安定な試薬は、所与の貯蔵期間の終わりに、検出活性の約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、約１％または約０．５％を喪失する。

いくつかの実施形態では、安定な組成物は、所与の貯蔵条件における所与の貯蔵期間の終わりに、検出活性の喪失がゼロである。所与の貯蔵条件は、相対湿度１０％以下、２０％以下、３０％以下、４０％以下、５０％以下、６０％以下、７０％以下、８０％以下、９０％以下、または１００％以下の湿度を含み得る。制御された貯蔵環境は、０％～５０％の相対湿度、０％～４０％の相対湿度、０％～３０％の相対湿度、０％～２０％の相対湿度、または０％～１０％の相対湿度を含み得る。制御された貯蔵環境は、－１００℃、－８０℃、－２０℃、４℃、約２５℃（室温）、または４０℃の温度を含み得る。制御された貯蔵環境は、－８０℃～２５℃、または－１００℃～４０℃の温度を含み得る。制御された保管環境は、システムまたはキットを光または機械的損傷から保護することができる。制御された貯蔵環境は、無菌または防腐性であり得、または光導管の無菌性を維持し得る。制御された貯蔵環境は、無菌または防腐性であり得る。

キットまたはシステムは、使用前に長期間保管されるように包装することができる。キットまたはシステムは、キットまたはシステムの劣化を回避するために包装することができる。包装は、包装内の湿度を制御するための乾燥剤または他の薬剤を含むことができる。包装は、キットまたはシステムを機械的損傷または熱的損傷から保護することができる。包装は、試薬及びプログラマブルヌクレアーゼシステムの汚染からキットまたはシステムを保護することができる。キットまたはシステムは、試薬の高い安定性をもたらすか、または試薬活性をほとんど喪失させない貯蔵条件と同様の条件下で輸送され得る。包装は、キットまたはシステムの無菌性を提供かつ維持するように構成され得る。キットまたはシステムは、標準的な製造及び出荷作業に適合することができる。

本明細書では、ポイントオブニード（ＰＯＮ）プログラマブルヌクレアーゼベースの装置の様々な実施形態を説明する。いくつかの実施形態では、ＰＯＮ装置は、図２１に示されるように、５プレックスの呼吸パネル用に構成される。図２１は、ウイルス検出用の別個の領域の被プールＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を含むＰＯＮ５プレックスパネルの例示的なアッセイの設計を示す。別個の領域は、（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、（２）インフルエンザＡ、（３）インフルエンザＢ、（４）Ｐａｎ－ＣｏＶ、及び（５）内因性ヒト制御の検出用である。（１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２領域は、Ｎ遺伝子標的及びＥ遺伝子標的を検出するためのｇＲＮＡを含み、（２）インフルエンザＡ領域は、ＨＩＮＩ標的、Ｈ３Ｎ２標的、及びＨＩＮＩｐｄｍ２００９標的を検出するためのｇＲＮＡを含み、（３）インフルエンザＢ領域は、山形系統の標的及びビクトリア系統の標的を検出するためのｇＲＮＡを含み、（４）Ｐａｎ－ＣｏＶ領域は、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３標的、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３標的、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ標的、及びＨＣｏＶ－ＨＫＵｌ標的を検出するためのｇＲＮＡを含み、（５）内因性ヒト制御領域は、ヒトｒｐｐ３０標的のｇＲＮＡを含む。各領域は、被プールｇＲＮＡを含むことができる。例えば、インフルエンザＡ領域のｇＲＮＡは、マトリックスプロテインＩ（ＭＰ）、非構造プロテイン１（ＮＳ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオプロテイン（ＮＰ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＰＢ１、ポリメラーゼ酸性タンパク質（ＰＡ）、及びポリメラーゼ塩基性タンパク質２（ＰＢ２）など、ＨＩＮＩ、Ｈ３Ｎ２、及びＨＩＮＩｐｄｍ２００９の間で９８％保存されている標的部位に結合する。各領域から検出されたシグナルは、その領域内の標的の検出を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＰＯＮプログラマブルヌクレアーゼベースの装置は、図２２に示されるように使い捨てである。

多重化ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイベースのラテラルフローアッセイ
ここで説明するのは、図２３に示すような、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイベースの多重ラテラルフローストリップ用の様々な装置及び方法である。いくつかの実施形態では、レポーター（２３０１）は、固体支持体の表面（２３００）に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ複合体）プローブ（２３０７）が表面（２３００）に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（２３０８）などのガイド核酸を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）は、試料の標的核酸の相補体となるように設計されたｓｇＲＮＡ（２３０８）を含む。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）及びレポーター（２３０１）は両方とも表面（２３００）に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）及びレポーター（２３０１）は両方とも、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）のプログラマブルヌクレアーゼによってレポーター（２３０１）が切断され得るのに十分に近接して表面（２３００）に固定化される。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）及びレポーター（２３０１）は両方とも、標的核酸とｓｇＲＮＡ（２３０８）が相補的であるときに、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）のｓｇＲＮＡ（２３０８）への標的核酸の結合時にプログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）のプログラマブルヌクレアーゼによりレポーター（２３０１）が切断（２３０９）され得るのに十分に近接して表面（２３００）に固定化される。そのような実施形態では、これは、標的の存在を示し、標的に対する「ヒット」である。いくつかの実施形態では、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）のｓｇＲＮＡ（２３０８）に相補的な標的核酸の結合は、プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）のプログラマブルヌクレアーゼが、プログラマブルヌクレアーゼの十分に近接した近接さで核酸の切断を開始するに至る。いくつかの実施形態では、表面（２３００）はウェルの底にある。いくつかの実施形態では、第１のプログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）及び第１のレポーター（２３０１）の集まりが、表面（２３００）の１つの位置で表面に固定化される。

いくつかの実施形態では、図２３Ａに示すように、レポーター（２３０１）は、表面リンカー（２３０２）、核酸（２３０３）、第２のリンカー（２３０６）、検出部分（例えば、標識）（２３０４）、及び親和性分子（例えば、結合部分）（２３０５）を含む。いくつかの実施形態では、結合部分（２３０５）はビオチンである。いくつかの実施形態では、表面に固定化された同じレポーター（２３０１）の複数のコピーが存在する。

いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップ（２３１０）を使用して、切断されたレポーター（２３０９）を検出する。いくつかの実施形態において、切断されたレポーター（２３０９）は、ラテラルフローストリップ（２３１０）の試料パッド（２３１１）に接触される。いくつかの実施形態では、切断されたレポーター（２３０９）は、試料パッドに存在するコンジュゲート粒子に結合する。いくつかの実施形態では、コンジュゲート粒子は金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子は、抗ビオチンで官能化される。いくつかの実施形態では、抗ビオチン官能化金ナノ粒子は、結合部分（２３０５）に１つまたは複数のビオチンを含む切断されたレポーターに結合する。

いくつかの実施形態では、レポーターは第２のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１つまたは複数の結合部分を核酸に連結する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１つまたは複数の標識を核酸に連結する。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、１つまたは複数の結合部分及び１つまたは複数の標識の両方をレポーターの核酸に連結する。いくつかの実施形態では、レポーターはデンドリマーまたはトレブラー分子である。

いくつかの実施形態において、レポーターは標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５、ＡＦ５９４、Ｃｙ３、またはラテラルフローアッセイのための任意の適切な標識である。

いくつかの実施形態では、レポーターは、結合のための化学的官能基を含む。いくつかの実施形態では、化学的官能基はビオチンである。いくつかの実施形態では、化学的官能基は、フロー捕捉プローブ（例えば、コンジュゲート粒子または捕捉分子）の捕捉プローブに相補的である。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、抗ビオチンで官能化された金ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは試料パッドに配置される。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、試料パッドと接触するコンジュゲートパッド内に配置され、ラテラルフローアッセイストリップの両方が、試料パッドとコンジュゲートパッドの両方を含み、さらに、試料パッドとコンジュゲートパッドの両方が検出領域で流体連通している。

いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップ（２３１０）は、検出領域（２３１２）を含む。いくつかの実施形態では、検出領域（２３１２）は、１つまたは複数の検出スポットを含む。いくつかの実施形態では、検出スポットは固定捕捉プローブ（例えば、捕捉分子）を含む。いくつかの実施形態では、固定捕捉プローブは、１つまたは複数の捕捉抗体を含む。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、抗ＡＦ５９４、または検出部分またはコンジュゲートに結合できる任意の他の適切な捕捉抗体である。

いくつかの実施形態では、ＦＩＴＣを含むフロー捕捉プローブは、抗ＦＩＴＣ抗体を含む固定捕捉プローブによって捕捉される。いくつかの実施形態では、ＴＡＭＲＡを含むフロー捕捉プローブは、抗ＴＡＭＲＡ抗体を含む固定捕捉プローブによって捕捉される。いくつかの実施形態では、ＤＩＧを含むフロー捕捉プローブは、抗ＤＩＧ抗体を含む固定捕捉プローブによって捕捉される。いくつかの実施形態では、Ｃｙ５を含むフロー捕捉プローブは、抗Ｃｙ５抗体を含む固定捕捉プローブによって捕捉される。いくつかの実施形態では、ＡＦ５７４を含むフロー捕捉プローブは、抗ＡＦ５９４抗体を含む固定捕捉プローブによって捕捉される。

いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップ（２３１０）は、コントロールライン（２３１４）を含む。いくつかの実施形態では、コントロールライン（２３１４）は、フロー捕捉プローブすべてに相補的な抗ＩｇＧを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブがレポーターに結合しないとき、フロー捕捉プローブはコントロールライン上の抗ＩｇＧによって捕捉され、試験ラインからシグナルが読み取られなくても装置が適切に機能していることをユーザに保証する。

いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップ（２３１０）は試料パッドを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは抗ビオチンを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブはＨＲＰを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、ＨＲＰ抗ビオチンを含む。いくつかの実施形態では、フロー捕捉プローブは、ＨＲＰ抗ビオチンＤＡＢ／ＴＭＢである。

ここで説明するのは、図２４に示すように、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイベースの多重ラテラルフローストリップのための様々な装置及び方法である。図２４は、ラテラルフローアッセイストリップで読み出されるＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの非限定的な例示的なワークフローを示す。いくつかの実施形態では、試料（２４０１）は、１つまたは複数の標的核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、試料（２４０１）（例えば、試料溶液）は、少なくとも第１及び第２の標的核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、試料（２４０１）は、ウェルの表面に固定化されたｓｇＲＮＡなどの異なるガイド核酸が１つまたは複数の位置にあるウェル（２４０２）（例えば、Ｄ１～Ｄ５）に導入される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、表面に固定化されたプログラマブルヌクレアーゼプローブの一部である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、試料中の標的核酸に特異的に結合するように設計される。いくつかの実施形態では、ウェルの表面上の異なる位置（例えば、位置Ｄ１～Ｄ５）に対応する異なるｓｇＲＮＡが存在し、異なるｓｇＲＮＡはそれぞれ、試料に存在していることも、いないこともある、異なる標的核酸配列に対して、相補的である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡを含むプログラマブルヌクレアーゼプローブに加えて、各位置は、異なる官能基を有する１つまたは複数のレポータープローブで官能化される。いくつかの実施形態では、レポータープローブは、プログラマブルヌクレアーゼプローブによって切断されるのに十分に近接している。いくつかの実施形態では、実施例７に記載されるように、特定のｓｇＲＮＡと、ｓｇＲＮＡが特異的に結合するように設計された標的核酸との間の結合により、１つまたは複数のレポーターのセクションが対応する核酸から切断され、試料溶液中に放出されることが可能になる。いくつかの実施形態では、レポーターは標識で官能化される。いくつかの実施形態では、ラテラルフローアッセイストリップは、検出スポット（例えば、２４０３、２４０４）を含む検出領域を含み、各検出スポットは異なるタイプの捕捉抗体を含む。いくつかの実施形態では、各捕捉抗体タイプは、レポーターの特定の標識タイプに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の検出スポット（２４０３）は、捕捉抗体抗ＦＩＴＣを含有する。いくつかの実施形態では、ウェル（２４０２）の表面上の位置Ｄ５は、第１の標的核酸配列に特異的なｓｇＲＮＡを含む第１の固定化プログラマブルヌクレアーゼプローブを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ５は、ＦＩＴＣで標識された固定化された第１のレポーター（２４０６）をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１の標的核酸配列がプログラマブルヌクレアーゼプローブに結合すると、第１のレポーター（２４０６）の切断可能な核酸が切断され、溶液中に放出される。代わりに、または組み合わせて、いくつかの実施形態では、第２の検出スポット（２４０４）は捕捉抗体抗ＤＩＧを含む。いくつかの実施形態では、第２の位置Ｄ４は、第２の標的核酸配列に特異的なｓｇＲＮＡを含む固定化されたプログラマブルヌクレアーゼプローブを含む。いくつかの実施形態では、Ｄ４は、ＤＩＧで標識された固定化された第２のレポーター（２４０５）をさらに含む。したがって、いくつかの実施形態では、第２の標的核酸配列が結合すると、固定化された第２のレポーター（２４０５）が切断され、溶液中に放出される。いくつかの実施形態では、切断された第１及び第２のレポーター（２４０５）及び（２４０６）を含有する溶液を、チェイス緩衝液と共にラテラルフローアッセイストリップの試料パッドに接触させる。いくつかの実施形態では、試料パッドは、その上に配置された１つまたは複数のフロー捕捉プローブ（例えば、抗ビオチンＡｕＮＰ）を有する。いくつかの実施形態では、切断された第１及び第２のレポーター分子を含む試料溶液は、チェイス緩衝液と共に、レポーターがコンジュゲート（例えば、抗ビオチン－金ナノ粒子）に結合している試料パッドを横切って流れる。いくつかの実施形態において、切断されたレポーターを含む溶液は、手動でピペッティングすることによって、試料パッドに接触される。いくつかの実施形態では、切断されたレポーターを含む溶液は、試料パッドと流体接続しているチャンバから引き出される試料パッドに接触する。いくつかの実施形態では、切断されたレポーターを含む溶液は、切断されたレポーター溶液が生じるアッセイが行われるチャンバから引き出されることによって、試料パッドに接触する。いくつかの実施形態では、レポーターは試料パッドで切断される。いくつかの実施形態では、レポーターはＤＥＴＥＣＴＲ（商標）のアッセイにより試料パッドにおいて切断される。いくつかの実施形態では、溶液は、毛細管現象またはウィッキングによって試料パッドに引き込まれ、引き出される。いくつかの実施形態では、毛細管現象またはウィッキングは、液体が吸収パッドに引き込まれることによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、毛細管現象またはウィッキングは、電力を必要とせず、液体が吸収パッドに引き込まれることによって、引き起こされる。いくつかの実施形態では、溶液は、圧力勾配によって試料パッドに引き込まれ、引き出される。いくつかの実施形態では、ＦＩＴＣで標識されたレポーター（２４０６）を有する金ナノ粒子－レポーターコンジュゲートは、捕捉抗体抗ＦＩＴＣを含有する第１の検出スポット（２４０３）に選択的に結合し、したがって試料中の第１の標的核酸配列の存在を示す。いくつかの実施形態では、ＤＩＧで標識されたレポーター（２４０５）を大概有するＡｕＮＰ－レポーターコンジュゲートは、捕捉抗体抗ＤＩＧを含有する第２の検出スポット（２４０４）に選択的に結合し、したがって試料中の第２の標的核酸配列の存在を示す。このようにして、いくつかの実施形態では、多重化試料中に存在する２つ以上の標的核酸配列の並行検出が可能になる。

本明細書に記載されるのは、図２５に示されるラテラルフローベースの検出の様々な実施形態である。いくつかの実施形態では、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（２５０１）を使用して、ラテラルフローベースのＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイにおける検出を強化する。いくつかの実施形態では、標的（複数可）核酸配列を含む試料を、プログラマブルヌクレーゼプローブ及びレポータープローブが表面に固定化された表面（２５００）にさらす。いくつかの実施形態では、レポータープローブにＨＲＰ分子が含まれている。いくつかの実施形態では、標的及びガイドＲＮＡ間の特異的結合イベントに続きプログラマブルヌクレアーゼによりレポーターを切断すると、レポーターの切断された部分が試料溶液（２５０６）に放出される。いくつかの実施形態では、次に、試料溶液は、過炭酸ナトリウム（２５０４）を含む試料パッドを含むかまたはそれに隣接するラテラルフローアッセイストリップ（２５０２）にさらされ、水溶液にさらされるとＨ_２Ｏ_２を生成する。いくつかの実施形態では、Ｈ_２Ｏ_２を形成するための過炭酸ナトリウムの再水和は、試料が領域を通ってウィッキングされるときに発生する。いくつかの実施形態では、基質は、ＤＡＢ、ＴＭＢ、または任意の他の十分な基質を含む。いくつかの実施形態では、「スポット」は青から赤に変化し、ＨＲＰの存在を示し、順次標的核酸配列の「ヒット」を示す。いくつかの実施形態では、読み出しは、試料溶液の色の変化時に溶液中で達成される（２５０８）。

ここでは、読み出しのためにラテラルフローアッセイストリップを利用するＨＲＰ強化多重化ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイを利用する様々な方法及び装置について説明する。いくつかの実施形態では、ＨＲＰシグナル強化多重化ラテラルフローアッセイは、図２６に示されている。いくつかの実施形態では、支持媒体の固定化表面（２６００）及びラテラルフローアッセイストリップ（２６１０）での検出は、シグナルの伝達が金ナノ粒子散乱光によって実行されないことを除いて、図２３～２６で説明したように実行される。代わりに、いくつかの実施形態では、抗ビオチン標識ＡｕＮＰは、ＨＲＰ－抗ビオチンＤＡＢ／ＴＭＢに取って代わられる。いくつかの実施形態では、ＨＲＰは、反応緩衝液及び／またはチェイス緩衝液によって再水和されるラテラルフローアッセイストリップ中に存在する過炭酸ナトリウムによって活性化される。いくつかの実施形態では、ＨＲＰは、ＰＣＲなどの試料増幅を必要としないように、十分に強いシグナルを可能にする。

本明細書では、ＤＮＡに対するＣａｓ１３ＲＮＡ切断特異性、ＨＲＰシグナル強化、及び捕捉オリゴプローブ特異性を利用した多重化標的核酸検出の様々な実施形態について説明する。いくつかの実施形態では、図２７に示すように、試料（２７００）は異なる標的核酸を含む。いくつかの実施形態では、次いで、試料（２７００）を、１つ以上の位置（例えば、５つの位置、Ｄ１～Ｄ５）で官能化されたウェル（２７０１）の表面に接触させる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の位置がある。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３酵素がプログラマブルヌクレアーゼプローブに存在する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１３はＲＮＡを切断するがＤＮＡは切断せず、ＤＮＡ及びＲＮＡ鎖の両方を有する核酸配列を含むレポーター（２７０２）の使用を可能にする。いくつかの実施形態では、標的核酸がｓｇＲＮＡに結合すると、レポーターのＲＮＡがＣａｓ１３酵素によって切断され、ＲＮＡの一部、完全なＤＮＡ配列、及びＦＩＴＣ標識を含む断片が溶液中に放出される。いくつかの実施形態では、この作用は、各位置または異なるレポーターを有するスポットで並行して繰り返される。いくつかの実施形態では、この作用は、５つの異なる標的核酸について位置Ｄ１からＤ５で並行して繰り返され、５つの別個のレポーター断片を生成する。いくつかの実施形態では、次いで、溶液をラテラルフローアッセイストリップの試料パッドに接触させ、試料パッドはＨＲＰ抗ＦＩＴＣを含む。いくつかの実施形態では、ＦＩＴＣ標識レポーター断片は、次にＨＲＰ－抗－ＦＩＴＣに結合して複合体（２７０３）を形成し、検出領域を横切って下流に運ばれ、複合体（２７０３）のオリゴの補完となるように設計された捕捉オリゴを含む検出スポットに特異的に結合する。図２８は、１週間の隔たりで実施された２回の反復実験についてのＤＮＡｓｅ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのアッセイの結果を示す。

シグナル強化のためのガイドＲＮＡのプール
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＣａｓ複合体プローブ（２９００～２９０２）をガイドプールに使用して、図２９Ａに示すようにラテラルフローアッセイでシグナル検出を強化する。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ複合体プローブ（２９００）は、標的核酸の第１のセグメントに相補的な第１のｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第２のＣａｓ複合体プローブ（２９０１）は、同じ標的核酸の第２のセグメントに相補的な第２のｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第３のＣａｓ複合体プローブ（２９０２）は、同じ標的核酸の第３のセグメントに相補的な第３のｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ複合体プローブ、第２のＣａｓ複合体プローブ、及び第３のＣａｓ複合体プローブはすべて、標的核酸の存在を示すために標識されたレポーターの十分な切断を可能にするのに十分近くに位置する。図２９Ｂは、試料パッド（２９０３）、試験ライン（２９０４）、及びコントロールライン（２９０５）を含む典型的なラテラルフローアッセイストリップを示す。

本明細書では、ラテラルフローアッセイにおけるシグナルの検出の強化を達成するためのガイドプールの様々な実施形態について説明する。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ガイドプールは強化されたＣａｓ１２ａ活性を示す。図３０（実施例１４に記載）は、個々のｇＲＮＡフォーマットを使用するＤＥＴＥＣＴＲ（商標）Ｃａｓ１２ａベースのアッセイと比較して、被プールガイド（被プールｇＲＮＡ）フォーマットを使用するＧＦ１８４標的の強化されたＣａｓ１２ａベースの検出を示すＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの結果を記す。図３０において、「赤」で標識されたｙ軸は、強度の単位を表示し、ｘ軸は、異なるＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応が生じたチャンバの番号を示す。図３１（実施例１４に記載）は、個々のガイドフォーマットを使用するＣａｓ１３ａベースのアッセイと比較して、被プールガイドフォーマットを使用するＳＣ２標的のＣａｓ１３ａベースの検出の感度の向上を示すＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの結果を記す。

図３２（実施例１４に記載）は、被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、ガイドＲＮＡを個別の形式で含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも標的ＲＮＡの開始時のコピー当たりの増幅産物を含有する結晶を多く生成したことを示す、陽性液滴の数をカウントするために使用される、各チャンバに対応する画像を示す。

図３３（実施例１４に記載）は、被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、ガイドＲＮＡを個別の形式で含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも標的テンプレートＲＮＡの開始時のコピー当たりのシグナル強度をより多く生成したことを示す、増幅後のシグナル強度の測定を示す。図３４（実施例１４に記載）は、被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、ガイドＲＮＡを個別の形式で含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも標的テンプレートＲＮＡの開始時のコピー当たりのシグナル強度をより多く生成したことを示す、増幅後のシグナル強度の測定を示す。図３４はまた、陽性液滴の数を計数することによって実施された相対的定量化が、被プールガイドＲＮＡを含有するＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料が、個々のフォーマットのガイドＲＮＡを含むＣａｓ１３ａ－ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料よりも、標的テンプレートＲＮＡの開始時のコピー当たりの増幅生成物を含む結晶を多く生成したことを示している。

図３５（実施例１４に記載）は、被プールガイド（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１）を含むＣａｓ１３ａＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの試料は、単一ガイドＲ４６８４、Ｒ４６６７、Ｒ４７８５（ＲＮＡｓｅＰガイド）を個別のフォーマットで含むＣａｓ１３ａＤＥＴＥＣＴＲ（商標）の試料ほど、標的の開始時のコピー当たりの標的検出の感度が高くないと呈したことを示している。

本明細書では、操作されたプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、操作されたＣａｓタンパク質）及び、操作されたガイド核酸のうちの少なくとも１つを含む、天然に存在しない組成物及びシステムが開示され、それぞれ、本明細書では単にＣａｓタンパク質及びガイド核酸と呼ばれる場合がある。一般に、操作されたＣａｓタンパク質及び操作されたガイド核酸は、天然には見出されないＣａｓタンパク質及びガイド核酸をそれぞれ指す。場合によっては、システム及び組成物は、少なくとも１つの天然に存在しない成分を含む。例えば、組成物及びシステムは、ガイド核酸の配列が天然に存在するガイド核酸の配列とは異なるかまたは改変されているガイド核酸を含み得る。場合によっては、組成物及びシステムは、自然には一緒に発生しない少なくとも２つの成分を含む。例えば、組成物及びシステムは、天然には一緒に存在しない反復領域及びスペーサー領域を含むガイド核酸を含み得る。また、例として、組成物及びシステムは、天然には一緒に存在しないガイド核酸及びＣａｓタンパク質を含み得る。逆に、明確にするために、「天然」、「天然に存在する」、または「自然界に見出される」Ｃａｓタンパク質またはガイド核酸には、人間や機械により遺伝子改変されていない細胞または生物からのＣａｓタンパク質及びガイド核酸が含まれる。

場合によっては、ガイド核酸は非天然の核酸塩基配列を含む。場合によっては、非天然配列は、天然には見出されない核酸塩基配列である。非天然配列は、天然に存在する配列の一部を含んでもよく、天然に存在する配列の一部は、天然に存在する配列の残りがなければ自然界には存在しない。場合によっては、ガイド核酸は、自然界では認められない順序または近接性で配置された２つの天然に存在する配列を含む。いくつかの例では、組成物及びシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質を含むリボヌクレオチド複合体と、自然界では一緒に生じないガイド核酸とを含む。操作されたガイド核酸は、天然には一緒に存在しない第１の配列及び第２の配列を含み得る。例えば、操作されたガイド核酸は、天然に存在する反復領域の配列と、天然に存在する真核配列に相補的なスペーサー領域とを含み得る。操作されたガイド核酸は、生物において天然に存在する反復領域の配列と、その生物において天然に存在しないスペーサー領域とを含み得る。操作されたガイド核酸は、第１の生物において生じる第１の配列、及び第２の生物において生じる第２の配列を含み得、第１の生物及び第２の生物は異なる。ガイド核酸は、ガイド核酸の３’末端または５’末端に、またはガイド核酸の第１の配列と第２の配列の間に配置された第３の配列を含み得る。例えば、操作されたガイド核酸は、リンカー配列によって結合された天然に存在するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。

場合によっては、本明細書に記載の組成物及びシステムは、天然に存在するＣａｓタンパク質に類似する操作されたＣａｓタンパク質を含む。操作されたＣａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の一部を欠いている可能性がある。Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質と比較して突然変異を含んでもよく、この場合この突然変異は自然界では見られない。Ｃａｓタンパク質はまた、天然に存在するＣａｓタンパク質と比較して、少なくとも１つの追加のアミノ酸を含み得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質に対する核局在化シグナルの付加を含み得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在する配列に対してコドン最適化されている（例えば、真核細胞における発現のために）。

場合によっては、本明細書で提供される組成物及びシステムは、Ｃａｓタンパク質及び本明細書に記載のガイド核酸をコードするマルチベクターシステムを含み、ガイド核酸及びＣａｓタンパク質は、同じまたは異なるベクターによってコードされる。いくつかの実施形態では、操作されたガイド及び操作されたＣａｓタンパク質は、システムの異なるベクターによってコードされる。

定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。本明細書における「または」への言及は、いずれも特に明記しない限り、「及び／または」を包含することが意図される。

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語及びその文法上の同義語は、記載された特徴、整数、工程、動作、要素、及び／または成分の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、工程、動作、要素、成分、及び／またはそれらのグループの存在または追加を排除するものではない。本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、関連する列挙された項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる組み合わせを含む。

本明細書で使用される場合、具体的に記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、数または数の範囲に関して「約」という用語は、記載された数及びその数＋／－１０％、またはある範囲について記載された値について記載された下限を１０％下回り、上限を１０％上回ることを意味すると理解される。

本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、及び「患者」という用語は互換的に使用され、ヒトを含む動物界の任意のメンバーを含む。

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、合成抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（二重特異性ｓｃＦｖを含む）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、またはそれらのエピトープ結合断片を指すが、これらに限定されない。いくつかの場合では、抗体は、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分である。いくつかの例では、抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む動物起源である。あるいは、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。

以下の実施例は、例示であり、本明細書に記載の合理化されたラテラルフロー装置及び方法の範囲を限定するものではない。

実施例１：核酸検出用のラテラルフロー装置
この例では、核酸検出用の合理化されたラテラルフロー装置について説明する。

個人から得た生物学的試料を試験して、個人は関心対象の標的核酸を持っているか判定できる。生物学的試料を試験して、標的核酸配列の存在または非存在を検出することができる。

装置は、試料調製、任意の増幅、及び標的核酸の検出のための試薬を含む、複数の単回使用のカートリッジを収容するように構成される。装置は、次の工程、（１）試料の調製（例えば、室温でのスワブからの溶出、（２）６０℃での等温核酸増幅（３）３７℃でのＣＲＩＳＰＲに基づく反応（例えば、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応）、及び（４）ラテラルフローストリップを使用した結果の視覚的読み取り（図１）を実行する。当該合理化されたラテラルフロー装置の図面が図２に示されている。

試料調製は、プロトタイプに搭載された溶液を用いた化学的溶解を含む。試料の溶解物（約２００μＬ）の全量は、少なくとも２つのラテラルフローストリップに分配される。昇温温度は６２℃、２～５分で予熱あり、試料投入で即反応開始、及び／または３７℃、２～５分予熱ありで、試料投入で即反応開始。ラテラルフロー装置は電池式で、単回使用である。操作者（例えば、臨床医または検査技師）は、装置に挿入されたスワブを取り除くことができないため、汚染、試料の漏れ、試料の損失などを減らすことができる。ユーザは、試料をラテラルフロー装置に挿入し、装置が試料を処理し、標的核酸を増幅し、標的核酸の有無を示す結果を得ることを可能にする。

標的測定基準、用途、微生物標的、及び追加の特徴の要約を以下の表５に示す。

（表５）

実施例２－改善させた核酸検出用のラテラルフロー装置
この実施例は、核酸の検出のための改善されたラテラルフロー装置を記載する。実施例１のラテラルフロー装置を改変し、関心対象の核酸のＣＲＩＳＰＲベースの検出に使用する。実施例１のラテラルフロー装置は、（１）酸化マグネシウム結晶または他の薬剤の使用による電源フリー機能、（２）増幅工程の除去、及びそれによる増幅に対応する領域の除去、及び（３）ＮＰスワブ以外の他の試料タイプ（唾液や血液など）の使用のために改変される。それは戦闘機のニーズに適応される。ユーザは、試料をラテラルフロー装置に挿入し、装置が試料を処理し、標的核酸の有無を示す結果を得ることを可能にする。

実施例３：核酸の検出のためのラテラルフロー装置のガイドプール
この実施例は、核酸の検出のためのラテラルフロー装置のガイドプールを記載する。実施例１または実施例２のラテラルフロー装置を核酸の検出に使用する。これらのラテラルフロー装置でマルチプレックスアッセイを実行し、５プレックスまたは１０プレックスのガイドプールを使用して、それぞれ５または１０の個別の標的を標的化、結合、及び検出する。ガイドプールは、標的の同じ核酸の異なる領域を標的にするように設計されているか、または様々な微生物をまとめて標的にするよう設計されている。ユーザは試料をラテラルフロー装置に挿入し、装置が試料を処理できるようにし、任意に標的核酸を増幅し、各標的核酸の存在または非存在を示す結果を得る。

実施例４：ポイントオブニ―ドＣＲＩＳＰＲ装置の概念設計
在宅試験は、迅速な試験結果、改善された疾患管理、及び医療提供者への疾患伝染のリスクの低減を含めた、患者と地域社会の両方に対する相当の利点を提供する。在宅試験の最も広く使用されている適用の２つは、グルコースモニタリング（Ｔｏｎｙｕｓｈｋｉｎａ＆Ｎｉｃｈｏｌｓ、２００９年）と妊娠試験（Ｇｎｏｔｈ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、２０１４年）である。ラテラルフローアッセイ（Ｋｏｃｚｕｌａ＆Ｇａｌｌｏｔｔａ、２０１６年）などの技術により、血液、唾液、尿などの体液中のタンパク質を迅速に試験できるようになっている。試料の回収にスワブを使用したラテラルフローによるタンパク質検出の商業的な例は、ＳａｖｖｙＣｈｅｃｋＴＭＶａｇｉｎａｌＹｅａｓｔＴｅｓｔ（「ＳａｖｖｙＣｈｅｃｋＴＭＶａｇｉｎａｌＹｅａｓｔＴｅｓｔ－ＳａｖｙｏｎＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ」、ｎ．ｄ．）である。在宅試験の可能性はあるものの、既存の試験方法は低分子とタンパク質の検出に限定されており、必要な時点で分子試験を行うための技術は現在存在していない。この実施例では、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイとスワブ入力を使用する在宅試験用のポイントオブニード装置の着想について説明する。

この実施例では、以下の工程が実行される：（１）試料調製（室温でのスワブからの溶出）、（２）約６０℃での等温核酸増幅、（３）３７℃でのＣＲＩＳＰＲベースの反応Ｃ、及び（４）ラテラルフローストリップを使用した、結果の視覚的な読み出しである。図１は、装置で行われるプロセスのワークフローを示している。

装置を使用するために、ユーザは、鼻孔（または、頬の細胞が標的の場合は頬）をスワブし、スワブを装置にねじ込む。蓋を装置にねじ込むときに、装置がロックされ（チャイルドセーフティロックのようなメカニズムを使用）、液体が装置から漏れるのを防ぐ。ロックを通過した後、蓋をねじ込み続けると、ブリスターパックに穴が開き、試料ポートの上部近くにあるブリスターパックに保存されている溶解緩衝剤とＬＡＭＰ緩衝剤が放出される。装置の試料調製部分の断面の概略図が、以下の図１５に示されている。

装置の試料調製部分の後、アッセイの残りに使用できる異なる戦略がある。１つのオプションは、図示のようにＬＡＭＰ部分の蛇行チャネルを使用して、連続マイクロ流体チャネルを使用することである。このチャネル内の流れは、チャネルの表面が十分に親水性であるとき、毛細管流によって駆動され得る。図１６は、マイクロ流体装置を上から見たところを概略的に示した平面図である。試料調製領域（図１で上述したスキームなど）が標識されているが、簡単にするために円として描かれている。マイクロ流体アーキテクチャの残りの部分は、黒い線で示されている。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）に多重化が必要なとき、設計を変更して、各分岐に１つの標的がある分岐ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）チャネルを含めることができる。反応のために、流体はＬＡＭＰチャネルをゆっくりと流れ、ヒーター上を移動して、標的の増幅をもたらす。その後、試料は凍結乾燥されたＤＥＴＥＣＴＲ（商標）試薬に接触し、検出用の光学システムがあり得る別のヒーター上でインキュベートされる。ＬＡＭＰの多重化が必要な場合は、複数のＬＡＭＰチャネルを有して実現できる。図１７は、この実施例で説明した装置のプロセス工程の詳細を提示している。

実施例５：アンプリコンの汚染を防ぎながらＣＲＩＳＰＲ診断反応を実行するためのクローズドラテラルフローアッセイ形式
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ診断反応は、２つの工程を含み得る。１つ目は、アッセイの単一分子感度を可能にし得る任意選択の核酸増幅工程である。この核酸増幅工程には、熱サイクル及び熱安定性ポリメラーゼを使用するＰＣＲなどの方法、または単一の温度で核酸標的を増幅するＲＰＡ、ＬＡＭＰ、ＳＤＡ、またはＮＥＡＲなどの等温法が含まれ得る。ＣＲＩＳＰＲ診断の２番目の工程は、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、またはＣａｓ１４などのプログラマブルヌクレアーゼタンパク質を使用して、プログラマブルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を使用した核酸増幅工程によって生成されたアンプリコンを認識するＣＲＩＳＰＲ酵素反応である。臨床試験室またはその他の設定でＣＲＩＳＰＲ診断反応を実行する主なリスクの１つは、核酸アンプリコンが試験室を汚染し、アッセイで偽陽性につながる潜在可能性である。ＰＣＲ及びその他の核酸増幅法では、これは一般に、増幅後にアッセイプレートを開けないようにすることで制御できる。ただし、一部のＣＲＩＳＰＲ診断ワークフロー、特にラテラルフローを読み出しとして使用するワークフローでは、通常、核酸アンプリコンの反応ボリュームを開いて、それをＣＲＩＳＰＲ酵素と結合させる。ラテラルフローストリップに搭載される核酸増幅反応を含む装置が開発されている。この例では、ＣＲＩＳＰＲ診断反応の２つの成分（核酸増幅反応及びＣＲＩＳＰＲ酵素という成分）を混合するように設計された装置が設計されるのと同時に、核酸アンプリコンによる実験室またはその他の環境の汚染を防ぐ。簡潔に、この装置は、核酸増幅反応を含む１つのチューブと、ＣＲＩＳＰＲ酵素構成要素を含む別のチューブを保持する反応カセットを使用する。装置のユーザは、増幅が終了した核酸増幅反応チューブを反応カセットに挿入する。反応カセットには、ＣＲＩＳＰＲ酵素試薬を含む２つ目のチューブも含まれている。反応カセットが装置に挿入され、装置の外部アームが反応カセットを押し下げ、装置を密閉する。反応カセットが押し下げられるときに、図１８に見られるように、２本の管を貫通する２本の針状またはかみそりの刃状の突起に押し付けられる。２本のチューブの内容物がミキシングチャンバに共に溜まり、紙のウィックに滴り落ちる。このウィックは、試薬を引き上げて、図１９にて見えるようにラテラルフローストリップを含む装置内部のカセットに入れる。ラテラルフローストリップは、ＣＲＩＳＰＲ診断反応の結果を評価するために使用される。反応チャンバの内容物をラテラルフローアッセイストリップ（複数可）と接触させるために、他の機構（例えば、アクチュエータ、マイクロフルイディクス、ポンプなど）を使用することができる。

実施例６：アンプリコンの汚染を防ぎながらＣＲＩＳＰＲ診断反応を実行するためのクローズドスピンカラムフォーマット
この実施例では、スピンカラムを使用して反応の２つの部分を分離するアッセイの第２の形式が、図２０に見られるように、説明される。核酸増幅反応はメインチューブの底で行うことができるが、ＣＲＩＳＰＲ酵素試薬はスピンカラム内のメインの反応とは別に保持される。より高い温度（例えば、５５～６０℃）に耐えることができるＣＲＩＳＰＲ酵素を使用するか、ＣＲＩＳＰＲタンパク質を変性させる温度を必要としない等温法を使用する場合、等温増幅は、ＣＲＩＳＰＲ診断反応のパフォーマンスを阻害することなくＣＲＩＳＰＲ成分から物理的に分離することができる。次いで反応は、マイクロ遠心チューブでチューブを回転させるか、シリンジを使用してＣＲＩＳＰＲ試薬を底部のチューブに押し込むことによって、組み合わせることができる。アッセイの結果は、アッセイの蛍光出力の視覚的検出を可能にする青色光とフィルターを使用して見ることができる。

実施例７：ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのラテラルフローアッセイストリップ
この実施例の目的は、図２３Ａ～Ｂに示されるように、平行読み出しのためのラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）ストリップを使用する、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースの多重化アッセイを実証することである。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイを実施するために、表面（２３００）をプログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）及びレポータープローブ（２３０１）で固定化する。この例では、面はＬＦＡストリップから分離される、ウェルの底である。レポータープローブ（２３０１）は、表面リンカー（２３０２）、切断可能な核酸配列（２３０３）、標識（２３０４）、及びストリップのフロー捕捉プローブ（２３０５）に対する結合部分を含む。この実施例では、結合部分はビオチンである。標識及び結合部分は、第２のリンカー（２３０６）によって核酸（２３０３）に結合され、この例では、リンカーはデンドリマーまたはトレブラー分子である。プログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）は、表面リンカーと、ｓｇＲＮＡ（２３０８）を順次含むプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ酵素）を含む。ｓｇＲＮＡには、反復単位（またはヘアピン）と認識配列が含まれている。認識配列は、試料の標的核酸に対する相補体である。

抗ビオチン標識金ナノ粒子は、図２３Ｂに示されるように、ＬＦＡストリップ（２３１０）の試料パッド（２３１１）に配置される。

この実施例では、最初の工程は、表面（２３００）を、標的核酸を含む試料と接触させることである。固定されたプログラマブルヌクレアーゼプローブ（２３０７）のｓｇＲＮＡ（２３０８）に相補的な標的核酸が結合すると、近接して固定されたレポーター（２３０１）がプログラマブルヌクレアーゼによって切断され、レポーター（２３０９）の切断された部分が溶液に放出される。

次に、試料中に存在した標的核酸に対応する切断されたレポーターを含む試料溶液を、ラテラルフローアッセイストリップ（２３１０）の試料パッド（２３１１）に次いで接触させる。この実施例において、試料パッドは、その上に配置されたフロー捕捉プローブ（例えば、抗ビオチン標識金ナノ粒子）を有する。レポーター分子の放出された部分を含む試料溶液が試料パッドと接触すると、当該試料溶液は次いで試料パッドを横切って流れる（例えば、ウィッキングによって）。試料溶液中の切断されたレポーターは、溶液での接触時に抗ビオチン金ナノ粒子フロー捕捉プローブと接触して結合する。次に、レポーターとナノ粒子の複合体は、ラテラルフローアッセイストリップの検出領域（２３１２）を通る毛細管現象によって、残りの液体試料と共に下流に運ばれる。この実施例では、検出領域（２３１２）は、６つの検出スポット（２３１３）を含み、各検出スポット（２３１３）は、レポーターの色素（２３０４）に特異的な異なる捕捉抗体タイプを含む。この実施例では、色素（２３０４）はＦＩＴＣであり、固定の捕捉プローブは検出スポット（２３１３）に対して官能化された抗ＦＩＴＣ抗体であり、他の標的核酸に特異的な他のレポーターの中でＦＩＴＣ標識レポーターの特異的検出を可能にする。コントロールライン（２３１４）が存在し、抗ＩｇＧで官能化され、ＦＩＴＣ標識レポーター断片（例えば、検出部分）に結合していないすべてのフロー捕捉プローブが捕捉及び検出されるようになっている。この実施例では、シグナルを増幅するために、複数の標識及び結合部分が検出部分（２３０６）のデンドリマーリンカーを介して存在していたことに留意すべきである。この実施例では、複数の検出スポット（２３１３）が存在し、実施例８で説明されているように、多重化された試料の並列検出の潜在可能性が許容される。

実施例８：多重化されたＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのラテラルフローアッセイストリップ
この実施例の目的は、図２４に示されるように、多重「ホットポット」アッセイを利用するラテラルフローアッセイストリップワークフローを実証することである。この実施例では、試料（２４０１）は標的核酸配列１及び２を含む。試料（２４０１）は、Ｄ１からＤ５までの５つの位置のそれぞれで、表面に固定化されている異なるｓｇＲＮＡ’配列が存在するウェルの表面（２４０２）に接触する。例えば、５つの異なるｓｇＲＮＡ’の各々は、図２４に示されるように、Ｄ１からＤ５までの５つの異なる位置に固定化された５つの異なるプログラマブルヌクレアーゼプローブ（例えば、図２３を参照）の一部である。さらに、５つの異なるｓｇＲＮＡ’のそれぞれが、試料中の異なる標的核酸に特異的に結合するように設計されているため、試料の多重化が可能になる。ｓｇＲＮＡを含む固定化されたプログラマブルヌクレアーゼプローブに加えて、Ｄ１からＤ５までの各位置は、異なる官能基を持つレポータープローブで官能化されている。レポータープローブは、プログラマブルヌクレアーゼプローブによって切断されるのに十分なほど近接している。したがって、実施例７に記載されるように、レポーターは、ｓｇＲＮＡと、ｓｇＲＮＡが特異的に結合するように設計された標的核酸との間の結合時に切断され、溶液中に放出される。この実施例では、Ｄ４とＤ５にはそれぞれ、２つの異なる標識または捕捉抗体認識要素で標識されたレポーターが含まれている。試料がウェル（Ｄ１からＤ５）と接触すると、レポーター分子のそれぞれの切断された部分が試料溶液中に放出される（実施例７に記載）。次いで、放出されたレポーター分子を含む試料溶液を試料パッドと接触させ、この実施例では、ラテラルフローアッセイに配される。この実施例では、各検出スポットに異なる種類の捕捉抗体が含まれており、各捕捉抗体の種類は、レポーターの特定の標識に特異的に結合する。この実施例では、検出スポット（２４０３）は捕捉抗体抗ＦＩＴＣを含み、ウェルＤ５は、１）第１の標的核酸配列に特異的なｓｇＲＮＡを含む固定化されたＣａｓ複合体、及び２）固定化されたレポーター分子（２４０６）を含み、それはＦＩＴＣで標識付けされている。したがって、第１の標的核酸配列が、対応するｓｇＲＮＡと結合すると、対応する固定化レポーター分子（２４０６）と対応する核酸（例えば、図２３の参照文字２３０１を参照）との間の結合が切断され、それにより、レポーター分子を溶液に放出する。対照的に、この実施例では、検出スポット（２４０４）には捕捉抗体抗ＤＩＧが含まれているが、ウェルＤ４は、１）第２の標的核酸配列に特異的なｓｇＲＮＡを含む固定化されたＣａｓ複合体、及び２）ＤＩＧで標識されている、固定化されたレポーター分子（２４０５）を含む。したがって、第２の標的核酸配列が対応するｓｇＲＮＡと結合すると、対応する固定化レポーター分子（２４０５）と対応する核酸との間の結合（例えば、図２３の参照文字２３０１を参照）が切断され、それによってレポーター分子が溶液に放出される。次に、切断されたレポーター分子（２４０５及び２４０６）を含む溶液を、チェイス緩衝液と共にＬＦＡストリップの試料パッドに接触させ、それにおいてレポーター分子が、試料パッドに配置されるフロー捕捉プローブ（例えば、抗ビオチンＡｕＮＰｓ）に結合し、それをピックアップする。ＦＩＴＣで標識されたレポーター（２４０６）を有するＡｕＮＰ－レポーターコンジュゲートは、捕捉抗体抗ＦＩＴＣを含有する検出スポット（２４０３）に選択的に結合し、したがって試料中の第１の標的核酸配列の存在を示す。ＤＩＧで標識されたレポーター（２４０５）を有するＡｕＮＰ－レポーターコンジュゲートは、捕捉抗体抗ＤＩＧを含有する検出スポット（２４０４）に選択的に結合し、したがって試料中の第２の標的核酸配列の存在を示す。このようにして、多重化試料中に存在する２つ以上の標的核酸配列の並行検出が可能になる。いくつかの実施例では、所与の検出スポットでのレポーター分子の検出が特定の標的核酸と相関するように、検出スポットは所定の位置で互いに離間している。

実施例９：ＨＲＰ強化のＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのラテラルフローアッセイストリップ
この実施例の目的は、図２５に示されるように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の紙ベースの検出を実証することである。ここで、「紙ベース」とはラテラルフローアッセイストリップを指す。実施例７及び８のように、標的（複数可）核酸配列を含む液体の青色試料を、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ／ｇＲＮＡプローブ及びレポータープローブが固定化された表面にさらす。この実施例では、レポータープローブにＨＲＰ分子が含まれている。標的とガイドＲＮＡ間の特異的結合イベントに続くＣａｓ酵素によりレポーターが切断すると、レポーターの切断された部分が試料溶液に放出される。この実施例では、報告された分子の放出されたセクションを有する試料溶液は、その後、水和するとＨ_２Ｏ_２を生成する過炭酸ナトリウムを含む試料パッドを含むラテラルフローアッセイストリップと接触する。Ｈ_２Ｏ_２を形成するための過炭酸ナトリウムの再水和は、前の例７及び８で説明したように、試料が試料パッド及びラテラルフローアッセイを通して検出スポットに運ばれるときに発生する。この実施例では、青から赤への色の変化を活性化する化学的基質ＤＡＢ及びＴＭＢは、ＨＲＰの存在を示し、順次標的核酸配列の「ヒット」を示す。ＨＲＰの化学触媒性質により、シグナルの増幅が可能になる。あるいは、試料溶液の色が青から赤に変化したときに、溶液中で読み出しを行うこともできる。

実施例１０：ＨＲＰ強化の多重化されたＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのラテラルフローアッセイストリップ
この実施例の目的は、図２６に示されるように、ＨＲＰシグナル強化の多重化されたラテラルフローアッセイを実証することである。固定化表面（２６００）及びラテラルフローアッセイストリップ（２６１０）での検出は、シグナルの伝達が金ナノ粒子散乱光によって実行されないことを除いて、前の実施例で説明したように実行される。代わりに、抗ビオチン標識ＡｕＮＰは、ＨＲＰ抗ビオチンＤＡＢ／ＴＭＢに代わられる。ＨＲＰは、ＬＦＡストリップに存在する過炭酸ナトリウムによって活性化され、反応緩衝剤及び／またはチェイス緩衝液によって再度水和される。このようにして、ＨＲＰは、ＰＣＲなどの試料の増幅を必要としないように、十分に強いシグナルを可能にする。多重化検出は、実施例８に記載したのと同じ方法で達成される。

実施例１１：Ｃａｓ１３ベースのＨＲＰ強化ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ＬＦＡと捕捉オリゴプローブ特異性
この実施例の目的は、図２７に示されるように、ＤＮＡに対するＣａｓ１３ＲＮＡ切断特異性、ＨＲＰシグナル強化、及び捕捉オリゴプローブ特異性を利用する多重化された標的核酸検出を実証することである。この実施例では、試料（２７００）は異なる標的核酸を含む。次いで、試料（２７００）を、実施例８に記載のように、Ｄ１～Ｄ５の５つの位置で官能化されたウェルの表面（２７０１）に接触させる。ここでの違いは、Ｃａｓ１３酵素がＣａｓ複合体プローブに存在することである。Ｃａｓ１３はＲＮＡを切断するが、ＤＮＡは切断しない。これにより、一方がＤＮＡで構成され、他方がＲＮＡで構成された核酸配列を含むレポーター（２７０２）の使用が可能になる。標的核酸がｓｇＲＮＡに結合すると、レポーターのＲＮＡがＣａｓ１３酵素によって切断され、ＲＮＡの一部分、完全なＤＮＡシーケンス、及びＦＩＴＣの標識を含む断片が、溶液に放出される。この行為は、５つの異なる標的核酸の各スポットＤ１からＤ５で並行して繰り返され、５つの異なるレポーター断片が生成される。次に、溶液をＬＦＡストリップの試料パッドに接触させ、試料パッドは、ＨＲＰ抗ＦＩＴＣが含まれている。次に、ＦＩＴＣ標識レポーター断片は、ＨＲＰ抗ＦＩＴＣに結合し、複合体（２７０３）を形成し、検出領域を横切って下流に運ばれ、複合体（２７０３）のオリゴの補完となるように設計された捕捉オリゴを含む検出スポットと特異的に結合する。このようにして、実施例８に記載されたような多重化された試料の並列検出が可能である。

実施例１２：Ｃａｓ１４を利用するＨＲＰ強化のＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのラテラルフローアッセイストリップ
この実施例の目的は、図２５に示されるように、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の紙ベースの検出を実証することである。ここで、「紙ベース」とはラテラルフローアッセイストリップを指す。実施例７及び８のように、標的（複数可）核酸配列を含む液体の青色試料を、プログラマブルヌクレアーゼプローブ及びレポータープローブが固定化された表面にさらす。この実施例では、レポータープローブにＨＲＰ分子が含まれている。標的とガイド核酸間の特異的結合イベントに続きＣａｓ１４酵素によりレポーターが切断すると、レポーターの切断された部分が試料溶液に放出される。この実施例では、試料溶液は、その後、水和するとＨ_２Ｏ_２を生成する過炭酸ナトリウムを含む試料パッドを含むラテラルフローアッセイストリップにさらされる。Ｈ_２Ｏ_２を形成するための過炭酸ナトリウムの再水和は、前の実施例７及び８で説明したように、試料が領域を通ってウィッキングされるときに発生する。基質にはＤＡＢ、ＴＭＢなどが含まれているため、「スポット」は青から赤に変化し、ＨＲＰの存在を示し、順次標的核酸配列の「ヒット」を示す。このようにして、ＨＲＰはシグナルの増幅を可能にする。あるいは、図２５に示すように、試料溶液の色が青色から赤色に変化したときに、溶液中で読み取りを行うこともできる。

実施例１３：ＨＲＰ－Ｔ２０－ビオチンＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのアッセイ
この実施例の目的は、ＨＲＰ及びＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ベースのアッセイを実証することであった。この実施例では、レポーターはＣａｓ複合体、または溶液中のＤＮＡｓｅ酵素によって切断された。切断されたレポーターは、ＨＲＰ－Ｔ２０－ビオチンに反応した。次いで、ＴＭＢ及びＨ_２Ｏ_２を含有する反応容量に上澄み溶液を添加して、色シグナルを発生させた。次いで、溶液の光学密度測定によって、切断されたレポーター－ＨＲＰコンジュゲートを検出した。光学密度測定値は、反応の最初から得られた。実験は、それぞれ２回の実行を含む２つのセットで実行され、各セットは１週間間隔で実行された。ＤＮａｓｅとＤＥＴＥＣＴＲ（商標）は、各セットの各実行で別々に使用された。ＤＮａｓｅの実行では、１ｎＭのＨＲＰ標的オリゴを青のシリーズで使用した。結果を図２８に示す。この実施例の重要性は、ＨＲＰとＤＥＴＥＣＴＲ（商標）の両方の複数回のターンオーバーにより、ＰＣＲなどの試料増幅に代わるシグナルの増幅が可能になることである。

実施例１４：ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイにおける強化された標的検出シグナル用のガイドプーリング
単一の標的分子内の異なる領域に結合するように設計されたガイドＲＮＡを、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイからの標的検出シグナルを強化するための戦略としてプールした。例えば、この戦略では、各ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）（商標）反応はＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＲＮＰ複合体のプールを含み、それぞれが単一の標的核酸分子内の異なる領域を標的とした。本明細書で論じられるように、この戦略は、シグナルがポアソン分布（１未満のコピー／液滴）内で検出するのに十分に強く、試料内の標的数の定量的評価を成すように、増加した数の複合体／単一標的を使用することによって、標的検出に対する感度の増加をもたらした。

Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼを使用した標的検出に対するガイドプールの効果を試験するために、最初にＣａｓ１２ａ複合化混合物を調製し、それにおいて、Ｒ１９６５（オフターゲットのガイド）、Ｒ１７６７、Ｒ３１６４、Ｒ３１７８ガイドが、被プールｇＲＮＡフォーマット（Ｒ１７６７、Ｒ３１６４、またはＲ３１７８から選択された３つのガイドのうちの２つ以上のプール）または単一ｇＲＮＡフォーマット（Ｒ１７６７、Ｒ３１６４、Ｒ３１７８が個別に存在する）に存在し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。テンプレートＲＮＡ（ＧＦ１８４）の２倍希釈系列を開始時の希釈濃度から作成した（５．４μｌの０．１ｎｇ／μＬのＧＦ１８４を、４４．６μｌのヌクレアーゼ不含有水に添加）。次に、Ｃａｓ１２複合体、レポーター基質、フルオレセイン、緩衝剤、及び希釈テンプレート（ＧＦ１８４またはオフターゲットテンプレートＧＦ５７７）を含むＤＥＴＥＣＴＲ（商標）マスターミックスを、表６に示すように構築した。その後、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ミックスをＳｔｉｌｌａＳａｐｐｈｉｒｅチップに搭載し、ＮａｉｃａＧｅｏｄｅに入れた。結晶は、各試料からの数千の液滴から作成された。増幅工程は実行されなかった。ＳａｐｐｈｉｒｅチップからのシグナルはＲｅｄチャネルで測定された。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの結果は、個々のガイドフォーマットを使用したＤＥＴＥＣＴＲ（商標）Ｃａｓ１２ａ－ベースのアッセイと比較して、被プールガイドフォーマットを使用したＧＦ１８４標的の強化されたＣａｓ１２ａベースの検出を示した。例えば、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイは、２つのガイドＲ１７６７及びＲ３１７８のプールを含むチャンバ５からの強化されたシグナルを、それぞれ個別のガイドフォーマットで、Ｒ１７６７及びＲ３１７８を含むチャンバ２またはチャンバ４からのシグナルと比較して、示した（図３０）。同様に、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイは、２つのガイド（Ｒ１７６７及びＲ３１７８）のプールを含むチャンバ５からのシグナルと比較して、またＲ１７６７、Ｒ３１６４、及びＲ３１７８をそれぞれ個別のガイドフォーマットにおいて含むチャンバ２、チャンバ３、またはチャンバ４からのシグナルと比較して、３つのガイド（Ｒ１７６７、Ｒ３１６４、及びＲ３１７８）のプールを含むチャンバ９からの強化されたシグナルを示した（図３０）。

（表６）

Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼの場合でも、ガイドプールによる標的検出に対する感度の向上が認められた。これらのアッセイでは、Ｃａｓ１３ａ複合化ミックスを調製し、それにおいて、Ｒ００２（オフターゲットのガイド）、Ｒ４５１７、Ｒ４５１９、Ｒ４５３０ガイドが、被プールｇＲＮＡフォーマット（Ｒ４５１７、Ｒ４５１９、またはＲ４５３０うちの２つ以上のプール）または単一ｇＲＮＡフォーマット（Ｒ４５１７、Ｒ４５１９、Ｒ４５３０が個別に存在する）に存在し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。次に、Ｃａｓ１３複合体、ＦＡＭ－Ｕ５レポーター基質、緩衝剤、及び希釈テンプレートＳＣ２ＲＮＡ（またはオフターゲットテンプレート５Ｓ－８７）を含むＤＥＴＥＣＴＲ（商標）マスターミックスを、表７に示すように構築した。その後、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）ミックスをＳｔｉｌｌａＳａｐｐｈｉｒｅチップに搭載し、Ｎａｉｃａ（登録商標）Ｇｅｏｄｅシステムに入れた。各試料の液滴から結晶が生成され、３７℃でインキュベートされた（増幅工程は実行されず）。ＳａｐｐｈｉｒｅチップからのシグナルはＣｙ５チャネルで測定された。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイの結果は、単一ガイドフォーマットを使用したＳＣ２標的ＲＮＡのＣａｓ１３ａベースの検出と比較して、被プールガイドフォーマットを使用したＳＣ２標的ＲＮＡの強化されたＣａｓ１３ａベースの検出を示した。例えば、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイは、１×１０^６コピーの濃度のテンプレート、及びそれぞれ個別のガイドフォーマットのガイドＲ４５１７、Ｒ４５１９、及びＲ４５３０を含むチャンバ２、チャンバ４、またはチャンバ６からのシグナルと比較して、１×１０^６コピーの濃度のテンプレートと、３つのガイドＲ４５１７、Ｒ４５１９、及びＲ４５３０のプールを含むチャンバ８（飽和－表示なし）からの強化されたシグナルを示した（図３１）。同様に、ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイは、１×１０^６コピーの濃度のテンプレートを含み、またそれぞれ個別のガイドフォーマットのガイドＲ１７６７、Ｒ３１６４、及びＲ３１７８を含むチャンバ２、チャンバ６、またはチャンバ４からのシグナルと比較して、１×１０^５コピーの濃度のテンプレートと、３つのガイドＲ１７６７、Ｒ３１６４、及びＲ３１７８のプールを含むチャンバ９からの強化されたシグナルを示した（図３１）。

（表７）

次に、被プールガイドフォーマットと単一ガイドフォーマットのいずれかでガイドＲＮＡを含むＣａｓ１３ａデジタル液滴ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイにおける標的検出の感度をアッセイした。ＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応マスターミックスが、各ｇＲＮＡ（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１、またはＲ４７８５（ＲＮａｓｅＰ））用に調製され、ｇＲＮＡに加えて、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ、及びレポーター基質が含まれていた。複合化後、各ＲＮＰ２μＬが、被プールｇＲＮＡフォーマット（７つのｇＲＮＡ、すなわち、Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６７６、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１、Ｒ４６６７、及びＲ４６８４のプール）で結合されるか、単一ｇＲＮＡフォーマットのままであった（この場合、Ｒ４６６７、Ｒ４６８４、及びＲ４７８５（ＲＮＡｓｅＰは個別に存在）。テンプレートＲＮＡ（ＴｗｉｓｔＳＣ２、ＡＴＣＣＳＣ２、及び５ｓ－８７オフターゲット）を希釈して、一連のテンプレート濃度を得た。テンプレートＲＮＡ（ＴｗｉｓｔＳＣ２、ＡＴＣＣＳＣ２、及び５ｓ－８７オフターゲットテンプレートＲＮＡ）の検出を対象としたＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応は、表８に示すように、Ｃａｓ１３ａ－ｇＲＮＡＲＮＰを前の工程で希釈したテンプレートＲＮＡと組み合わせることによって構築した。構築組されたＤＥＴＥＣＴＲ（商標）反応はＳｔｉｌｌａＳａｐｐｈｉｒｅチップのチャンバに搭載された。チップはＮａｉｃａ（登録商標）Ｇｅｏｄｅシステムに配置され、液滴生成プログラムを使用して結晶が生成され、検出された標的を含む液滴を明らかにするために画像化された。

被プールガイド（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１）を含むＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイによる標的検出の感度を、単一ガイドＲ４６８４、Ｒ４６６７、Ｒ４７８５（ＲＮＡｓｅＰガイド）を個別のフォーマットで含むＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイによる標的検出の感度と比較した。これらの陽性液滴の数を計数することによって行われた相対的な定量化は、被プールガイドＲＮＡを含む試料が、個々のフォーマットのガイドＲＮＡを含む試料よりも、開始時の標的ＲＮＡのコピーあたりの増幅生成物を含む結晶を多く生成したことを示した（図３２）。例えば、チャンバ１からの陽性の液滴の数は、チャンバ２及び３の液滴の数よりも多く、チャンバ５からの液滴の数は、チャンバ６及び７の液滴の数より多い（図３２）。チップからの標的検出シグナル強度の測定により、被プールガイド（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１）を含むＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイによる開始時の標的ＲＮＡのコピーあたりの標的検出の感度が、単一ガイドＲ４６８４、Ｒ４６６７、Ｒ４７８５（ＲＮＡｓｅＰガイド）を個別のフォーマットで含むＤＥＴＥＣＴＲ（商標）アッセイによる標的検出の感度より高いことも、確認された（図３３）。例えば、チャンバ１（７つのガイドプールとＴｗｉｓｔＳＣ２テンプレートＲＮＡを含む）からのシグナル強度は、チャンバ２及び３（Ｒ４６８４、及びＲ４６６７ｇＲＮＡをそれぞれ個別の形式でＴｗｉｓｔＳＣ２ＲＮＡの存在下で含む）のシグナル強度よりも高く、チャンバ５（７つのガイドプールとＡＴＣＣＳＣ２テンプレートＲＮＡを含む）からのシグナル強度は、チャンバ６及び７（Ｒ４６８４及びＲ４６６７ｇＲＮＡをそれぞれ個別の形式で、ＡＴＣＣＳＣ２ＲＮＡの存在下で含む）のシグナル強度よりも高い（図３３）。同様に、チャンバ５（７つのガイドプールとＡＴＣＣＳＣ２テンプレートＲＮＡを含む）からのシグナル強度は、チャンバ６（ｇＲＮＡＲ４６８４を個別のフォーマットで、またＡＴＣＣＳＣ２ＲＮＡを含む）のシグナル強度、チャンバ８（ＡＴＣＣＳＣ２テンプレートＲＮＡを伴う個々のフォーマットのコントロールＲＮＡｓｅＰｇＲＮＡを含む）からのシグナル強度、及びチャンバ１２（テンプレートＲＮＡを伴わない７つの被プールｇＲＮＡを含む）からのシグナル強度よりも高い（図３３）。

チャンバ５（７つのガイドプール及びＡＴＣＣＳＣ２テンプレートＲＮＡを含む）で観察された、増幅された標的を含む液滴の数（開始時の標的ＲＮＡのコピーあたり）の相対的な定量化は、チャンバ６（個々のフォーマットのｇＲＮＡＲ４６８４とＡＴＣＣＳＣ２ＲＮＡを含む）で観察された液滴の数、チャンバ８（個々のフォーマットで、ＡＴＣＣＳＣ２テンプレートＲＮＡを伴うコントロールＲＮＡｓｅＰｇＲＮＡを含む）で観察された液滴の数、及びチャンバ１２（テンプレートＲＮＡを伴わない７つの被プールｇＲＮＡを含む）で観察された液滴の数よりも多い（図３４）。被プールガイド（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１）を含むアッセイによる標的検出の感度を、単一ガイドＲ４６８４、Ｒ４６６７、Ｒ４７８５（ＲＮＡｓｅＰガイド）を個別のフォーマットで含むアッセイによる標的検出の感度と比較し、その時アッセイはベンチトップアッセイフォーマットで実施された（図３５）。ベンチトップアッセイから得た結果は、被プールガイド（Ｒ４６３７、Ｒ４６３８、Ｒ４６６７、Ｒ４６７６、Ｒ４６８４、Ｒ４６８９、Ｒ４６９１）を含む試料は、単一ガイドＲ４６８４、Ｒ４６６７、Ｒ４７８５（ＲＮＡｓｅＰガイド）を個別のフォーマットで含む試料による標的検出の感度ほど高くないことを示した（図３５）。

（表８）

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本開示から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更、及び置換が考えられるであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替形態が、本開示を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれによって包含されることが意図される。

Claims

標的核酸を検出するためのシステムであって、
（ａ）試薬チャンバ；
（ｂ）前記試薬チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ；
（ｃ）前記反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター；ならびに
（ｄ）検出領域であって、前記検出領域は、その上に配置され、前記放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記検出領域
を含む、前記システム。
前記ガイド核酸が、前記標的核酸またはその一部に逆相補的な少なくとも１０個のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のシステム。
前記検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
増幅試薬をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
前記増幅試薬が前記試薬チャンバ内に位置する、請求項４に記載のシステム。
前記増幅試薬がＬＡＭＰ試薬である、請求項４に記載のシステム。
前記ラテラルフローアッセイストリップが試料パッドをさらに含む、請求項３に記載のシステム。
前記試料パッドが前記試薬チャンバである、請求項７に記載のシステム。
前記ラテラルフローアッセイストリップがフロー捕捉プローブを含む、請求項３に記載のシステム。
前記フロー捕捉プローブが抗ビオチン官能化金ナノ粒子である、請求項９に記載のシステム。
前記ラテラルフローアッセイストリップがコンジュゲーションパッドをさらに含み、前記試料パッドが前記コンジュゲーションパッドと流体連通している、請求項７に記載のシステム。
前記試料パッドが、前記コンジュゲーションパッドと前記検出領域との間に位置する、請求項１０に記載のシステム。
前記コンジュゲーションパッドがフロー捕捉プローブを含む、請求項１０に記載のシステム。
前記フロー捕捉プローブが抗体を含む、請求項１２に記載のシステム。
前記試料パッド及び／または前記コンジュゲーションパッドが前記検出領域と流体連通している、請求項１０に記載のシステム。
前記ラテラルフローアッセイストリップが吸収パッドをさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
前記試料パッド、前記コンジュゲーションパッド、及び／または前記検出領域が、前記吸収パッドと流体連通している、請求項１６に記載のシステム。
前記吸収パッドが、毛細管現象によって前記ラテラルフローアッセイストリップを通して試料を引き込むように構成され、前記試料が前記標的核酸を含む、請求項１７に記載のシステム。
試料が、外部圧力によって前記ラテラルフローアッセイストリップを通って駆動され、前記試料が前記標的核酸を含む、請求項１７に記載のシステム。
前記外部圧力が、前記ラテラルフローアッセイストリップと流体連通するポンプによって加えられる、請求項１９に記載のシステム。
前記ポンプが、手動駆動シリンジまたは自動シリンジポンプである、請求項２０に記載のシステム。
前記固定捕捉プローブが抗体を含む、請求項１に記載のシステム。
前記抗体が、核酸捕捉配列、抗ＦＩＴＣ、抗ＤＩＧ、抗ＴＡＭＲＡ、抗Ｃｙ５、及び抗ＡＦ５９４からなる群から選択される、請求項２２に記載のシステム。
前記検出部分が化学的官能基を含む、請求項１に記載のシステム。
前記化学的官能基がビオチンである、請求項２４に記載のシステム。
前記検出部分が標識を含む、請求項１に記載のシステム。
前記標識が、核酸捕捉配列に相補的な核酸配列、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ５（商標）、及びＡＦ５９４（商標）からなる群から選択される、請求項２６に記載のシステム。
前記プログラマブルヌクレアーゼプローブがＣａｓ酵素をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
前記Ｃａｓ酵素が、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、及びＣａｓＰｈｉからなる群から選択される、請求項２８に記載のシステム。
複数のプログラマブルヌクレアーゼ及び複数の異なるガイド核酸をさらに含む、システムであって、前記複数のプログラマブルヌクレアーゼの各プログラマブルヌクレアーゼが、前記複数の異なるガイド核酸のガイド核酸を含む、請求項１に記載のシステム。
各ガイド核酸が、対応する標的核酸に対して相補的である、請求項３０に記載のシステム。
複数のレポーターをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
複数の標識をさらに含む、システムであって、前記複数のレポーターの各レポーターが、検出部分及び前記複数の標識のうちの標識を含む、請求項３２に記載のシステム。
複数の異なる固定捕捉プローブをさらに含む、システムであって、前記複数の標識の各標識が、対応する固定の前記複数の異なる固定捕捉プローブに対して相補的である、請求項３３に記載のシステム。
エンクロージャが、試料入口、前記試薬チャンバ、及びラテラルフローストリップを含む、請求項１に記載のシステム。
前記試薬チャンバと前記検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む、請求項３５に記載のシステム。
前記シグナルが視覚シグナルである、請求項１に記載のシステム。
前記検出領域が１つまたは複数の検出スポットを含む、請求項１に記載のシステム。
前記１つまたは複数の検出スポットの各検出スポットが、複数の固定捕捉プローブのうちの対応する固定捕捉プローブを含む、請求項３８に記載のシステム。
前記検出スポットが、線、円、楕円、長方形、三角形、及びプラス記号からなる形状の群から選択される、請求項３９に記載のシステム。
前記試薬チャンバが表面を含む、請求項１に記載のシステム。
前記プログラマブルヌクレアーゼ及び／または前記レポーターが、前記表面に固定化されている、請求項４１に記載のシステム。
前記プログラマブルヌクレアーゼ及び／または前記レポーターが、共有結合、非共有結合、または静電力によって前記表面に固定化されている、請求項４２に記載のシステム。
前記プログラマブルヌクレアーゼプローブ及び／または前記レポーターが、リンカーによって前記表面に固定化されている、請求項４３に記載のシステム。
前記プログラマブルヌクレアーゼの前記Ｃａｓ酵素が、前記リンカーによって前記試薬チャンバの表面に固定化されている、請求項２８に記載のシステム。
前記リンカーが、前記プログラマブルヌクレアーゼの前記ガイド核酸に結合されている、請求項４４または４５に記載のシステム。
対照スポットをさらに含む、請求項３に記載のシステム。
前記検出スポットが、前記試薬チャンバと前記対照スポットとの間に位置する、請求項４７に記載のシステム。
前記対照スポットが、前記試薬チャンバと前記検出スポットとの間に位置する、請求項４７に記載のシステム。
前記検出可能なシグナルが視覚的に検出可能なシグナルである、請求項１に記載のシステム。
前記プログラマブルヌクレアーゼが、前記切断可能な核酸をシス切断構成またはトランス切断構成で切断するように構成されている、請求項１に記載のシステム。
複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブをさらに含む、システムであって、前記複数のプログラマブルヌクレアーゼプローブの各プログラマブルヌクレアーゼプローブが、前記標的核酸の複数の対応するセグメントに相補的である、請求項１に記載のシステム。
前記標的核酸の各対応するセグメントが、重複しない、部分的に重複する、または完全に重複する、請求項５２に記載のシステム。
標的核酸を検出するためのラテラルフローアッセイストリップシステムであって、
（ａ）（ｉ）試料パッドに配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸との結合により活性化されるよう構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ、
（ｉｉ）切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター
を含む、試料パッド；ならびに
（ｂ）前記試料パッドに流体連結された検出領域であって、前記検出領域は、その上に配置され、前記放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記検出領域
を含む、前記ラテラルフローアッセイストリップシステム。
標的核酸を検出するためのラテラルフローアッセイストリップシステムであって、
（ａ）（ｉ）試料パッドに配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、（１）Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１４酵素及び（２）標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸への結合を介して活性化されるように構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ、ならびに
（ｉｉ）切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター
を含む、試料パッド；ならびに
（ｂ）前記試料パッドに流体連結された検出領域であって、前記検出領域は、その上に配置され、前記放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記検出領域
を含む、前記ラテラルフローアッセイストリップシステム。
標的核酸を検出するためのシステムであって、
（ａ）試薬チャンバ；
（ｂ）前記試料チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、（１）Ｃａｓ１４酵素またはＣａｓ１３酵素及び（２）標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸への結合を介して活性化されるように構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ；
（ｃ）前記試薬チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター；ならびに
（ｄ）検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップであって、前記検出領域は、その上に配置され、前記放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記ラテラルフローアッセイストリップ
を含む、前記システム。
弁が開いているとき、前記試薬チャンバが前記検出チャンバに流体接続される、請求項５６に記載のシステム。
標的核酸を検出するための方法であって、
（ａ）（ｉ）試薬チャンバ、
（ｉｉ）前記試薬チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ、
（ｉｉｉ）前記反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター、ならびに
（ｉｖ）検出領域を含むラテラルフローアッセイストリップであって、前記検出領域は、その上に配置され、前記放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記ラテラルフローアッセイストリップ
を含むシステムを提供する工程；
（ｂ）試料を前記試薬チャンバと接触させる工程；ならびに
（ｃ）前記固定捕捉プローブの前記位置で生成された前記検出可能なシグナルを介して、前記試料における前記標的核酸の存在を同定する工程
を含む、前記方法。
前記標的核酸を含む試料を増幅する工程をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
標的核酸を検出するための装置であって、
（ａ）（ｉ）試薬チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ、ならびに
（ｉｉ）前記反応チャンバ内に配置された、切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーターであって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター
を含む、前記試薬チャンバ；
（ｂ）前記試薬チャンバと流体連通する検出領域であって、前記検出領域は、その上に配置され、前記放出された検出部分を捕捉するように構成された固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記検出領域；ならびに
（ｃ）前記試薬チャンバと前記検出領域を含むハウジング
を含む、前記装置。
前記試薬チャンバと前記検出領域との間に配置された弁をさらに含み、開位置にある前記弁は、流体が前記試薬チャンバから前記検出領域へと通過することを可能にする、請求項６０に記載の装置。
前記検出領域が、前記ハウジング内に位置するラテラルフローアッセイストリップに位置する、請求項６０に記載の装置。
前記ラテラルフローアッセイストリップに位置し、前記試薬チャンバと前記検出領域との間に位置する試料パッドをさらに含む、請求項６２に記載の装置。
前記試薬チャンバと前記検出領域との間に位置する増幅チャンバをさらに含む、請求項６２または６３に記載の装置。
前記プログラマブルヌクレアーゼが、Ｃａｓ１３酵素またはＣａｓ１４酵素をさらに含む、請求項６０に記載の装置。
標的核酸を検出するための方法であって、
（ａ）（ｉ）（１）試薬チャンバ内に配置されたプログラマブルヌクレアーゼであって、標的核酸またはその一部に相補的なガイド核酸を含み、前記ガイド核酸の前記標的核酸への結合によって活性化されるように構成されている、前記プログラマブルヌクレアーゼ、及び
（２）切断可能な核酸及び検出部分を含むレポーター分子であって、前記活性化されたプログラマブルヌクレアーゼによる前記切断可能な核酸の切断により、前記切断可能な核酸から前記検出部分が放出される、前記レポーター分子
を含む、試薬チャンバ；
（ｉｉ）前記試薬チャンバと流体連通する検出領域であって、前記検出領域は、前記放出された検出部分を捕捉するための固定捕捉プローブを含み、前記検出部分の放出は、前記固定捕捉プローブに対応する位置で検出可能なシグナルを直接的または間接的に生成する、前記検出領域；
（ｉｉｉ）前記試薬チャンバと前記検出領域を含むハウジング
を含む装置を提供する工程；
（ｂ）試料を前記試薬チャンバに導入する工程であって、それによって前記核酸の前記切断を介して前記検出部分を放出させ、検出部分溶液を生成することを可能にする、前記工程；
（ｃ）前記検出部分溶液を前記検出領域と接触させる工程；ならびに
（ｄ）前記固定捕捉プローブに対応する前記位置で生成された前記検出可能なシグナルを介して、前記試料における前記標的核酸の存在を同定する工程
を含む、前記方法。