CN103045761A - 用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

一种感染性眼病常见致病微生物的检测试剂盒及检测方法。试剂盒由DNA扩增试剂、通用引物组合、阳性对照核酸和灭菌蒸馏水组成；其中DNA扩增试剂是一种无需提取样本的DNA而直接进行扩增的预混试剂及相应DNA聚合酶混合液；通用引物组合是针对感染性眼病几种常见致病微生物细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒和棘阿米巴原虫各自的保守序列设计并合成的通用正向及反向引物等量混合液。本发明所采用的引物在各致病原种类内是通用的，针对其他病原又是特异的，直接的PCR反应体系和程序也很高效；本发明省去了模板DNA提取步骤，保证了有限临床样本的最大利用度；同时也使得检测的时间大大缩短，对临床病变的早期诊断可以起到很好的辅助作用。

Description

用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于感染性眼病致病微生物的快速检测技术领域，具体涉及一种用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法，即通过直接PCR方法检测感染性眼病常见致病细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒和棘阿米巴原虫的特异性DNA的试剂盒及检测方法。

背景技术

感染性眼病是眼部最常见的多发病，包括角膜炎、结膜炎和眼内炎等，引起眼部病变微生物主要有细菌、真菌、病毒和棘阿米巴原虫。角膜炎和眼内炎患者一旦诊治不及时就有致盲的危险，只有早期及时确诊是由哪种病原微生物感染所致，才能更好的指导后续治疗中的合理用药以及选择合适的手术时机。因此感染性眼病致病微生物的早期诊断对防盲、治盲意义重大。

由细菌感染引起的眼部炎症是最广泛的，其致病菌主要有葡萄球菌（表葡萄、金葡萄）、肺炎球菌和铜绿假单胞菌。真菌引起的眼部感染是目前我国最常见的致盲性眼病之一，调查发现镰刀菌属、曲霉菌属和链格孢菌属为最常见的真菌性角膜炎致病菌。引起角膜感染的常见病毒主要是I型单纯疱疹病毒。棘阿米巴原虫也主要引起角膜感染，随着角膜接触镜的佩戴，其发病率也在上升。

目前临床上对以上病原微生物引起的眼部感染尚无快速有效的早期诊断方法。病毒性感染主要依赖于观察病症特点及询问有无反复发作史或免疫印记来进行确诊，前两者依赖于主观性后者则阳性率较低。而对于细菌、真菌和棘阿米巴原虫引发的感染则主要是先行病变组织涂片染色检查，这种方法虽然较便捷，但是观察依赖于有丰富经验的技术人员。从病变样本中进行病原微生物的培养是明确诊断的最可靠依据，但是这种培养方法耗时长，不能提供早期诊断结果，延误治疗；由于患者之前的用药还可能会影响培养的阳性；而且培养这些病原微生物也需要专业技术人员和硬件条件的完善。各种病原标本的涂片和培养是目前比较常规的病原检测方法，其缺点是显而易见的，即鉴定无法标准规范化，且培养方法阳性率不够高，并需要较长时间。因此临床上亟需新的有效快速的感染性眼病致病微生物的诊断方法。利用分子生物学方法诊断病原微生物为眼部感染的快速诊断提供了新的思路。已有研究者将普通PCR的方法应用于细菌、真菌和病毒引起的感染诊断，对细菌的16S rRNA、真菌rRNA基因的大、小亚基和病毒种特异性序列进行扩增和分析，可有效鉴定至种属。普通PCR方法诊断病原虽然高效特异，但要先对样本进行模板DNA的提取，这个过程本身就会造成样本的损失；加上临床眼科病变样本量本来就很少，即使采用高效便捷的试剂盒提取方法，不同病原微生物DNA提取也需要不同的试剂盒。所以考虑到要进行DNA提取，那么普通PCR难以适应临床需要。直接PCR方法就可以避开DNA提取的步骤，将临床样本直接进行各种病原微生物特异性DNA的扩增，既大大缩短了检测的时间，又高效特异，而且需要的话还可以进一步进行种属鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒及检测方法，以便快速、高效、准确地检测引发感染性眼病的细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫，省去临床病变样本DNA提取步骤，使得检测更加便捷。

本发明的试剂盒包括：

（1）DNA扩增试剂：

为2ХPCR预混试剂及相应的DNA聚合酶混合液；

（2）引物混合液：

包括有用于细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫检测的引物对，其信息如下：

细菌正向引物（BPF）: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG   SEQ ID NO:1

细菌反向引物（BPR）: ATTACCGCGGCTGCTGG      SEQ IDNO:2

真菌正向引物（FPF）: TCCGTAGGTGAACCTGCGG    SEQ ID NO:3

真菌反向引物（FPR）: TCCTCCGCTTATTGATATGC   SEQ ID NO:4

I型单疱病毒正向引物（HPF）: GTGCCGTTGTTCCCATTA  SEQ IDNO:5

I型单疱病毒反向引物（HPR）: TTTGTCCTTCTCGTCATCC  SEQ IDNO:6

棘阿米巴正向引物（APF）: TTAGAGTGTTCAAAGCAGGCAG SEQ ID NO:7

棘阿米巴反向引物（APR）: TGGTCGGCATCGTTTATG  SEQ ID NO:8

3)灭菌蒸馏水。

上述的试剂盒还包括有阳性对照核酸：

阳性对照核酸分别为含有细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒和棘阿米巴正反向引物扩增的目的序列的质粒，其中细菌扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:9；真菌扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:10；I型单纯疱疹病毒扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:11；棘阿米巴扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:12。

利用本发明的检测试剂盒对感染性眼病少量临床样本进行致病微生物检测的方法：

（1）临床样本的处理：病变角膜刮片用20μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离心管；房水或玻璃体经高速离心后吸弃上清，最终收集20μL（含沉淀），然后用移液器吹打均匀；结膜囊棉拭子用500μL灭菌纯水吹打数次后弃拭子，余液同房水处理方法。

（2）致病微生物特异性DNA扩增体系的配置：

分别在4个反应管中加入下列组分：

（3）致病微生物特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

步骤1: 98℃ 5分钟，

步骤2: 98℃ 30秒，

步骤3: 65℃ 30秒，每一个循环温度降低0.5℃，

步骤4: 72℃ 30秒，

步骤5: 重复2、3、4步骤9个循环，

步骤6: 98℃ 30秒，

步骤7: 60℃ 30秒，

步骤8: 72℃ 30秒，

步骤9: 重复6、7、8步骤25个循环，

步骤10: 72℃ 10分钟，

步骤11: 4℃ 保持。

（4）致病微生物特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测各致病微生物特异性DNA，根据扩增产物分子量是否与各致病微生物特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增，从而确定引发感染性眼病的致病微生物种类。

本发明通过根据感染性眼病常见致病微生物基因组DNA的保守序列，设计并合成可以分别扩增细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫特异DNA的通用引物，利用特殊PCR扩增试剂无需进行样本DNA提取而直接进行PCR反应的方法检测病原体。本发明省去了模板DNA提取步骤，减少了样本量损失的一个重要环节，保证了有限临床样本的最大利用度；同时也使得检测的时间大大缩短，2个小时即可出检测结果，对临床病变的早期诊断可以起到很好的辅助作用。本发明所采用的引物组合分别对细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫是特异的，但是对其中的每一类又是通用的，通过检测可直接判定是哪一类病原引发的感染。本发明采用的直接PCR扩增试剂扩增效率很高，扩增的虽然是未经模板DNA提取的粗样，但是特殊的聚合酶依然有很高的扩增效率。本发明采用的TouchDown的扩增程序，既避免了粗样本中模板的复杂性可能带来的非特异性扩增，又保证了特异序列的高效扩增。

具体实施方式

本发明选择根据细菌16s rRNA的不同菌种间保守区域所设计的可以扩增各种细菌的正反向通用引物；同样选择根据真菌rRNA内转录间隔区ITS的不同种间保守区域所设计的可以扩增各种真菌的正反向通用引物。根据I型单纯疱疹病毒基因组序列中保守的包膜糖蛋白G所对应的US4区域设计检测I型单纯疱疹病毒的型特异性引物，根据棘阿米巴18srRNA中保守的29区位设计检测棘阿米巴的属特异性引物，分别从GenBank数据库中下载9个不同株I型单纯疱疹病毒编码糖蛋白G的核酸序列和8株不同种属棘阿米巴原虫的18s rRNA核酸序列，利用序列分析软件DNAMAN version 6进行同源性比较，在同源性为100% 的区位，设计PCR扩增引物，利用DNAMAN软件中的引物分析功能对所设计引物进行各项参数的具体分析，最终确定本发明的扩增单疱病毒和棘阿米巴的正反向引物组。

下面对本发明的试剂盒和检测方法进行具体的描述。

检测感染性眼病致病微生物的试剂盒的制备 （5样次）：

(1)DNA扩增试剂，1管，DNA扩增试剂可以选用TaKaRa公司生产的、无需提取样本的DNA而直接进行扩增的2×MightyAmp 缓冲液和 MightyAmp DNA聚合酶（产品编号DR071）；内装60份扩增反应（每样次需做4个阳性反应，4个实验样品反应,4个阴性反应）所需试剂，10.5μL/份，每份含有10μL 2×MightyAmp 缓冲液、0.5μL MightyAmpDNA聚合酶；

(2)正反向引物组合，细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫的引物组各1管，每管内装15份，2μL/份，每份含正向引物和反向引物的浓度均为5μM，引物具体序列如下：

细菌通用正向引物（BPF）: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

细菌通用反向引物（BPR）: ATTACCGCGGCTGCTGG

真菌通用正向引物（FPF）: TCCGTAGGTGAACCTGCGG

真菌通用反向引物（FPR）: TCCTCCGCTTATTGATATGC

I型单疱病毒正向引物（HPF）: GTGCCGTTGTTCCCATTA

I型单疱病毒反向引物（HPR）: TTTGTCCTTCTCGTCATCC

棘阿米巴正向引物（APF）: TTAGAGTGTTCAAAGCAGGCAG

棘阿米巴反向引物（APR）: TGGTCGGCATCGTTTATG

(3)阳性对照核酸，为包含细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫目的DNA片段的质粒，分别为pUC-B，pUC-F，pUC-H和pUC-A，各1管，内装5μL。质粒制备的具体操作是在PCR扩增绿脓杆菌，白念珠菌，单疱病毒和棘阿米巴原虫保守区基因组DNA后，用试剂盒回收目的片段，连接到克隆质粒上，转入大肠杆菌E.coli中，经氨苄培养基平板筛选培养，挑取阳性克隆测序验证，提取阳性克隆的质粒即可作为阳性核酸。其中细菌阳性核酸的目的片段的序列为：SEQ ID NO:9、真菌阳性核酸的扩增目的片段的序列为：SEQ ID NO:10、I型单疱病毒阳性核酸pUC-H的扩增序列为：SEQ ID NO:11、棘阿米巴阳性核酸扩增目的片段序列为：SEQ ID NO:12。

(4) 灭菌蒸馏水，1管，内装1mL。

检测方法按照以下(1)-(4)程序进行：

（1）临床样本的处理：病变角膜刮取物用20μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离心管；房水或玻璃体经高速离心后吸弃上清，最终收集20μL（含沉淀），然后用移液器吹打均匀；结膜囊棉拭子用500μL灭菌纯水吹打数次后弃拭子，余液同房水处理方法。

（2）致病微生物特异性DNA扩增体系的配置：

分别在4个反应管中加入下列组分：

同时各做阳性和阴性对照，即阳性反应中模板各加入对应阳性核酸，阴性反应不加模板。

（3）致病微生物特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

 98℃ 5分钟/ 98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

（4）致病微生物特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测各致病微生物特异性DNA，根据扩增产物分子量是否与各致病微生物特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增，从而确定引发感染性眼病的致病微生物种类。

本发明的感染性眼病常见致病微生物快速检测试剂盒及检测方法不仅可以对感染性眼表疾病如角结膜炎的病灶刮片或结膜囊拭子样本进行致病原细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫检测，还可以对感染性眼内炎的房水以及玻璃体样本进行相应致病原检测。

实施例1本发明的试剂盒的敏感性检测

分别将通过计数等方法确定的已知浓度或滴度的细菌（绿脓杆菌）、真菌（白念珠菌）、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫悬液梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹,10⁰ copies/μL，采用本发明试剂盒中的DNA扩增试剂和相应引物组合进行扩增，评价直接PCR对各种病原微生物检测的敏感性，具体方法如下：

1) DNA扩增试剂10.5μL，各梯度病原微生物悬液1μL,正反向引物组合2μL，补灭菌蒸馏水至20μL；

2) 98℃ 5分钟/ 98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

3) PCR反应结束后，在各浓度梯度反应管中加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，本发明的试剂盒对微量的致病微生物就可扩增出阳性结果，灵敏度极高，其中细菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫可达10个拷贝数，真菌也可达100个拷贝数，在实际操作中使用本发明的引物检测的时候不会出现假阴性。

实施例2：本发明的试剂盒的种类内通用性和种类外特异性检测

利用眼科常见的病原细菌如表皮葡萄球菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，粘质沙雷菌，枯草杆菌和绿脓杆菌对细菌通用引物进行了通用性检测，同时还利用常见致病真菌、单疱病毒和棘阿米巴原虫以及角膜上皮细胞对细菌通用引物进行了特异性检测。同样利用眼科常见的病原真菌如茄病镰刀菌，烟曲霉菌，白念珠菌和链格孢菌对真菌通用引物进行了通用性检测，同时也利用其他细菌、病毒和棘阿米巴原虫以及角膜上皮细胞对真菌通用引物进行了特异性检测。另外对I型单疱病毒和棘阿米巴原虫的引物也分别利用其它病原体进行了特异性检测。

具体操作同实施例1的具体方法，结果显示，本发明的试剂盒中细菌引物组合只对各种细菌均有扩增，对其他眼科常见真菌、病毒及棘阿米巴原虫无扩增，同样真菌引物组合只特异扩增各种真菌，I型单疱病毒引物组合只特异扩增I型单疱病毒，而棘阿米巴的引物组合只特异扩增棘阿米巴原虫。说明本发明的引物在检测的时候不会出现假阳性。

实施例3：本发明的试剂盒对动物病变组织样品的检测

利用临床上高度怀疑真菌性角膜炎、病毒性角膜炎和棘阿米巴性角膜炎的3份病变角膜组织刮取物对本发明的试剂盒进行有效性验证，具体方法如下：

(1)病变角膜刮取物加入20μL灭菌蒸馏水吹打散开至均匀。

(2)视样品量取1-5μL上述样品悬液分别加入4个小PCR反应管中，加入10.5μL DNA扩增试剂，然后再各加入细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴引物组合2μL，加灭菌蒸馏水补足20μL 。同时对四种引物组合做加阳性核酸的阳性对照和不加模板的阴性对照。

(3)将上述反应管放入PCR仪进行TouchDown PCR反应：98℃ 5分钟/98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

(4)PCR反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳检测。

结果真菌性角膜炎角膜病变组织样品反应管只扩增出真菌特异DNA条带，而其余管无扩增；病毒性角膜炎病变角膜组织样品只扩增出I型单疱病毒特异DNA条带，其余管无扩增；阿米巴性角膜炎病变角膜组织样品只扩增出棘阿米巴原虫特异DNA条带，其余管无扩增；另外各引物组的阳性反应管有阳性扩增而阴性对照管无扩增。

实施例4：本发明的试剂盒对动物组织病变累及体液样品的检测

利用临床上高度怀疑细菌性眼内炎的房水样品对本发明的试剂盒进行有效性验证，具体方法如下：

取收集的房水样品进行高速离心，吸弃上清，留约20μL样品，吹打均匀；余步骤同实施例3中(2)～(4)，结果显示细菌性眼内炎的房水样品反应管只扩增出细菌特异DNA条带，其余管无阳性扩增，另外各引物组的阳性反应管有阳性扩增而阴性对照管无扩增。实际应用表明本发明制备的试剂盒能够准确的对眼科致病微生物进行检测。

Claims (3)

1.用于检测感染性眼病致病微生物的试剂盒，所述的试剂盒包括如下的组分：

1）DNA扩增试剂：

为2ХPCR预混试剂及DNA聚合酶混合液；

2）引物混合液：

包括有用于细菌、真菌、I型单疱病毒和棘阿米巴原虫检测的引物对，其信息如下：

细菌正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1、

细菌反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:2、

真菌正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:3、

真菌反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:4、

I型单疱病毒正向引物的核苷酸序列为  SEQ ID NO:5、

I型单疱病毒反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:6、

棘阿米巴正向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:7、

棘阿米巴反向引物的核苷酸序列为 SEQ ID NO:8；

3)灭菌蒸馏水。

2.如权利要求1所述的试剂盒，还包括有阳性对照核酸：

阳性对照核酸分别为含有细菌、真菌、I型单纯疱疹病毒和棘阿米巴正反向引物扩增的目的片段的质粒，其中细菌扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:9；真菌扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:10；I型单纯疱疹病毒扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:11；棘阿米巴扩增的目的片段的序列为SEQ ID NO:12。

3.权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

（1）临床样本的处理：病变角膜刮片用20μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离心管；房水或玻璃体经高速离心后吸弃上清，最终收集20μL（含沉淀），然后用移液器吹打均匀；结膜囊棉拭子用500μL灭菌纯水吹打数次后弃拭子，余液同房水处理方法；

（2）致病微生物特异性DNA扩增体系的配置：

分别在4个反应管中加入下列组分：

（3）致病微生物特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

步骤1: 98℃ 5分钟，

步骤2: 98℃ 30秒，

步骤3: 65℃ 30秒，每一个循环温度降低0.5℃，

步骤4: 72℃ 30秒，

步骤5: 重复2、3、4步骤9个循环，

步骤6: 98℃ 30秒，

步骤7: 60℃ 30秒，

步骤8: 72℃ 30秒，

步骤9: 重复6、7、8步骤25个循环，

步骤10: 72℃ 10分钟，

步骤11: 4℃ 保持；

（4）致病微生物特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测各致病微生物特异性DNA，根据扩增产物分子量是否与各致病微生物特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增，从而确定引发感染性眼病的致病微生物种类。