CN102559867B - 牡蛎折光马尔太虫lamp检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，它采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据折光马尔太虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明的LAMP检测试剂盒，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎折光马尔太虫，解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷，具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，特别适于基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。
Description
技术领域
本发明涉及牡蛎折光马尔太虫检测领域，尤其是一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。
背景技术
折光马尔太虫(Marteilia refringens)对牡蛎养殖的危害较大，可引起贝类消瘦、消化道变色、停止生长并死亡，大洋洲和欧洲等国家其感染现象普遍存在。
折光马尔太虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起折光马尔太虫PCR检测方法和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，，因而难以适应基层现场检测需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测牡蛎折光马尔太虫的需要。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：
牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：
反应液A：含有10×等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、10mM dNTPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物1、20uM的内引物2、20uM的外引物1、20uM的外引物2、20uM的环引物1、20uM的环引物2、5M甜菜碱、625μM钙黄绿素和12.5mM氯化锰；10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
内引物1序列为CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA，
内引物2序列为AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT，
外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC，
外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC，
环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG，
环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC。
反应液A每管24μL，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合酶8U/ul、3.5ul 10mM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM的环引物2，1ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和2.5ul双蒸水。
本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据折光马尔太虫共有的基因保守区(见序列表SEQ.ID.No.1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此发明了用于快速检测牡蛎折光马尔太虫的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒。应用本发明的LAMP检测试剂盒建立牡蛎折光马尔太虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎折光马尔太虫。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。
另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入SYBR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性：一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本发明使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的SYBR Green I和Gene Finder染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了SYBR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。
附图说明
图1是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。
图1中：1折光马尔太虫，2单孢子虫，3副溶血弧菌，4溶藻弧菌，5派琴虫，6河弧菌，7贝类组织。
图2是应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。
图2中：1-8分别为以下不同浓度的牡蛎折光马尔太虫DNA 20ng/管，2ng/管，200pg/管，20pg/管，2pg/管，200fg/管，20fg/管，2fg/管。
图3是PCR方法检测牡蛎折光马尔太虫敏感性试验结果图。
图3中：M为100bp DNA ladder，1-8分别为以下不同浓度的牡蛎折光马尔太虫DNA20ng/管，2ng/管，200pg/管，20pg/管，2pg/管，200fg/管，20fg/管，2fg/管。
具体实施方式
一、牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒的配制
反应液A：每管24μL，其组成为：2.5ul 10×等温反应缓存液、1.0ul Bst DNA聚合酶8U/ul、3.5ul 10mM dNTPs、5ul 25mM硫酸镁、0.25ul 20uM的内引物1、0.25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物1、2ul 20uM的外引物2、1ul 20uM的环引物1、1ul 20uM的环引物2，1ul 5M甜菜碱、1ul 625μM钙黄绿素和1ul 12.5mM氯化锰和2.5ul双蒸水。
其中，10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100。
内引物1序列为CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA(见序列表SEQ.ID.No.2)，
内引物2序列为AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT(见序列表SEQ.ID.No.3)，
外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC(见序列表SEQ.ID.No.4)，
外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC(见序列表SEQ.ID.No.5)，
环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG(见序列表SEQ.ID.No.6)，
环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC(见序列表SEQ.ID.No.7)。
二、应用本发明牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒检测牡蛎折光马尔太虫的方法(以下简称LAMP检测法)
1、组织样品中DNA的提取
使用北京天跟生物工程公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(商品名：海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，型号：DP324-03)提取组织DNA，浓度能达到20ng/ul。
2、牡蛎折光马尔太虫LAMP反应
以提取的牡蛎折光马尔太虫DNA为模板，在装有24μL反应液A管中加入1μL待检DNA构成25ul反应体系；LAMP反应程序如下：61℃60min，然后80℃5min。直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有牡蛎折光马尔太虫；如果颜色为黄色，说明待检样品不含有牡蛎折光马尔太虫。
三、LAMP检测法的特异性和敏感性试验
1.特异性试验
分别以折光马尔太虫、单孢子虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌和贝类组织的核酸为模板，按照前述牡蛎折光马尔太虫LAMP反应体系和条件进行反应。
结果见图1，对牡蛎折光马尔太虫的检测为阳性结果(显示绿色)，而对单孢子虫、副溶血弧菌、派琴虫、溶藻弧菌、河弧菌和贝类组织的检测均为阴性(显示黄色)。
2.敏感性试验
将牡蛎折光马尔太虫DNA按10倍递增稀释成20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg。
牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法检出限与PCR对比
牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法反应体系和条件按前述进行。
牡蛎折光马尔太虫PCR反应组成如下：在25ul的反应体系中含10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μl，牡蛎样品模板DNA 1μL，25μmol/L的上、下游引物(上游引物为Marteilia 1：5-TACGACCGTAGCCTTTCCAC-3；下游引物为Marteilia 2：5-CGCCTCTACTCTTCTCCCAA-3)各0.5μl，ddH2O补足25μL。扩增程序为94℃变性5分钟，然后进入94℃变性1分钟，57℃退火1分钟，72℃延伸1分钟的循环，共进行35个循环，最后再经72℃延伸10分钟。
牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法通过肉眼直接观察结果，结果见图2。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，然后进行溴化乙锭染色，结果见图3。牡蛎折光马尔太虫LAMP检测方法的检测限为20fg，而常规PCR的检测限为2pg，LAMP方法敏感性比常规PCR高100倍。
Claims (2)
1.一种牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：
反应液A：含有10×等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/μl、10mM dNTPs、25mM硫酸镁、20μM的内引物1、20μM的内引物2、20μM的外引物1、20μM的外引物2、20μM的环引物1、20μM的环引物2、5M甜菜碱、625μM钙黄绿素和12.5mM氯化锰；所述10×等温反应缓存液含有200mM pH值为8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%曲拉通X-100；
所述内引物1序列为CGGCTTCTGCAAACACGTTCGAGTCGTCCCGAATCTACCCA，
所述内引物2序列为AGAGGTTGGAAGATTCGCACCGCCGACAAATCCAATGCTCCT，
所述外引物1序列为GTCCGAGTGATCTTGTCAGC，
所述外引物2序列为CGAGTAAGTGCATGCACAAC，
所述环引物1序列为TCGTGGCTGCCTATCTTTCCAG，
所述环引物2序列为ACCCACAACTTCGATAGCCCC。
2.根据权利要求1所述的牡蛎折光马尔太虫LAMP检测试剂盒，其特征在于
所述反应液A每管24μL，其组成为：2.5μL 10×等温反应缓存液、1.0μL Bst DNA聚合酶8U/μL、3.5μL 10mM dNTPs、5μL 25mM硫酸镁、0.25μL 20μM的内引物1、0.25μL 20μM的内引物2、2μL 20μM的外引物1、2μL 20μM的外引物2、1μL 20μM的环引物1、1μL 20μM的环引物2，1μL 5M甜菜碱、1μL 625μM钙黄绿素和1μL 12.5mM氯化锰和2.5μL双蒸水。
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