KR101602918B1 - 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트 및 검출 방법 - Google Patents

톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트 및 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 이용하는 경우, 기존의 PCR 진단법과 비교하였을 때 100배 이상으로 민감성이 높고, 톡소플라즈마만을 검출하는 특이성이 우수할 뿐만 아니라, 고가의 장비를 요구하지 않아 질병이 발생하는 현장에서 직접 수행할 수 있어, 톡소플라즈마의 진단 및 검출에 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트 및 검출 방법{Primer set, kit and method for detecting Toxoplasma gondii using loop-mediated isothermal amplification reaction}
본 발명은 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트 및 검출 방법에 관한 것이다.
톡소플라즈마 곤디 (Toxoplasma gondii)는 단세포 기생충이며 고양이과에 속하는 동물을 종숙주로 하고, 사람을 포함한 다양한 종류의 포유류와 일부 조류를 중간숙주로 하는 대표적인 인수공통 기생체이다. 톡소플라즈마 기생충은 사람의 소화기관을 둘러싸고 있는 세포들 속에서 증식하며, 뇌, 골격 근육, 심장 근육, 눈, 폐, 림프절을 포함한 모든 장기로 퍼질 수 있다. 정상적인 면역 방어체계를 가진 톡소플라즈마증 감염 환자들 중 90% 정도는 아무런 증상을 느끼지 못하여 감염을 인식하지 못하나, 면역체계가 약화된 사람, 특히 후천적 면역결핍증 환자에서는 톡소플라즈마증의 증상들이 흔히 뇌와 연관되어 심하게 나타난다. 톡소플라즈마는 세계적으로 분포하고 있으며 많은 선진국 및 국내 일부 지역에서도 톡소포자충 항체 양성률이 증가하는 양상이 확인되어 국민건강을 위협하는 위험 요인으로 부각되고 있다.
톡소플라즈마를 진단하는 기존 방법에는 라텍스 응집 테스트(Latex Agglutination Test), 항혈청진단법(enzyme-linked immunosorbent assay, enzyme-linked immunospecific assay, ELISA) 등의 면역학적 방법들이 주로 사용되고 있으나, 감염단계에 따라 특이적 항체의 존재가 변화될 수 있으며 진단 방법간의 일치율이 떨어지는 등의 문제점이 있다. 또한, Nested PCR, real-time PCR이 동물, 수질, 토양 및 임상 표본에서 톡소플라즈마 DNA를 진단하는데 사용되고 있다. 이러한 분자적 진단법은 높은 민감도를 가지고 있는 반면 고가의 기계, 실험적 지식 및 기술이 필요한 방법이므로 현장에서 수행하기에는 많은 제약이 따랐다.
이를 대체하기 위한 등온증폭반응은 기존의 PCR 방법과 유사하나,기존 PCR 방법이 변성, 접합, 및 신장의 세 단계를 반복적으로 수행하면서 유전자의 증폭을 시행하기 때문에 반응과정 중 지속적으로 온도의 변화를 필요로 하는 반면, 등온증폭반응은 고정된 일정 온도에서 접합 및 신장이 가능한 장점을 가지고 있다. 이는 기존 PCR 방법에 사용되는 Taq DNA 중합효소(polymerase)를 사용하는 대신, 핵산말단가수분해(exonuclease) 기능을 갖고 있는 Bst DNA 중합효소를 사용함으로써 열에 의존하지 않고 DNA의 이중나선 구조의 변성을 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 등온증폭반응은 유전자를 증폭하는 동안 온도의 변화를 필요로 하지 않기 때문에 전문장비 없이 손쉽게 고정된 온도에서 유전자 증폭을 가능하게 한다.
이에 본 발명자는 톡소플라즈마 검출 및 진단을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용할 경우 기존 방법으로 진단할 때 발생하는 문제점을 극복하고, PCR 진단법과 비교하였을 때 100배 이상으로 민감성이 높으며, 톡소플라즈마만을 검출하는 특이성이 우수할 뿐만 아니라 고가의 장비를 요구하지 않아 질병이 발생하는 현장에서 직접 수행할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트 및 검출 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 톡소플라즈마를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은, (a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하며 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 등온증폭반응을 이용한 톡소플라즈마 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 이용하는 경우, 기존의 PCR 진단법과 비교하였을 때, 100배 이상으로 민감성이 높고, 톡소플라즈마만을 검출하는 특이성이 우수할 뿐만 아니라, 고가의 장비를 요구하지 않아 질병이 발생하는 현장에서 직접 수행할 수 있어, 톡소플라즈마의 진단 및 검출에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응의 수행을 위한 최적 반응 온도(A), dNTP 농도(B) 및 시간 조건(C)을 확인한 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 기질 희석양을 달리하여(1×109부터 1×100 copies/㎕) 등온증폭반응 및 conventional PCR 을 수행한 후 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 톡소플라즈마 감염 조직 및 Neospora caninum tachyzoites에 대해 등온증폭반응을 수행한 후 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 일광 및 자외선 조건 하에 SYBR Green I과 GeneFinder를 이용한 형광 검출 및 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 톡소플라즈마를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트는 톡소플라즈마 유전자 내의 서열이다. 상기 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍은 증폭하고자 하는 산물의 양 말단에 해당하는 프라이머로서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머는 역방향 프라이머이다. 또한, 상기 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍은 증폭하고자 하는 산물의 내부에 위치하는 프라이머로서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머는 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer; FIP)이며, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프라이머는 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 톡소플라즈마 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 DNA 중합효소, dNTPs, 및 완충액 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하며 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 등온증폭반응을 이용한 톡소플라즈마의 검출 방법을 제공한다.
이하, 각 단계에 대해 상세히 설명한다.
상기 (a)단계는 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계이다. 이때, 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 (a) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 체액 등일 수 있으나, 톡소플라즈마가 검출될 수 있는 시료이면 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b)단계는 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계이다. 상기 (b)단계의 등온증폭반응은 바람직하게는 50~70℃에서 수행될 수 있다.
상기 (b)단계에서 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
상기 (c)단계는 증폭산물을 검출하는 단계이다. 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 등 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로오스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광을 형광 측정기를 이용하여 측정하는 방법이다. 상기 방사성 측정 방법은 증폭 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
또한, 증폭산물 검출은 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 형광 염색 물질을 적용할 수 있으나, 바람직하게는, SYBR 그린I과 GeneFinder, 페놀 레드를 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 SYBR 그린I과 GeneFinder을 사용할 수 있다. 상기 형광 염색 물질은 DNA 이중가닥에 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 하기 위하여 첨가한 것이다. 특히, 상기 SYBR 그린I 또는 GeneFinder는 DNA 이중 가닥에 삽입되어 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현하는 물질이다. 따라서 톡소 플라즈마를 본 발명에 따라 LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 LAMP 생성물에 SYBR 그린I 또는 GeneFinder을 첨가한 후 자외선을 조사하게 되면 녹색 형광을 나타내게 된다. 즉, 본 발명은 전기영동 등 별도의 추가적 실험을 하지 않고도, LAMP 증폭실험 후 SYBR 그린I 또는 GeneFinder 염색에서 녹색형광을 나타내면 질병에 감염된 것을 의미하고, 녹색형광을 나타내지 않으면 비감염을 의미하므로 톡소 플라즈마에 감염되었는지의 여부를 고감도이면서 신속하게 육안으로 확인할 수 있다.
상기 방법을 이용하여 톡소플라즈마를 검출하는 경우, 기존의 PCR 진단법과 비교하였을 때 100배 이상으로 민감성이 높고, 톡소플라즈마만을 검출하는 특이성이 우수할 뿐만 아니라, 고가의 장비를 요구하지 않아 질병이 발생하는 현장에서 직접 수행할 수 있어, 톡소플라즈마의 진단 및 검출에 효과적으로 이용될 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 톡소플라즈마 검출을 위한 등온증폭반응용 특이 프라이머 세트 제작
등록되어있는 Toxoplasma gondii B1 유전자(AF179871)를 바탕으로 등온증폭반응 프라이머 설계 소프트웨어인 Primer Explorer(http://primerexplorer.jp/e/index.html)를 이용하여 톡소플라즈마에 특이적인 등온증폭반응용 프라이머를 제작하였다.
정방향 프라이머(5'-ACCAGCAGCAGAGGAGTG-3', 서열번호 1) 및 역방향 프라이머(5'-CAGACGAATCAACGGAACT-3', 서열번호 2)는 각 내부 프라이머(inner primer)의 바깥 쪽에 위치하도록 설계하였으며, 각 18nt, 19nt의 크기로 제작하였다. 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer; FIP)(5'-CCTCCTCTTCGCGAAACCTCAATTTTAGATGCCTAGAGGAGACACA-3', 서열번호 3), 역방향 내부 프라이머는(backward inner primer; BIP)(5'- AACAAGAGACGTGCCGCATGTTTTTACTGTGCCATTTTCTGAGCA-3', 서열번호 4)는 톡소플라즈마 안티 센스 서열의 상보적인 염기서열과 루프(loop)를 형성하는 서열의 부분 및 TTTT spacer를 합하여 설계되었으며, 서열번호 3은 46nt, 서열번호 4는 45nt의 크기로 제작하였다. 상기 프라이머는 Bioneer사(Korea)에 주문 의뢰하여 제작하였으며 내부 프라이머는 PAGE 정제된 것을 사용하였다.
실시예 2. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응 시 최적 조건 확인
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하기 위한 최적 반응 온도, dNTP 농도 및 시간 조건을 확인하였다.
먼저, 최적 반응 온도를 확인하기 위하여, 각 40pmole의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 2), FIP 및 BIP프라이머(서열번호 3 및 4), 5pmole의 10mM dNTPs, 8U Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs, USA), 1XThermoPol 반응 완충액 (20mM Tris-HCl, 10mM KCL, 10mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100) 및 1㎕ 톡소플라즈마 DNA를 총 부피 50㎕ 로 맞추어 PCR 반응액을 만들었다. 상기 반응액을 이용하여, 95℃에서 10분간 변성, 55~65℃ 범위에서 60분간 DNA 합성 반응 및 80℃에서 10분간 열처리하여 등온증폭반응을 수행하였다. 이의 결과를 도 1(A)에 나타내었다. M은 100bp ladder이고, 1번 레인은 65℃, 2번 레인은 64.3℃, 3번 레인은 63.1℃, 4번 레인은 61.3℃, 5번 레인은 59℃, 6번 레인은 57.3℃, 7번 레인은 56.0℃, 8번 레인은 55℃이며 9번 레인은 음성 대조군이다.
도 1(A)에 나타낸 바와 같이, 최적 어닐링 온도는 60℃임을 확인하였다.
또한, 최적 dNTP 농도 조건을 알아내기 위하여 dNTP 농도를 2.5~40mM로 변화를 주어 상기 60℃의 최적 온도 조건하에 실험을 수행하였다. 각 5pmole의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 2), FIP 및 BIP프라이머(서열번호 3 및 4) 10pmole, 2.5~40mM dNTPs, 8U Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs, USA) 및 1XThermoPol 반응 완충액 (20mM Tris-HCl, 10mM KCL, 10mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100)및 1㎕ 톡소플라즈마 DNA를 총 부피 50℃로 맞추어 PCR 반응액을 만들었다. 상기 반응액을 이용하여, 95℃에서 10분 변성, 60℃에서 60분간 DNA 합성 반응 및 80℃에서 10분간 열처리하여 등온증폭반응을 수행하였다. 이의 결과를 도 1(B)에 나타내었다. M은 100bp ladder이고, 1번 레인은 2.5mM, 2번 레인은 5mM, 3번 레인은 10mM, 4번 레인은 20mM, 5번 레인은 30mM, 6번 레인은 40mM, 7번 레인은 음성 대조군이다.
도 1(B)에 나타낸 바와 같이, 최적 dNTP 농도는 10mM임을 확인하였다.
또한, 최적 반응 시간 조건을 알아내기 위하여 반응 시간을 10~60분으로 변화를 주어 실험을 수행하였다. 각 5pmole의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 2), FIP 및 BIP프라이머(서열번호 3 및 4) 40pmole, 10mM dNTPs, 8U Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs, USA) 및 1XThermoPol 반응 완충액 (20mM Tris-HCl, 10mM KCL, 10mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100) 및 1㎕ 톡소플라즈마 DNA를 총 부피 50℃로 맞추어 PCR 반응액을 만들었다. 상기 반응액을 이용하여, 95℃에서 10분간 변성, 60℃에서 10~60분간 DNA 합성 반응 및 80℃에서 10분간 열처리하여 등온증폭반응을 수행하였다. 이의 결과를 도 1(C)에 나타내었다. M은 100bp ladder이고, 1번 레인은 60분, 2번 레인은 40분, 3번 레인은 30분, 4번 레인은 20분, 5번 레인은 10분, 6번 레인은 양성 대조군이며, 7번 레인은 음성 대조군이다.
도 1(C)에 나타낸 바와 같이, 최소 30분으로 반응시간을 단축시켜도 톡소플라즈마의 진단이 가능함을 확인하였다.
실시예 3. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭 반응 시 민감도 확인
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응 수행 시, 검출한계를 측정하기 위하여 기질 희석양을 달리하여 실험을 수행하였다. 보다 구체적으로, Toxoplasma gondii tachyzoite (RH strain)에서 DNA를 추출하였으며, 이를 1×109부터 1×100 copies/㎕까지 단계적으로 희석하여 주형으로 사용하여 등온증폭반응을 수행하였고, 상기 주형을 사용한 종래의 PCR 결과와 민감도를 비교하였다. 상기 종래의 PCR을 수행하기 위하여, 각 5pmole의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 2) 및 TOPsimpleTM DryMIX-HOT (Enzynomics, Korea)로 PCR 반응액을 만들고, 변성(94℃, 5분), 증폭(94℃에서 20초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 30초 조건으로 35 주기 반복), 확장(72℃, 10분) 조건으로 PCR을 수행하였다. 또한, 등온증폭반응을 수행하기 위하여, 각 5pmole의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 2), FIP 및 BIP프라이머(서열번호 3 및 4) 40pmole, 10mM dNTPs, 8U Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs, USA) 및 1×ThermoPol 반응 완충액 (20mM Tris-HCl, 10mM KCL, 10mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100) 및 1㎕ Toxoplasma gondii tachyzoite DNA를 총 부피 50㎕ 로 맞추어 PCR 반응액을 만들었다. 상기 반응액을 이용하여, 95℃에서 10분간 변성, 60℃에서 60분간 DNA 합성 반응 및 80℃에서 10분 열처리하여 등온증폭반응을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 (A)는 등온증폭반응을 이용한 결과로서 1~10 레인은 1×109부터 1×100 copies/㎕ 이며, 11번 레인은 음성 대조군이다. 도 2의 (B)는 conventional PCR을 이용한 결과로서 1~10 레인은 1×109부터 1×100 copies/㎕ 이며, 11번 레인은 음성 대조군이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행할 경우 1×109부터 1×102 copies/㎕까지 검출이 가능하여 높은 민감성을 나타냄을 확인하였다. 반면, 기존의 conventional PCR을 이용할 경우 copy수가 적어질수록 검출 반응성이 단계적으로 낮아지는 것을 확인하였으며, 1×104 copies/㎕까지만 검출이 가능한 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행할 경우 conventional PCR을 수행한 것 보다 100배 더 톡소플라즈마에 대한 민감성이 높음을 확인할 수 있다.
실시예 4. 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭 반응 시 특이성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 수행 시 특이성을 확인하기 위하여, 형태적 유사성 때문에 1990년대 톡소플라즈마로 여겨졌고 톡소플라즈마와 같은 속에 속하는 Neospora caninum tachyzoites를 이용한 비교 실험을 수행하였다. 등온증폭반응을 수행하기 위하여, 각 5pmole의 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호 1 및 2), FIP 및 BIP프라이머(서열번호 3 및 4) 40pmole, 10mM dNTPs, 8U Bst DNA polymerase large fragment (New England Biolabs, USA) 및 1XThermoPol 반응 완충액 (20mM Tris-HCl, 10mM KCL, 10mM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1% Triton X-100) 및 1㎕의 각 비교 DNA를(확인바랍니다) 총 부피 50㎕로 맞추어 PCR 반응액을 만들었다. 상기 반응액을 이용하여, 95℃에서 10분 변성, 60℃에서 60분간 DNA 합성 반응 및 80℃에서 10분간 열처리하여 등온증폭반응을 수행하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 1번 레인은 톡소플라즈마 감염 고양이의 간 DNA, 2번 레인은 톡소플라즈마 감염 고양이의 근육 DNA, 3번 레인은 톡소플라즈마 감염 고양이의 비장 DNA, 4번 레인은 톡소플라즈마 감염 고양이의 신장 DNA, 5번 레인은 톡소플라즈마 감염 고양이의 폐 DNA, 6번 레인은 톡소플라즈마 DNA, 7번 레인은 음성 대조군이며, 8번 레인은 Neospora caninum tachyzoites DNA이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하였을 때 같은 속에 속하는 Neospora caninum tachyzoites에는 반응하지 않았으나, 톡소플라즈마가 감염된 고양이의 여러 조직에서는 모두 반응하여 특이성이 우수한 것을 확인하였다.
실시예 5. 형광 시약을 이용한 검출 확인
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응의 현장 적용 가능성을 확인하기 위하여, 등온증폭반응 수행 후, 증폭산물에 X100 SYBR Green I(Sigma, USA) 또는 GeneFinder(China)를 첨가하고, 일광 및 자외선 조건 하에 형광 검출을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4의 (A)는 일광 하의 조건에서, 1P는 증폭산물에 SYBR Green I 첨가, 1N은 증폭산물 없이 SYBR Green I 첨가, 2P는 증폭산물에 GeneFinder 첨가, 2N은 증폭산물 없이 GeneFinder 첨가한 것이다. 도 4의 (B)는 자외선 조건 하에서, 1P는 1P는 증폭산물에 SYBR Green I 첨가, 1N은 증폭산물 없이 SYBR Green I 첨가를 나타낸 것이다. 도 4의 (C)는 증폭산물을 전기영동하여 확인한 것으로, P는 증폭산물이 있는 양성 대조군을, N은 증폭산물이 없는 음성 대조군을 나타낸 것이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 증폭산물에 SYBR Green I 및 GeneFinder를 첨가한 것은 그 혼합물이 강한 녹색형광을 나타내는 것을 확인하였다. 반면 증폭산물을 넣지 않은 대조군에서는 혼합물이 오렌지색으로 변하는 것을 확인하였다.
<110> Animal and plant quaratine agency <120> Primer set, kit and method for detecting Toxoplasma gondii using loop-mediated isothermal amplification reaction <130> 1.46P <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 accagcagca gaggagtg 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward primer <400> 2 cagacgaatc aacggaact 19 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward inner primer, FIP <400> 3 cctcctcttc gcgaaacctc aattttagat gcctagagga gacaca 46 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> backward inner primer, BIP <400> 4 aacaagagac gtgccgcatg tttttactgt gccattttct gagca 45

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)를 검출하기 위한 고리매개 등온증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification) 반응용 프라이머 조성물.
  2. 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부프라이머 쌍;으로 구성되는 고리매개 등온증폭반응용 프라이머 세트를 포함하는 톡소플라즈마 곤디 검출용 키트.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 키트는 DNA 중합효소, dNTPs, 및 완충액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 톡소플라즈마 곤디 검출용 키트.
  4. (a) 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍; 및 서열번호 3 및 4의 내부 프라이머 쌍;으로 구성되는 프라이머 세트를 이용하며 고리매개 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 고리매개 등온증폭반응을 이용한 톡소플라즈마 곤디 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 (a)단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 및 체액으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 톡소플라즈마 곤디 검출 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 (b)단계의 고리매개 등온증폭반응은 50~70℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 톡소플라즈마 곤디 검출 방법.
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