CN106119401A - 牛附红细胞体荧光定量pcr检测引物、探针及检测试剂盒 - Google Patents
牛附红细胞体荧光定量pcr检测引物、探针及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒,所述引物基因序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2;所述探针的基因序列为SEQ ID No:3;所述试剂盒包含基因序列为SEQ ID No:1和基因序列为SEQ ID No:2的引物和基因序列为SEQ ID No:3的探针。本发明所提供的牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒,使牛附红细胞体病原的检测操作简便,特异性、敏感性和重复性良好,能更准确、快速地检测出样本中的牛附红细胞体。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学应用领域,具体涉及一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
牛附红细胞体病是由温氏附红细胞体(Mycoplasmawenyonii)寄生于牛血浆、红细胞及骨髓表面等部位而引起的一种人兽共患病,本病可引发牛黄疸、贫血、发热、呼吸、消化和繁殖障碍等(张守发,张国宏,宋建臣.牛附红细胞体体外培养试验[J].中国兽医科技,2002,32(8):27—29)。自张汝南等(张汝南,罗富贵,黄桂英,等.马、牛、羊附红细胞体的发现与虫体检验法[J].兽医科技杂志。1983,9;24—26.)报道该病以来,我国多地检测出该病的流行(陈启军,尹继剐,刘明远.附红细胞体及附红细胞体病[J].中国兽医学报,2006,26(4):460—464)。
目前,常用的牛附红细胞体检测方法有如下方法:(1)牛附红细胞体血液镜检:通过采集疑似牛附红细胞体发病牛血液,通过显微镜观察的方式确诊。(2)Elisa抗体检测方法:它的原理是牛感染牛附红细胞体后产生抗体,通过抗体的检测确定是否感染牛附红细胞体。
现有方法存在以下缺点:(1)牛附红细胞体血液镜检:该方法为经典的病原学诊断方法,但采用本法检测对检测人员的经验有较高要求,且容易出现假阳性和假阴性结果,该方法只能为辅助性诊断方法(黄占欣.索勋,秦建华,等.牛附红细胞体病双抗体夹心ELISA诊断方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医。2007,10:11-13.),不能很好的满足现代化养殖快速有效的病原学检测;(2)Elisa抗体检测方法:该方法的前提是感染牛附红细胞体并产生抗体,由于从感染牛附红细胞体到产生抗体需要一定的时间,这对牛附红细胞体的检测在时间上有一定的局限性,不能及时准确的检测到牛附红细胞体血液镜检;另外,之前感染过牛附红细胞体的牛,后续抗体会在一定时间内持续存在,即使当牛体内没有牛附红细胞体时也会检测到抗体,抗体检测结果阳性也无法说明牛体内是否存在牛附红细胞体病原。
由此可见,现有技术还存在不足。
发明内容
有鉴于此,有必要针对上述的问题,提供一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒,涉及一种荧光定量PCR的实际应用,通过在牛附红细胞体16S rRNA基因处设计定量PCR引物,并采用探针法建立荧光定量PCR检测方法,更准确、快速地鉴别牛附红细胞体。
本发明是通过下述技术方案实现上述目的:
一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物,基因序列为:
上游引物F:GCCTCGCGTGAAAATAGGAA(SEQ ID No:1)
下游引物R:TGAAAAATTCCTCACTGCTGCTT(SEQ ID No:2)。
一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测探针,基因序列为:
探针P:5'-ATGTCCTATTAGGTAGTTGGC-3'(SEQ ID No:3)。
进一步的,所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团,探针P的5’端结合荧光报告基团。
进一步的,所述探针P的荧光淬灭基团为TAMRA。
进一步的,所述探针的荧光报告基团FAM。
进一步的,一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒,包含所述上游引物、下游引物和探针。
所述牛附红细胞体荧光定量PCR检测方法,具体操作包括:
(1)DNA提取:
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取牛附红细胞体总DNA;
(2)荧光定量PCR:
荧光定量PCR反应预混液20μL,包括:模板2μL,探针0.1μL,q-pcr Mix酶10μL,分子生物学用水7.46μL,荧光定量PCR上下游引物各0.2μL,Rox参比染料0.04μL;
将所述反应预混液加入定量PCR扩增仪上进行定量扩增,荧光定量PCR反应程序为:
(3)结果判读:扩增曲线CT值小于35的判定为阳性,CT值大于35且小于40的判定为阴性,此CT值区间的样品需重复检测,若第二次检测仍在此区间,即判定为阳性。
本发明有益效果:
本发明根据GenBank所公布的牛附红细胞体16S rRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱),采用Primer express软件设计出牛附红细胞体定量PCR扩增引物,并在所设计的扩增引物序列中间设计定量探针引物。并将所设计得到的引物和探针应用于牛附红细胞体的荧光定量PCR检测试剂盒和荧光定量PCR检测方法中,操作简单实用,特异性强、敏感度高,重复性好,适应现代化养牛场快速准确的检测需要。
附图说明
图1普通PCR扩增图(1:牛附红细胞体;2:大肠杆菌;3:沙门氏菌;4:枯草杆菌;5:金黄色葡萄球菌;6:阴性对照;M:DNA标准DL2000),目的片段361bp;
图2荧光定量PCR引物特异性实验扩增结果;
图3荧光定量PCR敏感性实验扩增结果。
具体实施方式
为了更加详细、清除地阐述本发明所要解决的问题、所采取的技术方案和达到的有益效果,现结合附图和相关实验做以下解释,要说明的是,以下内容仅为本发明的部分实施例,本发明包含但不限于以下内容。
引物和探针的设计
根据GenBank所公布的牛附红细胞体16S rRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱),采用Primer express软件设计出定量PCR扩增引物,并于所设计的扩增引物中间设计探针引物。
其中,荧光定量PCR上下游引物和探针基因序列分别为:
上游引物F:GCCTCGCGTGAAAATAGGAA;(SEQ ID No:1)
下游引物R:TGAAAAATTCCTCACTGCTGCTT;(SEQ ID No:2)
探针P:5'FAM-ATGTCCTATTAGGTAGTTGGC-3'TAMRA;(SEQ ID No:3)
其中,探针P的3’端结合荧光淬灭基团为TAMRA;探针P的5’端结合荧光报告基团为FAM。
实施例一
牛附红细胞体荧光PCR检测方法,具体操作:
(1)待检样品前处理:200μL牛附红细胞体疑似阳性全血,200μL牛附红细胞体阳性全血(测序确定为牛附红细胞体),200μL生理盐水(阴性对照组)。
样品做如下操作:
牛全血:取200μL牛全血,于-20℃反复冻融3次,使红细胞破裂,溶出附在红细胞上的牛附红细胞体,取200μL冻融后的全血作为待检液。
阴性组:取200μL生理盐水作为阴性对照组。
(2)DNA提取:
采用细菌基因组DNA试剂盒(天根细菌基因组DNA提取试剂盒),按照说明步骤提取以上各组样品的DNA。
(3)定量PCR:
取(2)中提取的DNA模板2μL作为定量PCR模板加入到下列荧光定量PCR预混液中。
荧光定量PCR反应预混液包括:模版2μL,探针0.1μL,q-pcr Mix酶10μL,分子生物学用水7.46μL,荧光定量PCR上下游引物各0.2μL,Rox参比染料0.04μL。荧光定量PCR预混液各试剂均购自Life Technologies公司,由上海基康生物技术有限公司合成荧光定量PCR引物和探针。
将上述预混体系置于ABI公司的7500Fast定量PCR扩增仪上进行定量扩增。
荧光定量PCR反应程序:
荧光定量PCR引物扩增长度为157bp,其基因序列如SEQ ID No:7。
(4)扩增检测结果判定:
扩增曲线CT值小于35的判定为阳性,CT值大于35且小于40的判定为阴性,此CT值区间的样品需重复检测,若第二次检测仍在此区间,即判定为阳性。本次检测结果见表1。
表1检测结果
样品 | CT值 | 结果判定 |
牛附红细胞体阳性全血 | 17 | 阳性 |
疑似感染牛附红细胞体阳性全血 | 26 | 阳性 |
生理盐水 | 无扩增 | 阴性 |
实施例二特异性检测
提取大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌DNA进行特异性检测。使用实施例1中所提供的方法和引物探针,进行荧光定量扩增,结果显示,除阳性对照组外均没有扩增曲线,说明本检测方法特异性良好。扩增结果见图2。
实施例三敏感性检测
(1)质粒的制备
根据GenBank所公布的牛附红细胞体16SrRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱),采用Primerexpress软件设计出普通PCR扩增引物,对实施例1中所提取的DNA为模板进行普通PCR扩增。
普通PCR引物基因序列为:
上游引物:GGATTAATGCTGGTGGTATGCA;(SEQ ID No:4)
下游引物:CCCATATTCCTACGGGAAGCA;(SEQ ID No:5)
普通PCR反应程序为:
普通PCR扩增片段序列如SEQ ID No:6。参见图1。按照胶回收试剂盒(GelExtraCtionKit试剂盒)对切割下的目的条带进行胶回收,将回收的目的片段连接PMD-18-T载体制备质粒,将质粒转染感受态大肠杆菌DH5α,涂板并筛选转染成功的单菌落,挑取菌落摇菌后做菌液PCR鉴定。按照质粒提取试剂盒(Plasmid Mini KitⅠ)说明提取阳性菌液的质粒。质粒经测序和比对,核对正确后方可使用。
(2)敏感性检测
经核酸蛋白测定仪测算出起始质粒拷贝数,以此作为标准品。经测定计算,本次所得质粒浓度为4.85×109拷贝数/μL。然后将质粒做10倍浓度稀释,取原始质粒浓度梯度的10-6-10-9稀释倍数的质粒做模版,各浓度梯度取2μL为模板,按照实施例1中所述方法进行定量PCR检测,以出现定量PCR阳性曲线的最高稀释倍数为本检测方法的最高敏感度。结果显示,最小检出模板浓度为4.85拷贝数/μL,见图3。
实施例四重复性试验
荧光定量PCR重复性实验
采用不同浓度梯度的标准质粒(10-4-10-7浓度梯度),各浓度梯度在同一反应中重复测定5次,计算出各重复样品的变异系数(CV)。实验结果显示(表2),各稀释梯度重复样品Ct值得变异系数皆小于2%,显示本荧光定量PCR重复性良好。
表2荧光定量PCR重复性实验
拷贝数 | CVCt(%) |
×10-4 | 0.97 |
×10-5 | 0.91 |
×10-6 | 1.1 |
×10-7 | 1.2 |
综上所述,结合各类数据表格、结果附图,本发明所提供的具有根据GenBank所公布的牛附红细胞体16SrRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱),采用Primer express软件设计出普通PCR扩增引物和探针的检测试剂盒和检测方法,操作简便,特异性、敏感性和重复性良好,能更准确、快速地鉴别诊断牛附红细胞体病原。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (6)
1.一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物,其特征在于,所述引物基因序列为SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2。
2.一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测探针,其特征在于,所述探针基因序列为SEQ IDNo:3。
3.根据权利要求2所述的检测探针,其特征在于,所述探针的3’端结合荧光淬灭基团,探针P的5’端结合荧光报告基团。
4.根据权利要求3所述的检测探针,其特征在于,所述探针的荧光淬灭基团为TAMRA。
5.根据权利要求3所述的检测探针,其特征在于,所述探针的荧光报告基团FAM。
6.一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒,其特征在于,包含权利要求1所述的引物和权利要求2-5任一所述的探针。
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