CN106119401A - 牛附红细胞体荧光定量pcr检测引物、探针及检测试剂盒 - Google Patents

牛附红细胞体荧光定量pcr检测引物、探针及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒，所述引物基因序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2；所述探针的基因序列为SEQ ID No:3；所述试剂盒包含基因序列为SEQ ID No:1和基因序列为SEQ ID No:2的引物和基因序列为SEQ ID No:3的探针。本发明所提供的牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒，使牛附红细胞体病原的检测操作简便，特异性、敏感性和重复性良好，能更准确、快速地检测出样本中的牛附红细胞体。

Description

牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学应用领域，具体涉及一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
牛附红细胞体病是由温氏附红细胞体(Mycoplasmawenyonii)寄生于牛血浆、红细胞及骨髓表面等部位而引起的一种人兽共患病，本病可引发牛黄疸、贫血、发热、呼吸、消化和繁殖障碍等(张守发，张国宏，宋建臣.牛附红细胞体体外培养试验[J].中国兽医科技，2002，32(8)：27—29)。自张汝南等(张汝南，罗富贵，黄桂英，等.马、牛、羊附红细胞体的发现与虫体检验法[J].兽医科技杂志。1983，9；24—26.)报道该病以来，我国多地检测出该病的流行(陈启军，尹继剐，刘明远.附红细胞体及附红细胞体病[J].中国兽医学报，2006，26(4)：460—464)。
目前，常用的牛附红细胞体检测方法有如下方法：(1)牛附红细胞体血液镜检：通过采集疑似牛附红细胞体发病牛血液，通过显微镜观察的方式确诊。(2)Elisa抗体检测方法:它的原理是牛感染牛附红细胞体后产生抗体，通过抗体的检测确定是否感染牛附红细胞体。
现有方法存在以下缺点：(1)牛附红细胞体血液镜检：该方法为经典的病原学诊断方法，但采用本法检测对检测人员的经验有较高要求，且容易出现假阳性和假阴性结果，该方法只能为辅助性诊断方法(黄占欣.索勋，秦建华，等.牛附红细胞体病双抗体夹心ELISA诊断方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医。2007,10:11-13.)，不能很好的满足现代化养殖快速有效的病原学检测；(2)Elisa抗体检测方法：该方法的前提是感染牛附红细胞体并产生抗体，由于从感染牛附红细胞体到产生抗体需要一定的时间，这对牛附红细胞体的检测在时间上有一定的局限性，不能及时准确的检测到牛附红细胞体血液镜检；另外，之前感染过牛附红细胞体的牛，后续抗体会在一定时间内持续存在，即使当牛体内没有牛附红细胞体时也会检测到抗体，抗体检测结果阳性也无法说明牛体内是否存在牛附红细胞体病原。
由此可见，现有技术还存在不足。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物、探针及检测试剂盒，涉及一种荧光定量PCR的实际应用，通过在牛附红细胞体16S rRNA基因处设计定量PCR引物，并采用探针法建立荧光定量PCR检测方法，更准确、快速地鉴别牛附红细胞体。
本发明是通过下述技术方案实现上述目的：
一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物，基因序列为：
上游引物F：GCCTCGCGTGAAAATAGGAA(SEQ ID No:1)
下游引物R：TGAAAAATTCCTCACTGCTGCTT(SEQ ID No:2)。
一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测探针，基因序列为：
探针P：5'-ATGTCCTATTAGGTAGTTGGC-3'(SEQ ID No:3)。
进一步的，所述探针P的3’端结合荧光淬灭基团，探针P的5’端结合荧光报告基团。
进一步的，所述探针P的荧光淬灭基团为TAMRA。
进一步的，所述探针的荧光报告基团FAM。
进一步的，一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，包含所述上游引物、下游引物和探针。
所述牛附红细胞体荧光定量PCR检测方法，具体操作包括：
(1)DNA提取：
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取牛附红细胞体总DNA；
(2)荧光定量PCR：
荧光定量PCR反应预混液20μL，包括：模板2μL，探针0.1μL，q-pcr Mix酶10μL，分子生物学用水7.46μL，荧光定量PCR上下游引物各0.2μL，Rox参比染料0.04μL；
将所述反应预混液加入定量PCR扩增仪上进行定量扩增，荧光定量PCR反应程序为：
(3)结果判读：扩增曲线CT值小于35的判定为阳性，CT值大于35且小于40的判定为阴性，此CT值区间的样品需重复检测，若第二次检测仍在此区间，即判定为阳性。
本发明有益效果：
本发明根据GenBank所公布的牛附红细胞体16S rRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱)，采用Primer express软件设计出牛附红细胞体定量PCR扩增引物，并在所设计的扩增引物序列中间设计定量探针引物。并将所设计得到的引物和探针应用于牛附红细胞体的荧光定量PCR检测试剂盒和荧光定量PCR检测方法中，操作简单实用，特异性强、敏感度高，重复性好，适应现代化养牛场快速准确的检测需要。
附图说明
图1普通PCR扩增图(1：牛附红细胞体；2：大肠杆菌；3：沙门氏菌；4：枯草杆菌；5：金黄色葡萄球菌；6：阴性对照；M：DNA标准DL2000)，目的片段361bp；
图2荧光定量PCR引物特异性实验扩增结果；
图3荧光定量PCR敏感性实验扩增结果。
具体实施方式
为了更加详细、清除地阐述本发明所要解决的问题、所采取的技术方案和达到的有益效果，现结合附图和相关实验做以下解释，要说明的是，以下内容仅为本发明的部分实施例，本发明包含但不限于以下内容。
引物和探针的设计
根据GenBank所公布的牛附红细胞体16S rRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱)，采用Primer express软件设计出定量PCR扩增引物，并于所设计的扩增引物中间设计探针引物。
其中，荧光定量PCR上下游引物和探针基因序列分别为：
上游引物F：GCCTCGCGTGAAAATAGGAA；(SEQ ID No:1)
下游引物R：TGAAAAATTCCTCACTGCTGCTT；(SEQ ID No:2)
探针P：5'FAM-ATGTCCTATTAGGTAGTTGGC-3'TAMRA；(SEQ ID No:3)
其中，探针P的3’端结合荧光淬灭基团为TAMRA；探针P的5’端结合荧光报告基团为FAM。
实施例一
牛附红细胞体荧光PCR检测方法，具体操作：
(1)待检样品前处理：200μL牛附红细胞体疑似阳性全血，200μL牛附红细胞体阳性全血(测序确定为牛附红细胞体)，200μL生理盐水(阴性对照组)。
样品做如下操作：
牛全血：取200μL牛全血，于-20℃反复冻融3次，使红细胞破裂，溶出附在红细胞上的牛附红细胞体，取200μL冻融后的全血作为待检液。
阴性组：取200μL生理盐水作为阴性对照组。
(2)DNA提取：
采用细菌基因组DNA试剂盒(天根细菌基因组DNA提取试剂盒)，按照说明步骤提取以上各组样品的DNA。
(3)定量PCR：
取(2)中提取的DNA模板2μL作为定量PCR模板加入到下列荧光定量PCR预混液中。
荧光定量PCR反应预混液包括：模版2μL，探针0.1μL，q-pcr Mix酶10μL，分子生物学用水7.46μL，荧光定量PCR上下游引物各0.2μL，Rox参比染料0.04μL。荧光定量PCR预混液各试剂均购自Life Technologies公司，由上海基康生物技术有限公司合成荧光定量PCR引物和探针。
将上述预混体系置于ABI公司的7500Fast定量PCR扩增仪上进行定量扩增。
荧光定量PCR反应程序：
荧光定量PCR引物扩增长度为157bp，其基因序列如SEQ ID No:7。
(4)扩增检测结果判定：
扩增曲线CT值小于35的判定为阳性，CT值大于35且小于40的判定为阴性，此CT值区间的样品需重复检测，若第二次检测仍在此区间，即判定为阳性。本次检测结果见表1。
表1检测结果
样品 CT值 结果判定
牛附红细胞体阳性全血 17 阳性
疑似感染牛附红细胞体阳性全血 26 阳性
生理盐水 无扩增 阴性
实施例二特异性检测
提取大肠杆菌、沙门氏菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌DNA进行特异性检测。使用实施例1中所提供的方法和引物探针，进行荧光定量扩增，结果显示，除阳性对照组外均没有扩增曲线，说明本检测方法特异性良好。扩增结果见图2。
实施例三敏感性检测
(1)质粒的制备
根据GenBank所公布的牛附红细胞体16SrRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱)，采用Primerexpress软件设计出普通PCR扩增引物，对实施例1中所提取的DNA为模板进行普通PCR扩增。
普通PCR引物基因序列为：
上游引物：GGATTAATGCTGGTGGTATGCA；(SEQ ID No:4)
下游引物：CCCATATTCCTACGGGAAGCA；(SEQ ID No:5)
普通PCR反应程序为：
普通PCR扩增片段序列如SEQ ID No:6。参见图1。按照胶回收试剂盒(GelExtraCtionKit试剂盒)对切割下的目的条带进行胶回收，将回收的目的片段连接PMD-18-T载体制备质粒，将质粒转染感受态大肠杆菌DH5α，涂板并筛选转染成功的单菌落，挑取菌落摇菌后做菌液PCR鉴定。按照质粒提取试剂盒(Plasmid Mini KitⅠ)说明提取阳性菌液的质粒。质粒经测序和比对，核对正确后方可使用。
(2)敏感性检测
经核酸蛋白测定仪测算出起始质粒拷贝数，以此作为标准品。经测定计算,本次所得质粒浓度为4.85×109拷贝数/μL。然后将质粒做10倍浓度稀释，取原始质粒浓度梯度的10-6-10-9稀释倍数的质粒做模版，各浓度梯度取2μL为模板，按照实施例1中所述方法进行定量PCR检测，以出现定量PCR阳性曲线的最高稀释倍数为本检测方法的最高敏感度。结果显示，最小检出模板浓度为4.85拷贝数/μL，见图3。
实施例四重复性试验
荧光定量PCR重复性实验
采用不同浓度梯度的标准质粒(10-4-10-7浓度梯度)，各浓度梯度在同一反应中重复测定5次，计算出各重复样品的变异系数(CV)。实验结果显示(表2)，各稀释梯度重复样品Ct值得变异系数皆小于2％，显示本荧光定量PCR重复性良好。
表2荧光定量PCR重复性实验
拷贝数 CVCt(％)
×10-4 0.97
×10-5 0.91
×10-6 1.1
×10-7 1.2
综上所述，结合各类数据表格、结果附图，本发明所提供的具有根据GenBank所公布的牛附红细胞体16SrRNA基因序列(GB︱KX171205.1︱)，采用Primer express软件设计出普通PCR扩增引物和探针的检测试剂盒和检测方法，操作简便，特异性、敏感性和重复性良好，能更准确、快速地鉴别诊断牛附红细胞体病原。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述引物基因序列为SEQ IDNo:1和SEQ ID No:2。
2.一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述探针基因序列为SEQ IDNo:3。
3.根据权利要求2所述的检测探针，其特征在于，所述探针的3’端结合荧光淬灭基团，探针P的5’端结合荧光报告基团。
4.根据权利要求3所述的检测探针，其特征在于，所述探针的荧光淬灭基团为TAMRA。
5.根据权利要求3所述的检测探针，其特征在于，所述探针的荧光报告基团FAM。
6.一种牛附红细胞体荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的引物和权利要求2-5任一所述的探针。
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