CN103160600A

CN103160600A - 检测温氏附红细胞体的pcr试剂盒

Info

Publication number: CN103160600A
Application number: CN2013101174561A
Authority: CN
Inventors: 蒋勇; 胡洪平; 吴刚
Original assignee: Sichuan Huibo Veterinary Medicine Technology Co Ltd
Current assignee: Sichuan Huibo Veterinary Medicine Technology Co Ltd
Priority date: 2013-04-07
Filing date: 2013-04-07
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，含有检测温氏附红细胞体16SrRNA基因的特异引物，其中上游引物如SEQIDNO.1所示，下游引物如SEQIDNO.2所示，该引物能够特异扩增温氏附红细胞体的16SrRNA基因，而不能扩增猪附红细胞体、羊附红细胞体及大肠杆菌的16SrRNA基因片段，并且灵敏度高，最小检测量为1.1×10^-6μg/mL，将本发明公开的PCR检测试剂盒用于临床诊断，性能稳定，操作方便，易于标准化。

Description

检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测领域，涉及检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒。

背景技术

附红细胞体病(Eperythrozoonsis)是由血液寄生生物——附红细胞体(Eperythrozoon)引起的一种人畜共患病，它主要寄生于人和动物红细胞表面、血浆及骨髓中，具多形态性。感染后多呈隐性经过，急性发病时以贫血、黄疸、发热等为主要临床症状。

附红细胞体对畜牧养殖业和人类健康具有重要的危害性及潜在危害性，主要体现在：① 破坏宿主红细胞，严重影响动物红细胞的输氧功能及免疫力，使患畜的抵抗力下降，易继发或并发其他疾病，造成严重经济损失。② 该病可垂直传播，怀孕动物感染时可引起弱胎、死胎或流产，后代生长发育迟缓。③ 不同种动物的附红细胞体可产生交叉感染，据资料证实小鼠、家兔、以及奶牛之间存在着交叉感染，与患病畜频繁接触的饲养员或兽医，其附红细胞体感染率达到了90%，因此，推断奶牛的附红细胞体很可能感染人，本病已成为一个不容忽视的公共卫生问题，这给人类健康带来严重的威胁。

附红细胞体病流行范围广，感染的宿主种类多。目前，世界上已有30多个国家和地区报道过该病，我国已有20多个省、市、自治区相继报道发现本病流行，所感染的宿主包括牛、羊、猪、兔、马、犬、猫和人等。在已经报道的附红细胞体种类中，温氏附红细胞体（Eperythrozoon wenyonii，E.wenyonii）是引起牛发生附红细胞体病的重要病原。

目前在对温氏附红细胞体病的诊断主要采用镜检，病初进行鲜血压片或涂片，染色镜检能给予检出，但受检查者对温氏附红细胞体的观察影响和检查条件的干扰，而当病畜患有贫血时，红细胞和附红细胞体均受破坏，则检出附红细胞体相对困难，此外利用此方法无法将一些立克次氏体病原如牛边缘无浆体区分开来，因而容易出现误诊。由于宿主产生的抗体是针对受破坏的红细胞而不是针对附红细胞体本身，因而在应用补体结合试验、间接血凝试验（IHA）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等血清学方法诊断附红细胞体感染时，诊断的特异性不强。因此，探索开发简易、敏感、特异的诊断技术是当前研究附红细胞体病的首要任务。PCR检测技术以其特异性强，敏感性高、检出速度快等特点，已被广泛用于细菌、病毒等微生物的检测。但是不同种类的附红细胞体亲缘性较近，无法将温氏附红细胞体与其他种类的附红细胞体区分开。为准确和快速诊断温氏附红细胞体病，急需一种对温氏附红细胞体特异好，扩增效率高的检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，为诊断该疾病提供可靠的技术保障。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供温氏附红细胞体的PCR试剂盒，对温氏附红细胞体特异好，灵敏度高，能够准确快速的诊断温氏附红细胞体病。

为实现上述发明目的，技术方案为：

检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

优选的，所述上游引物的浓度为20 μmol/L，所述下游引物的浓度为20 μmol/L。

优选的，还含有PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、DNA聚合酶和双蒸水。

更优选的，所述PCR缓冲液浓度为10 mmol/L，MgCl₂浓度为2.5 mmol/L，dNTPs浓度为2.5 mmol/L，DNA聚合酶的浓度为5U/μL。

最优选的，所述PCR试剂盒的反应体系为：每25μL反应体系含有24μL如下组分，2.5μL浓度为10mmol/L的10×PCR缓冲液，1.5μL浓度为2.5mmol/L的MgCl₂，2μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，1μL浓度为20μmol/L的上游引物，1μL浓度为20μmol/L的下游引物，0.125μL浓度为5U/μL的DNA聚合酶，余量为水。

本发明的有益效果在于：本发明公开的温氏附红细胞体的PCR试剂盒，引物特异性好，能够特异扩增温氏附红细胞体16S rRNA 基因序列，而不能扩增猪附红细胞体、羊附红细胞体等的16S rRNA 基因序列，因此能够避免假阳性，并且该试剂盒的灵敏度高，最小检测量为1.1×10^-6μg/mL；与常规的温氏附红细胞体病诊断方法，如与鲜血压片或涂片染色镜检、补体结合试验、间接血凝试验（IHA）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等血清学试验相比，具有灵敏度高、特异性好、操作简便、易标准化等优点，与现有PCR方法相比，特异性强、灵敏度高，降低假阳性和假阴性。

附图说明

图1为对感染温氏附红细胞体的水牛、奶牛和黄牛血样PCR检测结果，其中M：DL-2000；S1-S3：水牛全血基因组DNA；N1-N3：奶牛全血基因组DNA；H1-H4：黄牛全血基因组DNA。

图2为特异性PCR电泳结果图，其中，M：DL2000；1：温氏附红细胞体；2：猪附红细胞体；3：羊附红细胞体；4：大肠杆菌DNA；5：空白对照。

图3为温氏附红细胞体特异性PCR敏感性图，其中M：DL-2000；0：阴性对照；1-8：稀释浓度分别为55.14μg/mL、11.028μg/ mL、2.2056μg/ mL、0.44μg/ mL、8.8×10^-2μg/ mL ml、1.76×10^-2μg/ mL、3.529×10^-3μg/ mL和7.058×10^-4μg/ mL。

图4为温氏附红细胞体特异性PCR敏感性图，其中M：DL-2000；0：阴性对照；9-16：稀释浓度分别为7.058×10^-4μg/ mL、1.412×10^-4μg/ mL、2.82×10^-5μg/ mL、5.6×10^-6μg/ mL、1.1×10^-6μg/ mL、2.2×10^-7μg/ mL、4.4×10^-8μg/ mL和8.8×10^-9μg/ mL。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例 1

采集感染温氏附红细胞体的奶牛、黄牛和水牛血样，利用Promega公司的DNA提取试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）提取全血基因组DNA。

选取GenBank中收录的牛、羊、猪、猫、兔附红细胞体的16S rRNA基因核苷酸序列，设计并合成一对扩增附红细胞体的16S rRNA的引物，理论扩增片段为446bp，引物序列如下：

上游引物Cm1：5’-cgaacgagtggaacttgttctgc-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物Cm2：5’-tagtaccatcaaggcgtgctc-3’ （SEQ ID NO.2）；

引物序列由上海英骏（Invitrogen）生物技术有限公司合成。

以制备的基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示：

表1、PCR反应体系组成

溶液种类	体积（μL）
		10×PCR缓冲液（10 mmol/L）	2.5μL
MgCl₂（2.5 mmol/L）	1.5μL
		dNTPs（2.5 mmol/L）	2μL
Cm1（20 μmol/L）	1μL
		Cm2（20 μmol/L）	1μL
rTaq酶 (5U/μL)	0.125μL
		全血基因组DNA模板	1μL
双蒸水	16.875μL
		总体积	25μL

PCR反应程序为，94℃预变性5分钟；94℃变性20秒，59℃退火20秒，72℃延伸20秒，共35个循环；最后72℃循环7分钟。

取5μL扩增的PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果如图1所示。由图1可知感染温氏附红细胞体的水牛、奶牛和黄牛血样提取的基因组DNA扩增产物约416bp，结果大小相符。

实施例2

将实施例1电泳后的琼脂糖凝胶中的目的条带切下，按Promega公司的凝胶提取试剂盒（E.Z.N.A. Gel Extraction Kit）的使用说明回收目的条带；取回收的目的条带与T载体（pMD18-T）在16℃条件下连接过夜，然后转化JM109感受态细胞，过夜培养后挑取白色菌落接种于1mL LB液体培养基中，然后在37℃、150rpm条件下过夜培养，PCR鉴定并挑选阳性克隆，将阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。以感染温氏附红细胞体的黄牛血样基因组为模板的测序结果如SEQ ID NO.3所示，其碱基数为415bp；以感染温氏附红细胞体的奶牛和水牛血样基因组为模板的测序结果分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，其碱基数均为416bp。将获得的序列与公开的温氏附红细胞体的16S rRNA（GenBank：FJ375309）进行比较，序列同源性在99%以上，将获得的如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的核酸序列提交至GenBank，分别获得登陆号，即EU646897、EU646898和EU646899。

实施例 3

按实施例1的PCR方法，以温氏附红细胞体感染奶牛的血样基因组DNA作为阳性对照，分别对猪附红细胞体、羊附红细胞体及大肠杆菌DNA为模板进行PCR检测，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。由图2可知，以猪附红细胞体、羊附红细胞体及大肠杆菌DNA为模板未能扩增出任何条带，而以温氏附红细胞体感染奶牛的血样基因组DNA扩增出约416bp条带。表明SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物特异性好，能够特异扩增温氏附红细胞体的16S rRNA，而不能扩增猪附红细胞体、羊附红细胞体等，因此能够用于温氏附红细胞体的特异性检测。

实施例 4

将温氏附红细胞体感染奶牛的血样基因组DNA稀释至55.14μg/mL，然后用双蒸水按1：5的体积比进行梯度稀释，每个稀释度取1μL作为模板，按实施例1的方法进行PCR检测，扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3和图4所示。由图3和图4可知，出现阳性克隆的最小浓度为1.1×10^-6μg/mL，因此利用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物序列检测温氏附红细胞体感染的最小检出量为1.1×10^-6μg/mL。

因此，可以将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列用于制备检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，试剂盒中还可以包括常规的PCR检测试剂，如10×PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、DNA聚合酶和双蒸水。

实施例 5

利用检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒对四川、重庆的14个区县共307头份牛血液样本进行检测，同时采用了鲜血压片法和姬姆萨染色法检测与其进行比较观察，结果如表2所示。

表2、PCR与常规检测方法对四川、重庆部分地区温氏附红细胞体的检测结果

Figure 2013101174561100002DEST_PATH_IMAGE001

由表2可知，鲜血压片法对温氏附红细胞体的阳性检出率为27%-75%，平均为46%；姬姆萨染色法对温氏附红细胞体的阳性检出率为27%-77%，平均为48%；特异性PCR方法对温氏附红细胞体的阳性检出率为0%-33%，平均为11%，低于鲜血压片法和姬姆萨染色法检测结果。其原因可能为因立克次氏体病原感染导致的误诊，因此使用本发明的试剂盒检测温氏附红细胞体感染的准确度更高。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

<110> 四川汇博兽药科技有限公司

<120> 检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒

<160> 5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物Cm1

<400> 1

cgaacgagtg gaacttgttc tgc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物Cm2

<400> 2

tagtaccatc aaggcgtgct c 21

<210> 3

<211> 415

<212> DNA

<213> 温氏附红细胞体（Eperythrozoonwenyonii）

<220>

<223> 黄牛温氏附红细胞体

<400> 3

cgaacgagtg gaacttgttc tgctagtggc aaacgggcga gtaatacata tttaacttac 60

ttttacgagg aggatagcag ttcgaaagga ctattaatac tccataggtt tataaactaa 120

atcaaagagg ctccctcggg ggcctcgcgt gaaaatagga atatgtccta ttaggtagtt 180

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<210> 4

<211> 416

<212> DNA

<213> 温氏附红细胞体（Eperythrozoonwenyonii）

<220>

<223> 奶牛温氏附红细胞体

<400> 4

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<213> 温氏附红细胞体（Eperythrozoonwenyonii）

<220>

<223> 水牛温氏附红细胞体

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Claims

1. 检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。

2.根据权利要求1所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于：所述上游引物的浓度为20 μmol/L，所述下游引物的浓度为20 μmol/L。

3.根据权利要求1所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于：还包括10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl₂、DNA聚合酶和双蒸水。

4.根据权利要求3所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于：所述10×PCR缓冲液浓度为10 mmol/L，MgCl₂浓度为2.5 mmol/L，dNTPs浓度为2.5 mmol/L，DNA聚合酶的浓度为5U/μL。

5. 根据权利要求1-4任一项所述检测温氏附红细胞体的PCR试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂盒的反应体系为：每25μL反应体系含有24μL如下组分，2.5μL浓度为10mmol/L的10×PCR缓冲液，1.5μL浓度为2.5mmol/L的MgCl₂，2μL浓度为2.5mmol/L的dNTPs，1μL浓度为20μmol/L的上游引物，1μL浓度为20μmol/L的下游引物，0.125μL浓度为5U/μL的DNA聚合酶，余量为水。