CN101948914B - 一种环介导等温扩增方法在温氏附红细胞体体外检测中的应用 - Google Patents
一种环介导等温扩增方法在温氏附红细胞体体外检测中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于寄生虫分子检测技术领域，具体涉及一种温氏附红细胞体的快速环介导等温扩增检测方法。步骤包括：(1)设计三对特异性引物；(2)提取血液样品总DNA；(3)环介导的等温扩增反应和扩增产物分析。在凝胶成相系统上成像观察结果，扩增产物为不同大小区带组成的阶梯式图谱为温氏附红细胞体阳性，或在扩增的最终产物中加入SYBR Green I自然光下肉眼观察结果，扩增产物变为黄绿色为温氏附红细胞体阳性，扩增产物为红棕色为温氏附红细胞体阴性。本发明特异性强，可作鉴别常见血液原虫；灵敏度高，比普通PCR敏感性高10-100倍；检测简单快速，只需一台水浴锅1小时即可出结果。
Description
技术领域
本发明属于寄生虫分子检测技术领域，具体涉及一种环介导等温扩增方法在温氏附红细胞体体外检测中的应用。
技术背景
附红细胞体病是由专性血液寄生生物附红细胞体引起的，以贫血、黄疽、发热等为主要临床特征的疾病。国内外曾有人称之为黄疸性贫血病、类边虫病、赤兽体病和红皮病等【1】。自1928年Schilling和Dingen等在啮齿类动物中查到类球状血虫体以来，科学家们相继在不同的动物体内发现了此种类球状血虫体的存在。其中，Adler等于1934年在牛体中发现了形态和类球状血虫体相似的微生物，命名为温氏附红体(E.wenyoni)。
对附红细胞体的分类历来存在争议。1974年《伯杰细菌鉴定手册》第八版将附红体分类在立克次氏体目(Rickettsiares)，无浆体科(Anaplasmatacae)，血巴尔通体属(Haemobartonella)，也称附红细胞体属(Eperythrozoon)【2】。1997年，Harold Neimark等人根据16S rRNA基因的序列进行系统发育分析认为附红细胞体属中的温氏附红细胞体(Eperythrozoon wenyonii)属于支原体(Mycoplasma)，并且与肺炎支原体(M.pneumoniae)更为接近【3】。2001年，Harold Neimark等人建议将血巴尔通体属(Haemobartonella)以及附红细胞体属(Eperythrozoon)中的四个种移到支原体属(Mycoplasma)中，并定义了新的名字。因此，16S rRNA基因对于附红细胞体的分子进化和检测等具有十分重要的意义【4】。
基于分子水平对牛温氏附红细胞体16S rRNA基因进行PCR扩增可以及时准确的进行病原鉴别，但是普通的PCR，以及灵敏度更高的巢式PCR、荧光定量PCR，都必须依赖昂贵的精密仪器，检测费用高，对检测人员要求较高的技术等，无法在条件较差的基层实验室进行。环介导等温扩增法(loop mediated isothermal amplification，LAMP)可以在等温条件下高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列。这种方法不需要特别的设备，只需要一台可以提供60℃恒温环境的仪器(如水浴锅或便携式恒温电热器)。不仅大大降低了检测的费用，而且给临床应用带来极大方便【5】。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、特异而又简单实用的牛温氏附红细胞体的环介导等温扩增(LAMP)检测方法。
本发明的具体方案包括下列步骤：
(1)引物设计：根据本申请人于2005年已报道的登录号为AY946266.1的温氏附红细胞体16S rRNA基因序列(见序列表SEQ ID NO：1所示)设计三对特异性引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下所示：
外引物F3：5′-GTTGATCCATTGTTAAAGGC-3′；(对应序列表SEQ ID NO：2)
外引物B3：5′-ACGGCGTGGACTACTGG-3′；(对应序列表SEQ IDNO：3)
内引物BIP：5′CGCATTCCACCGCTACACttttGCTTAACAAATGTGTGCGAT-3′；(对应序列表SEQID NO：4)
内引物FIP：5′AACACCAGAGGCTAAGttAATCCCATTTGCTCCCCACGC-3′；(对应序列表SEQ IDNO：5)
促环引物LF：5′-CCTGATTAACTCTAGGGAG-3′；(对应序列表SEQ ID NO：6)
促环引物BF：5′-ATAACTGACACTGAGGCTT-3′。(对应序列表SEQ ID NO：7)
上述引物对的核苷酸序列已经采用专用软件PatentIn3.1处理成专利程序的核苷酸序列计算机可读形式副本。这些引物对在序列表中被依次命名为SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：7。
(2)牛血液样品中总DNA的提取：用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，购自TIANGEN公司，产品目录号：DP304-03)，按照该试剂盒的说明书牛血液样品中的总DNA。
(3)环介导的等温扩增：
1)建立环介导的等温扩增(LAMP)反应体系：2.5μL 10倍体积的Bst DNA聚合酶缓冲液(该缓冲液的成分为0.2MTris-HCL，0.1M(NH4)2SO4，0.1M KCL，20Mm MgSO4，1％TritonX-100)，2mM MgCl2，0.6M甜菜碱(betaine)，0.4mM dNTPs，外引物F3B3各0.08μM，内引物FIP BIP各0.6μM，促环引物LF LB各0.28μM，8U BstDNA聚合酶，5μLDNA模板，用灭菌双蒸水补齐至25μL。其中阳性对照为构建好的温氏附红细胞体阳性质粒，阴性对照为灭菌双蒸水；
2)环介导的等温扩增反应：95℃预变性5min后加入8U的Bst DNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应；
3)扩增产物分析：采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
显色反应：将1000倍体积的荧光显色剂SYBR Green I进行10倍稀释，之后取1-2μL加入至25μL的环介导等温扩增的最终产物中，在自然光下用肉眼观察扩增产物的显色情况。若扩增产物变为黄绿色则为温氏附红细胞体阳性，若扩增产物为红棕色则为温氏附红细胞体阴性。
琼脂糖凝胶电泳：取25μL的环介导等温扩增的最终反应产物10μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。扩增产物为由不同大小的区带组成的阶梯式图谱为温氏附红细胞体阳性。
其中步骤1)所述的阳性质粒的制备方法是，用已报道的嗜血营养菌通用引物16S U1，16S U2扩增牛血液总DNA中牛温氏附红体的16S rRNA基因全长，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下并进行回收，将回收产物与PMD19-T载体进行连接后转化至大肠杆菌DH5d感受态细胞，37℃培养8-12h，然后挑取单菌落进行培养，待菌液浑浊后用碱裂解法提取重组质粒，用EcoR I进行酶切鉴定，测序，将测序结果导入NCBI数据库进行序列比对，得到温氏附红细胞体的阳 性质粒。
本发明所设计的三对特异引物成功建立了对温氏附红细胞体快速、灵敏、特异而又简单实用的温氏附红细胞体分子检测方法，与其它传统PCR方法相比本发明有以下优点：
1.本发明经济实用：反应是在恒温的条件下进行，不需要昂贵的PCR仪，只需要一台可以提供恒温的设备，比如水浴锅即可完成。
2.本方法的灵敏度高：结果显示本发明所建的LAMP方法在拷贝数为6.21×1012copies/ml的阳性质粒稀释到10-11时仍能检测到阳性扩增条带。比普通PCR敏感性高10-100倍。
3.本发明的方法特异性强：3对引物对靶序列的8个特异序列区的识别，保证了LAMP方法扩增的高度特异性。
4.本发明检测简单：直接肉眼观察反应产物经SYBR Green I染色后的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是报道的(登录号为AY946266.1)温氏附红细胞体16SrRNA基因的核苷酸序列；
序列表SEQ ID NO：2-7是本发明用于温氏附红细胞体16SrRNA基因扩增的特异性引物对的核苷酸序列。
序列表SEQ ID NO：8-9是本发明中涉及到的用于嗜血营养菌16SrRNA基因扩增的通用引物对的核苷酸序列。
图1：是本发明对牛血液中总DNA扩增电泳结果；图中：泳道M：λDNA/Hind III DNAMarker，泳道1、2、3、4为四个重复。
图2：是本发明对温氏附红细胞体DNA扩增产物中加入SABR Green I后的照片。图左边管为温氏附红细胞体阳性结果，图右边管为温氏附红细胞体阴性结果；
图3：是本发明对对临床检测到的温氏附红细胞体进行电泳检测结果；
图中：泳道M：Trans2K DNA Marker，泳道1-13为临床检测到的温氏附红细胞体，依次为：ZY(湖北枣阳)6-5，ZY8-5，HN(湖南常德)8-15，HN9-8，YL(河南鄢陵)769-9，YL791-6，DY(湖北大冶)17N，DY23N，DY31N，DY34N，HZ(湖北黄州)6N，HZ8N，HZ9N，泳道14为阴性对照；
图4：是本发明对温氏附红细胞体特异性检测；
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道1：温氏附红细胞体阳性对照，泳道2-9：边缘无浆体，环形泰勒虫，瑟氏泰勒虫，水牛泰勒虫，东方巴贝斯虫，刚地弓形虫；
图5：是本发明对构建阳性质粒时的酶切结果；
图中：泳道M：Trans2K Plus DNA Marker，泳道1-5为从不同单菌落提取质粒后酶切的结果
图6：是本发明对温氏附红细胞体LAMP检测方法敏感性实验结果。
图中：泳道M：Trans2KPlusDNAMarker，泳道1-10：以阳性质粒分别稀释到10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12倍为模板DNA进行LAMP扩增的结果。
图7：利用LAMP方法检测临床温氏附红细胞体的试验流程图
图8：LAMP扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域，其中斜体英文字母为促环形成引物对。
具体实施方式
实施例1：对血液样品进行温氏附红细胞体的检测
1.牛血样总DNA的提取：用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(购自TIANGEN公司，目录号：DP304-03，按试剂盒说明书操作)提取牛血液样品中的总DNA。
2.环介导的等温扩增：
建立一个环介导的等温扩增(LAMP)反应体系，该体系如下：2.5μL 10倍体积的BstDNA聚合酶缓冲液(其成分为0.2M Tris-HCL，0.1M(NH4)2SO4，0.1M KCL，20Mm MgSO4，1％TritonX-100)，2mM MgCl2，0.6M甜菜碱(betaine)，0.4mM dNTPs，外引物F3B3各0.08μM，内引物FIP BIP各0.6μM，促环引物LF LB各0.28μM，8U Bst DNA聚合酶，5μL DNA模板，用灭菌双蒸水补齐至25μL。其中阳性对照为构建好的牛附红细胞体阳性质粒(具体构建方法将在实施例3：温氏附红细胞体LAMP检测方法敏感性试验中加以描述)，阴性对照为灭菌双蒸水；95℃预变性5min后加入8U的Bst DNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应；
环介导的等温扩增反应扩增产物分析：
显色反应：将1000倍体积的荧光显色剂SYBR Green I进行10倍稀释，之后取1-2μL加入至25μL的环介导等温扩增的最终产物中，在自然光下用肉眼观察扩增产物的显色情况。若扩增产物变为黄绿色则为温氏附红体阳性，若扩增产物为红棕色则为温氏附红细胞体阴性。结果如图2。
琼脂糖凝胶电泳：取10μL的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。扩增产物由不同大小的区带组成的阶梯式图谱的样品为温氏附红细胞体阳性。结果如图3。
实施例2：牛温氏附红细胞体LAMP检测方法特异性试验
如表1所示，在特异性试验中所用的边缘无浆体、瑟氏泰勒虫、水牛泰勒虫、东方巴贝斯虫以及刚地弓形虫虫株是由本申请人所在的动物寄生虫实验室分离并保存的虫株(参见参考文献【6】-【10】)。环形泰勒虫虫株是中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠(参见《遗传资源来源信息披露登记表》)。所有虫株均以冷冻抗凝血的形式保存。
表1牛温氏附红细胞体LAMP检测的特异性试验
表1的说明：“+”表示可以检测到有不同大小的区带组成的阶梯式图谱，“-”表示不能检测到。
表1的虫株名称的相关发表信息如下：
(1)边缘无浆体虫株为华中农业大学动物医学院寄生虫实验室分离并保存(见参考文献【6】)。
(2)瑟氏泰勒虫虫株为华中农业大学动物医学院寄生虫实验室分离并保存(见参考文献【7】)。
(3)水牛泰勒虫虫株为华中农业大学动物医学院寄生虫实验室分离并保存(见相关参考文献【8】)。
(4)东方巴贝斯虫虫株为华中农业大学动物医学院寄生虫实验室分离并保存(见参考文献【9】)。
(5)刚地弓形虫虫株为华中农业大学动物医学院寄生虫实验室分离并保存(见参考文献【10】)。
总DNA的提取：按血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)(购自TIANGEN公司，目录号：DP304-03)，按照该试剂盒说明书介绍的方法提取上述6种虫株中的总DNA。
环介导等温扩增反应：2.5μL 10倍体积的BstDNA聚合酶缓冲液(其组成成分为0.2M Tris-HCL，0.1M(NH4)2SO4，0.1M KCL，20Mm MgSO4，1％TritonX-100)，2mM MgCl2，0.6M甜菜碱(betaine)，0.4mM dNTPs，外引物F3B3各0.08μM，内引物FIP BIP各0.6μM，促环引物LF LB各0.28μM，8U BstDNA聚合酶，5μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL。其中阳性对照为构建好的牛附红细胞体阳性质粒(具体构建方法将在实施例3：温氏附红细胞体LAMP检测方法敏感性试验中加以描述)，阴性对照为灭菌双蒸水；95℃预变性5min后加入8U的Bst DNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63℃反应50min，然后80℃作用5min后终止反应；
环介导的等温扩增反应扩增产物分析：
取10μL的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。扩增产物由不同大小的区带组成的阶梯式图谱的样品为温氏附红细胞体阳性。结果如图4。
实施例3：温氏附红细胞体LAMP检测方法敏感性试验
用16S rRNA基因阳性质粒作为模板，检测温氏附红细胞体LAMP方法的敏感性。方法如下：
1.实施例1的方法从牛血液样品中提取血液总DNA模板。
2.用报道的PCR方法扩增目的片段：用已报道的嗜血营养菌通用引物16S U1，16S U2(见下列具体引物的序列所示)扩增牛血液总DNA中牛温氏附红体的16S rRNA基因全长(即SEQIDNO：1所示的核苷酸序列)，所述的引物对的核苷酸序列如文献【11】所示。
16S U1：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；(对应序列表SEQ ID NO：8)
16S U2：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′；(对应序列表SEQ ID NO：9)
上述引物对的核苷酸序列已经采用专用软件PatentIn3.1处理成专利程序的核苷酸序列计算机可读形式副本。这些引物对在序列表中被分别命名为SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。
反应体系为：5.0μL 10×PCR Buffer(其成分为100mM Tris-HCl(pH8.3)，500mM KCl，15mM MgCl2)，0.4mM dNTPs，上游引物16S U10.4μM，下游引物16S U20.4μM，DNA模板6μL，3.0U rTaq DNA聚合酶，灭菌双蒸水补齐至50μL。将上述试剂混匀后置于PCR仪中，反应参数设置为：95℃10min后进入循环，94℃1min，57℃1min，72℃1min15s，30个循环后72℃再延伸10min，最后15℃保温。
3.PCR产物分析：取50μL的PCR扩增产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果。结果可以看1471bp大小的片段。
4.阳性质粒的构建：
将扩增的目的基因从琼脂糖凝胶上切下，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(该试剂盒购自TianGen公司)回收DNA。将回收产物与PMD19-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接，连接体系为：1μL PMD19-T载体，10μL solμtion，9μL回收产物，将上述试剂混匀后玉16℃水浴过夜。取10μL连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃循环水中热击90s，快速冰浴1-2min使细胞冷却，加入400μL LB液体培养基，37℃摇床上培育45min，8000rpm离心2min，弃去400μL上清液，将余下液体吹打均匀，吸取100μL涂布于含1/1000氨苄青霉素的LB琼脂平皿上，37℃培养8-12h。用灭菌移液器头挑取菌落置于3ml含1/1000氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培育12h，用传统的碱裂解方法提取重组质粒【12】。具体步骤如下：
(1)将培养物转移到1.5ml微量离心管中，12000r/m离心5min，倾去上清，将离心管倒置于吸水纸上，尽量让培养液流尽。
(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I(成分如下)，涡旋，使沉淀完全分散，室温静置5分钟。
溶液I：50mmol/L 葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)
10mmol/L EDTA(pH8.0)
(3)加入200μl新配制的溶液II，颠倒几次，充分混匀，置于冰上5分钟。
溶液II：0.2mol/L NaOH
1％ SDS(十二烷基磺酸钠)
(4)加入150μl用冰预冷的溶液III，上下颠倒几次，于冰上放置3-5分钟。
溶液III：5mol/L乙酸钾 6ml
冰乙酸 11.5ml
双蒸水 28.5ml
(5)12000rpm离心10min，将上清转移到另一离心管中，不要将沉淀吸起。
(6)加等量体积的酚∶氯仿∶异戊醇(体积比为25∶24∶1)涡旋混匀，12000rpm离心5min。
(7)取上层液相于另一离心管中，加入等量体积的氯仿∶异戊醇，涡旋混匀后，12000rpm离心5min。
(8)取上层液相于另一离心管中，加2倍体积预冷的无水乙醇，混匀后于-20℃沉淀30min。(9)12000rpm离心10min，小心吸去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，以使所有液体流出。(10)用浓度为70％乙醇洗一次，倒掉洗液并倒置吸水纸上让痕量液体流尽。然后用真空干燥器抽干或自然干燥直到无乙醇气味。(11)用20μl含RNA酶的TE或灭菌双蒸水溶解，37℃作用30分钟以去除RNA。
用酶切方法鉴定重组质粒：用EcoR I限制性核酸内切酶(购自宝生物工程(大连)有限公司)对提取的质粒进行酶切，其反应体系为：EcoR I 0.4μL，10×H缓冲液(其组成成分为500mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl2，10mM Dithiothreitol，1000mM NaCl)2μL，质粒2μL，灭菌双蒸水补齐至25μL，37℃作用2h。将酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，取10μL的酶切产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果。如图5挑选2号菌液送北京奥科生物技术有限责任公司进行测序。将测序结果导入NCBI数据库进行序列比对，证实该重组质粒为温氏附红细胞体的阳性质粒。
5.将克隆的阳性质粒10倍稀释后通过紫外分光光度计测定浓度，计算质粒拷贝数，公式为：
(6.23×1023copies/mol)×(浓度g/ml)÷[碱基数×(660道尔顿/碱基)]＝拷贝数/ml
经计算所构建好的温氏附红细胞体阳性质粒的拷贝数为：6.21×1012copies/ml
用ddH2O将上述质粒进行倍比稀释，即，分别稀释到10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-10，10-11，10-12倍。具体稀释方法如下：取10μL构建好的阳性质粒加入990μL ddH2O中，充分混匀后取100μL加入另一管已有900μL ddH2O的EP管中，再次混匀后取100μL加入下一管已有900μL ddH2O的EP管中，依次类推。
6.LAMP敏感性实验：以F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF、LB为促环引物对已稀释好的阳性质粒进行扩增。稀释好的阳性质粒分别取5μL，体系中其他试剂为2.5μL 10倍体积的BstDNA聚合酶缓冲液(其组成成分为0.2M Tris-HCL，0.1M(NH4)2SO4，0.1M KCL，20Mm MgSO4，1％TritonX-100)，2mM MgCl2，0.6M甜菜碱(betaine)，0.4mM dNTPs，外引物F3B3各0.08μM，内引物FIP BIP各0.6μ M，促环引物LF LB各0.28μM，8U BstDNA聚合酶，灭菌双蒸水补齐至25μL。95℃预变性5min后加入8U的BstDNA聚合酶至上述除酶以外的反应体系中，再将其放置于63℃反应50min，然后于80℃作用5min后终止反应。
7.扩增产物分析：取10μL的环介导等温扩增的最终反应产物，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。扩增产物由不同大小的区带组成的阶梯式图谱的样品为温氏附红细胞体阳性。结果显示此LAMP方法在拷贝数为6.21×1012copies/ml的阳性质粒稀释到10-11时仍能检测到阳性扩增条带。其结果如图6所示。
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Claims (1)
1.一种用于温氏附红细胞体的特异性分析的环介导等温扩增检测的引物组合，其特征在于，所述的引物组合的DNA序列如下所示：
外引物F3：5′-GTTGATCCATTGTTAAAGGC-3′；
外引物B3：5′-ACGGCGTGGACTACTGG-3′；
内引物BIP：5′-CGCATTCCACCGCTACACttttGCTTAACAAATGTGTGCGAT-3′；
内引物FIP：5′-AACACCAGAGGCTAAGttAATCCCATTTGCTCCCCACGC-3′；
促环引物LF：5′-CCTGATTAACTCTAGGGAG-3′；
促环引物BF：5′-ATAACTGACACTGAGGCTT-3′。
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