CN109423523A - 支原体检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种支原体检测方法，包含：提供生物样本；利用反应混合物与生物样本进行聚合酶连锁反应，其中反应混合物包含引物对为选自由SEQ ID NO:1‑2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列及衍生序列所组成的群组；以及分析聚合酶连锁反应的增幅产物的有无以判断生物样本中支原体的存在与否。在此亦提供一种检测支原体的试剂盒，包含前述所提的引物对。

Description

支原体检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明关于一种支原体检测方法及其试剂盒，尤其是一种支原体的分子检测方法及其试剂盒。

背景技术

支原体泛指支原体属(Mycoplasma)的原核生物，为革兰氏阴性菌。习知许多种类的支原体为人体或其他动物的病原疾病。举例来说，常见于猫或狗血液系统中的亲血性支原体(hemotropic Mycoplasma)，主要传染途径为经输血、口、垂直传染、伤口以及跳蚤、壁虱的叮咬，潜伏期为约2至约17天。当猫被血液支原体感染之后极易产生致命的症状，例如：导致溶血性贫血，进而造成猫血巴东虫症(feline haemobartonellosis)或是猫传染性贫血症(feline infectious anemia)。

被血液支原体感染之后，主要临床症状为发烧、贫血、抑郁、无食欲、黏膜苍白、黄疸、胆红素尿、体重减轻等。惟上述症状临床上不是很明显，尤其大部分感染后没有血红素尿和黄疸状态，极易被忽略而失去治疗时机，导致罹病后的死亡率高达三成。目前检测出感染后投予药物，大部分的患者约二到三周的疗程即可痊愈。但若延误就医而出现严重症状时，除须住院治疗外，死亡风险亦相对提升许多。故在临床上若能早期检测是否感染血液支原体，对于疾病治愈率的提升有其重要性。

发明内容

本发明的一实施方式为提供一种检测支原体的方法，包含：提供一生物样本；利用一反应混合物与生物样本进行聚合酶连锁反应，其中反应混合物包含一引物对为选自由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列及衍生序列所组成的群组；以及分析聚合酶连锁反应的增幅产物的有无以判断生物样本中支原体的存在与否。

根据一些实施方式，其中所进行的聚合酶连锁反应为即时定量聚合酶连锁反应。

根据一些实施方式，其中反应混合物进一步包含一寡核苷酸探针为选自由SEQ IDNO:3-4所示的核苷酸序列及其简并序列所组成的群组。

根据一些实施方式，其中该支原体为Mycoplasma haemofelis，且寡核苷酸针为一介于支原体Mycoplasma haemofelis的16S核糖体RNA基因的第563至第710个碱基对之间的24个碱基对的寡核苷酸。

根据一些实施方式，其中该SEQ ID NO:1-4的简并序列具有约30％至约99％同源于SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。

根据一些实施方式，其中该生物样本为血液、唾液、腹水液、口腔黏膜样本或鼻黏膜样本。

本发明的一实施方式为提供一种用于检测支原体的试剂盒，包含一引物对为选自由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列及衍生序列所组成的群组。

根据一些实施方式，进一步包含一寡核苷酸探针为选自由SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列及其简并序列所组成的群组。

根据一些实施方式，其中SEQ ID NO:1-4的简并序列具有约30％至约99％同源于SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。

根据一些实施方式，进一步包含一反应试剂，其中反应试剂包含：去氧核糖核苷三磷酸；DNA聚合酶；以及盐类。

附图说明

本发明的实施例依据以下详尽的叙述搭配附图做阅读。

图1为根据本发明各种实施方式，显示SEQ ID NO:1-4针对Mycoplasmahaemofelis的16S核糖体RNA进行引物及探针设计位置的图。

图2为根据本发明各种实施方式，以引物对SEQ ID NO:1-2进行检测的电泳结果图。

图3A为根据本发明各种实施方式，以引物对SEQ ID NO:1-2进行即时定量聚合酶连锁反应的增幅曲线图。

图3B为依据图3A所得的增幅产物，其电泳结果图。

图4A为根据本发明各种实施方式，进行非探针型即时定量聚合酶连锁反应，其不同模板起始量的增幅曲线图。

图4B为依据图4A，其不同模板起始量的标准曲线图。

图5A为根据本发明各种实施方式，进行探针型即时定量聚合酶连锁反应，其不同模板起始量的增幅曲线图。

图5B为依据图5A，其不同模板起始量的标准曲线图。

图6A为根据本发明各种实施方式，进行探针型即时定量聚合酶连锁反应，以临床血液检体为模板来源的增幅曲线图。

图6B依据图6A所得的增幅产物，其电泳结果图。

图7A为根据本发明各种实施方式，进行探针型即时定量聚合酶连锁反应，以各种类症病原体为模板来源的增幅曲线图。

图7B依据图7A所得的增幅产物，其电泳结果图。

图7C为根据本发明各种实施方式，进行探针型即时定量聚合酶连锁反应，以各种类症病原体为模板来源的增幅曲线图。

图7D依据图7C所得的增幅产物，其电泳结果图。

图8A-8B为根据本发明各种实施方式，与市售试剂盒进行比较，探针型即时定量聚合酶的增幅曲线图。

具体实施方式

为使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对本发明的实施方式与具体实施例提出说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本发明的实施例。

于本文中，除非内文中对于冠词有所特别限定，否则“一”与“该”可泛指单一个或多个。将进一步理解的是，本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”及相似词汇，指明其所记载的特征、区域、整数、步骤、操作、元件与/或组件，但不排除其所述或额外的其一个或多个其它特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件，与/或其中的群组。

本发明的实施方式为利用分子生物学技术，设计出具有高度专一性的引物对以快速检测病原体的存在。此处所述“病原体”，指造成人类、动物或其他生物疾病的致病因子。在一实施例中，病原体包含但不限于病毒、真菌、细菌、线虫以及普里昂(prion)。

本发明的实施例提供一种支原体检测方法，包含：提供生物样本；利用反应混合物与生物样本进行聚合酶连锁反应，其中反应混合物包含一引物对选自由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列(degenerate sequence)及衍生序列(derivative sequence)所组成的群组；以及分析聚合酶连锁反应的增幅产物的有无以判断生物样本中该支原体的存在与否。

聚合酶连锁反应(Polymerase chain reaction,PCR)为常用的分子生物学技术之一。利用具有寡核苷酸序列的引物对扩增特定的去氧核糖核酸(DNA)片段。应理解的是，本文所揭露的序列可用于各种以聚合酶连锁反应为基础的技术。在一实施例中，聚合酶连锁反应可包含但不限于反转录聚合酶连锁反应(RT-PCR)、即时定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)、巢式聚合酶连锁反应(nested PCR)、多对引物聚合酶连锁反应(multiplexPCR)以及热不对称交错聚合酶连锁反应(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)。

在一实施例中，前述反应混合物与生物样本进行聚合酶连锁反应之后，可利用胶体电泳(gel electrophoresis)分析增幅产物的有无，藉以判断生物样品中是否有支原体的存在。在另一实施例中，若所采用的聚合酶连锁反应为即时聚合酶连锁反应，可利用前述进行即时聚合酶连锁反应的装置，检测相对荧光单位(relative fluorescence unit,RFU)以分析增幅产物的有无，藉以判断生物样品中是否有支原体的存在。

根据前述所提的各种聚合酶连锁反应技术，习知即时定量聚合酶连锁反应的荧光系统可分为“探针型”及“非探针型”。在一实施例中，SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:1-2互补的核苷酸序列、SEQ ID NO:1-2的简并序列及SEQ ID NO:1-2的衍生序列可用于即时聚合酶连锁反应。在一实施例中，若采用的即时聚合酶连锁反应为探针型的荧光系统，前述反应混合物中可进一步包含具有寡核苷酸序列的探针，其选自由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.3的简并序列及SEQ ID NO.4的简并序列所组成的群组。

根据本发明的部分实施例，本文所揭露的寡核苷酸序列SEQ ID NO:1-4可用于检测支原体属的病原菌。前述支原体属的病原菌可例如为猫支原体(M.gateae)、狸猫支原体(M.felis)、猫血液支原体(M.haemofelis)、狗支原体(M.cynos)、犬支原体(M.canis)、泡沫支原体(M.spumans)、爱氏支原体(M.edwardii)、小猫支原体(M.feliminutum)、牛生殖道支原体(M.bovigenitalium)、发酵支原体(M.fermentans)、人型支原体(M.hominis)或肺炎支原体(M.pneumoniae)。

习知猫血液支原体(Mycoplasma haemofelis)的16S核糖体RNA基因序列(GenBank:JQ689951.1)具有771个碱基对(base pair,bp)。在一实施例中，所欲检测的目标病原体为猫血液支原体，且寡核苷酸探针SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4为介于前述猫血液支原体的16S核糖体RNA第563至第710个碱基对之间的24个碱基对的寡核苷酸。

另外，根据前述可知，本发明实施例所使用的寡核苷酸序列并不限于本文所揭露的SEQ ID NO:1-4。此处所述的“简并序列”指本文所揭露的寡核苷酸序列中部分核苷酸为其他核苷酸所取代。举例来说，在一实施例中，SEQ ID NO:1-4的简并序列具有约30％至约99％同源(homologous)于SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。换言之，SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列中约1％至约70％可为其他核苷酸所取代，且于增幅目标DNA片段时仍保有良好的专一性。在另一实施例中，SEQ ID NO:1-4的简并序列具有30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源于SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。

此处所述“衍生序列”指本文所揭露的寡核苷酸序列中在3’端或5’端可进行修饰，并且仍保留部分或全部序列。

此处所述“生物样本”指任何待测的检体。在一实施例中，生物样品可为血液、唾液、腹水液、口腔黏膜或鼻黏膜样本。

本发明尚有一实施例提供一种用于检测支原体的试剂盒(kit)，包含一引物对为选自由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列及衍生序列所组成的群组。此试剂盒中所述相同或类似的元件如前述所提，在此不多做赞述。在一些实施例中，上述试剂盒可进一步包含反应试剂。举例来说，反应试剂可包含但不限于去氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTP)、DNA聚合酶(DNA polymerase)以及盐类。去氧核糖核苷三磷酸包含去氧腺苷三磷酸(dATP)、去氧胸腺苷三磷酸(dTTP)、去氧胞苷三磷酸(dCTP)以及去氧鸟苷三磷酸(dGTP)。DNA聚合酶可为各种热稳定的DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶。盐类可为各种含有镁的化合物，例如氯化镁(MgCl₂)。

为进一步证实本发明的各种实施方式可用于检测支原体的存在，遂进行以下试验。应注意的是，下述实施例仅提供作为示范目的，而非限制本发明。

引物及探针设计

细菌为原核生物，同种的细菌其16S核糖体RNA都具有高度保留性。故本试验利用线上设计程序primer 3以及GenScript Real-time PCR Primer Design针对猫血液支原体(Mycoplasma haemofelis)的16S核糖体RNA(GenBank:JQ689951.1)进行引物及探针的设计。

根据GenBank资料库提供关于Acession No.JQ689951.1的资讯，图1显示Mycoplasma haemofelis其16S核糖体RNA的正股序列，故可知此菌其16S核糖体RNA具有771个碱基对。

本实施例中引物对为SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为针对第563-583个碱基对的位置进行设计(如右箭号方框所示)；SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为针对第691-710个碱基对的位置进行设计(如左箭号方框所示)。据此，利用引物对SEQ ID NO:1-2可增幅的产物大小为148碱基对。

本实施例中的寡核苷酸探针为SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4。SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为针对第663-686个碱基对的位置进行设计(如矩形方框所示)。SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列则为SEQ ID NO.3的互补序列。据此，若采用探针型的聚合酶连锁反应，SEQID NO:3-4可黏合的位置为第663至第686个碱基对的24个碱基对。

血液检体的DNA萃取

血液检体收集于采血管(含EDTA抗凝血剂)，之后取200μL的血液，依照市售DNA萃取试剂盒(QIAamp DNA blood Mini kit,Qiagen)操作说明进行核酸萃取，最后将核酸回溶于200μL洗脱缓冲溶液(Elution buffer)。确诊感染血液支原体的诊断，经由血液抹片与巢式聚合酶连锁反应(Nested PCR)验证。

标准质体

根据前述GenBank资料库编号JQ689951.1所示的序列，将其选殖于pUC57载体(BioBasic Inc.,GenBank:Y14837.1)，以获得带有血液支原体16S核糖体RNA的标准质体。

依据市售聚合酶连锁反应试剂盒(GoTaq Flexi DNA polymerase,Promega)操作说明书，以血液支原体16S核糖体RNA的标准质体做为模板，加入0.4μM的引物对SEQ ID NO:1-2、0.25mM的去氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、4mM的氯化镁溶液(MgCl₂solution)、稀释倍数为1倍的聚合酶缓冲溶液(1×polymerase buffer)以及1单位的Go Taq聚合酶(Go Taqpolymerase,Promega)。PCR条件为95℃作用2分钟后，以95℃30秒，60℃30秒，72℃20秒进行30个循环反应。接着将PCR反应后所得的产物以胶体电泳进行分析。如图2所示，栏M为分子量标示栏(marker ladder)；栏1及栏2皆为PCR反应后所获得的增幅产物，为两重复。根据前述引物设计可知，增幅产物大小为148bp，而栏1及栏2的增幅产物大小皆位于200bp与100bp之间。接着将增幅产物做定序确认无误。后续试验以带有血液支原体16S核糖体RNA的标准质体做为正对照组(positive control)的模板来源。

即时定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)

本试验利用real-time PCR，再次确认引物对SEQ ID NO:1-2可增幅出预期的产物。

以前述标准质体为模板，使用10μL的市售real-time PCR反应试剂试剂盒(KAPAFast SYBR green universal master mix)混合500μM的引物对SEQ ID NO:1-2，配制成总体积为20μL的反应混合液。real-time PCR条件为95℃3秒，60℃20秒，于real-time PCR反应器(CFX-96,BioRad)进行40个循环反应。结果参照图3A，其为real-time PCR反应后所得的增幅曲线图。横轴为反应循环数(cycles)，纵轴为相对荧光单位(relativefluorescence unit,RFU)。由此增幅曲线图可知，无模板对照组(no template control,NTC)未存在增幅产物，故无荧光反应。反之，两重复的荧光反应结果皆呈现相同的正趋势，Cq值(quantification cycle)约在21。接着将前述进行real-time PCR所得的产物以胶体电泳进行分析。继续参照图3B，栏M为分子量标示栏，栏1及栏2为real-time PCR所产生的增幅产物(148bp)，两重复的结果皆位于150bp与100bp之间。据此，前述标准质体及real-timePCR的初步测试可确定本试验设计的引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2对Mycoplasmahaemofelis的16S核糖体RNA具有专一性，遂进一步对引物的灵敏度及专一性做更深入的试验。

引物灵敏度分析(非探针型)

在此试验中以不同的模板量进行非探针型的real-time PCR，以测试引物对SEQID NO.1及SEQ ID NO.2的灵敏度。首先，配制含0.2×10¹⁰拷贝数(copy number)的标准质体，再将其以10倍序列稀释配制为以下八组浓度：0.2×10⁰、0.2×10¹、0.2×10²、0.2×10³、0.2×10⁴、0.2×10⁵、0.2×10⁶、0.2×10⁷(copies/μL)。接着各取5μL(即为10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies)做为模板，进行如上述real-time PCR反应，三重复。参照图4A至4B，其为real-time PCR反应后所得的增幅曲线图及标准曲线图。如图4A所示，无模板对照组未存在增幅产物，故无荧光反应。反之，10⁰至10⁷copies的荧光反应结果皆呈现正趋势。如下表一所示，10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies平均的Cq值分别为32.45、31.05、28.35、25.07、21.47、17.67、14.28、10.49。

表一

拷贝数	10<sup>0</sup>	10<sup>1</sup>	10<sup>2</sup>	10<sup>3</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>6</sup>	10<sup>7</sup>
									Cq值	32.45	31.05	28.35	25.07	21.47	17.67	14.28	10.49

继续参照图4B，即将图4A所增幅的结果数值做成标准曲线图。横轴即将拷贝数取对数值，为起始量对数值(Log starting quantity)。纵轴为阈值循环数，即为Cq值。标准曲线具有可信度的动态范围(dynamic range)为：相关系数(R²)大于0.98；增幅效率(E)介于90％至110％。前述增幅效率若低于90％，可能表示引物设计不良造成黏合效果差，故增幅效率较差。增幅效率若高于110％，可能表示引物有过多非专一性的黏合产生，造成增幅效率过高。如图4B所示，根据前述10⁰至10⁷copies八组的结果数值，可做出斜率为3.302的直线，其相关系数为0.99以及增幅效率为100.8％。故引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2的灵敏度符合动态范围，并且检测极限可至1copy。

引物灵敏度分析(探针型)

在此试验中以不同的模板量进行探针型的real-time PCR，以测试引物对SEQ IDNO:1-2及探针SEQ ID NO.3的灵敏度。首先，配制含0.2×10¹⁰拷贝数(copy number)的标准质体，再将其以10倍序列稀释配制为以下七组浓度：0.2×10¹、0.2×10²、0.2×10³、0.2×10⁴、0.2×10⁵、0.2×10⁶、0.2×10⁷(copies/μL)。接着各取5μL(即为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies)做为模板，进行与前述相似的real-time PCR反应，三重复。惟，与前述real-time PCR不同的是，由于此试验采用的是探针型荧光系统，故反应试剂有所不同。即分别以前述七组拷贝数的标准质体为模板，分别与10μL的市售real-time PCR反应试剂试剂盒(KAPA Fast probe universal master mix)混合500μM的引物对SEQID NO:1-2及250μM的探针SEQ ID NO.3，配制成总体积为20μL的反应混合液。反应条件与前述real-time PCR相同，每组试验三重复。

参照图5A至5B，其为real-time PCR反应后所得的增幅曲线图及标准曲线图。如图5A所示，无模板对照组未存在增幅产物，故无荧光反应。反之，10¹至10⁷copies的荧光反应结果皆呈现正趋势。如下表二所示，10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies平均的Cq值分别为34.85、30.23、27.02、23.80、20.65、17.29、14.01。

表二

拷贝数	10<sup>1</sup>	10<sup>2</sup>	10<sup>3</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>6</sup>	10<sup>7</sup>
								Cq值	34.85	30.23	27.02	23.80	20.65	17.29	14.01

继续参照图5B，即将图5A所增幅的结果数值做成标准曲线图。横轴即将拷贝数取对数值，为起始量对数值(Log starting quantity)。纵轴为阈值循环数，即为Cq值。如图5B所示，根据前述图5A中10¹至10⁷copies七组的结果数值，可做出斜率为3.385的直线，其相关系数为0.997以及增幅效率为97.4％。故引物对SEQ ID NO.1-2搭配探针SEQ ID NO.3使用的灵敏度符合动态范围，并且检测极限可至10copies。

引物专一性试验(A)

由于前述试验于实验室进行，所使用的模板来源皆为纯化后的DNA。故本试验采集临床血液检体做为模板来源，进一步证实在临床上的应用。本试验使用相同于前述所提探针型的real-time PCR进行检测，仅模板来源替换为临床血液检体。根据模板来源可分为三组，为检体1、检体2及正对照组，每组试验皆为两重复。如图6A所示，无模板对照组未存在增幅产物，故无荧光反应。反之，检体1及检体2皆与正对照组的荧光反应结果皆呈现相似的正趋势。接着将前述以real-time PCR所得的产物增幅产物以胶体电泳进行分析。继续参照图6B，其为各组检测结果电泳图。栏M为分子量标示栏；栏1及栏2所示为检体1；栏3及栏4所示为检体2；栏5及栏6所示为正对照组。栏1至栏6的产物大小皆无误，皆介于100bp及150bp间，且没有非专一性产物存在。由此试验可知，尽管模板来源未经纯化，本试验的引物对SEQ IDNO.1-2及探针SEQ ID NO.3皆能保有高度的专一性，而不会有非专一性的增幅情形产生。

引物专一性试验(B)

在临床诊断上存在类似Mycoplasma haemofelis感染症状的其他类症病原菌，如大焦虫(Babesia canis)、小焦虫(Babesia gibsoni)及艾利希体(Ehrlichia canis)。故本试验以大焦虫、小焦虫及艾利希体做为模板来源，进一步证实在临床上的应用。本试验使用相同于前述所提探针型的real-timePCR进行检测，仅模板来源替换为大焦虫、小焦虫及艾利希体。

如上所述，遂将本试验分为九组，分别为：(1)大焦虫；(2)小焦虫；(3)艾利希体；(4)大焦虫的质体；(5)小焦虫的质体；(6)艾利希体的质体；(7)未受焦虫感染的血液检体；(8)正对照组；(9)无模板对照组。

参照图7A，其为对大焦虫、小焦虫、艾利希体、正常检体、正对照组以及无模板对照组进行检测的增幅曲线图。大焦虫、小焦虫、艾利希体、正常检体及无模板对照组(1-10，对应至图7B的栏1-10)未存在引物对SEQ ID NO.1-2所欲增幅的区段，故无增幅产物进而无荧光反应产生。反之，正对照组的荧光反应结果皆呈现相似的正趋势。接着将前述real-timePCR所得的产物以胶体电泳进行分析。继续参照图7B，其为各组检测结果电泳图。栏M为分子量标示栏；栏1及栏2所示为大焦虫；栏3、栏4、栏5及栏8所示为小焦虫；栏6、栏7及栏10所示为正常检体；栏9所示为艾利希体；栏11及栏12所示为正对照组。栏1至栏10皆无产物存在，仅栏11及栏12的正对照组有专一性产物存在，介于100bp至150bp间。

此外，本试验尚有抽取大焦虫的质体、小焦虫的质体及艾利希体的质体做为模板来源(10^-6拷贝数)一同进行检测试验。

参照图7C，其为对大焦虫的质体、小焦虫的质体及艾利希体的质体、正对照组以及无模板对照组进行检测的增幅曲线图。大焦虫的质体、小焦虫的质体及艾利希体的质体、正对照组以及无模板对照组(1-8，对应至图7D的栏1-8)未存在引物对SEQ ID NO.1-2所欲增幅的区段，故无增幅产物进而无荧光反应产生。反之，正对照组的荧光反应结果皆呈现相似的正趋势。接着将前述real-time PCR所得的产物以胶体电泳进行分析。继续参照图7D，其为各组检测结果电泳图。栏M为分子量标示栏；栏1及栏2所示为无模板对照组；栏3及栏4所示为大焦虫的质体；栏5及栏6所示为小焦虫的质体；栏7及栏8所示为艾利希体的质体。栏1至栏8皆无产物存在。应理解的是，图7A至图7D皆为同一试验。图7B及图7D为因电泳凝胶的加样(loading)孔数不足，故分为两片凝胶进行电泳分析。

检测效能分析

最后，本试验与市售检测试剂盒(Mycoplasma haemofelis and Mycoplasmahaemocanis,16S ribosomal RNA geneStandard Kit；Primerdesign Ltd.)进行比较，藉以验证引物对SEQ ID NO:1-2及探针SEQ ID NO.3具有优于现有商品的检测效能。据此，实施例所用的引物对为SEQ ID NO:1-2，探针为SEQ ID NO.3；比较例所用的引物对及探针为上述市售检测试剂盒。

本试验以标准质体为模板来源，并且依照模板起始量分为两组：(1)10copies；(2)100copies。接着利用与前述相同的探针型real-time PCR进行检测。数据以平均值(means)表示之，并以Student’s t-test来比较实施例与比较例间的差异性。以星号“*”表示具有显著差异，*表示p<0.0001。

参照图8A，其为模板起始量为10copies时的增幅曲线图。根据增幅曲线图的结果显示实施例与比较例皆有荧光反应的产生，但比较例的Cq值明显大于实施例。由下表三可知，实施例的Cq值优于比较例1.98个循环数，并且具有显著差异。代表在极低浓度(例如10copies)的检测，实施例优于比较例约2个循环数。换言之，相较于市售试剂盒，本发明实施方式可提升4倍的检测效能。

表三

参照图8B，其为模板起始量为100copies时的增幅曲线图。根据增幅曲线图的结果显示实施例与比较例皆有荧光反应的产生，但比较例的Cq值亦明显大于实施例。由下表四可知，实施例的Cq值优于比较例1.53个循环数，并且具有显著差异。代表在低浓度(例如100copies)的检测，相较于市售试剂盒，本发明实施方式可提升4倍的检测效能。

表四

100拷贝数	Cq值	Cq值的差值
			实施例	31.52*	0
比较例	33.05	1.53

前文概述数个实施例的特征以使得本领域技术人员可更好地理解本发明内容的态样。本领域技术人员应了解，可容易地将本发明内容用作设计或修改用于实现相同目的及/或达成本文引入的实施例的相同优点的其他制程及结构的基础。本领域技术人员亦应认识到，此类等效物构造不违背本发明内容的精神及范畴，且可在不违背本发明内容的精神及范畴的情况下于此作出各种变化、替代以及变更。

SEQUENCE LISTING

<110> 台达电子工业股份有限公司

<120> 支原体检测方法及其试剂盒

<130> 1705083TW01

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 1

tgcagctact caatagttgt a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 2

aagcgtcatt tatggcctaa 20

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

ccgccttcgc ctctggtgtt ctta 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

taagaacacc agaggcgaag gcgg 24

Claims (10)

1.一种支原体检测方法，包含：

提供一生物样本；

利用一反应混合物与该生物样本进行聚合酶连锁反应，其中该反应混合物包含一引物对为选自由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列及衍生序列所组成的群组；以及

分析该聚合酶连锁反应的增幅产物的有无以判断该生物样本中该支原体的存在与否。

2.如权利要求1所述的方法，其中该聚合酶连锁反应为即时定量聚合酶连锁反应。

3.如权利要求2所述的方法，其中该反应混合物进一步包含一寡核苷酸探针为选自由SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列及其简并序列所组成的群组。

4.如权利要求3所述的方法，其中该支原体为Mycoplasma haemofelis，且该寡核苷酸探针为一介于该支原体Mycoplasma haemofelis的16S核糖体RNA基因的第563至第710个碱基对之间的24个碱基对的寡核苷酸。

5.如权利要求1或3所述的方法，其中该SEQ ID NO:1-4的简并序列具有约30％至约99％同源于SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。

6.如权利要求1所述的方法，其中该生物样本为血液、唾液、腹水液、口腔黏膜样本或鼻黏膜样本。

7.一种支原体检测试剂盒，包含一引物对为选自由SEQ ID NO:1-2所示的核苷酸序列、其互补的核苷酸序列、简并序列及衍生序列所组成的群组。

8.如权利要求7所述的试剂盒，进一步包含一寡核苷酸探针为选自由SEQ ID NO:3-4所示的核苷酸序列及其简并序列所组成的群组。

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其中该SEQ ID NO:1-4的简并序列具有约30％至约99％同源于SEQ ID NO:1-4所示的核苷酸序列。

10.如权利要求7所述的试剂盒，进一步包含一反应试剂，其中该反应试剂包含：

去氧核糖核苷三磷酸；

DNA聚合酶；以及

盐类。