TWI642785B - 黴漿菌檢測方法及其套組 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種黴漿菌檢測方法，包含：提供生物樣本；利用反應混合物與生物樣本進行聚合□連鎖反應，其中反應混合物包含引子對係選自由SEQ ID NO:1-2所示之核□酸序列、其互補之核□酸序列、簡併序列及衍生序列所組成的群組；以及分析聚合□連鎖反應之增幅產物的有無以判斷生物樣本中黴漿菌的存在與否。在此亦提供一種檢測黴漿菌的套組，包含前述所提之引子對。

Description

黴漿菌檢測方法及其套組

本發明之實施方式係關於一種黴漿菌檢測方法及其套組，尤其是一種黴漿菌的分子檢測方法及其套組。

黴漿菌係泛指黴漿菌屬( Mycoplasma)的原核生物，為革蘭氏陰性菌。習知許多種類的黴漿菌為人體或其他動物的病原疾病。舉例來說，常見於貓或狗血液系統中的親血性黴漿菌(hemotropic Mycoplasma)，主要傳染途徑為經輸血、口、垂直傳染、傷口以及跳蚤、壁蝨的叮咬，潛伏期為約2至約17天。當貓被血液黴漿菌感染之後極易產生致命的症狀，例如：導致溶血性貧血，進而造成貓血巴東蟲症(feline haemobartonellosis)或是貓傳染性貧血症(feline infectious anemia)。

被血液黴漿菌感染之後，主要臨床症狀為發燒、貧血、抑鬱、無食慾、黏膜蒼白、黃疸、膽紅素尿、體重減輕等。惟上述症狀臨床上不是很明顯，尤其大部分感染後沒有血紅素尿和黃疸狀態，極易被忽略而失去治療時機，導致罹病後的死亡率高達三成。目前檢測出感染後投予藥物，大部分的患者約二到三週的療程即可痊癒。但若延誤就醫而出現嚴重症狀時，除須住院治療外，死亡風險亦相對提升許多。故在臨床上若能早期檢測是否感染血液黴漿菌，對於疾病治癒率的提升有其重要性。

本發明之一實施態樣係提供一種檢測黴漿菌的方法，包含：提供一生物樣本；利用一反應混合物與生物樣本進行聚合□連鎖反應，其中反應混合物包含一引子對係選自由SEQ ID NO:1-2所示之核□酸序列、其互補之核□酸序列、簡併序列及衍生序列所組成的群組；以及分析聚合□連鎖反應之增幅產物的有無以判斷生物樣本中黴漿菌的存在與否。

根據一些實施方式，其中所進行的聚合□連鎖反應為即時定量聚合□連鎖反應。

根據一些實施方式，其中反應混合物進一步包含一寡核□酸探針係選自由SEQ ID NO:3-4所示之核□酸序列及其簡併序列所組成的群組。

根據一些實施方式，其中該黴漿菌為 Mycoplasma haemofelis，且寡核□酸針為一介於黴漿菌 Mycoplasma haemofelis的16S核糖體RNA基因的第563至第710個鹼基對之間的24個鹼基對的寡核□酸。

根據一些實施方式，其中該SEQ ID NO:1-4之簡併序列具有約30%至約99%同源於SEQ ID NO:1-4所示之核□酸序列。

根據一些實施方式，其中該生物樣本為血液、唾液、腹水液、口腔黏膜樣本或鼻黏膜樣本。

本發明之一實施態樣係提供一種用於檢測黴漿菌的套組，包含一引子對係選自由SEQ ID NO:1-2所示之核□酸序列、其互補之核□酸序列、簡併序列及衍生序列所組成的群組。

根據一些實施方式，進一步包含一寡核□酸探針係選自由SEQ ID NO:3-4所示之核□酸序列及其簡併序列所組成的群組。

根據一些實施方式，其中SEQ ID NO:1-4之簡併序列具有約30%至約99%同源於SEQ ID NO:1-4所示之核□酸序列。

根據一些實施方式，進一步包含一反應試劑，其中反應試劑包含：去氧核糖核□三磷酸；DNA聚合□；以及鹽類。

為使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例，在有益的情形下可相互組合或取代，也可在一實施例中附加其他的實施例，而無須進一步的記載或說明。在以下描述中，將詳細敘述許多特定細節以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而，可在無此等特定細節之情況下實踐本發明之實施例。

於本文中，除非內文中對於冠詞有所特別限定，否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是，本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似詞彙，指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件與/或組件，但不排除其所述或額外的其一個或多個其它特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件，與/或其中之群組。

本發明之實施方式為利用分子生物學技術，設計出具有高度專一性的引子對以快速檢測病原體的存在。此處所述「病原體」，係指造成人類、動物或其他生物疾病的致病因子。在一實施例中，病原體包含但不限於病毒、真菌、細菌、線蟲以及普里昂(prion)。

本發明之實施例提供一種黴漿菌檢測方法，包含：提供生物樣本；利用反應混合物與生物樣本進行聚合□連鎖反應，其中反應混合物包含一引子對係選自由SEQ ID NO:1-2所示之核□酸序列、其互補之核□酸序列、簡併序列(degenerate sequence)及衍生序列(derivative sequence)所組成的群組；以及分析聚合□連鎖反應之增幅產物的有無以判斷生物樣本中該黴漿菌的存在與否。

聚合□連鎖反應(Polymerase chain reaction, PCR)為常用的分子生物學技術之一。利用具有寡核□酸序列之引子對擴增特定的去氧核糖核酸(DNA)片段。應理解的是，本文所揭露的序列可用於各種以聚合□連鎖反應為基礎的技術。在一實施例中，聚合□連鎖反應可包含但不限於反轉錄聚合□連鎖反應(RT-PCR)、即時定量聚合□連鎖反應(real-time PCR)、巢式聚合□連鎖反應(nested PCR)、多對引子聚合□連鎖反應(multiplex PCR)以及熱不對稱交錯聚合□連鎖反應(thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)。

在一實施例中，前述反應混合物與生物樣本進行聚合□連鎖反應之後，可利用膠體電泳(gel electrophoresis)分析增幅產物的有無，藉以判斷生物樣品中是否有黴漿菌的存在。在另一實施例中，若所採用的聚合□連鎖反應為即時聚合□連鎖反應，可利用前述進行即時聚合□連鎖反應的裝置，偵測相對螢光單位(relative fluorescence unit, RFU )以分析增幅產物的有無，藉以判斷生物樣品中是否有黴漿菌的存在。

根據前述所提的各種聚合□連鎖反應技術，習知即時定量聚合□連鎖反應的螢光系統可分為「探針型」及「非探針型」。在一實施例中，SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:1-2互補之核□酸序列、SEQ ID NO:1-2之簡併序列及SEQ ID NO:1-2之衍生序列可用於即時聚合□連鎖反應。在一實施例中，若採用的即時聚合□連鎖反應為探針型的螢光系統，前述反應混合物中可進一步包含具有寡核□酸序列的探針，其係選自由SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 3之簡併序列及SEQ ID NO. 4之簡併序列所組成的群組。

根據本發明之部分實施例，本文所揭露之寡核□酸序列SEQ ID NO:1-4可用於檢測黴漿菌屬的病原菌。前述黴漿菌屬的病原菌可例如為貓黴漿菌( M. gateae)、狸貓黴漿菌( M. felis)、貓血液黴漿菌 (M. haemofelis)、狗黴漿菌( M. cynos)、犬黴漿菌( M. canis)、 泡沫黴漿菌( M. spumans)、愛氏黴漿菌( M. edwardii)、小貓黴漿菌( M. feliminutum)、牛生殖道黴漿菌( M. bovigenitalium)、發酵黴漿菌( M. fermentans)、人型黴漿菌( M. hominis)或肺炎黴漿菌( M. pneumoniae)。

習知貓血液黴漿菌( Mycoplasma haemofelis)的16S核糖體RNA基因序列(GenBank: JQ689951.1)具有771個鹼基對(base pair, bp)。在一實施例中，所欲檢測的目標病原體為貓血液黴漿菌，且寡核□酸探針SEQ ID NO. 3及SEQ ID NO. 4為介於前述貓血液黴漿菌之16S核糖體RNA第563至第710個鹼基對之間的24個鹼基對的寡核□酸。

另外，根據前述可知，本發明之實施例所使用的寡核□酸序列並不限於本文所揭露的SEQ ID NO:1-4。此處所述之「簡併序列」係指本文所揭露的寡核□酸序列中部分核□酸為其他核□酸所取代。舉例來說，在一實施例中，SEQ ID NO:1-4之簡併序列具有約30%至約99%同源(homologous)於SEQ ID NO:1-4所示之核□酸序列。換言之，SEQ ID NO:1-4所示之核□酸序列中約1%至約70%可為其他核□酸所取代，且於增幅目標DNA片段時仍保有良好的專一性。在另一實施例中，SEQ ID NO:1-4之簡併序列具有30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源於SEQ ID NO:1-4所示之核□酸序列。

此處所述「衍生序列」係指本文所揭露的寡核□酸序列中在3’端或5’端可進行修飾，並且仍保留部分或全部序列。

此處所述「生物樣本」係指任何待測的檢體。在一實施例中，生物樣品可為血液、唾液、腹水液、口腔黏膜或鼻黏膜樣本。

本發明尚有一實施例提供一種用於檢測黴漿菌的套組(kit)，包含一引子對係選自由SEQ ID NO:1-2所示之核□酸序列、其互補之核□酸序列、簡併序列及衍生序列所組成的群組。此套組中所述相同或類似的元件如前述所提，在此不多做贊述。在一些實施例中，上述套組可進一步包含反應試劑。舉例來說，反應試劑可包含但不限於去氧核糖核□三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate, dNTP)、DNA聚合□(DNA polymerase)以及鹽類。去氧核糖核□三磷酸包含去氧腺□三磷酸(dATP)、去氧胸腺□三磷酸(dTTP)、去氧胞□三磷酸(dCTP)以及去氧鳥□三磷酸(dGTP)。DNA聚合□可為各種熱穩定的DNA聚合□，例如Taq DNA聚合□。鹽類可為各種含有鎂的化合物，例如氧化鎂(MgCl ₂)。

為進一步證實本發明之各種實施方式可用於檢測黴漿菌的存在，遂進行以下試驗。應注意的是，下述實施例僅提供作為示範目的，而非限制本發明。

引子及探針 設計

細菌為原核生物，同種的細菌其16S核糖體RNA都具有高度保留性。故本試驗利用線上設計程式primer 3以及GenScript Real-time PCR Primer Design針對貓血液黴漿菌( Mycoplasma haemofelis)的16S核糖體RNA(GenBank: JQ689951.1)進行引子及探針的設計。

根據GenBank資料庫提供關於Acession No. JQ689951.1的資訊，第1圖顯示 Mycoplasma haemofelis其16S核糖體RNA的正股序列，故可知此菌其16S核糖體RNA具有771個鹼基對。

本實施例中引子對為SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.1所示之核苷酸序列係針對第563-583個鹼基對的位置進行設計(如右箭號方框所示)；SEQ ID NO.2所示之核苷酸序列係針對第691-710個鹼基對的位置進行設計(如左箭號方框所示)。據此，利用引子對SEQ ID NO：1-2可增幅的產物大小為148鹼基對。

本實施例中的寡核苷酸探針為SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4。SEQ ID NO.3所示之核苷酸序列係針對第663-686個鹼基對的位置進行設計(如矩形方框所示)。SEQ ID NO.4所示之核苷酸序列則為SEQ ID NO.3之互補序列。據此，若採用探針型的聚合酶連鎖反應，SEQ ID NO：3-4可黏合的位置為第663至第686個鹼基對的24個鹼基對。

血液檢體的DNA萃取

血液檢體收集於採血管(含EDTA抗凝血劑)，之後取200μL的血液，依照市售DNA萃取試劑盒(QIAamp DNA blood Mini kit,Qiagen)操作說明進行核酸萃取，最後將核酸回溶於200μL洗脫緩衝溶液(Elution buffer)。確診感染血液黴漿菌之診斷，係經由血液抹片與巢式聚合酶連鎖反應(Nested PCR)驗證。

標準質體

根據前述GenBank資料庫編號JQ689951.1所示的序列，將其選殖於pUC57載體(Bio Basic Inc., GenBank: Y14837.1)，以獲得帶有血液黴漿菌16S核糖體RNA的標準質體。

依據市售聚合□連鎖反應套組(GoTaq Flexi DNA polymerase, Promega)操作說明書，以血液黴漿菌16S核糖體RNA的標準質體做為模板，加入0.4μM的引子對SEQ ID NO:1-2、0.25mM的去氧核糖核□三磷酸(dNTP)、4 mM的氧化鎂溶液(MgCl ₂solution)、稀釋倍數為1倍的聚合□緩衝溶液(1× polymerase buffer)以及1單位的Go Taq聚合□(Go Taq polymerase, Promega)。PCR條件為95℃作用2分鐘後，以95℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 20秒進行30個循環反應。接著將PCR反應後所得的產物以膠體電泳進行分析。如第2圖所示，欄M為分子量標示欄(marker ladder)；欄1及欄2皆為PCR反應後所獲得的增幅產物，為兩重複。根據前述引子設計可知，增幅產物大小為148 bp，而欄1及欄2的增幅產物大小皆位於200 bp與100 bp之間。接著將增幅產物做定序確認無誤。後續試驗以帶有血液黴漿菌16S核糖體RNA的標準質體做為正對照組(positive control)的模板來源。

即時定量聚合□連鎖反應 (real-time PCR)

本試驗利用real-time PCR，再次確認引子對SEQ ID NO:1-2可增幅出預期的產物。

以前述標準質體為模板，使用10μL的市售real-time PCR反應試劑套組(KAPA Fast SYBR green universal master mix)混合500μM的引子對SEQ ID NO:1-2，配製成總體積為20 μL的反應混合液。real-time PCR條件為95℃ 3秒，60℃ 20秒，於real-time PCR反應器(CFX-96, BioRad)進行40個循環反應。結果參照第3A圖，其為real-time PCR反應後所得之增幅曲線圖。橫軸為反應循環數(cycles)，縱軸為相對螢光單位(relative fluorescence unit, RFU)。由此增幅曲線圖可知，無模板對照組(no template control, NTC)未存在增幅產物，故無螢光反應。反之，兩重複的螢光反應結果皆呈現相同的正趨勢，Cq值(quantification cycle)約在21。接著將前述進行real-time PCR所得的產物以膠體電泳進行分析。繼續參照第3B圖，欄M為分子量標示欄，欄1及欄2為real-time PCR所產生的增幅產物(148bp)，兩重複的結果皆位於150bp與100bp之間。據此，前述標準質體及real-time PCR的初步測試可確定本試驗設計的引子對SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2對 Mycoplasma haemofelis的16S核糖體RNA具有專一性，遂進一步對引子的靈敏度及專一性做更深入的試驗。

引子靈敏度分析 ( 非探針型 )

在此試驗中以不同的模板量進行非探針型的real-time PCR，以測試引子對SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2的靈敏度。首先，配製含0.2×10 ¹⁰拷貝數(copy number)的標準質體，再將其以10倍序列稀釋配製為以下八組濃度：0.2×10 ⁰、0.2×10 ¹、0.2×10 ²、0.2×10 ³、0.2×10 ⁴、0.2×10 ⁵、0.2×10 ⁶、0.2×10 ⁷(copies/μL)。接著各取5 μL(即為10 ⁰、10 ¹、10 ²、10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷copies)做為模板，進行如上述real-time PCR反應，三重複。參照第4A至第4B圖，其為real-time PCR反應後所得之增幅曲線圖及標準曲線圖。如第4A圖所示，無模板對照組未存在增幅產物，故無螢光反應。反之，10 ⁰至10 ⁷copies的螢光反應結果皆呈現正趨勢。如下表一所示，10 ⁰、10 ¹、10 ²、10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷copies平均的Cq值分別為32.45、31.05、28.35、25.07、21.47、17.67、14.28、10.49。

表一 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td><b>拷貝數</b></td><td> 10⁰</td><td> 10¹</td><td> 10²</td><td> 10³</td><td> 10⁴</td><td> 10⁵</td><td> 10⁶</td><td> 10⁷</td></tr><tr><td><b>Cq</b><b>值</b></td><td> 32.45 </td><td> 31.05 </td><td> 28.35 </td><td> 25.07 </td><td> 21.47 </td><td> 17.67 </td><td> 14.28 </td><td> 10.49 </td></tr></TBODY></TABLE>

繼續參照第4B圖，即將第4A圖所增幅的結果數值做成標準曲線圖。橫軸即將拷貝數取對數值，為起始量對數值(Log starting quantity)。縱軸為門檻循環數，即為Cq值。標準曲線具有可信度的動態範圍(dynamic range)為：相關係數(R ²)大於0.98；增幅效率(E)介於90%至110%。前述增幅效率若低於90%，可能表示引子設計不良造成黏合效果差，故增幅效率較差。增幅效率若高於110%，可能表示引子有過多非專一性的黏合產生，造成增幅效率過高。如第4B圖所示，根據前述10 ⁰至10 ⁷copies八組的結果數值，可做出斜率為3.302的直線，其相關係數為0.99以及增幅效率為100.8%。故引子對SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2的靈敏度符合動態範圍，並且檢測極限可至1 copy。

引子靈敏度分析 ( 探針型 )

在此試驗中以不同的模板量進行探針型的real-time PCR，以測試引子對SEQ ID NO:1-2及探針SEQ ID NO. 3的靈敏度。首先，配製含0.2×10 ¹⁰拷貝數(copy number)的標準質體，再將其以10倍序列稀釋配製為以下七組濃度：0.2×10 ¹、0.2×10 ²、0.2×10 ³、0.2×10 ⁴、0.2×10 ⁵、0.2×10 ⁶、0.2×10 ⁷(copies/μL)。接著各取5 μL(即為10 ¹、10 ²、10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷copies)做為模板，進行與前述相似之real-time PCR反應，三重複。惟，與前述real-time PCR不同的是，由於此試驗採用的是探針型螢光系統，故反應試劑有所不同。即分別以前述七組拷貝數的標準質體為模板，分別與10μL的市售real-time PCR反應試劑套組(KAPA Fast probe universal master mix)混合500μM的引子對SEQ ID NO:1-2及250μM的探針SEQ ID NO. 3，配製成總體積為20 μL的反應混合液。反應條件與前述real-time PCR相同，每組試驗三重複。

參照第5A至第5B圖，其為real-time PCR反應後所得之增幅曲線圖及標準曲線圖。如第5A圖所示，無模板對照組未存在增幅產物，故無螢光反應。反之，10 ¹至10 ⁷copies的螢光反應結果皆呈現正趨勢。如下表一所示，10 ¹、10 ²、10 ³、10 ⁴、10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷copies平均的Cq值分別為34.85、30.23、27.02、23.80、20.65、17.29、14.01。

表二 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td><b>拷貝數</b></td><td> 10¹</td><td> 10²</td><td> 10³</td><td> 10⁴</td><td> 10⁵</td><td> 10⁶</td><td> 10⁷</td></tr><tr><td><b>Cq</b><b>值</b></td><td> 34.85 </td><td> 30.23 </td><td> 27.02 </td><td> 23.80 </td><td> 20.65 </td><td> 17.29 </td><td> 14.01 </td></tr></TBODY></TABLE>

繼續參照第5B圖，即將第5A圖所增幅的結果數值做成標準曲線圖。橫軸即將拷貝數取對數值，為起始量對數值(Log starting quantity)。縱軸為門檻循環數，即為Cq值。如第5B圖所示，根據前述第5A圖中10 ¹至10 ⁷copies七組的結果數值，可做出斜率為3.385的直線，其相關係數為0.997以及增幅效率為97.4%。故引子對SEQ ID NO. 1-2搭配探針SEQ ID NO. 3使用的靈敏度符合動態範圍，並且檢測極限可至10 copies。

引子專一性試驗 (A)

由於前述試驗係於實驗室進行，所使用的模板來源皆為純化後的DNA。故本試驗採集臨床血液檢體做為模板來源，進一步證實在臨床上的應用。本試驗使用相同於前述所提探針型的real-time PCR進行檢測，僅模板來源替換為臨床血液檢體。根據模板來源可分為三組，為檢體1、檢體2及正對照組，每組試驗皆為兩重複。如第6A圖所示，無模板對照組未存在增幅產物，故無螢光反應。反之，檢體1及檢體2皆與正對照組的螢光反應結果皆呈現相似的正趨勢。接著將前述以real-time PCR所得的產物增幅產物以膠體電泳進行分析。繼續參照第6B圖，其為各組檢測結果電泳圖。欄M為分子量標示欄；欄1及欄2所示為檢體1；欄3及欄4所示為檢體2；欄5及欄6所示為正對照組。欄1至欄6的產物大小皆無誤，皆介於100bp及150bp間，且沒有非專一性產物存在。由此試驗可知，儘管模板來源未經純化，本試驗之引子對SEQ ID NO. 1-2及探針SEQ ID NO. 3皆能保有高度的專一性，而不會有非專一性的增幅情形產生。

引子專一性試驗 (B)

在臨床診斷上存在類似 Mycoplasma haemofelis感染症狀的其他類症病原菌，如大焦蟲( Babesia canis)、小焦蟲( Babesia gibsoni)及艾利希體( Ehrlichia canis)。故本試驗以大焦蟲、小焦蟲及艾利希體做為模板來源，進一步證實在臨床上的應用。本試驗使用相同於前述所提探針型的real-time PCR進行檢測，僅模板來源替換為大焦蟲、小焦蟲及艾利希體。

如上所述，遂將本試驗分為九組，分別為：(1)大焦蟲；(2)小焦蟲；(3)艾利希體；(4)大焦蟲之質體；(5)小焦蟲之質體；(6)艾利希體之質體；(7)未受焦蟲感染之血液檢體；(8)正對照組；(9)無模板對照組。

參照第7A圖，其為對大焦蟲、小焦蟲、艾利希體、正常檢體、正對照組以及無模板對照組進行檢測的增幅曲線圖。大焦蟲、小焦蟲、艾利希體、正常檢體及無模板對照組(1-10，對應至第7B圖的欄1-10)未存在引子對SEQ ID NO. 1-2所欲增幅的區段，故無增幅產物進而無螢光反應產生。反之，正對照組的螢光反應結果皆呈現相似的正趨勢。接著將前述real-time PCR所得的產物以膠體電泳進行分析。繼續參照第7B圖，其為各組檢測結果電泳圖。欄M為分子量標示欄；欄1及欄2所示為大焦蟲；欄3、欄4、欄5及欄8所示為小焦蟲；欄6、欄7及欄10所示為正常檢體；欄9所示為艾利希體；欄11及欄12所示為正對照組。欄1至欄10皆無產物存在，僅欄11及欄12之正對照組有專一性產物存在，介於100bp至150bp間。

此外，本試驗尚有抽取大焦蟲之質體、小焦蟲之質體及艾利希體之質體做為模板來源(10 ^-6拷貝數)一同進行檢測試驗。

參照第7C圖，其為對大焦蟲之質體、小焦蟲之質體及艾利希體之質體、正對照組以及無模板對照組進行檢測的增幅曲線圖。大焦蟲之質體、小焦蟲之質體及艾利希體之質體、正對照組以及無模板對照組(1-8，對應至第7D圖的欄1-8)未存在引子對SEQ ID NO. 1-2所欲增幅的區段，故無增幅產物進而無螢光反應產生。反之，正對照組的螢光反應結果皆呈現相似的正趨勢。接著將前述real-time PCR所得的產物以膠體電泳進行分析。繼續參照第7 D圖，其為各組檢測結果電泳圖。欄M為分子量標示欄；欄1及欄2所示為無模板對照組；欄3及欄4所示為大焦蟲之質體；欄5及欄6所示為小焦蟲之質體；欄7及欄8所示為艾利希體之質體。欄1至欄8皆無產物存在。應理解的是，第7A圖至第7D圖皆為同一試驗。第7B圖及第7D圖係因電泳凝膠的加樣(loading)孔數不足，故分為兩片凝膠進行電泳分析。

檢測效能分析

最後，本試驗與市售檢測套組(Mycoplasma haemofelis and Mycoplasma haemocanis, 16S ribosomal RNA gene genesig ^□Standard Kit; Primerdesign Ltd. )進行比較，藉以驗證引子對SEQ ID NO:1-2及探針SEQ ID NO. 3具有優於現有商品的檢測效能。據此，實施例所用之引子對為SEQ ID NO:1-2，探針為SEQ ID NO. 3；比較例所用之引子對及探針為上述市售檢測套組。

本試驗以標準質體為模板來源，並且依照模板起始量分為兩組：(1)10 copies；(2)100 copies。接著利用與前述相同的探針型real-time PCR進行檢測。數據以平均值(means)表示之，並以Student’s t-test來比較實施例與比較例間的差異性。以星號「*」表示具有顯著差異，*表示p＜0.0001。

參照第8A圖，其為模板起始量為10 copies時的增幅曲線圖。根據增幅曲線圖的結果顯示實施例與比較例皆有螢光反應的產生，但比較例的Cq值明顯大於實施例。由下表三可知，實施例的Cq值優於比較例1.98個循環數，並且具有顯著差異。代表在極低濃度(例如10 copies)的檢測，實施例優於比較例約2個循環數。換言之，相較於市售套組，本發明之實施方式可提升4倍的檢測效能。

表三 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td><b>10</b><b>拷貝數</b></td><td><b>Cq</b><b>值</b></td><td><b>Cq</b><b>值之差值</b></td></tr><tr><td><b>實施例</b></td><td> 34.71* </td><td> 0 </td></tr><tr><td><b>比較例</b></td><td> 36.69 </td><td> 1.98 </td></tr></TBODY></TABLE>

參照第8B圖，其為模板起始量為100 copies時的增幅曲線圖。根據增幅曲線圖的結果顯示實施例與比較例皆有螢光反應的產生，但比較例的Cq值亦明顯大於實施例。由下表四可知，實施例的Cq值優於比較例1.53個循環數，並且具有顯著差異。代表在低濃度(例如100 copies)的檢測，相較於市售套組，本發明之實施方式可提升4倍的檢測效能。

表四 <TABLE border="1" borderColor="#000000" width="85%"><TBODY><tr><td><b>100</b><b>拷貝數</b></td><td><b>Cq</b><b>值</b></td><td><b>Cq</b><b>值之差值</b></td></tr><tr><td><b>實施例</b></td><td> 31.52* </td><td> 0 </td></tr><tr><td><b>比較例</b></td><td> 33.05 </td><td> 1.53 </td></tr></TBODY></TABLE>

前文概述數個實施例之特徵以使得熟習該項技術者可更好地理解本揭示內容之態樣。熟習該項技術者應瞭解，可容易地將本揭示內容用作設計或修改用於實現相同目的及/或達成本文引入之實施例的相同優點之其他製程及結構之基礎。熟習該項技術者亦應認識到，此類等效物構造不違背本揭示內容之精神及範疇，且可在不違背本揭示內容之精神及範疇之情況下於此作出各種變化、替代以及變更。

無

本發明之實施例係依據以下詳盡的敘述搭配圖式做閱讀。 第1圖係根據本發明各種實施方式，顯示SEQ ID NO:1-4針對 Mycoplasma haemofelis的16S核糖體RNA進行引子及探針設計位置的圖。 第2圖係根據本發明各種實施方式，以引子對SEQ ID NO:1-2進行檢測之電泳結果圖。 第3A圖係根據本發明各種實施方式，以引子對SEQ ID NO:1-2進行即時定量聚合□連鎖反應之增幅曲線圖。 第3B圖係依據第3A圖所得的增幅產物，其電泳結果圖。 第4A圖係根據本發明各種實施方式，進行非探針型即時定量聚合□連鎖反應，其不同模板起始量的增幅曲線圖。 第4B圖係依據第4A圖，其不同模板起始量的標準曲線圖。 第5A圖係根據本發明各種實施方式，進行探針型即時定量聚合□連鎖反應，其不同模板起始量的增幅曲線圖。 第5B圖係依據第5A圖，其不同模板起始量的標準曲線圖。 第6A圖係根據本發明各種實施方式，進行探針型即時定量聚合□連鎖反應，以臨床血液檢體為模板來源的增幅曲線圖。 第6B圖依據第6A圖所得的增幅產物，其電泳結果圖。 第7A圖係根據本發明各種實施方式，進行探針型即時定量聚合□連鎖反應，以各種類症病原體為模板來源的增幅曲線圖。 第7B圖依據第7A圖所得的增幅產物，其電泳結果圖。 第7C圖係根據本發明各種實施方式，進行探針型即時定量聚合□連鎖反應，以各種類症病原體為模板來源的增幅曲線圖。 第7D圖依據第7C圖所得的增幅產物，其電泳結果圖。 第8A-8B圖係根據本發明各種實施方式，與市售套組進行比較，探針型即時定量聚合□的增幅曲線圖。

＜110＞ 台達電子工業股份有限公司 ＜120＞ 黴漿菌檢測方法及其套組 ＜160＞ 4 ＜210＞ 1 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成之寡核□酸 ＜400＞ 1 tgcagctact caatagttgt a 21 ＜210＞ 2 ＜211＞ 20 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成之寡核□酸 ＜400＞ 2 aagcgtcatt tatggcctaa 20 ＜210＞ 3 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成之寡核□酸 ＜400＞ 3 ccgccttcgc ctctggtgtt ctta 24 ＜210＞ 4 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 合成之寡核□酸 ＜400＞ 4 taagaacacc agaggcgaag gcgg 24

Claims (8)

1. 一種黴漿菌檢測方法，包含：提供一生物樣本；利用一反應混合物與該生物樣本進行聚合酶連鎖反應，其中該反應混合物包含一引子對係選自由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列及其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NO：1-2所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NO：1-2具有90%以上同源性之核苷酸序列；以及分析該聚合酶連鎖反應之增幅產物的有無以判斷該生物樣本中該黴漿菌的存在與否。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該聚合酶連鎖反應為即時定量聚合酶連鎖反應。
3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該反應混合物進一步包含一寡核苷酸探針係選自由SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所組成的群組之核苷酸序列及其簡併序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NO：3-4所示之 核苷酸序列。
4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該黴漿菌為Mycoplasma haemofelis，且該寡核苷酸探針為一介於該黴漿菌Mycoplasma haemofelis的16S核糖體RNA基因的第563至第710個鹼基對之間的24個鹼基對的寡核苷酸。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生物樣本為血液、唾液、腹水液、口腔黏膜樣本或鼻黏膜樣本。
6. 一種黴漿菌檢測套組，包含一引子對係選自由SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：2所組成的群組之核苷酸序列、其互補之核苷酸序列、其簡併序列及其衍生序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NO：1-2所示之核苷酸序列，該衍生序列係指在3’端或5’端進行修飾，使其和SEQ ID NO：1-2具有90%以上同源性之核苷酸序列。
7. 如申請專利範圍第6項所述之套組，進一步包含一寡核苷酸探針係選自由SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所組成的群組之核苷酸序列 及其簡併序列，其中該簡併序列係指90%以上同源於SEQ ID NO：3-4所示之核苷酸序列。
8. 如申請專利範圍第6項所述之套組，進一步包含一反應試劑，其中該反應試劑包含：去氧核糖核苷三磷酸；DNA聚合酶；以及鹽類。