CN117551747A - 一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，属于生物技术领域，包括如下步骤：根据布鲁氏菌的特异基因序列设计qPCR特异性引物组，确保试剂盒对羊、牛以及猪的布鲁氏菌的特异性检测；根据设计得到的qPCR特异性引物组检测羊、牛以及猪的布鲁氏菌的TaqMan荧光定量qPCR特异性引物组，并以待测样本DNA为模板进行荧光定量qPCR扩增检测；根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有布鲁氏菌，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有布鲁氏菌。本发明的检测方法，通过对引物和探针的独特设计，优化了qPCR反应体系，实现了实时监测技术应用。
Description
技术领域
本发明属于于生物技术领域，具体涉及一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法、试剂盒及其应用。
背景技术
布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染病。布鲁氏菌病主要通过直接接触感染源，如受感染动物的分泌物、排泄物或组织液体，或通过食用感染源，例如未经消毒的牛奶、奶制品等传播。布鲁氏菌分为10个种型:6种经典型菌种，即羊种、牛种、猪种、绵羊附睾种、沙林鼠种和犬种；4种新发现种型，即B.microti、B.ceti、B.inopinata和B.pinnipedialis，它们可感染猪、牛、犬、羊、鼠、骆驼等多种哺乳动物，其中羊种、牛种和猪种可感染人。该病在全球范围内广泛存在，给畜牧业和人类健康带来了严重威胁。传统的布病检测方法主要是基于细菌培养和血清学检测，但这些方法存在着操作繁琐、耗时长、结果不稳定等问题，限制了其在实际应用中的广泛使用。
目前PCR方法已广泛应用于布病诊断、环境及动物产品的布鲁氏菌检测、布鲁氏菌分型等方面，而且能从患病初期血清学阴性样品中检出病原，从而弥补了血清学检测方法的不足。然而，其常规的PCR方法在运用到羊、牛、猪的布鲁氏菌病的检测时候有着多种技术困难，这是由于羊、牛、猪的布鲁氏菌病检测与其他疾病相比，存在着以下几个特殊的挑战和问题：特异性问题：布鲁氏菌存在多个亚种和血清型，不同亚种和血清型间的基因序列存在差异，因此需要设计特异性的引物和探针，以确保对羊、牛、猪布病的准确检测。样本复杂性：羊、牛、猪布鲁氏菌病的样本来源广泛，包括血液、组织、粪便等，这些样本中可能存在其他细菌或病毒的污染，对检测结果的准确性提出了要求。检测灵敏度：目前的检测方法主要还是基于抗原-抗体特异性结合的免疫学方法，并且布鲁氏菌在感染初期的病程中，病原体的数量较少，因此需要提高检测方法的灵敏度，确保早期感染的准确检测。检测通量问题：尽管基于PCR的核酸检测方法已经在布病检测方面有了应用，但是都是采用实时荧光的方法，只采用一种荧光，若想实现同一样本的多种病菌检测则需要较大的待检样本量，一定程度上限制了检测通量的提升。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，通过运用TaqMan技术对羊、牛、猪布鲁氏菌病进行快速检测。
本发明通过下述技术方案实现：S1、根据布鲁氏菌的特异基因序列设计qPCR特异性引物组，确保试剂盒对羊、牛以及猪的布鲁氏菌的特异性检测；S2、根据设计得到的qPCR特异性引物组检测羊、牛以及猪的布鲁氏菌的TaqMan荧光定量qPCR特异性引物组，以待测样本DNA为模板进行荧光定量PCR扩增检测；S3、根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有布鲁氏菌，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有布鲁氏菌。
进一步地，特异基因序列设计qPCR特异性引物组可以包括如下引物中的任意一组：
需要说明的是，可以将上表中的布鲁氏菌分为5管，第1管布鲁氏菌可以用于鉴别种属布病菌，后4管布鲁氏菌可以用于鉴别不同亚种布病菌。通过在每个管内添加ACTB作为内标，从而验证qPCR的有效性。
进一步地，所述检测方法还可以包括，验证步骤，通过构建含有目标基因片段的质粒，使用包含目标基因片段的质粒DNA，作为阳性对照样，用于验证试检测方法的有效性。
进一步地，验证步骤中所述的目标基因片段的质粒DNA，可以包括如下引物中的任意一条：
进一步地，qPCR特异性引物组包括正向引物、反向引物和TaqMan荧光探针序列。
进一步地，步骤S2还可包括根据哺乳动物基因组序列信息，选择保守的Actin基因序列设计保守探针。
进一步地，qPCR扩增检测包括，构建qPCR反应体系和进行qPCR扩增反应。
进一步地，构建qPCR反应体系包括：使用20uL的反应体系，配制qPCR反应体系，将PCR primer mix、TaqMan Mix、TaqMan PCR Master Mix和待测样本DNA加入PCR管，其中，2xTaqMan qPCR master mix的体积为10uL，Probe primer mix的体积为1uL，PCR primer mixx的体积为4uL，待测样本DNA的体积为5uL。
进一步地，进行qPCR扩增反应包括：预变性、变性以及退火延伸，其中，预变性温度为95℃，时间为5min，循环次数为1次；变性温度为95℃，时间为15s，循环次数为45次；退火延伸温度为60℃，时间为30s，循环次数为45次。
进一步的，所述根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有布鲁氏菌，包括以样品的荧光信号强度和循环阈值Ct为主要依据，即根据检测扩增产物的荧光信号是否达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数也就是Ct值来判断。
进一步的，当检测通道的循环阈值Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线即视为阳性；当检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本则建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性；若样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线则视为阴性。
为实现本发明的技术目的，本发明第二方面提供了一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测试剂盒，该检测试剂盒能够根据上述检测方法检测待测样品中的布鲁氏菌。
为实现本发明的技术目的，本发明第三方面提供了基于多重TaqMan的qPCR特异性检测的应用，其具有如下任一所述的用途：在检测羊、牛以及猪布鲁氏菌病中的应用；在诊断羊、牛以及猪布鲁氏菌病中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明的检测方法，通过对引物和探针的独特设计，同时优化设计了qPCR反应体系、实时监测技术应用和对照样本的应用等核心方案，解决了现有技术中存在的操作繁琐、耗时长、结果不稳定等问题；
2、本发明提供的试剂盒具有操作简便、快速准确、结果稳定和高特异性的优点，可应用于羊、牛、猪布鲁氏菌病的检测和诊断领域，并且能够实现对各种布鲁氏菌的亚种区分，能够具体到哪一种布鲁氏菌；
3、本发明提供的试剂盒的高特异性体现在，能够通过在特定位点设计种间差异的特异性探针，可以区分不同种属的布鲁氏菌；快速检测体现在，将一次检测流程缩短到2小时左右，并且能够做到在单管闭管条件下的可达5重靶标的扩增检测；安全便捷体现在，可搭配全自动一体化设备，具有生物安全实验资质，实现样品进、结果出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1示出了本发明实施例2中的检测试剂盒ROX检测通道的检测结果示意图；
图2示出了本发明实施例2中的检测试剂盒TAM检测通道的检测结果示意图；
图3示出了本发明实施例2中的检测试剂盒HEX检测通道的检测结果示意图；
图4示出了本发明实施例2中的检测试剂盒FAM检测通道的检测结果示意图；
图5示出了本发明实施例2中的检测试剂盒Cy5检测通道的检测结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本发明，未具体描述公知的结构、材料或方法。
实施例1、
在本实施例中提供了一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法。
TaqMan技术是一种基于荧光探针的实时qPCR技术，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。TaqMan探针是一种双标记的探针，其中包含一个荧光染料和一个荧光淬灭剂。在qPCR反应过程中，当探针与目标基因片段结合时，荧光染料和淬灭剂之间的距离缩短，导致荧光信号的增强。通过监测qPCR反应过程中的荧光信号，可以实时判断是否存在目标基因片段，从而快速准确地进行检测和诊断。
结合TaqMan技术，并通过对引物和探针的设计优化、qPCR反应体系的优化和实时监测技术的应用，实现了对羊、牛、猪布鲁氏菌病的快速、准确、稳定和特异性的检测以及不同亚种鲁氏菌种鉴别、疫苗株与野毒株区分。
具体来说包括如下步骤：
步骤1：根据布鲁氏菌的特异基因序列设计qPCR特异性引物组，确保试剂盒对羊、牛以及猪的布鲁氏菌的特异性检测。同时根据哺乳动物基因组序列信息，选择保守的Actin基因序列设计保守探针。
具体来说，特异基因序列设计qPCR特异性引物组如表1所示：
表1.布鲁氏菌的特异基因序列qPCR特异性引物组
/>
步骤2：根据设计得到的qPCR特异性引物组检测羊、牛以及猪的布鲁氏菌的TaqMan荧光定量qPCR特异性引物组，并以待测样本DNA为模板进行荧光定量qPCR扩增检测。
具体来说，qPCR特异性引物组包括正向引物、反向引物和TaqMan荧光探针序列。qPCR的扩增检测包括，构建qPCR反应体系和进行qPCR扩增反应。
其中，qPCR反应体系为使用20uL的反应体系，配制qPCR反应体系，将PCR primermix、TaqMan Mix、TaqMan PCR Master Mix和待测样本DNA加入PCR管。具体如表2所示。
表2.qPCR反应体系试剂组分表
| 试剂组分 | 体积(uL) |
| 2x TaqMan qPCR master mix | 10 |
| Probe primer mix(10uM) | 1 |
| PCR primer mix(10uM) | 4 |
| Template DNA | 5 |
qPCR扩增反应，需要设置合适的温度和时间条件，具体qPCR扩增反应程序设置如表3所示。
表3.qPCR扩增反应程序设置表
步骤3：根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有布鲁氏菌，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有布鲁氏菌。
具体来说，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有布鲁氏菌，包括以样品的荧光信号强度和循环阈值Ct为主要依据，也即根据扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数(Ct值)来判断。
其中，当检测通道的循环阈值Ct值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线即视为阳性；当检测通道Ct值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本则建议重复试验，重复试验结果出现Ct值≤35.0和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性；若样本检测结果无Ct值且无明显的扩增曲线则视为阴性。
步骤4：验证步骤，可以通过构建含有目标基因片段的质粒，使用包含目标基因片段的质粒DNA，作为阳性对照样，用于验证试检测方法的有效性。本步骤中所采用的用于插入质粒的目标基因片段如表5所示。
表5.插入质粒的目标基因片段
/>
/>
/>
/>
/>
实施例2、
本实施例提供了一种基于实施例1中所述方法的检测试剂盒。
本实施例中的TaqMan检测试剂盒包含有2X TaqMan qPCR Mix、5管不同的亚种probe primer mix及阳性对照样等试剂组分，能够实现在单个反应孔中进行多重荧光定量qPCR，可同时检测4种不同的布鲁氏菌，适用于羊、牛、猪等畜牧动物布鲁氏菌病的检测。具体来说，在实际检测过程中可以将以布鲁氏菌分为5管，第1管用于鉴别种属布鲁氏菌，后4管用于鉴别不同亚种的布鲁氏菌。同时可以在每管添加ACTB作为内标，用于验证qPCR的有效性。
需要说明的是：在本实施例中添加ACTB(β-actin基因)作为内标意味着使用该基因作为一个参照点来规范其他基因表达数据的变化。以便确认qPCR反应的有效性，如果内参基因未正确扩增，那么实验可能存在问题，如试剂失效、qPCR设定错误等。同时可以校正样本间的变异，样本间可能存在DNA量的差异，使用内参基因可以帮助校正这些差异，确保目标基因表达水平的变化是真实的，而不是由于实验操作或样本处理导致的误差。在本实施例中通过添加ACTB作为内标，从而用于实现定量分析，有助于提高数据的可靠性和比较性。
表6示出了本实施例中的检测试剂盒的检测结果。图1为本实施例的检测试剂盒ROX检测通道的检测结果示意图；图2为本实施例的检测试剂盒TAM检测通道的检测结果示意图；
图3为本实施例的检测试剂盒HEX检测通道的检测结果示意图；图4为本实施例的检测试剂盒FAM检测通道的检测结果示意图；图5为本实施例的检测试剂盒Cy5检测通道的检测结果示意图。
表6.TaqMan检测试剂盒结果
/>
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述检测方法，包括以下步骤：
S1、根据布鲁氏菌的特异基因序列设计qPCR特异性引物组，确保试剂盒对羊、牛以及猪的布鲁氏菌的特异性检测；
S2、根据设计得到的qPCR特异性引物组检测羊、牛以及猪的布鲁氏菌的TaqMan荧光定量qPCR特异性引物组，并以待测样本DNA为模板进行荧光定量qPCR扩增检测；
S3、根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有布鲁氏菌，如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有布鲁氏菌。
2.根据权利要求1中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述特异基因序列设计qPCR特异性引物组包括如下引物中的任意一组：
。
3.根据权利要求1中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括，验证步骤，
通过构建含有目标基因片段的质粒，使用包含目标基因片段的质粒DNA，作为阳性对照样，用于验证试检测方法的有效性。
4.根据权利要求1中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述qPCR特异性引物组包括正向引物、反向引物和TaqMan荧光探针序列。
5.根据权利要求1中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述步骤S1中还包括根据哺乳动物基因组序列信息，选择保守的Actin基因序列设计保守探针。
6.根据权利要求1中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述PCR扩增检测包括，构建PCR反应体系和进行PCR扩增反应。
7.根据权利要求6中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述构建PCR反应体系包括：
使用20 uL的反应体系，
配制PCR反应体系，将PCR primer mix、TaqMan Mix、TaqMan PCR Master Mix和待测样本DNA加入PCR管，其中，
2x TaqMan qPCR master mix的体积为10 uL，Probe primer mix的体积为1 uL，PCRprimer mix x的体积为4 uL，待测样本DNA的体积为5 uL。
8.根据权利要求6中所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，其特征在于，所述进行PCR扩增反应包括：预变性、变性以及退火延伸，其中，
预变性温度为95°C，时间为5 min，循环次数为1次；
变性温度为95°C，时间为15 s，循环次数为45次；
退火延伸温度为60°C，时间为30 s，循环次数为45次。
9.一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测试剂盒，其特征在于，基于权利要求1-8中任意一项所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法，检测样本中的布鲁氏菌。
10.一种基于多重TaqMan的qPCR特异性检测的应用，其特征在于，如权利要求1-8中任意一项所述的基于多重TaqMan的qPCR特异性检测方法或权利要求9中所述的试剂盒，其具有如下任一所述的用途：
在检测羊、牛以及猪布鲁氏菌病中的应用；
在诊断羊、牛以及猪布鲁氏菌病中的应用。
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