KR101323575B1

KR101323575B1 - Ｎｄｍ-1 유전자 및 ｘ 유전자를 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR101323575B1
Application number: KR1020110080478A
Authority: KR
Inventors: 용동은
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-10-30
Also published as: KR20130017818A

Abstract

본 발명은 NDM-1 유전자 및 X 유전자를 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NDM-1 단백질 및 X 단백질을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법을 이용하면, 기존 항균제의 항균력을 회복시킬 수 있는 물질을 제공할 수 있다.

Description

ＮＤＭ-1 유전자 및 Ｘ 유전자를 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법 {Method for screening enhancer of an antimicrobial agent using NDM-1 gene and X gene}

본 발명은 NDM-1 유전자 및 X 유전자를 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

암 등 중증 질환 환자 증가로 인한 면역기능 부전자 증가로 매년 입원환자 중 5-10%, 약 400만 명의 의료관련 감염이 발생하고 있고, 이로 인한 항균제 비용은 연 15억 달러로 추산되며 연 5.1%씩 성장하고 있다(Datamonitor, 2007).

1960년대와 1970년대 초반까지 항균제 개발에 괄목할 만한 성과가 있었고, 이를 통하여 많은 감염증이 치료되었다. 그러나 40 여년이 지난 요즈음에도 감염병은 세계적으로 2번째 흔한 사인이자 (WHO Report-2002) 미국 내에서는 3번째 사인으로 보고되어서 (Pinner RW. JAMA. 1996:275:189-93) 그 심각성이 줄어들지 않고 있다. 더군다나 최근 여러 항균제에 내성인 세균이 출현, 증가하고 있어서 약제 선택의 폭이 현저히 줄어들고 있다. 내성 세균의 출현은 항균제의 사용으로 촉진되며, 일단 출현한 내성 세균은 항균제의 사용이나 비위생적인 환경으로 확산된다. 우리나라의 KONSAR 자료에 의하면 주요 의료관련 감염균인 Klebsiella pneumoniae의 세프타지딤(ceftazidime) 내성율은 25-35%에 이르고 있고 플루오로퀴노론(fluoroquiolone) 내성은 2002년 10% 이하였으나 2004년 30% 이상으로 증가하였다. 이는 extended-spectrum beta-lactamase 등의 광범위 항균제 분해 효소 생성균 증가가 중요한 원인으로 판단된다.

이와 같은 세계적인 그람음성 세균에서의 항균제 내성율 증가로 드디어 치료 가능한 항생제에 모두 내성인 pandrug-resistant gram-negative bacilli가 출현하게 되었다. 더군다나 Enterobacteriaceae, glucose-nonfermenting bacilli 모두에서 이들이 증가하고 있어서 더욱 심각한 문제라고 할 수 있다.

한편, 최근들어 카베페넴 내성의 새로운 원인으로 New Delhi metallo-β-lactatmase 효소인 NDM-1이 출현하였다. 본 발명자들은 카바페넴 내성인 Klebsiella pneumoniae 및 Escherichia coli로부터 NDM-1 유전자를 클로닝하고, NDM-1 유전자를 가지는 형질전환체의 이미페넴(imipenem) 및 메로페넴(meropenem)의 MIC값이 매우 높게 나타남을 확인한 바 있다.

이에 본 발명자들은 항균제 내성 세균 문제를 궁극적으로 해결하기 위하여 기존 항균제의 항균력을 부활시키는 후보 물질을 찾기 위해 노력한 결과, NDM-1 유전자의 하류부에 NDM-1 유전자의 발현을 크게 활성화시키는 신규한 유전자 X가 존재함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 NDM-1 및 X 단백질을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여,

(a) 서열번호 1로 표시되는 NDM-1 단백질 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명은 다른 구체예에서,

(a) 서열번호 1로 표시되는 NDM-1 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법을 제공하며, 이 때 상기 NDM-1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되고, X 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항균제는 페니실린계, 세팔로스포린계 또는 카바페넴계 항균제인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 항균제는 엠피실린, 세파로신, 세프트리악손, 세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 이미페넴, 메로페넴 및 에르타페넴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

삭제

본 발명은 또 다른 구체예에서, 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체, 서열번호 1로 표시되는 NDM-1 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체를 제공한다.

본 발명은 또 다른 구체예에서, 서열번호 4로 표시되는 유전자와 혼성화할 수 있는 PCR용 프라이머 세트를 제공하며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시료"는 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 양 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

유전자의 발현량 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), 노던블롯팅(Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRCpress), cDNA 마이크로어레이를 이용한 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) 또는 인 시투(in situ) 혼성화 반응(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))을 이용하여 실시할 수 있다.

RT-PCR 프로토콜에 따라 실시하는 경우에는 우선, 시료를 처리한 세포에서 총 RNA를 분리한 다음, 올리고 dT 프라이머 및 역전사효소를 이용하여 단일가닥 cDNA를 제조한다. 이어, 단일가닥 cDNA를 주형으로 이용하고, 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 유전자-특이적 프라이머 세트는 하기 표 2에서 열거 되어 있다. 그런 다음, PCR 증폭 산물을 전기영동하고, 형성된 밴드를 분석하여 유전자의 발현량 변화를 측정한다.

단백질의 양의 변화는 당업계에 공지된 다양한 면역분석 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경재 분석, 그리고 샌드위치 분석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 표지된 단백질-특이 항체가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 시료가 처리된 세포로부터 추출물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계 (ⅱ) 단백질-특이 항체와 상기 세포 추출물을 반응시키는 단계 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다. 상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시 퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다. 상기 ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 "항균제"는 세균 및/또는 곰팡이류의 번식을 억제하는 것으로, 무기계 항균제, 유기계 천연물 추출계 항균제, 유기계 지방족 화합물 항균제 및 유기계 방향족 화합물 항균제를 포함한다. 또한, 이에 한정되지 않지만, 무기계 항균제로서는, 차아염소 나트륨으로 대표되는 염소 화합물 과산화 수소로 대표되는 과산화물 붕산, 붕산 나트륨으로 대표되는 붕산 화합물 황산동으로 대표되는 동화합물 황산 아연, 염화 아연으로 대표되는 아연 화합물 유황, 다황산 석회, 수화 유황으로 대표되는 유황계물 산화 칼슘으로 대표되는 칼슘 화합물 티오술파이트 은착염, 질산은으로 대표되는 은화합물 그 밖에, 옥소(沃素), 실리코플루오리드 나트륨 등을 들 수 있고, 유기계 천연물 추출계 항균제로서는, 히노키티올, 맹종죽(孟宗竹) 추출액, 크레오소트유(油) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 항균제는 페니실린계(Penicillin), 세팔로스포린계(cephalosporin), 카바페넴계(carbapenem) 등이 있다.

본 발명에 따른 NDM-1 단백질 및 X 단백질을 이용하여 항균 감수성 증강제를 스크리닝하는 방법을 이용하면, 기존 항균제의 항균력을 회복시킬 수 있는 물질을 제공할 수 있다.

도 1은 pK18에 도입된 bla _NDM _-1의 flanking region을 나타낸 것이다(PAI: phosphoribosyl anthranilate isomerase, ldh:lactate dehydrogenase, D:결절된 유전자).
도 2는 PSFDuet-1 벡터, bla _NDM _-1, X 유전자를 이용한 벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 이미페넴 가수분해 곡선을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

Etest 를 이용한 박테리아 균주 및 항균성 민감도 테스트

본 발명자들은 NDM-1 유전자 및 인접 DNa를 클로닝하고 E. coli TOP10 세포에서 발현시켰고, 상기 균주는 세페핌(cefepime) 및 아즈트레오남(aztreonam)을 제외하고 모든 세팔로스포린류(cephalosporins)에 대하여 저항성을 가지고 있었다. 추가적인 AmpC-b-lactamase의 생산이나 외막 단백질의 변형과 같은 숙주세포의 모든 장애요인을 배제하기 위하여 오리지날 벡터 플라스미드 pK18-bla _NDM _-1을 추출하여 다른 E. coli TOP10에 형질전환시켰다. 실험 균주의 항균성 민감도를 측정하기 위하여 Etest strips(AB bioMerieux, Solna, Sweden)를 사용하였다.

벡터의 구조

ORF 파인더(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 이용하여 예상되는 OFR를 찾아내었다. NDM-1를 포함하는 ORF를 하기 표 1의 프라이머를 이용한 PCR반응을 통해 증폭시켰다. 우선, 형질전환체의 카베페넴 MIC 값을 증가시키는 추정 유전자의 위치를 찾기 위해 플라스미드 벡터 pK18을 사용하였다. 추정 ORF를 발견하면, 증폭된 구조는 분해된 다음, 멀티플 클로닝 부위 두 세트를 가지는 pRSFDuet-1 벡터(Novagen Gibbstown, NJ, USA)에 결합되었다. 표 1의 프라이머를 이용하여 구조체의 DNA 서열을 확인하고 각 플라스미드 벡터의 표현형 특징을 확인하기 위해 E. coli TOP10에 형질전환시켰다.

프라이머	타겟	서열 (5'-3')	-
99, 5'putative efflux duet Nde1	X 유전자의 5'	GGAATTCCATATGATGCGGTGCCGGTATCCTTAC(서열번호 5)	Duet vector
100, 3'putative efflux duet Xho1	X 유전자의 3'	CCGCTCGAGTTATTTCCGATAATGATCGCC(서열번호 6)	Duet vector
101, 5' 96NDM DUET EcoR1	bla _NDM _-1의 5'	CCGGAATTCGGCCCCATATTTTTGCTACAGT	Duet vector
102, 3' 96NDM DUET HindIII	bla _NDM _-1의 3'	CGCAAGCTTTCAGCGCAGCTTGTCGGC	Duet vector
110, 5' Kpn1 NDM- LDH 20100217	bla _NDM _-1의 5'	GGGGTACCCGCCCCATATTTTTGCTACAGT	Pk18 vector
109, 3' NDM1 BamH1 20100217	bla _NDM _-1의 3'	CCGGGATCCTCAGCGCAGCTTGTCGGC	Pk18 vector
111, 3' Xba1 NDM- LDH 20100217	△ldh의 3'	GCTCTAGATCAGGCGGGTAAGGATACCGG	Pk18 vector
113, 3' efflux Xba1 PAI- efflux 20100217	△Efflux pump의 5'	GCTCTAGAAAATCGCCGACTTCACCCTGG	Pk18 vector
112, 5' PAI EcoR1 PAI- efflux 20100217	△PAI의 5'	CCGGAATTCGATGCCCGCGAAAATCAAGATT	Pk18 vector
18, Efflux(NDM) EcoR1 (end-start)	△Efflux pump의 3'	CCGGAATTCTTACCTCTGAAGGTGCAACTC	Pk18 vector
19, Efflux(NDM) Xba1 (start-end)	△Efflux pump의 5'	GCTCTAGAGGAAATCGCCGACTTCACCCTGG	Pk18 vector
16S rRNA F	16S rRNA 유전자	AGCTAGAGTATGGGAGAGGATGG	RT-qPCR Sense
16S rRNA R	16S rRNA 유전자	TTCGTACCTCAGCGTCAGTATTAG	RT-qPCR Antisense
16S rRNA	16S rRNA 유전자	TGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGA	RT-qPCR Probe
NDM F	bla _NDM _-1의 5'	TTGATCGTCAGGGATGGC	RT-qPCR Sense
NDM R	bla _NDM _-1의 3'	AGGTTGATCTCCTGCTTGA	RT-qPCR Antisense
NDM	bla _NDM _-1	TAC[+C]GC[+C]TG[+G]AC[+C]GAT	RT-qPCR Probe

RT - qPCR 테스트

전체 RNA를 RNeasy Protect Bacteri Mini Kint and RNase-free DNase set (Qiagen, Hildne, Germany)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 형질전환체로부터 확보하였다. RT-qPCR은 랜덤 프라이머(Promega, Madison, WI, USA) 및 RNase inhibitor(GenDEPOT, Barker, TX)를 이용하여 Omniscript RT kint (Qiagen)로 수행되었다. LightCycler (Roche Diagnositcs, Indianapolis, IN, USA)를 이용한 리얼타임 PCR 실험에 사용된 프라이머 및 프로브는 표 1에 나타내었다. 모든 프로브의 5', 3' 말단은 6-carboxyfluorescein (FAM) 및 fluorescence quencher dye (BHQ1)로 각각 라벨링되었다. 프리믹스 4 μL(LightCycler Taqman Master kit, Roche Diagnostics), 프라이머 1 μL(final concentration, 0.5 μmol/L), 프로브 0.1 μL(final concentration, 0.1 μmol/L), 물 9.9 μL 및 10배 희석된 cDNA 5 μL를 포함하는 총 부피 20μL에서 증폭을 수행하였다. 반응은 95℃에서 10분, 95℃에서 15초 동안 40회, 60℃에서 60초 동안 이루어졌다. NDM-1 유전자의 발현 정도는 16S rRNA에 대하여 평균화되었고, #14 에서의 bla _NDM _-1 유전자의 발현이 기초 레벨로 사용되었다.

가수분해

실험 균주를 소니케이션(sonication)하여 용해시키고, 4℃, 12000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 얻었다. 이미페넴 분해효소(imipenemase)의 활성은 100μM의 이미페넴을 가지고 UV-1601PC spectrophotometer (Shimadzu Corp., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다.

X 유전자의 컴퓨터 분석

뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 시퀀스를 인터넷 상(http://www.ebi.ac.uk/fasta33/)에서 이용 가능한 시퀀스와 비교하였다.

X 유전자의 발견

bla _NDM _-1 유전자를 가지고 있는 pK18 벡터는 이미페넴과 메로페넴에 대하여 높은 MIC 값(12μg/ml)을 가짐을 확인한 바 있다. 본 발명자들은 AmpC β-lactamase의 과량생산이나 외막 단백질의 손실이 MIC 값을 증가시킬 수 있기 때문에, 이러한 카베페넴 MIC에 대한 세포적 영향을 배제하기 위하여 새로운 TOP10에 bla _NDM _-1 유전자를 가지는 pK18 벡터를 형질전환시켰다. 그러나, 그 MIC 값은 12μg/ml로 변함이 없었다. 이로부터 형질전환 플라스미드에 있는 어떠한 유전자가 카베페넴 MIC 값을 증가시키는 원인임을 확신하게 되었다.

어떠한 유전자가 카베페넴 MIC값에 영향을 미치는지를 찾아내기 위하여, pK18에 삽입된 유전자 조각의 PCR 증폭된 ORF를 활용하였다. 유전자 조각 리스트는 다음과 같다: bla _NDM _-1 alone/ bla _NDM _-1 plus △PAI, △bla _DHA _-1, △ldh/ bla _NDM _-1plus △PAI, △bla _DHA-1, △ldh, gene X plus △Efflux pump/ △PAI, △ldh, gene X plus △Efflux pump/ △Efflux pump. 여러 구조의 벡터들을 E. coli TOP10 컴피턴트 세포에 형질전환시키고, 이미페넴과 메로페넴의 MIC 값을 측정하였다(도 1, 표 2).

E. coli TOP10(pK18-bla _NDM _-1)의 이미페넴 및 메로페넴 MIC 값은 E. coli TOP10(pK18) 보다 각각 31.6, 65.2배 증가하였고, E. coli TOP10(pk18-bla _NDM _-1, △PAI, △bla _DHA _-1, △ldh)의 MIC 값도 E. coli TOP10(pK18-bla _NDM _-1)와 비슷하게 각각 31.6, 87배 증가하였다. 또한, E. coli TOP10(pk18-bla _NDM _-1, △PAI, △bla _DHA _-1, △ldh, gene X, △Efflux pump)의 MIC 값은 각각 168.4, 1391.3배로 크게 증가하였다. 그러나, E. coli TOP10(pK18-DPAI, △bla _DHA _-1, △ldh, gene X, △Efflux pump)와 E. coli TOP10(pK18-△Efflux pump)의 MIC 값은 다시 낮게 나타났다. 이로부터, △ldh 하류부에 위치한 특정 유전자가 bla _NDM _-1유전자와 협동으로 이미페넴 및 메로페넴의 MIC 값을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 항균제 감수성 변화를 디스크 확산법으로 측정한 억제대를 확인한 결과, 아즈트레오남(monobactam)을 제외한 베타-락탐 계열에서만 억제대가 감소하고 미노싸이클린(minocycline), 아미노글리코시드(아미카신(amikacin), 토브라마이신(tobramycin), 젠타마이신(gentamicin)), 플루오로퀴노론 (레보플록사신(levofloxacin)), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole) 등에서는 영향이 없는 것을 확인하였다(표 3).

컴피턴트 세포(벡터-도입된 유전자)	MIC (mg/ml)		Fold increase ^a
컴피턴트 세포(벡터-도입된 유전자)	Imipenem	Meropenem	Imipenem	Meropenem
E. coli TOP10	0.094	0.023	0.5	0.1
E. coli TOP10 (pk18)	0.19	0.023	1.0	1.0
E. coli TOP10 (pk18- bla _NDM _-1)	6	1.5	31.6	65.2
E. coli TOP10 (pk18- bla _NDM _-1, DPAI, Dbla _DHA-1, Dldh)	6	2	31.6	87.0
E. coli TOP10 (pk18-bla _NDM _-1, DPAI, Dbla _DHA-1, Dldh, gene X, DEfflux pump)	32	32	168.4	1391.3
E. coli TOP10 (pk18- DPAI, Dbla _DHA-1, Dldh, gene X, DEfflux pump)	0.125	0.016	0.7	0.7
E. coli TOP10 (pk18-DEfflux pump)	0.19	0.023	1.0	1.0

항균제	디스크 확산법 시험의 억제대 지름, mm
항균제	E. coli TOP10	E. coli TOP10 (pk18)	E. coli TOP10 (pk18- bla _NDM _-1)	E. coli TOP10 (pk18- △PAI, △b la _D _HA-1, △ldh, gene X, △Efflux pump)
Ampicillin	23	24	6	6
Cephalothin	23	24	6	6
Ampicillin-sulbactam	23	24	6	6
Imipenem	35	34	23	11
Piperacillin	35	35	16	9
Meropenem	38	38	21	11
Cefepime	39	40	20	10
Cefotaxime	43	37	9	6
Ceftazidime	37	36	6	6
Aztreonam	39	41	37	39
Cefoxitin	28	27	6	6
Minocycline	21	28	25	28
Gentamicin	30	29	32	30
Amikacin	31	26	26	26
Piperacillin-tazobactam	33	36	16	10
Levofloxacin	41	36	45	46
Trimethoprim-sulfamethoxazole	35	36	35	35
Tobramycin	33	29	31	30
Amoxicillin-clavulanate	29	26	6	6

X 유전자가 카베페넴 MIC 값에 미치는 효과의 확인

뉴클레오티드 585 사이즈의 추정된 X 유전자의 ORF는 ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)를 이용하여 △ldh의 하류부에 위치함을 확인하였다. 카베페넴 MIC 값에 대한 X 유전자의 역할을 확인하기 위하여, 두 개의 멀티 클로닝 사이트를 가지는 pRSFDuet-1 벡터와 E. coli TOP10 세포를 사용하였다(도 2).

그 결과, X 유전자만을 가지는 PSFDuet-1 벡터로 형질전환시킨 형질전환체의 MIC 값은 앰피실린(ampicillin) 3 mg/ml, 세파로신(cephalothin) 4 mg/ml, 세프트리악손(ceftriaxone) 2 mg/ml, 세포탁심(cefotaxime) 0.047 mg/ml, 세프타지딤(ceftazidime) 0.25 mg/ml, 아즈트레오남(aztreonam) 0.047 mg/ml, 세페핌(cefepime) 0.032 mg/ml, 오플록사신(ofloxacin) 0.094 mg/ml로 나타났다. 그러나, blaNDM-1 유전자를 가지는 PSFDuet-1 벡터로 형질전환시킨 형질전환체는 다음의 MIC값을 크게 증가시켰다: >256 mg/ml(앰피실린), >256 mg/ml(세파로신), >256 mg/ml(세프트리악손), 12 mg/ml(세포탁심), >256 mg/ml(세프타지딤). 한편, 아즈트레오남(0.023 mg/ml), 레보플록사신(0.032 mg/ml), 오플록사신(0.125 mg/ml)의 값은 크게 변하지 않았고, 세페핌(0.38 mg/ml), 이미페넴(0.25 mg/ml), 메로페넴(0.064 mg/ml) 및 에르타페넴(0.064 mg/ml)의 값은 약간 증가하였다. 또한, X 유전자와 blaNDM-1 유전자를 가지는 PSFDuet-1 벡터로 형질전환시킨 형질전환체는 MIC 값을 훨씬 더 증가시켰다: 64 mg/ml (세포탁심), 2 mg/ml (세페핌), 0.75 mg/ml (이미페넴), 0.38 mg/ml (메로페넴), and 0.5 mg/ml (에르타페넴)(표 4).

항균제	MIC (mg/ml)					Fold increase
항균제	E. coli TOP10	E. coli TOP10 (PSFDuet-1)	#10 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-gene X)	#14 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-bla _NDM _-1)	#10-8 E. coli TOP10 (PSFDuet-1- bla _NDM-1,gene X)	#10 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-gene X)	#14 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-bla _NDM _-1)	#10-8 E. coli TOP10 (PSFDuet-1- bla _NDM-1,gene X)
AMP	3	3	3	>256	>256	1.0	>85.3	>85.3
KEP	4	4	4	>256	>256	1.0	>64.0	>64.0
CRO	0.094	0.023	0.023	>125	>256	1.0	>5,434.8	>11,130.4
CTX	0.047	0.047	0.047	12	64	1.0	255.3	1,361.7
CAZ	0.38	0.25	0.25	>256	>256	1.0	>1024.0	>1024.0
AZT	0.094	0.047	0.047	0.023	0.064	1.0	0.5	1.4
FEP	0.032	0.032	0.032	0.38	2	1.0	11.9	62.5
IPM	0.019	0.019	0.125	0.25	0.75	1.0	2.0	6.0
MEM	0.012	0.012	0.012	0.064	0.38	1.0	5.3	31.7
ERT	0.006	0.012	0.012	0.064	0.5	1.0	5.3	41.7
LEV	0.003	0.006	0.032	0.032	0.006	1.0	1.0	0.2
OFX	0.012	0.016	0.094	0.125	0.023	1.0	1.3	0.2

X 유전자와 blaNDM -1 유전자의 발현

X 유전자가 bla _NDM _-1유전자의 발현 정도를 증가시키는 것인지 또는 X 유전자의 산물이 NDMA-1 효소와 함께 기능하는 것인지를 확인하기 위하여, RT-qPCR 및 카바페넴 가수분해 테스트를 수행하였다(도 3). bla _NDM _-1및 X 유전자를 가지는 PSFDuet-1 벡터로 형질전환시킨 형질전환체에서 bla _NDM _- ₁의 발현 정도는 bla _NDM _-1유전자만을 가지는 형질전환체에 비하여 약 300배 증가하였음을 확인하였다(표 5).

균주	RT-qPCR을 이용한 bla _NDM _-1 유전자의 발현 정도		이미페넴 가수분해 활성 -이미페넴 자체분해 있음/없음(mU/mg protein)
균주	Fold	SD	이미페넴 가수분해 활성 -이미페넴 자체분해 있음/없음(mU/mg protein)
#10 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-gene X)	관찰되지 않음	관찰되지 않음	40.9/ 0
#14 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-bla _NDM _-1)	1	0.222	306.6/ 265.7
#10-8 E. coli TOP10 (PSFDuet-1- bla _NDM _-1,gene X)	308.2	0.726	2055.7/ 2014.8

이미페넴 분해효소(imipenemase) 활성은 PSFDuet-1-bla _NDM _-1 형질전환체에서는 자체분해를 하는 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-gene X) 보다 7.5배 증가한 306.6 mU/mg protein 을 나타내었다. 또한, bla _NDM _-1,및X 유전자를 가지는 형질전환체에서는 E. coli TOP10 (PSFDuet-1-bla _NDM _-1)보다 약 6.7배 증가한 2055.7 mU/mg protein을 나타내었다(표 5).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

(a) 서열번호 1로 표시되는 NDM-1 단백질 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 단백질의 양 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 단백질의 양 또는 활성이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서,
상기 항균제는 페니실린계, 세팔로스포린계 또는 카바페넴계 항균제인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서,
상기 항균제는 카베페넴계 항균제인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 1항에 있어서,
상기 항균제는 엠피실린, 세파로신, 세프트리악손, 세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 이미페넴, 메로페넴 및 에르타페넴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
(a) 서열번호 1로 표시되는 NDM-1 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 세포에 분석할 시료를 접촉시키는 단계;
(b) 상기 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 유전자의 발현량이 감소조절(down regulation)되는 것으로 측정될 때, 상기 시료가 항균 활성을 증가시키는 물질임을 판별하는 단계를 포함하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서,
상기 NDM-1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되고, X 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서,
상기 항균제는 페니실린계, 세팔로스포린계 또는 카바페넴계 항균제인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서,
상기 항균제는 카베페넴계 항균제인 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 5항에 있어서,
상기 항균제는 엠피실린, 세파로신, 세프트리악손, 세포탁심, 세프타지딤, 세페핌, 이미페넴, 메로페넴 및 에르타페넴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
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서열번호 3으로 표시되는 X 단백질.
제 19항의 단백질을 코딩하는 핵산.
제 20항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체.
서열번호 1로 표시되는 NDM-1 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 X 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 형질전환체.
제 6항에 있어서,
서열번호 4로 표시되는 유전자와 혼성화할 수 있는 PCR용 프라이머 세트를 이용한 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.
제 24항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 것을 특징으로 하는 PCR용 프라이머 세트를 이용한 항균제 감수성 증강제 스크리닝 방법.