ITPO20070023A1 - Metodo e dispositivo per l'analisi multipla ad alta sensibilita di campioni biologici - Google Patents

Description

D E S C R I Z I O N E

annessa a domanda di brevetto per INVENZIONE INDUSTRIALE dal titolo: METODO E DISPOSITIVO DI ANALISI MULTIPLA AD ALTA SENSIBILITÀ DI CAMPIONI BIOLOGICI

La presente invenzione riguarda un metodo ed un dispositivo per l’analisi multipla e ad alta sensibilità di campioni biologici.

In particolare l’invenzione riguarda un metodo ed un dispositivo per la rilevazione di coppie di affinità molecolare, quali acido nucleico-acido nucleico (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) o proteina-proteina.

E’ noto che, negli ultimi 20 anni, le tecniche di biologia molecolare hanno generato un sempre maggior interesse nell’ambito della biologia e della medicina, e numerose sono state le loro applicazioni in una vasta gamma di ambiti, come nell’identificazione e mappatura di geni, sequenziamento del DNA, diagnostica medica e biotecnologie.

Fra le tecniche note, la Polymerase Chain Reaction (PCR), e relative modifiche, é stata ampiamente utilizzata sia in ricerca che in diagnostica clinica per amplificare e analizzare piccolissime quantità specifiche di acido nucleico di cui si conoscono le sequenze nucletidiche iniziali e terminali. Tale tecnica sfrutta la capacità dell’enzima DNA-polimerasi di sintetizzare progressivamente un nuovo filamento di DNA a partire da DNA denaturato a particolari condizioni di temperatura. La Ligase Chain Reaction (LCR) rappresenta la variante più comune della PCR, sfruttando l’azione di una ligasi termostabile. Queste tecniche sono molto sensibili e affidabili, ma anche molto costose e dispendiose in termini di tempo, richiedono inoltre tecnici ampiamente qualificati e sono poco idonee ad essere automatizzate. La PCR Quantitativa (Q-PCR), basata sull’amplificazione di un target di DNA, é inoltre una delle più comuni modifiche della PCR che può dare solo informazioni di tipo semiquantitativo (numero di copie di una sequenza di DNA in un campione) e può anche dare problemi in termini di rilevazione di un basso numero di copie del modello nonché in seguito alla presenza di inibitori.

L’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), e relative modifiche, é un’altra tecnica molto utilizzata in diagnostica e rappresenta un metodo di analisi immunologica usato in biochimica per rilevare la presenza di un dato antigene caratteristico di un organismo patogeno in un campione che ne è probabilmente affetto, oppure per misurare la concentrazione di anticorpi nel plasma sanguigno, come ad esempio nei test per l’AIDS. Tale tecnica si basa sulla reazione specifica antigene-anticorpo, resa visibile con varie procedure. Molte altre tecniche basate sul principio della tecnica ELISA sono state sviluppate nel corso degli anni passati. Una di queste é rappresentata dalla tecnica “Two-hybryd capture” sviluppata da Digene per la rilevazione del papillomavirus umano (HPV), in grado di rilevare degli ibridi RNA:DNA utilizzando un segnale chemilominescente amplificato. Tali tecniche, benché sensibili e affidabili, non permettono il cosiddetto “multiplexing”, ossia la rilevazione in contemporanea e nello stesso pozzetto di piu sottotipi di variabilità (ex. sottotipi del virus HPV). Esse sono inoltre soggette agli svantaggi dei limiti di sensibilità derivanti dall’uso di un segnale fluorescente come metodo di rilevazione: bassa stabilità dei coloranti, influenza dell’ambiente fisico-chimico sull’intensità del segnale, dispendiosità del sistema di rilevazione del segnale.

A partire dagli inizi degli anni ‘90, si sono sviluppate le tecniche di Microarray che sono state applicate in particolare nel campo della ricerca biomedica. Tali tecniche prevedono che microscopiche sonde di DNA siano attaccate a una superficie solida (vetro, plastica), e si leghino a target complementari, previamente amplificati e marcati con un fluoroforo, qualora presenti nel campione da testare, dando luogo alla rilevazione di un segnale fluorescente (luminoso) in caso di avvenuta ibridazione. Tali tecniche prevedono dunque una preliminare amplificazione del segnale per assicurarne una migliore sensibilità, come nel caso della rilevazione degli RNAm amplificati con una RT-PCR, e sono dunque soggette ai limiti della PCR previamente enunciati. I Microarray sono inoltre molto costosi, richiedendo la presenza di scanner estremamente cari caratterizzati da specifici laser focalizzati in grado di eccitare ogni singolo micro-spot, non sono di facile automazione e dunque risultano poco utilizzabili in diagnostica. Prevedendo inoltre la rilevazione di un segnale fluorescente generato da un fluoroforo, essi sono soggetti ai problemi precedentemente enunciati in termini di sensibilità del segnale.

Negli ultimi anni una serie di tecniche di rilevazione definite come “Latex Agglutination” sono state sviluppate allo scopo di superare i problemi rilevanti dalle tecniche fluorescenti o di PCR. Secondo questo approccio, un anticorpo (o un antigene) é presente sulla superficie di particelle in lattice. Quando una sospensione contenente lo specifico antigene (o anticorpo) complementare da rilevare é mischiata con la sospensione delle particelle in lattice, si causa una agglutinazione visibile in grado di rilevare lo specifico antigene o anticorpo tramite uno “shift” di scala dimensionale. Tali tecniche sono attualmente applicate alla rilevazione solo di specifici antigeni o anticorpi (no su acidi nucleici), impiegano particelle di dimensioni micrometriche ed esculdono il multiplexing. In tale settore, numerosi brevetti possono essere individuati (US6200820, US5589401 , US7122384, US7169556, US5175112), ma molti di questi riguardano tecniche non quantitative o molto complesse.

Scopo della presente invenzione è pertanto quello di fornire una tecnica di biotecnologia analitica consenta di effettuare la rilevazione di coppie di affinità molecolare, del tipo acido nucleico-acido nucleico (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) o proteina-proteina e che non sia affetta dai limiti delle tecniche note. In particolare è scopo dell’invenzione quello di fornire un metodo ed un dispositivo per la rilevazione simultanea e quantitativa di subtipi differenti (multiplexing) di un sistema biologico (virus, modificazioni genetiche, etc).

I suddetti scopi sono conseguiti con un metodo ed un dispositivo basati sull’aumento dimensionale determinato dall’uso di nanoparticelle, di natura non biologica, interagenti con strutture biologiche, quali acidi nucleici o proteina, in grado poi di permettere la rilevazione di un certo sistema biologico (virus, modificazioni genetiche, etc.).

Più in particolare, il metodo ed il dispositivo proposti prevedono la costituzione di una architettura a macroarray di nanoparticelle in latex legate a sonde molecolari o anticorpi specifici, assorbite su una superficie solida e organizzate preferibilmente in monostrato. Lo scopo del sistema é quello di rilevare specificatamente una coppia di affinità molecolare: proteina-proteina come il complesso antigene-anticorpo, oppure DNA-DNA o DNA-RNA come il complesso sonda-target. Per la rilevazione e la quantificazione dell’awenuto accoppiamento non è previsto pertanto l’uso di un segnale fluorescente, ma bensì l’uso di sorgenti laser focalizzati accoppiati a un sistema di fotosensori: varie strategie di rilevazione possono essere applicate, quali per esempio l’analisi d’immagine o il light scattering.

I vantaggi dell’invenzione saranno meglio compresi, insieme con le caratteristiche tecniche, dalla descrizione dettagliata che segue di un esempio non limitativo di attuazione, con riferimento agli allegati disegni, nei quali:

- la Fig. 1 illustra schematicamente il metodo oggetto dell’invenzione;

- LA Fig. 2 illustra schematicamente un’applicazione dell’invenzione alla rilevazione di più sottotipi di un sistema biologico;

- la Fig. 3 illustra un ingrandimento del particolare A di Fig. 2.

Con riferimento alla Fig. 1 , per la rilevazione di un elemento X di una coppia di affinità (target) si determina il legame con altri due componenti Y,Z dell’altro elemento della coppia di affinità (nell’esempio illustrato due elementi complementari a due diverse porzioni terminali del target) uno ancorato ad una nanoparticella N e l’altro ad un supporto solido S.

Più in particolare, in conformità dell’invenzione, nanoparticelle N in latex monodisperse nella sospensione da testare si legano specificatamente al target X tramite sonde molecolari Y complementari ancorate sulle suddette nanoparticelle. Tali complessi nanoparticelle/sonda/target diffondono successivamente per movimenti Browniani dalla sospensione liquida all’interfaccia solido/liquida, fino a essere attraccate alla superficie solida S (ad es. una parete di una cuvetta contenente la sospensione) in forma di monostrato, legando il target X ad altre sonde molecolari Z specifiche (complementari ad altre porzioni del target), a loro volta assorbite sulla superficie solida.

In questo modo, attraccando sonde di tipo diverso in differenti aree della superficie solida (come esemplificato più sotto), si viene a creare una sorta di distribuzione a macroarray delle particelle, con ciascuna area caratterizzata da una particolare particella legata a una particolare sonda specifica, permettendo cosi la caratterizzazione specifica di più sottotipi di certo sistema biologico (multiplexing).

Il metodo proposto garantisce robustezza e affidabilità, nonché velocità di analisi e automazione, nonché minori sforzi in termini di costi e addestramento di personale specializzato rispetto alle metodiche precedenti.

Un’alta sensibilità di analisi é ottenuta non con un’accrescimento quantitativo del materiale presente, come nel caso della tecnica PCR, ma piuttosto sfruttando l’enorme segnale di amplificazione che emerge quando si passa da una scala molecolare (acido nucleico o proteina) a una macroscopica (particelle in latex): lo “shift” di scala dimensionale è infatti di due-tre ordini di grandezza. Un processo addizionale che potenzia la sensibilità del test é poi rappresentato dall’effetto di concentrazione che si verifica quando particelle monodisperse sono assorbite dalla sospensione liquida alla superficie solida in forma di monostrato.

II metodo ed il dispositivo oggetto della presente invenzione consentono dunque il raggiungimento di due obbiettivi cruciali in diagnostica medica: il potenziamento del segnale, con l’arricchimento spaziale e la concentrazione selettiva di una molecola da analizzare in una configurazione bidimensionale, e la capacità di eseguire più test nello stesso tempo, nello stesso pozzetto e con lo stesso campione (multiplexing), con notevole risparmio di tempo, soldi e materiale biologico.

Il sistema proposto in generale, e quest’ultima potenzialità in particolare, risultano particolarmente utili e vantaggiosi nel caso della rilevazione di mutazioni genetiche in campioni umani, nonché applicabili nel genotyping di virus pericolosi per l’uomo.

Nelle Figg. 2 e 3 è schematicamente illustrata la rilevazione di genotipi diversi (quattro nell’esempio) del papillomavirus umano (HPV) mediante un metodo ed un dispositivo in conformità della presente invenzione.

Nell’esempio, il genoma (G1-G4) dei vari sottotipi di HPV é il target da rilevare, le sonde (C) ancorate alle nanoparticelle (N) sono rappresentate da sonde di DNA complementari a regioni costanti del genoma dell’HPV (quindi in grado di rilevare qualsiasi sottotipo di HPV), mentre le sonde (V1 -V4) legate al supporto solido (S) sono rappresentate da sonde di DNA complementari a regioni variabili del genoma dell’HPV (quindi in grado di rilevare specificatamente un particolare sottotipo di HPV), permettendo quindi la rilevazione spaziale dei vari sottotipi (multiplexing).

Il sistema prevede l’utilizzo di un contenitore in plastica (ad es. una cuvetta), su una cui parete (S) determinare un’area di circa 1 cm<2>, suddivisa in celle (1 -4) in ciascuna delle quali è ancorato un tipo di oligonucleotide (V1-V4) corrispondente a una specifica sonda di DNA complementare alla parte variabile del genoma di uno specifico genotipo di HPV.

All’interno della cuvetta viene quindi versata una sospensione contenente della nanoparticelle (N) in latex di dimensioni dell’ordine dei 100-300 nm, sulla cui superficie sono presenti delle sonde (C) di DNA (precedentemente ancorate alle nanoparticelle) specifiche per la porzione costante del genoma dell’HPV, e quindi in comune ai vari sottotipi di HPV.

Versando all’interno della cuvetta il campione biologico da testare circa la presenza qualitativa e quantitativa dell’HPV, in presenza del target (ad es. G1) specifico (presenza di una molecola di un certo sottotipo di HPV) si viene a formare il legame tra il target stesso con una nanoparticella (N) tramite la sua porzione (C) di DNA costante e quello con la porzione (1) della parete (S) della cuvetta tramite la sua porzione (V1 ) di DNA variabile, determinando cosi l’ancoraggio delle nanoparticelle alla parete della cuvetta (cfr. Fig. 3).

Dopo aver effettuato un lavaggio per eliminare le nanoparticelle non adese, un successivo illuminamento della parete con della luce trasversale e la conseguente rilevazione di un segnale di light scatter (statico o dinamico), permette la rilevazione qualitativa dei vari sottotipi di HPV presenti nel campione testato in base alla disposizione spaziale degli oligonucleotidi tipospecifici adesi alla parete.

Grazie alla previa determinazione sperimentale di curve di taratura nonché l’utilizzo di un algoritmo matematico specifico, è inoltre possibile la rilevazione quantitativa di ciascun sottotipo di HPV presente nel campione testato. Vantaggiosamente l’associazione e la correlazione probabilistico-statistica dell’effettiva concentrazione dello specifico sottotipo nel campione ed il conteggio delle specifiche nanoparticelle adese in monostrato al supporto solido evita la possibile insorgenza di problemi di sotto- o sovrastima di uno o più sottotipi.

Il trovato così concepito è suscettibile di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell’ambito del concetto inventivo. Inoltre tutti i dettagli possono essere costituiti da elementi tecnicamente equivalenti.

Claims (8)

1. R I V E N D I C A Z I O N I 1 . Metodo per l’analisi multipla ad alta sensibilità di campioni biologici caratterizzato dal fatto di comprendere le seguenti fasi: - fornire una pluralità di nanoparticelle in latex; - applicare a ciascuna nanoparticella almeno una sonda di un primo tipo avente affinità con almeno un analita; - applicare alla superficie di una parete una pluralità di sonde di almeno un secondo tipo aventi affinità con detto almeno un analita; - porre detta pluralità di nanoparticelle a contatto con un campione fluido determinando l’ancoraggio tra una o più di dette nanoparticelle e detto analita, se presente nel campione, per il tramite del legame instaurantesi tra le sonde del primo tipo e detto analita; - porre dette nanoparticelle legate a detto analita a contatto con detta parete in modo da determinarne l’adesione alla superficie a seguito del legame instaurantesi tra le sonde di detto secondo tipo e detto analita; - illuminare detta parete con luce trasversale e rilevare il segnale di light scatter statico o dinamico.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 , caratterizzato dal fatto che dette sonde del primo tipo sono complementari ad una porzione costante di detto analita.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che dette sonde del secondo tipo sono complementari a porzioni variabili di detto analita.
4. 4. Metodo secondo una delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto di suddividere la superficie di detta parete in una pluralità di celle e di applicare in ciascuna cella almeno una sonda complementare ad una diversa porzione variabile di detto analita, in modo da determinare l’ancoraggio nelle diverse celle di nanoparticelle legate a sottotipi differenti dell’analita.
5. 5. Dispositivo per l’analisi multipla ad alta sensibilità di campioni biologici caratterizzato dal fatto di comprendere: - un contenitore per l’accoglimento di un campione fluido da analizzare; - una pluralità di nanoparticelle in latex disperse nel fluido, a ciascuna nanoparticella essendo ancorata almeno una sonda di un primo tipo avente affinità con almeno un analita; - una pluralità di sonde di almeno un secondo tipo aventi affinità con detto analita ed ancorate alla superficie di almeno una parete del contenitore; - mezzi per illuminare detta parete con luce trasversale e per rilevare il segnale di light scatter statico o dinamico generato a seguito dell’adesione delle nanoparticelle alla superficie della parete provocata dai legami instauratisi tra le sonde portate dalle nanoparticelle e l’analita e tra questo e le sonde ancorate alla superficie.
6. 6. Dispositivo secondo la rivendicazione 5, caratterizzato dal fatto che la superficie di detta parete è suddivisa in una pluralità di celle e che, a ciascuna cella, è ancorata almeno una sonda complementare ad una diversa porzione variabile di detto analita, in modo da determinare l’ancoraggio nelle diverse celle di nanoparticelle legate a sottotipi differenti dell’analita.
7. 7. Metodo e dispositivo secondo una delle rivendicazioni precedenti per la rilevazione di genotipi diversi del papillomavirus umano (HPV).
8. 8. Metodo e dispositivo per l’analisi multipla ad alta sensibilità di campioni biologici sostanzialmente come sopra descritto ed illustrato, con riferimento agli annessi disegni e per gli enunciati scopi.