JP2000325082A - 核酸固定化フィルムの積層体及びその薄片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 核酸固定化並びに核酸固定化フィルムの
積層体及びその薄片。 【効果】 本発明によれば、核酸が任意に高密度且つ正
確に二次元に配列された薄片を再現性よく効率的に得る
ことができる。この薄片を用いて、検体中の核酸の種類
および量を調べることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸が固定化され
た高分子材料に関する。詳しくは、核酸固定化フィルム
の積層体及びその薄片に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、各種生物におけるゲノムプロジェ
クトが進められており、ヒト遺伝子をはじめとして、多
数の遺伝子とその塩基配列が急速に明らかにされつつあ
る。配列の明らかにされた遺伝子の機能については、各
種の方法で調べることができるが、その有力な方法の一
つとして、明らかにされた塩基配列情報を利用した遺伝
子発現解析が知られている。例えば、ノーザンハイブリ
ダイゼーションに代表されるような、各種の核酸：核酸
間ハイブリダイゼーション反応や各種のPCR反応を利用
した方法が開発され、当該方法により各種遺伝子とその
生体機能発現との関係を調べることができる。しかしな
がら、これらの方法では適用し得る遺伝子の数に制限が
ある。したがって、今日のゲノムプロジェクトを通して
明らかにされつつあるような、一個体レベルという極め
て多数の遺伝子から構成される複雑な反応系全体からみ
ると、上記方法により遺伝子の総合的・系統的解析を行
うことは困難である。最近になって、多数遺伝子の一括
発現解析を可能とするＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡ
チップ法）と呼ばれる新しい分析法、ないし方法論が開
発され、注目を集めている。

【０００３】これらの方法は、いずれも核酸：核酸間ハ
イブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法で
ある点で原理的には従来の方法と同じであるが、マイク
ロアレイ又はチップと呼ばれる平面基盤片上に、多数の
ＤＮＡ断片が高密度に整列固定化されたものが用いられ
ている点に大きな特徴がある。マイクロアレイ法の具体
的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子
等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基盤片上でハ
イブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮ
ＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を蛍光色
素等でラベル後、高解像度解析装置で高速に読みとる方
法が挙げられる。こうして、サンプル中のそれぞれの遺
伝子量を迅速に推定できる。即ち、この新しい方法の本
質は、基本的には反応試料の微量化と、その反応試料を
再現性よく多量・迅速・系統的に分析、定量しうる形に
配列・整列する技術との統合であると理解される。

【０００４】核酸を基盤上に固定化するための技術とし
ては、上記ノーザン法同様、ナイロンシート等の上に高
密度に固定化する方法の他、更に密度を高めるため、ガ
ラス等の基盤の上にポリリジン等をコーティングして固
定化する方法、あるいはシリコン等の基盤の上に短鎖の
核酸を直接固相合成していく方法などが開発されてい
る。

【０００５】しかし、例えば、ガラス等の固体表面を化
学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸をスポッティン
グ固定化する方法[Science 270, 467-470(1995)]は、ス
ポット密度でシート法より優れるものの、スポット密度
及びスポット当たり固定できる核酸量がシリコン基盤上
における直接合成法(U.S.Patent 5,445,934、U.S.Paten
t 5,774,305）と比較して少量であり、再現が困難であ
る点が指摘されている。他方、シリコン等の基盤の上に
フォトリソグラフィー技術を用い、多種の短鎖核酸をそ
の場で規則正しく固相合成していく方法に関しては、単
位面積当たりに合成しうる核酸種数（スポット密度）及
びスポット当たりの固定化量（合成量）、並びに再現性
等において、スポッティング法より優れるとされるもの
の、固定化しうる化合物種は、フォトリソグラフィーに
より制御可能な比較的短鎖の核酸に限られる。さらに、
高価な製造装置と多段の製造プロセスにより、チップ当
たりの大きなコストダウンが困難とされる。その他、微
小な担体上に核酸を固相合成しライブラリー化する手法
として、微小なビーズを利用する方法が知られている。
この方法は、チップ法より長鎖の核酸を多種・安価に合
成することが可能であり、またｃＤＮＡ等より長鎖の核
酸も固定可能と考えられる。しかしながら、チップ法と
異なり、指定の化合物を指定の配列基準で再現性よく整
列させたものを作製することは困難である。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような状況下、鎖
長によらず核酸を所定の濃度に固定化でき、測定可能な
形に高密度に再現よく配列化可能で、安価な大量製造に
適応しうる新たな体系的方法論の確立は、今後重要性を
増すと考えられる遺伝子解析に強く求められるものであ
り、本発明が解決しようとする課題である。

【０００７】具体的には、本発明が解決しようとする課
題は、ナイロンシートやガラス基盤のような二次元担体
上への微量スポッティングや微量分注による核酸配列体
製造法に比べ、核酸固定化量が高く、単位面積あたり配
列される核酸分子種の高密度化が可能で、大量生産によ
り適した配列体、すなわち核酸が固定化された二次元的
（平面的）配列体（固定化核酸二次元配列体という）の
製造法の確立である。また、本発明が解決しようとする
課題はシリコン基盤上へのフォトリソグラフィーと固相
合成との組み合わせによる高密度オリゴ核酸配列体製造
法と比べ、ｃＤＮＡを含む長鎖の核酸にも適応可能で、
製造コストのより低い固定化核酸二次元配列体製造法の
確立である。そこで、本発明は、核酸が固定化された核
酸固定化フィルムの積層体及びその薄片を提供すること
を目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上述の如
き課題を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、核酸配列
化プロセスと固定化プロセスとを同一の二次元担体上で
行う従来法の発想を改め、各種核酸の固定化プロセスを
フィルムにそれぞれ独立して行い、それらの配列化プロ
セスに各種のフィルム賦形、積層技術を導入することに
より核酸固定化フィルムの積層体を作製し、得られる積
層体の薄片化プロセスを経ることで、固定化核酸二次元
配列体を作製し得ることを見いだし、本発明を完成する
に至った。

【０００９】すなわち、本発明は、核酸が固定化された
核酸固定化フィルム（Ｆ）を積層してなる、核酸固定化
フィルムの積層体（Ａ）である。該積層体（Ａ）として
は、１ｃｍあたり１０層以上の核酸固定化フィルム
（Ｆ）を含むものが挙げられる。また、固定化する核酸
の種類が、核酸固定化フィルムの積層体（Ａ）を構成す
る各核酸固定化フィルム（Ｆ）の全部又は一部において
異なるものも、本発明の積層体（Ａ）に含まれる。さら
に、本発明は、前記核酸固定化フィルムの積層体（Ａ）
をフィルムの厚さ方向に切断してなる、核酸固定化フィ
ルム断面を有する薄片（Ｓ）である。

【００１０】さらに、本発明は、前記薄片（Ｓ）の切断
面を接合面として積層してなる、核酸固定化フィルム断
面を有する薄片の積層体（Ｂ）である。該積層体（Ｂ）
としては、１ｃｍあたり１０層以上の薄片（Ｓ）を含む
ものが挙げられる。また、固定化する核酸の種類が、積
層体（Ａ）及び積層体（Ｂ）を構成する各核酸固定化フ
ィルム（Ｆ）の全部又は一部において異なるものも、本
発明の積層体（Ｂ）に含まれる。

【００１１】さらに、本発明は、前記核酸固定化フィル
ム断面の積層体（Ｂ）を薄片の厚さ方向に切断してな
る、核酸固定化フィルム断面を有する薄片（Ｐ）であ
る。該薄片（Ｐ）としては、１cm²あたり、１００以上
の核酸固定化フィルム（Ｆ）の断面を含むものが挙げら
れる。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、核酸が固定されたフィルムを重ねて層状にし
た積層体に関し、また、該積層体をフィルムの厚さ方向
に切断することにより得られる薄片に関する。本発明の
積層体及び薄片を作製するための概要を以下に説明する
（図８）。

【００１３】図８において、フィルム11〜16の6種類を
積層すべきフィルムとして使用する場合を例示する。こ
れらフィルムには同種又は異種の核酸がそれぞれ固定さ
れている。上記フィルムは、ｘ、ｙ及びｚ軸の3次元座
標において、ｘｙ平面を基準として、ｚ軸方向に積層す
る。例えば、フィルム11〜13を積層すると積層体（A
1)、フィルム14〜16を積層すると積層体（A2)を得るこ
とができる（図８(b)）。次に、フィルムの厚さ方向に
積層体を切断（スライス）する。すなわち、積層体(A1)
及び(A2)を、ｙｚ平面により、x軸に交差する方向に切
断する（図8(c))。その結果、積層体(A1)については薄
片S1を、積層体(A2)については薄片S2を得ることができ
る。

【００１４】薄片S1及びS2には、それぞれフィルム11〜
13、フィルム14〜16に対応する層が作られている。フィ
ルム11〜13及びフィルム14〜16に固定する核酸の種類を
変えると、それぞれ3種類の核酸の層からなる薄片を得
ることができる。従って、薄片S1及びS2を任意に組み合
わせて積層することにより、種々の核酸が固定されたフ
ィルムを含む積層体を得ることができる。例えば、図８
においてS1、S2、S1の順に積層したとすると（図8
(d))、得られる積層体の1層目にはフィルム11〜13、2段
目にはフィルム14〜16、3段目にはフィルム11〜13の層
からなる積層体(B)を得ることができる（図８(e))。積
層体(B)は、ｘｚ平面においてフィルム１〜６がすべて
表出している（露出している）ため、本発明においては
このすべてのフィルムが表れている面を切断面として切
断する。すなわち、上記積層体(B)をｘｚ平面でy軸方向
に交差するように切断する。その結果、フィルム11〜16
に含まれる核酸のすべてを含む薄片（薄片P)を得ること
ができる（図８(f))。

【００１５】本発明において、フィルムに固定化する対
象となる核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）や
リボ核酸（ＲＮＡ）が挙げられる。本発明に用いる核酸
は、市販のものでもよく、また、生細胞などから得られ
た核酸でもよい。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製
は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Blin
らの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303
(1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Fa
valoroらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.6
5: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化す
る核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミド
ＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しく
は化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等によ
り合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオ
チド等を用いることもできる。

【００１６】本発明では、核酸をそのまま固定化しても
よく、また、核酸に化学的修飾を施した誘導体や、必要
に応じて変成させた核酸を固定化してもよい。核酸の化
学的修飾には、アミノ化、ビオチン化、ディゴキシゲニ
ン化等が知られており[Current Protocols In Molecula
r Biology, Ed.; Frederick M. Ausubel et al.(199
0)、脱アイソトープ実験プロトコール(1)ＤＩＧハイブ
リダイゼーション（秀潤社）]、本発明ではこれらの修
飾法を採用することができる。一例として、核酸へのア
ミノ基導入に関して説明する。

【００１７】アミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖と一本
鎖核酸との結合位置は特に限定されるものではなく、核
酸の５’末端または３’末端のみならず核酸の鎖中（例
えば、リン酸ジエステル結合部位または塩基部位）であ
ってもよい。この一本鎖核酸誘導体は、特公平3-74239
号公報、米国特許4,667,025号、米国特許4,789,737号等
に記載の方法にしたがって調製することができる。この
方法以外にも、例えば、市販のアミノ基導入用試薬［例
えば、アミノリンクII（商標名）；ＰＥバイオシステム
ズジャパン社、Amino Modifiers（商標名）；クロンテ
ック社］などを用いて、又はＤＮＡの５’末端のリン酸
にアミノ基を有する脂肪族炭化水素鎖を導入する周知の
方法（Nucleic Acids Res.,11(18),6513-(1983) ）にし
たがって調製することができる。

【００１８】本発明において、核酸の固定化に用いるこ
とができるフィルム材料としては、核酸を固定化できる
ものであれば特に限定されるものではないが、合成高分
子、半合成高分子、天然高分子等を材料とするフィルム
を用いることができる。合成高分子としては、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ポリスチレン及びその共重合
物、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリカーボ
ネート、ポリメチルメタクリレート、飽和ポリエステ
ル、ポリビニルアルコール、ポリアミド（例えばナイロ
ン６、ナイロン６６、ナイロン６１０、ナイロン１１
等）、ポリイミド、ポリフェニレンオキシド、ポリスル
ホン、ポリパラキシレン、ポリアミドイミド、ポリエス
テルイミド、ポリベンゾイミダゾール等が挙げられる。

【００１９】半合成樹脂の代表例としては、ジアセテー
ト、トリアセテート、キトサン等のセルロース系誘導体
が挙げられる。天然高分子の代表例としては、セルロー
ス、でんぷん、キチン、コラーゲン等が挙げられる。本
発明に用いるフィルムの厚みは、特に規定されるもので
はないが、好ましくは０．１μｍから１０００μｍであ
る。

【００２０】本発明に用いるフィルムは、特にその形態
が規定されるものではない。例えば、平滑な表面を有す
るものでもよく、多孔質膜又は多孔質表面を有するもの
でもよく、不織布等でもよい。この場合、核酸の固定化
領域としてフィルム表面、フィルム内部又はフィルム内
部の空隙等を利用することも可能である。本発明に用い
るフィルムは、無処理の状態でそのまま用いてもよい
が、必要に応じて、反応性官能基を導入したフィルムで
あってもよく、また、プラズマ処理やγ線、電子線など
の放射線処理を施したフィルムであってもよい。

【００２１】核酸をフィルムに直接固定化する場合に
は、例えばフィルムと核酸との間における各種化学的又
は物理的な相互作用、すなわちフィルムが有している官
能基と、核酸のヌクレオチドを構成する成分との間の化
学的又は物理的な相互作用を利用することができる。

【００２２】例えば、無修飾の核酸をフィルムに固定化
する場合には、核酸とフィルムとを作用させた後、ベー
キングや紫外線照射により固定できる。また、アミノ基
で修飾された核酸をフィルムに固定化する場合には、グ
ルタルアルデヒドや１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド(EDC)等の架橋剤を用い
てフィルムの官能基と結合させることができる。核酸を
含む試料をフィルムに作用させる際の温度は、５℃〜９
５℃が好ましく、１５℃〜６０℃が更に好ましい。処理
時間は通常５分〜２４時間であり、１時間以上が好まし
い。

【００２３】上述の方法により得られた核酸固定化フィ
ルムは、適当な化学的又は物理的処理をすることができ
る。例えば、熱処理、アルカリ処理、界面活性剤処理な
どを行うことにより、固定化された核酸を変成させる。
あるいは、細胞、菌体などの生材料から得られた核酸を
使用する場合は、不要な細胞成分などを除去する。そし
て、処理後のフィルムを核酸を検出する材料として用い
ることができる。なお、これらの処理は別々に実施して
もよく、同時に実施してもよい。また、核酸を含む試料
をフィルムに固定化する前に適宜実施してもよい。

【００２４】上記の通り調製された核酸固定化フィルム
（Ｆ）（図１）は、本発明の核酸固定化フィルム積層体
（Ａ）を構成する基本単位とすることができる。そし
て、これらの核酸固定化フィルム（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３，
・・・・Ｆｎ）を順次積層して、核酸固定化フィルムの
積層体（Ａ）となすことができる（図２）。この際、積
層するフィルムの層数は特に限定されるものではない
が、通常は、1枚のフィルムの厚さに応じて１０〜１,０
００層となるように積層することが好ましい。各核酸固
定化フィルム（Ｆ）の各々のフィルムに固定化されてい
る核酸の種類は、それぞれ異なる種類の核酸とすること
が可能であり、また、同一の核酸が固定化されたフィル
ムを任意の層数に積層させることも可能である。

【００２５】フィルムの積層方法は、特に限定されるも
のではなく、一般的に知られる積層方法、たとえばラミ
ネート加工法により接着することができる。ラミネート
加工法としては、ホットメルトラミネート、ドライラミ
ネート、ウェットラミネート等が挙げられる。ホットラ
ミネートに用いられる接着剤としては低分子量ポリエチ
レン−酢酸ビニル共重合体、パラフィンワックス、エチ
レン−アクリル酸エステル共重合体などが使用され、こ
れらを加熱溶融して塗布した後直ちに圧着し積層するこ
とができる。

【００２６】ドライラミネートに用いられる接着剤とし
ては、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデンなどの
ビニル系樹脂、ニトロセルロース、エチルセルロースな
どのセルロース系樹脂、エポキシ系樹脂、ゴム系樹脂な
どが挙げられ、これらの溶液をフィルムにコーティング
した後乾燥し、その後加圧または、加熱加圧して圧着
し、積層することができる。ウェットラミネートに用い
られる接着剤としては例えばカゼイン、グルテン、ゼラ
チン、デキストリン、澱粉等の水溶性の接着剤や、ポリ
塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルブチラール、
酢酸ビニル−アクリル酸エステルの共重合体等のエマル
ション、合成ゴムラテックス等が挙げられ、これらを塗
布した後直ちに圧着し、乾燥して積層することができ
る。

【００２７】上記の通り調整された核酸固定化フィルム
の積層体（Ａ）を、図３に示すごとくフィルムの厚さ方
向、好ましくはフィルム積層平面に対して垂直な平面方
向に切断することにより、図４に示すような核酸固定化
フィルム積層体断面を有する薄片（Ｓ）を得ることがで
きる。この際の切断方法としては、例えば、ミクロトー
ムを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙げられ
る。薄片の厚みは任意に調整することができるが、通常
０．１〜１０００μｍである。核酸固定化フィルムの積
層体（Ａ１，Ａ２，Ａ３，・・・Ａｎ）を切断すること
により得られた核酸固定化フィルム断面を有する薄片
（Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，・・・・Ｓｎ）は、その断面を接
合面として順次積層することで、図５に示す核酸固定化
フィルム断面を有する薄片の積層体（Ｂ）を得ることが
できる。この際、積層する薄片の層数は特に限定される
ものではないが、通常は、１０〜１,０００層となるよ
うに積層することが好ましく、積層体の厚さ方向に１ｃ
ｍあたり１０層以上の薄片（Ｓ）を含むものが好まし
い。各薄片（Ｓ）は、各々異なる核酸固定化フィルムの
積層体（Ａ）から得られたものでも、同一の核酸固定化
フィルムの積層体（Ａ）から得られたものでもよい。核
酸固定化フィルム断面の積層体（Ｂ）中の各々の核酸固
定化フィルム（Ｆ）に固定化されている核酸の種類は、
それぞれ異なる種類の核酸とすることが可能である。ま
た、同一の核酸が固定化された核酸固定化フィルム
（Ｆ）は任意の数を含むこともできる。即ち、本発明に
よれば、固定化された核酸の種類と配列の順序に関して
は、目的に応じて任意に設定することが可能である。

【００２８】この場合に、フィルムに固定化された核酸
の種類があらかじめ決められた状態で積層することが望
ましいが、必ずしもそのように積層させる必要はない。
その理由は、積層体を形成する段階ではフィルムに固定
化した核酸の種類が不明でも、積層体の断面を切断した
後、一旦ハイブリダイゼーション手法等を用いて断面に
おける核酸の種類と配置位置を決定することにより、特
定の核酸が固定されたフィルムの位置を確認することが
できるためである。従って、この手法を用いて、一度、
薄片内に配置された複数種類の核酸の種類と位置を決定
しておけば、同一配列体から得られる薄片はすべて同一
の位置配置であるので、同一配列体から得られるすべて
の薄片の核酸の位置配置がわかる。

【００２９】本発明においては、上記の通り調整された
核酸固定化フィルム断面を有する薄片の積層体（Ｂ）
を、図６に示すごとく薄片の厚さ方向、好ましくは薄片
積層平面に対して垂直な平面方向に切断することによ
り、図７に示す核酸固定化フィルム断面を有する薄片
（Ｐ）を得ることができる。

【００３０】この際の切断方法としては、例えば、ミク
ロトームを用いて配列体から薄片を切り出す方法等が挙
げられる。薄片の厚みは任意に調整することができる
が、通常１〜５,０００μｍ、好ましくは１０〜２,００
０μｍである。

【００３１】得られた核酸固定化フィルム断面を有する
薄片（Ｐ）には、該配列体を構成する核酸固定化フィル
ム（Ｆ）の数に応じた核酸が存在する。薄片の断面積あ
たりの核酸の数に関しては、用いる核酸固定化フィルム
の厚さ又は固定化方法等を適宜選択することにより、薄
片断面積１ｃｍ²あたり１００以上、更には１０００以
上の核酸が固定化された薄片を作製することも可能であ
る。

【００３２】これら薄片（Ｓ）及び（Ｐ）は、固定化さ
れた核酸をプローブとして、検体と反応させてハイブリ
ダイゼーションを行うことにより、検体中の特定の塩基
配列を有する核酸の検出に用いることができる。本発明
で言うプローブとは、狭義には検出すべき遺伝子の塩基
配列と少なくとも一部が相補的な塩基配列を有する核酸
を指す。即ち、本発明の核酸固定化フィルム２次元積層
体断面を有する薄片を検体と反応させてハイブリダイゼ
ーションを行い、プローブと相補的な検体中に存在する
核酸とのハイブリッドを形成させ、このハイブリッドを
検出することにより、目的とする塩基配列を有する検体
中の核酸を検出することができる。

【００３３】また、本発明で言うプローブとは、広義に
は検体中に存在するタンパク質や低分子化合物等と特異
的に結合することができる核酸を指す。従って、これら
の薄片の利用法としては、固定化された核酸（プロー
ブ）とハイブリッドを形成する核酸を検出するための利
用に留まらず、固定化された核酸と特異的に結合するタ
ンパク質や低分子化合物等の各種試料（例えば生体成分
等）を検出するための利用が挙げられる。

【００３４】固定化された核酸とハイブリッドを形成す
る核酸や、固定化された核酸と特異的に結合する各種生
体成分の検出には、公知の手段を用いることができる。
例えば、検体中の核酸、タンパク質又は低分子化合物等
に、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの標
識体を作用させ、この標識体を検出することができる。
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、
何ら制限されることはなく、従来公知の各種手段を用い
ることができる。

【００３５】

【実施例】本発明を以下の実施例によって更に詳細に説
明する。但し、本発明はこれら実施例によりその技術的
範囲が限定されるものではない。 〔参考例１〕オリゴヌクレオチド及び5'末端にアミノ基
を有するオリゴヌクレオチドの調製：以下に示したオリ
ゴヌクレオチド（プローブＡ、プローブＢ）を合成し
た。

【００３６】プローブＡ: GCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCG
AGGGCTC（配列番号１） プローブＢ: GATGAGGTGGAGGTCAGGGTTTGGGACAGCAG（配
列番号２） オリゴヌクレオチドの合成はＰＥバイオシステムズ社の
自動合成機DNA/RNA synthesizer (model394)を用いて行
い、一般的手法により、脱保護及び精製して使用した。
また、ＤＮＡ合成の最終ステップでアミノリンクII（商
標名）（アプライドバイオシステム社）を用いてそれぞ
れのオリゴヌクレオチドの５'未端にＮＨ₂（ＣＨ₂）₆−
を導入しアミノ化したプローブも調製した。

【００３７】〔実施例１〕 核酸固定化フィルムの作製
（１）：ナイロンフィルム（日本ポール株式会社製 バ
イオダインＡ）に対し、参考例１において作製した未修
飾のオリゴヌクレオチド（プローブＡ及びＢ）をそれぞ
れ、以下の方法により固定化した。参考例１において作
製したオリゴヌクレオチドの水溶液（核酸濃度１０μｇ
／ｍｌ）を、ナイロンフィルム片面に塗布し、空気中で
乾燥後、８０℃で１時間ベーキングを行いオリゴヌクレ
オチドＡが固定化されたフィルム（Ｆａ）及びオリゴヌ
クレオチドＢが固定化されたフィルム（Ｆｂ）を得た。

【００３８】〔実施例２〕核酸固定化フィルムの作製
（２）:セルロースアセテートフィルム（アドバンテッ
ク製、厚さ１２５μｍ）に対し、参考例１において作製
したアミノ基を有するオリゴヌクレオチド（プローブＡ
及びＢ）をそれぞれ、以下の方法により固定化した。1
gの臭化シアンを2 mlのジメチルホルムアミドに溶解し
た。２cm×20cmのセルロースアセテートフィルムを含む
水溶液に添加し、15〜20℃で10〜20分放置した。pHは５
mol/l水酸化ナトリウム添加により10.5〜11.5に維持し
た。反応後、約15倍量の冷水で洗浄し、最後に１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。

【００３９】こうして活性化されたセルロースアセテー
トフィルムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
に、参考例１において作製したアミノ基を有するオリゴ
ヌクレオチド（0.1〜30 mM）を加え、20℃で終夜放置し
た。反応終了後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１Ｍ塩化カリ
ウム溶液、水で順次洗浄し、オリゴヌクレオチドが固定
化されたフィルム（Ｆａ’）及びオリゴヌクレオチドＢ
が固定化されたフィルム（Ｆｂ’）を得た。

【００４０】〔実施例3〕核酸固定化フィルム積層断面
を有する薄片（Ｓ）の作製（１） 実施例１で得た、オリゴヌクレオチドＡが固定化された
フィルム（Ｆａ）の非固定化面に、ポリ酢酸ビニルの酢
酸エチル溶液（固形分２％）を乾燥膜厚２μｍになるよ
う塗布し、室温で乾燥した。ついで、上記フィルム（Ｆ
ａ）の非固定化面に実施例１で得られた、オリゴヌクレ
オチドＢが固定化されたフィルム（Ｆｂ）の固定化面を
接着した。同様な操作を繰り返すことで、積層数２０層
の図２に示す核酸固定化フィルムの積層体（Ａ）を得
た。

【００４１】得られた核酸固定化フィルムの積層体
（Ａ）を、図３に示すごとくフィルムに垂直方向にミク
ロトームを用いて１００μｍの厚さに切り出すことによ
り、図４に示す核酸固定化フィルム積層体断面を有する
薄片（Ｓ）を得た。実施例２で得られたプローブＡまた
はプローブＢが固定化されたセルロースアセテートフィ
ルムについても同様の操作により核酸固定化フィルム積
層体断面を有する薄片（Ｓ’）を得た。

【００４２】〔実施例４〕核酸固定化フィルム断面の積
層体（Ｂ）の作製 実施例３で得られた核酸固定化フィルム積層体断面を有
する薄片（Ｓ）を、得られた断面を接合面として実施例
３と同様にポリ酢酸ビニルを介して順次積層し、積層数
２０層の図に示す核酸固定化フィルム断面の積層体
（Ｂ）を得た（図５）。実施例３で得られた核酸固定化
フィルム積層体断面を有する薄片（Ｓ’）についても同
様の操作により核酸固定化フィルム断面の積層体
（Ｂ’）を得た。

【００４３】〔実施例５〕核酸固定化フィルム断面の積
層体の薄片（Ｐ）の作製：実施例４で得られた核酸固定
化フィルム断面の積層体（Ｂ）を、図６に示すごとくミ
クロトームを用いて１００μｍの厚さに切り出すことに
より、縦横各々２０個 計４００個の核酸固定化フィル
ムが規則的に正方に配列された核酸固定化フィルム断面
の積層体の薄片（Ｐ）を得た（図７）。さらに、実施例
４で得られた核酸固定化フィルム断面の積層体（Ｂ’）
より、核酸固定化フィルム断面の積層体の薄片（Ｐ’）
を得た。

【００４４】〔参考例２〕試料核酸の標識：試料核酸の
モデルとして、参考例４で合成したオリゴヌクレオチド
（プローブＡ、プローブＢ）の配列の一部に相補的なオ
リゴヌクレオチド（Ｃ、Ｄ）を合成した。 オリゴヌクレオチドＣ： GAGCCCTCGCTCGTACAGCAAGGTTTC
G（配列番号３） オリゴヌクレオチドＤ： CTGCTGTCCCAAACCCTGACCTCCACC
（配列番号４）

【００４５】これらのオリゴヌクレオチドの5'末端を、
参考例４と同様にしてアミノリンクII（商標名）（ＰＥ
バイオシステムズジャパン社）を用いてそれぞれのオリ
ゴヌクレオチドの５'未端にＮＨ₂（ＣＨ₂）₆−を導入し
た後、以下のようにしてディゴキシゲニン(DIG: Digoxi
genin、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)で標
識した。

【００４６】末端アミノ化されたオリゴヌクレオチドを
それぞれ100 mMホウ酸緩衝液(pH8.5)に終濃度2 mMにな
るように溶かした。等量のDigoxigenin-3-O-methylcarb
onyl-ε-aminocapronic acid-N-hydroxy-succinimide e
ster (26mg/mlジメチルホルムアミド溶液)を加え、室温
にて一晩静置した。

【００４７】量を100μlに調整し、2μlのグリコーゲン
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、10μl
の3M酢酸ナトリウム(pH5.2)、300μlの冷エタノールを加
え、15,000rpm 15分の遠心により沈殿を回収した。沈殿
に500μlの70%エタノールを加え15,000rpm 5分の遠心に
より沈殿を再びチューブの底に集めた。沈殿を風乾し、
100μlの10 mM Tris-HCl (pH7.5),1 mM EDTAに溶かし
た。こうして得られたDIG標識オリゴヌクレオチドを試
料核酸のモデルとして用いた。

【００４８】〔参考例３〕ハイブリダイゼーション：実
施例３で作製した核酸固定化フィルム積層体断面を有す
る薄片（Ｓ）及び（Ｓ’）、並びに実施例５で作製した
核酸固定化フィルム断面の積層体の薄片（Ｐ）及び
（Ｐ’）をハイブリダイゼーション用のバッグに入れ、
以下の組成からなるハイブリダイゼーション溶液を注ぎ
込み、４５℃で30分間プレハイブリダイゼーションを行
った。次に、参考例２で得られたＤＩＧ標識ＤＮＡを加
え、４５℃で１５時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。

【００４９】 ハイブリダイゼーション溶液組成： ─────────────────────────────────── 5xSSC(0.75M塩化ナトリウム、0.075Mクエン酸ナトリウム、pH7.0） 5% ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社） 0.1% N- ラウロイルザルコシンナトリウム 0.02% SDS（ラウリル硫酸ナトリウム） 50%ホルムアミド ───────────────────────────────────

【００５０】〔参考例４〕検出：ハイブリダイゼーショ
ン終了後、核酸固定化薄片を、あらかじめ保温しておい
た５０ｍｌの0.1 x SSC, 0.1% SDS溶液に移し、振盪し
ながら20分間の洗浄を４５℃で３回行った。下記組成の
DIG緩衝液１を加え、室温で振盪しながらSDSの除去を行
った。これを再度繰り返した後、下記組成のDIG緩衝液
２を加え１時間振盪した。緩衝液を除いた後、DIG緩衝
液２に10000分の１量の抗DIGアルカリフォスファターゼ
標識抗体溶液を加えた溶液１０mlを加え、30分間ゆっく
り振盪させることにより抗原抗体反応を行わせた。次に
0.2% Tween 20を含むDIG緩衝液１で15分間２回振盪する
ことにより洗浄し、引き続き下記組成の DIG緩衝液３に
３分間浸した。 DIG緩衝液３を除いた後、AMPPDを含むD
IG緩衝液３mlを加え、10分間平衡化した。

【００５１】水分をきり、新しいハイブリダイゼーショ
ン用バッグに移し、37℃で１時間おいた後、X線フィル
ム用のバインダーにX線フィルムとともに挟みフィルム
を感光させた。その結果、何れも、プローブＡが配置さ
れた場所には、オリゴヌクレオチドＣが結合し、プロー
ブＢが配置された場所には、オリゴヌクレオチドＤが結
合していることが確認された。

【００５２】DIG緩衝液１： 0.1 Mマレイン酸、0.15M塩
化ナトリウム(pH7.5) DIG緩衝液２： DIG緩衝液１に0.5%濃度でブロッキング
試薬を添加したもの DIG緩衝液３： 0.1 Mトリス−塩酸(pH9.5)、0.1 M塩化
ナトリウム、0.05M 塩化マグネシウム ブロッキング試薬 ： 抗DIGアルカリフォスファター
ゼ標識抗体溶液および AMPPDはDIG Detectionキット
（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)中の試薬
である。

【００５３】

【発明の効果】本発明により、核酸固定化フィルムの積
層体及びその薄片と核酸固定化フィルム断面の積層体及
びその薄片が提供される。本発明によれば、核酸が任意
に高密度且つ正確に二次元に配列された薄片を再現性よ
く効率的に得ることができる。この薄片を用いて、検体
中の核酸の種類および量を調べることができる。

【００５４】本発明を従来法と比較した利点、有用性と
しては、例えば、固定化プロセスをフィルム上で分離・
独立して行うことにより、鎖長によらず核酸の定量的固
定が可能となったこと、任意の厚みのフィルムを積層す
ることにより測定可能な形に高密度に再現よく配列化可
能となったこと、また、その結果得られる選られる三次
元構造体としての積層体から目的とする二次元配列体を
作製するため、従来法にはない薄片化プロセスが新たに
導入されたが、それに伴いスポッティング法のような誤
差の多い微量分注操作が不要となり、連続切片化を通し
た多量生産が可能となったこと等があげられる。

【００５５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> MITSUBISHI RAYON CO., LTD. <120> AN ARRAY OF A NUCLEIC ACID-FIXED FILM AND A SLICE OF THE ARRAY <130> P99-0240 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 1 gcgatcgaaa ccttgctgta cgagcgaggg ctc 33 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 2 gatgaggtgg aggtcagggt ttgggacagc ag 32 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 gagccctcgc tcgtacagca aggtttcg 28 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ctgctgtccc aaaccctgac ctccacc 27

【００５６】

【配列表フリーテキスト】

配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】核酸固定化フィルム（Ｆ）を示す図である。

【図２】核酸固定化フィルムの積層体（Ａ）を示す図で
ある。

【図３】核酸固定化フィルムの積層体（Ａ）の切断方法
の概念を示す図である。

【図４】核酸固定化フィルム積層体断面を有する薄片
（Ｓ）を示す図である。

【図５】核酸固定化フィルム断面の積層体（Ｂ）を示す
図である。

【図６】核酸固定化フィルム断面の積層体（Ｂ）を薄片
状に切断する切断方法の概念を示す図である。

【図７】核酸固定化フィルム断面の積層体の薄片（Ｐ）
を示す図である。

【図８】本発明の積層体及び薄片を作製するための概要
を示す図である。

【符号の説明】

１…核酸を固定化するフィルム, ２…核酸を固定化した
面，３…１層目の核酸固定化フィルムＦ１， ４…２層
目の核酸固定化フィルムＦ２,５…３層目の核酸固定化
フィルムＦ３, ６…n層目の核酸固定化フィルムＦｎ,７
…切断された核酸固定化フィルム積層体断面を有する薄
片（Ｓ）,８…１層目の核酸固定化フィルム積層体断面
を有する薄片（Ｓ１）,９…ｎ層目の核酸固定化フィル
ム積層体断面を有する薄片（Ｓｎ）,１０…切断された
核酸固定化フィルム断面の積層体の薄片（Ｐ）１１…フ
ィルム, １２…フィルム, １３…フィルム, １４…フィ
ルム,１５…フィルム, １６…フィルム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 村瀬 圭 広島県大竹市御幸町20番１号 三菱レイヨ ン株式会社中央技術研究所内 (72)発明者 湯 不二夫 神奈川県横浜市鶴見区大黒町10番１号 三 菱レイヨン株式会社化学品開発研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA09 HA11 HA13 HA14 4B029 AA07 AA21 AA23 BB20 CC03 CC11 FA15 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR38 QR55 QR56 QR84 QR85 QS34 QS35 QS39 QX02 4F100 AJ09A BA01 BA22 BA25 BA26 DE10 EJ32 JC00 JL02 YY00A

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 核酸が固定化された核酸固定化フィルム
   （Ｆ）を積層してなる、核酸固定化フィルムの積層体
   （Ａ）。
2. 【請求項２】 積層体（Ａ）が、１ｃｍあたり１０層以
   上の核酸固定化フィルム（Ｆ）を含むものである、請求
   項１記載の積層体（Ａ）。
3. 【請求項３】 固定化する核酸の種類が、核酸固定化フ
   ィルムの積層体（Ａ）を構成する各核酸固定化フィルム
   （Ｆ）の全部又は一部において異なるものである、請求
   項１または２に記載の積層体（Ａ）。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか1項に記載の積
   層体（Ａ）をフィルムの厚さ方向に切断してなる、核酸
   固定化フィルム断面を有する薄片（Ｓ）。
5. 【請求項５】 請求項４記載の薄片（Ｓ）の切断面を接
   合面として積層してなる、核酸固定化フィルム断面を有
   する薄片の積層体（Ｂ）。
6. 【請求項６】 積層体（Ｂ）が、１ｃｍあたり１０層以
   上の薄片（Ｓ）を含むものである、請求項５記載の積層
   体（Ｂ）。
7. 【請求項７】 固定化する核酸の種類が、積層体（Ａ）
   及び積層体（Ｂ）を構成する各核酸固定化フィルム
   （Ｆ）の全部又は一部において異なるものである、請求
   項５または６に記載の積層体（Ｂ）。
8. 【請求項８】 請求項５〜７のいずれか１項に記載の積
   層体（Ｂ）を薄片の厚さ方向に切断してなる、核酸固定
   化フィルム断面を有する薄片（Ｐ）。
9. 【請求項９】 薄片（Ｐ）が、１cm²あたり、１００以
   上の核酸固定化フィルム（Ｆ）の断面を含むものであ
   る、請求項８記載の薄片（Ｐ）。