CN101565710A - 3-甾酮-△1-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种3－甾酮－Δ¹－脱氢酶，通过构建各种表达载体并转化相关菌株，从而获得了多种工程菌株，包括无3－甾酮－Δ¹－脱氢酶活性或高3－甾酮－Δ¹－脱氢酶活性的菌株，采用这些工程菌可以有选择地制备雄甾－4－烯－3，17－二酮和9α－雄甾－4－烯－3，17－二酮或雄甾－1，4－二烯－3，17－二酮和3－酮－1，4－二烯类甾体化合物。上述这些工程菌株，可以大大提高甾体医药生产体系的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

3-甾酮-△1-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及3-甾酮-△¹-脱氢酶技术领域，特别是指一种3-甾酮-△¹-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用。

背景技术

甾体化合物(Steroids)又称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核，结构相似的化合物。其基本结构下图所示，由于类固醇母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。在动物体内，甾体是主要的内源性激素，由性器官和肾上腺皮质所分泌，与生殖、骨骼和大脑的发育、生物效应的调控以及稳态的维持密切相关。甾体药物多指甾体激素药物，例如肾上腺皮质激素、性激素、蛋白同化激素等；此外，甾体药物还具有许多非激素功能，例如抗病毒、治疗肿瘤疾病、降胆固醇、治疗冠心病、抗抑郁和保护神经等。因此甾体药物在临床上有着广泛的应用，是产量仅次于抗生素的第二大类药物。

3-甾酮-△¹-脱氢酶(3-ketosteroid-△¹-dehydrogenase)，即甾体化合物的C1，2位脱氢酶，在微生物中广泛存在，该酶催化3-酮-4-烯类甾体化合物的C1，2位脱氢反应，是催化降解甾体化合物母核的一步关键反应，可用于制备相应的3-酮-1，4-二烯类甾体化合物(如图1)，在甾体药物的制备中具有重要应用价值，与本发明相关的应用主要有以下两点：

①3-甾酮-△¹-脱氢酶催化甾体化合物的C1，2位脱氢是微生物降解甾醇的一步关键反应，在甾体医药工业应用中，与微生物降解甾醇制备雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)与雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)相关(如图2所示)。分枝杆菌是工业生产中降解甾醇(动植物甾醇、单纯甾醇或多甾醇混合物)制备AD与ADD的重要微生物。大多数分枝杆菌菌株降解甾醇会同时积累AD与ADD这两种产物，AD与ADD结构非常相似，仅在C1，2位差一双键，因此在工业生产中将这AD与ADD进行下游的分离是十分困难和昂贵的，因此降解甾醇同时积累AD与ADD的分枝杆菌在工业生产中是无法单独应用的。AD与ADD在C1，2位双键的差异是由微生物中的3-甾酮-△¹-脱氢酶导致的，其中ADD是AD经3-甾酮-△¹-脱氢酶催化C1，2脱氢的产物(图2所示)。解决分枝杆菌降解甾醇同时积累AD与ADD的必由途径是获得单独积累AD或ADD，方法主要有两种，其一是通过工艺法实现，其二是通过只产AD或ADD的菌种法实现：工艺法，可通过两步联合生物转化法实现ADD的单独生产(可参考专利CN 1639354A)；菌株法，主要工作原理是获得无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性或高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株，无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株可降解甾醇生成AD，高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株可降解甾醇生成ADD而无AD积累，获得这些菌株的方法有两个，其一可通过大量诱变筛选工作获得单独产AD或ADD的菌种，这方面有大量文献报道，其二可通过基因工程的方法，理性的对3-甾酮-△¹-脱氢酶进行改造，从而获得无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性或高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株，从而实现单产AD或ADD的基因工程菌株。

②甾体化合物的C1，2位双键是许多甾体药物的必需结构，尤其是具有抗炎活性的3-酮-4-烯类甾体药物在C1，2位导入双键后，能成倍地增加抗炎活性，因而3-甾酮-△¹-脱氢酶催化的反应在甾体药物的生产中占有极其重要的地位，是一步关键反应。具有3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的微生物可用于生产泼尼松龙、地塞米松、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮等甾体药物以及这些甾体药物的同系物。利用化学方法也可以对甾体化合物进行C1，2位脱氢反应，一般采用二氧化硒法，该方法常使产品中带有少量难以除尽的对人体有害的硒，采用化学法进行类固醇1-位脱氢收率低、毒性大、环境污染严重，而微生物转化法则是一个很理想的选择，但其仍有一些缺陷，例如转化效率不高或转化过程中有甾核降解等副反应发生等。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种3-甾酮-△¹-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用，工程菌包括无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性或高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株，采用这些工程菌可以有选择地制备雄甾-4-烯-3，17-二酮和9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和3-酮-1，4-二烯类甾体化合物，从而实现单产AD或ADD的目的，这些工程菌的应用，可以大大提高甾体医药生产过程中的的效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种3-甾酮-△¹-脱氢酶基因，其特点是，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。根据本发明的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因，可实现多种基因工程菌株的构建，包括无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性或高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株。

较佳地，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第807-2507位核苷酸序列具有70％以上的一致性、更优的是具有85％以上的一致性或与所述SEQ ID NO：1所示序列具有60％以上的一致性。SEQ ID NO：1所示序列的其余核苷酸序列含有该酶的调控元件与邻近基因片段。

较佳地，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列SEQ ID NO：2具有75％以上的一致性，更优是的具有89％以上的一致性。

SEQ ID NO：1的获得，是根据对Mycobacterium avium，Mycobacterium vanbaalenii，Mycobacterium gilvum、Mycobacterium smegmatis的全基因组测序信息的分析，找出注解为3-甾酮-△¹-脱氢酶的基因序列，通过同源性比较，根据高保守区设计兼并引物，对上述菌株进行克隆，在获得一克隆片段之后，随后通过染色体走读(Chromosome walking)或通过杂交法在上述菌株的基因文库进行筛选等工作，最终获得包含3-甾酮-△¹-脱氢酶基因、该酶基因的调控基因以及邻近基因的大片段核苷酸序列——SEQ ID NO：1。3-甾酮-△¹-脱氢酶的基因片段，也可通过cDNA反转录、分枝杆菌转座因子随机突变库的筛选获得，然后再通过上述的方法进一步获得SEQ ID NO：1全部或其中部分片段。此外，本发明提供的SEQ ID NO：1等3-甾酮-△¹-脱氢酶基因，除上述方法获得外，也可通过基因合成法实现。

按照上述工作方法，本领域的普通技术人员可以较容易地获得来自上述分枝杆菌的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因与其相邻基因的片段，SEQ ID NO：1远大于3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的核苷酸序列长度，由于3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的调控元件及相邻基因对上述基于3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的基因工程菌的构建有重要影响，因此本发明涵盖整个SEQ ID NO：1序列，但又不局限于SEQ ID NO：1的全长片段，经分析SEQ ID NO：1中的807-2507片段是编码3-甾酮-△¹-脱氢酶的基因，是本发明的核心基因序列，SEQ ID NO：1中包含807-2507的部分或全部的任一长度的基因片段均属本发明的范畴，此外，SEQ ID NO：1中的807-2507编码的3-甾酮-△¹-脱氢酶的氨基酸序列SEQ ID NO：2，也是本发明的核心。

现提供的SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2的编码序列，不应被视为是对本发明中的3-甾酮-△¹-脱氢酶的限定，由于测序、突变、或核苷酸多态性等原因，可能会出现一些错误或变异性，这是正常的变化，应视为本发明的范畴。根据本发明提供的SEQ ID NO：1与SEQID NO：2，本领域的普通技术人员可以容易地从分枝杆菌，特别是Mycobacterium sp.NRRLB-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacteriumgilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii、Mycobacterium neoaurum NwIB-01(保藏号CCTCC M 209094)等分枝杆菌中获得3-甾酮-△¹-脱氢酶基因或基因片段。对上述全基因组测序的分枝杆菌的基因数据的分析，我们发现Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii等分枝杆菌的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因与SEQ ID NO：1及其中的807-2507序列的一致性均在80％左右。SEQ ID NO：1中的807-2507编码3-甾酮-△¹-脱氢酶的阅读框共1701个碱基，编码566个氨基酸，按此3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的完整长度，在NCBI数据库中按Blastn与Blastx比对检索，除全基因组测序的分枝杆菌菌株中能发现其同源基因外，尚无其它序列一致性高于70％的同源基因的报道，因此本发明强调同SEQ ID NO：1的序列一致性在60％以上，与SEQ ID NO：1中807-2507的序列一致性在70％以上，更优的是一致性在85％以上，以及与SEQ ID NO：2的序列一致性在75％以上，更优的是一致性在89％以上的酶基因均视为与本发明提供的是同一种3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。

上述序列的一致性数据是通过Clustal W1.8软件进行基因序列两两比对分析获得的(Thompson JD，et al.Nucleic Acids Res.1994，22：4673-4680)，其中应用参数为本领域技术人员常用的设置。

较佳地，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶基因来源于分枝杆菌属微生物。

更佳地，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。

更进一步地，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacteriumvanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

更进一步地，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。尤其是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacteriumneoaurum ATCC 25795、Mycobacterium neoaurum NwIB-01(保藏号CCTCC M 209094)。

在本发明的另一方面，提供了一种3-甾酮-△¹-脱氢酶，其特点是，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

较佳地，所述3-甾酮-△¹-脱氢酶与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性，更优的是89％以上的一致性。

在本发明的另一方面，提供了一种基因工程表达载体，其特点是，所述表达载体整合有权利要求1所述的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。

较佳地，所述表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体。

更佳地，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

更进一步地，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体或pLMJ72链霉菌整合表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。所述pET系列质粒载体宿主菌为大肠杆菌BL21用热激方法导入，所述pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体宿主菌为变铅青链霉菌用原生质体转化方法导入，所述pLMJ72链霉菌整合表达载体和pFZ36分枝杆菌整合载体利用电转化方法导入。

可以理解，通过基因操作可以实现3-甾酮-△¹-脱氢酶在多种微生物中的表达。在本发明的另一方面，提供了一种基因工程表达菌株，其特点是，所述基因工程表达菌株含有上述的细菌表达载体或者整合有上述的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。所述基因工程表达菌株能降解甾醇从而生产ADD而不积累AD，或可对3-酮-4-烯类甾体化合物进行C1，2位脱氢从而生产3-酮-1，4-二烯类甾体化合物。

较佳地，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体，相应地，所述基因工程表达菌株是大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

更佳地，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体或pLMJ72链霉菌整合表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，相应地，所述大肠杆菌是BL21菌株，所述链霉菌是变铅青链霉菌Streptomyces lividans，所述分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、MycobacteriumPhlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

3-甾酮-△¹-脱氢酶在分枝杆菌中可以通过表达性重组载体进行表达，所用重组基因工程载体为低拷贝型或高拷贝型的分枝杆菌基因表达载体；3-甾酮-△¹-脱氢酶在分枝杆菌中可以是整合在染色体上进行表达的，通过靶向、无标记的方式进行整合，3-甾酮-△¹-脱氢酶基因在染色体上是单拷贝或多拷贝整合的。

在本发明的另一方面，提供了上述的基因工程表达菌株在降解甾醇制备雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)中的应用。

在本发明的另一方面，提供了上述的基因工程表达菌株在对3-酮-4-烯类甾体化合物进行△¹-脱氢反应制备3-酮-1，4-二烯类甾体化合物中的应用。

在本发明的另一方面，提供了一种分枝杆菌基因工程突变菌株，其特点是，通过突变上述的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因，并通过同源重组构建获得。即通过基因操作实现3-甾酮-△¹-脱氢酶功能的失活，失活可以是活性完全丧失或部分丧失，来构建无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的分枝杆菌基因工程菌株，其通过对3-甾酮-△¹-脱氢酶基因进行靶向性的、无标记性的基因工程操作实现。该无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的分枝杆菌基因工程菌株能降解甾醇从而生产AD而不积累ADD。

较佳地，所述突变是缺失或点突变所述3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。可对SEQ ID NO：1的任一部分与任一长度的基因片段进行缺失或对SEQ ID NO：2中任一位点进行点突变。

具体的讲基因缺失：是通过分枝杆菌的打靶载体，通过同源双交换实现的，首先要确定SEQ ID NO：1中要缺失的片段，克隆该片段两翼的合适长度的基因片段，经连接后，插入打靶载体的合适位点，随后把打靶载体导入分枝杆菌中，最后经过一定的筛选程序筛选获得基因缺失突变子；本发明优先采用的是无标记基因同框缺失的方法，所用的载体是分枝杆菌自杀打靶质粒，该类型的基因缺失载体是分枝杆菌分子生物学中常用的工具。具体的讲点突变：是在体外实现SEQ ID NO：1中所需位点的突变，然后通过分枝杆菌的打靶载体，经同源双交换实现的，首先确定SEQ ID NO：1中要突变的一个或几个位点，克隆一定长度含有该位点的基因片段，在体外通过PCR、基因合成等方法实现位点的突变，随后插入打靶载体的合适位点，把打靶载体导入分枝杆菌中，使突变的基因序列与原始基因序列发生同源交换，最后经过一定的筛选程序筛选获得突变子。

在本发明的另一方面，提供了上述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备雄甾-4-烯-3，17-二酮中(AD)的应用。

在本发明的另一方面，提供了上述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮中(9α-OH-AD)的应用。

因此，上述构建成功的分枝杆菌基因工程菌株，主要应用于降解甾醇制备AD、ADD与它们的衍生物，其生产工艺一般而言包括：在适当的培养基中培养生长旺盛的种子，而后将培养物转入含有甾醇、培养基或缓冲液的生物反应器中，随后经过3-10天转化，生成AD和/或ADD。其中，培养基为通常分枝杆菌培养基，在菌种保存中心或大量有关分枝杆菌的文献报道中均有介绍，包括碳源、氮源、无机盐和缓冲系统等；其中甾醇的添加，需要利用有溶剂、表面活性剂、油脂类物质和环糊精等作为助溶剂，这可参考大量相关文献报道。

表达高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的分枝杆菌基因工程菌株，也可用作甾体化合物的C1，2脱氢制备3-甾酮-1，4-二烯甾体化合物，其生产工艺包括：在适当的培养基中培养生长旺盛的种子，而后将培养物转入含有3-甾酮-4-烯甾体化合物、培养基或缓冲液的生物反应器中，随后经过1-5天转化，生成3-甾酮-1，4-二烯甾体化合物。其中，培养基同上；其中甾体化合物的添加同上。

表达高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的链霉菌基因工程菌株，主要应用于甾体化合物的C1，2脱氢制备3-甾酮-1，4-二烯甾体化合物，其生产工艺包括：在适当的培养基中培养生长旺盛的种子，而后将培养物转入含有3-甾酮-4-烯甾体化合物、培养基或缓冲液的生物反应器中，随后经过1-5天转化，生成3-甾酮-1，4-二烯甾体化合物。其中，培养基可用链霉菌常用培养基；其中甾体化合物的添加同上。

可理解，在上述应用中可以采用上述基因工程菌株的全细胞或粗酶液进行。

在本发明的另一方面，提供了一种新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，所述新金分枝杆菌的保藏编号是CCTCC M 209094。

较佳地，包括上述的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因。

综上，本发明提供了一种3-甾酮-△¹-脱氢酶基因，通过构建各种表达载体并转化相关菌株，从而获得多种菌株，包括无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性或高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株，采用这些工程菌可以有选择地制备雄甾-4-烯-3，17-二酮和9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和3-酮-1，4-二烯类甾体化合物，从而实现单产AD或ADD或相应衍生物的目的，可以大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为3-酮-4-烯类甾体化合物经C1，2位脱氢制备3-酮-1，4-二烯类甾体化合物的示意图。

图2为微生物降解甾醇制备AD与ADD反应式与关键酶示意图。

图3为本发明筛选的菌种转化底物后的薄层层析(TLC)图谱。其中泳道1是底物植物甾醇(灰色条带)，泳道2和3均是本发明筛选的菌种转化底物的产物，其中红色条带为产物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，绿色条带为雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)。

图4为扩增3-甾酮-△¹-脱氢酶基因保守序列时的核酸电泳图。其中泳道1～2是相同的PCR重复，泳道3是DNA标准marker。

图5为扩增3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的全序列M.S-KSDD电泳图。其中泳道1是DNA标准marker，泳道2～3是相同的PCR重复。

图6为载体pET-M.S-KSDD构建过程的酶切验证图谱。其中泳道1是DNA标准marker，泳道2是pET-M.S-KSDD重组质粒单酶切结果，泳道3是pET-M.S-KSDD经Nco I、Hind III双酶切结果。

图7为基因工程菌BL21/MS.KSDD的表达产物的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1是DNA标准marker，泳道2为0小时的全菌，泳道3为加IPTG诱导2小时后的全菌蛋白电泳图；泳道4为加IPTG诱导6小时后全菌蛋白；泳道5为加IPTG诱导12小时后全菌蛋白。

图8为构建3-甾酮-△¹-脱氢酶基因缺失的分枝杆菌基因工程菌株示意图。

图9为异源表达工程菌BL21/MS.KSDD转化AD生成ADD的高效液相色谱，其中随着时间的延长，ADD的生成逐渐变多。

图10为工程菌株转化植物甾醇的结果的高效液相色谱。

图11为工程菌株转化3-酮-4-烯类甾体化合物的结果(以ADD转化为AD为例)。

菌株Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏时间2009年4月28号，保藏地点是武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M 209094。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

本申请所采用的基因操作技术主要有：基因表达技术与无标记酶功能失活技术。基因表达技术，主要有：非染色体整合式的低拷贝表达质粒或高拷贝表达质粒的表达方式；染色体整合式的单拷贝3-甾酮-△¹-脱氢酶基因或多拷贝3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的表达方式。无标记酶功能失活技术，主要有：无抗性标记的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因同框缺失方式；无抗性标记的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的点突变失活方式。

在本发明的实施例中使用的大肠杆菌BL21、JM109、DH5a、TOP10、及pET22、pET28、pET32载体均购自Novagen公司，引物均由大连宝生物(Takara)公司合成。

本发明所指甾体化合物为3-醇-5-烯甾体和3-酮-4-烯甾体，仅以一类3-醇-5-烯甾体化合物——“甾醇”为例，甾醇又分为胆固醇、麦角甾醇和植物甾醇等，植物甾醇较为常用，植物甾醇为甾醇混合物由谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇等多种甾醇组成，多来自于油脂脱臭馏出物、制浆造纸业的塔罗油等工业副产品。

实施例1  Mycobacterium neoaurum NwIB-01(保藏号CCTCC M 209094)对甾体化合物的转化

以植物甾醇为唯一碳源，从活性污泥中分离出一株可降解甾醇的微生物，经过亚硝基胍及紫外光等化学与物理诱变等工作，发明人自行筛选了一株具有良好生产性状的突变株，该菌株可降解转化甾醇的生成AD与ADD，经过菌种鉴定确定该微生物菌株为新金分枝杆菌，命名为Mycobacterium neoaurum NwIB-01，该菌于2009年4月28号保存于武汉中国典型培养物保藏中心(保藏号CCTCC M 209094)。

利用1％-10％的表面活性剂、聚合物或有机溶剂(例Tween80、乙醇、硅油、豆油等等)等物质对甾体化合物进行助溶。采用两级或三级培养，以1％-50％的种子接种最终的转化培养基，甾体化合物可以在任一时间进行投加。甾体转化的条件是：培养温度25-37℃，高溶氧值，pH可控在5.0-8.0之间，以薄层层析(TLC)或高效液相色谱(HPLC)分析确定转化反应的结束时间。反应结束后，甾体转化物可用同体积的乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂萃取三次，合并反应液，真空干燥，进而进行分析与产品制备。

图2为一个分枝杆菌转化植物甾醇的例子，该例子的实验条件如下。采用1％-10％的Tween80和硅油为助溶剂，在装样量为30毫升的250毫升摇瓶中采用两级培养，其中以3-30％的种子量接种含有0.5-3％植物甾醇的二级培养基，在26-35℃，200-300rpm，pH5.0-8.0之间的条件下进行培养，经3-7天，甾醇转化率高于95％，生成ADD与AD，产物累积量为投料量的80-95％(摩尔比)，ADD与AD之比约为5∶1至10∶1。

图3为薄层层析(TLC)图，其制备条件为：展开剂采用石油醚∶乙酸乙酯(6∶4至7∶3)；薄板采用烟台硅胶厂出品的5×10cm的预制板；显色，采用20％的硫酸溶液均匀喷淋，并于100℃烘箱内烘烤5min至显出斑点。其中灰色条带为底物植物甾醇(图3的1泳道)，红色条带为产物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)，绿色产物为雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)(分别为图3的2与3泳道)。

实施例2  3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的获得、分子鉴定及在大肠杆菌中的异源表达

本实施例仅以PCR方法为例，从分枝杆菌Mycobacterium neoaurum NwIB-01中克隆3-甾酮-△¹-脱氢酶的SEQ ID NO：1序列。

2.1、3-甾酮-△¹-脱氢酶基因保守序列的获得(见图4)

通过对已知分枝杆菌3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的分析，选择了三株分枝杆菌的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因进行基因同源比对(数据来源于NCBI，序列号见后)：

Mycobacterium avium 104(gb|CP000479.1|)；

Mycobacterium vanbaalenii PYR-1(gb|CP000511.1|)；

Mycobacterium smegmatis str.MC2 155(gb|CP000480.1|)；

在得到分枝杆菌中3-甾酮-△¹-脱氢酶保守序列的相关信息之后，利用软件Oligo 6.0及Primer 5.0设计兼并引物，利用降落及热不均衡PCR扩增分枝杆菌Mycobacteriumneoaurum NwIB-01的部分序列。

PCR引物为KSDD-1和KSDD-2(KSDD-1：5’-GTGTTCTACATGACTGMYCAGGAG-3’；KSDD-2：5’-TGCGGATYCCGCCCTTG-3’)。以Mycobacterium neoaurum NwIB-01的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所用PCR反应体系如下：取适量的模板DNA 2μL，10×PCR Buffer 2μL，25mM MgCl₂1.6μL，2.5mM dNTP 1.6μL，引物(20μmol/L)各1μL，Taq DNA聚合酶1U，补水至总体积20μL。所用PCR反应程序如下：94℃1分钟，50℃30秒，72℃2分钟，30个循环。

通过NCBI Blastn比对，通过上述方法获得的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的保守序列，与Mycobacterium gilvumPYR-GCK延胡索酸脱氢酶/琥珀酸盐脱氢酶基因(GenbankCP000656)有84％的同源性、与Mycobacterium smegmatis str.MC2155的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因(Genbank CP000480)有83％的同源性、与Mycobacterium vanbaalenii PYR-1延胡索酸脱氢酶/琥珀酸盐脱氢酶有82％的同源性、与Mycobacterium avium 104的甾体一位脱氢酶基因(Genbank CP000479)有79％同源性。由此判断该DNA片段是一3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的部分序列。

2.2、全长3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的获得

将Mycobacterium neoaurum NwIB-01基因组总DNA分别用粘性末端限制性内切酶Sau3AI、EcoRI、HindIII和PstI消化后纯化回收，在T4DNA Ligase作用下与相应步行接头Sau3AI Cassette、EcoRI Cassette、HindIII Cassette和PstI Cassette连接得到步行文库。

为了提高PCR特异性，使用巢式PCR方法：

设计引物如下：

C1：5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’

C2：5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’

F1：5’-GTGTCTTTGACGTAGTGGTGGTAGGGAGC-3’

F2：5’-CGGAGATGTTGTCGTTCGTGCTGAA-3’

实验步骤如下：

第一步，用C1和F1做引物，以1μl相应的步行文库做模板进行PCR，具体条件为：10循环：(94℃，30秒；65℃，30秒；72℃，2分钟)+20循环：(94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，2分钟)；

第二步，以第一步的PCR产物做模板，以C2和F2做引物，进行第二轮PCR，具体条件为：10循环：(94℃，30秒；72℃，2分钟)+20循环：(95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，2分钟)。最终，PCR产物经胶回收，连接pMD19-T载体测序。

通过测序，得到了来源于Mycobacterium neoaurum NwIB-01的基因片段，该片段包含3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的全序列(SEQ ID NO：1中的807-2507片段)以及该基因前后一些相邻基因的片段，通过比对3-甾酮-△¹-脱氢酶基因和Mycobacterium smegmatis str.MC2155(Genbank CP000480)的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的一致辞性达到82％，与Mycobacterium avium 104的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因的(Genbank CP000479)一致性达到76％。

2.3、3-甾酮-△¹-脱氢酶基因在大肠杆菌中的异源表达

根据MS-KSDD全长基因序列，设计并合成扩增引物KSH-Q和KSH-H，其序列如下所示：

KSDD-Q：5’-GTACGAATTCGTGTTCTACATGACTG-3’；

KSDD-H：5’-GATTAAGCTTTCAGGCCTTTCCAG-3’。

其中，在引物KSDD-Q上引入EcoRI酶切位点，在引物KSDD-H上引入Hind III酶切位点。

以所筛选的野生菌株总DNA为模板，以引物KSH-Q和KSH-H为引物对，进行PCR扩增，具体条件如下：

反应体系：Tag酶1μl，缓冲液5μl，模板1μl，dNTP 4μl，上下游引物各1μl，纯水33μl。

反应过程：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃120s，30个循环；72℃10min。

将PCR产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图5所示，根据图5结果，回收大小约1700bp的片段。

回收片段经EcoRI、Hind III双酶切，目的DNA片段回收纯化后，与同样经限制性内切酶酶切过的质粒pET-22b(+)(约5.5kb)在T4DNA连接酶的作用下，16℃连接，筛选，得到重组质粒pET-MS.KSDD。双酶切验证所得的重组质粒，见图6。将其测序，测序结果显示，克隆入的3-甾酮-△1-脱氢酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。按常规方法将质粒转化大肠杆菌BL21，获得生产3-甾酮-△1-脱氢酶的基因工程菌BL21/MS.KSDD。

从转化平板上任意挑取BL21/MS.KSDD菌落，接入2mL含有75μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃培养至对数生长期后，加入IPTG至终浓度1mmol/L，在诱导的不同时间，离心收集菌体，超声破菌，离心收集上清，SDS-PAGE电泳，结果如图7所示。根据图7结果，MS.KSDD蛋白表达量较高，在约60kDa处看到清晰条带，与预期的3-甾酮-△1-脱氢酶大小吻合。

实施例3  3-甾酮-△¹-脱氢酶基因缺失的分枝杆菌基因工程菌株的构建方法

构建分枝杆菌基因缺失质粒，该质粒经电转化进入分枝杆菌。利用卡纳青霉素及潮霉素进行双抗筛选，然后利用蔗糖平板进行复筛，得到基因敲除克隆子。利用PCR方法对上述克隆子进行验证。基因缺失双交换如图6所示，最终基因缺失菌种命名为NwIB-201。这里要说明的是，这里获得的NwIB-201是对NwIB-909菌株进行3-甾酮-△¹-脱氢酶基因缺失获得的，NwIB-909是NwIB-01的衍生菌株，该菌株缺乏甾核降解的关键酶——3-甾酮-9α-羟基化酶的活性，因而不能降解甾体母核。

具体步骤如下：

1.敲除质粒构建：根据分枝杆菌Mycobacterium neoaurum NwIB-01序列设计敲除上下游引物。QC-ksdd-uu CGCCTGCAGTCCGCCGGATTCAAAATGATGATC

QC-ksdd-ud CCGAAGCTTTGGGCAGTCATGTAGAACACGTTATAG

QC-ksdd-du CCGAAGCTTGACCTGGGCACCAAGGGCGGTATT

QC-ksdd-dd CGCGGATCCCACCCCCGAGAGCACCACGGTGTT

分别将目标基因3-甾酮-△¹-脱氢酶的上下游基因克隆到pMD19-T载体上，然后分别用PstI、HindIII，HindIII、BamI酶切，酶切产物分别连接在经相应酶切的分枝杆菌基因敲除质粒pIL上。分别用PacI酶切上述质粒和pGOAL19质粒后进行非定向连接，构建基因敲除质粒MS-QCKSDD。

2.敲除质粒导入：分支杆菌感受态制备：一级种子OD长到1.0左右，1％转接二级种子；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入1ml甘油悬浮菌体，并分装保存。电转化：10μl质粒加入300μl感受态菌体中放置10min，电击条件如下12.5kv/cm、25μF、20ms。

3.重组子筛选：电转产物加入培养基恢复培养3-24h，涂布培养基成分如下hyg50μg/ml、Kn 20μg/ml、X-gal 50μg/ml。经SCO单交换菌挑取：挑取带蓝斑菌落，pcr验证和DSO双交换菌挑取：将验证好的SCO菌涂布含2％的蔗糖平板，挑取白色菌落。

实施例4  3-甾酮-△¹-脱氢酶基因点突变失活的分枝杆菌基因工程菌株的构建

根据得到的目标基因SEQ ID NO：1、及其翻译的蛋白序列，将其中数个碱基序列进行突变构建基因点突变失活菌种。最终基因敲除菌种命名为NwIB-202。这里要说明的是，这里获得的NwIB-202是对NwIB-909菌株进行3-甾酮-△¹-脱氢酶基因缺失获得的，NwIB-909是NwIB-01的衍生菌株，该菌株缺乏甾核降解的关键酶——3-甾酮-9α-羟基化酶的活性，因而不能降解甾体母核。

基因点突变按照重叠延伸PCR法进行。先分别用编码区上游引物与突变下游引物；突变上游引物与编码区下游引物进行第1次PCR。然后将纯化后的两管PCR产物混合，再用编码区上、下游引物进行第2次PCR。纯化PCR产物，直接克隆到pGEM-T easy质粒中进行测序。筛选需要的在特定位点突变的克隆子，构建质粒。

实施例5  3-甾酮-△¹-脱氢酶基因过表达

利用pAL5000及其衍生载体pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体将3-甾酮-△¹-脱氢酶基因重新导入分枝杆菌，以使原始分枝杆菌菌种中的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因过表达。最终基因过表达菌种命名为NwIB-203(单拷贝)、NwIB-204(多拷贝)。

所用引物序列如下：

U：CGGGGATCCGTGTTCTACATGACTGCCCAGGACTA

D：GGCAAGCTTTCAGGCCTTTCCAGCGAGATGCAAC

PCR反应体系退火条件经优化确定为55℃2min。从分枝杆菌中克隆出1.7kb的KSDD基因，经回收与载体pMD19-T连接，构建重组克隆质粒，测序验证。用限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切克隆载体，回收插入到经相同酶切的分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pAL5000或pFZ2中，构建重组质粒pAL5000-KSDD或pFZ2-KSDD，经序列测定证实含有KSDD基因，且基因序列和阅读框架正确。

电转重组质粒pAL5000-KSDD或pFZ2-KSDD进入分枝杆菌并用卡那霉素平板进行筛选。

实施例6  3-甾酮-△¹-脱氢酶基因整合表达的分枝杆菌基因工程菌株的构建

利用pFZ36分枝杆菌整合表达载体将3-甾酮-△¹-脱氢酶基因导入分枝杆菌整合。最终基因整合表达菌种命名为NwIB-205(单拷贝)、NwIB-206(多拷贝)。

所用引物序列如下：

U：GACGAATTCATGTTCTACATGACTGCCCAGGACT

D：CGCAAGCTTTCAGGCCTTTCCAGCGAGAT

整合质粒pFZ36构建、电转及筛选同上。PCR反应体系退火条件经优化确定为57℃2min，PCR产物克隆入质粒pMD19-T中，用限制性内切酶ECORI、HindIII双酶切克隆载体，回收插入到经相同酶切的分枝杆菌-大肠杆菌穿梭整合质粒pFZ36。

实施例7  3-甾酮-△¹-脱氢酶基因过表达及整合表达链霉菌基因工程菌株的构建

利用pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体将3-甾酮-△¹-脱氢酶基因重新导入链霉菌宿主菌，以使链霉菌宿主菌中的3-甾酮-△¹-脱氢酶基因过表达。宿主菌为变铅青链霉菌用原生质体转化方法导入。最终基因过表达菌种命名为NwIB-207(单拷贝)、NwIB-208(多拷贝)。

利用pLMJ72链霉菌整合表达载体将3-甾酮-△¹-脱氢酶基因导入链霉菌整合。最终基因整合表达菌种命名为NwIB-209(单拷贝)、NwIB-2010(多拷贝)。

所用引物序列如下：

U：CGCCATATGGTGTTCTACATGACTGCCCAGGACT

D：CGGAATTCTCAGGCCTTTCCAGCGAGATGCAAC

PCR反应体系退火条件经优化确定为56℃2min。从分枝杆菌中克隆出1.7kb的KSDD基因，经回收与载体pMD19-T连接，构建重组克隆质粒，测序验证。用限制性内切酶NdeI、EcoRI双酶切克隆载体，回收插入到经相同酶切的pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达质粒中，构建重组质粒pLMJ-KSDD，经序列测定证实含有KSDD基因，且基因序列和阅读框架正确。

利用原生质体转化方法将重组质粒pLMJ-KSDD导入链霉菌。整合质粒pLMJ72构建、电转及筛选同上。

链霉菌原生质体的制备：在250ml三角瓶中加入25ml链霉菌液体培养基然后加入一定量的孢子悬液及所需的生长因子后在200rpm摇床上培养36-40h离心收集菌丝体小心倒去上清液重新用10.3％蔗糖悬浮洗涤2次后离心倒去上清液打散，然后取适量的菌丝体加入到5ml缓冲液配制的溶菌酶溶液中溶菌酶终浓度2mg/ml，30℃温育15-60min。3000r/min离心10min去上清用手指弹动轻轻打散原生质体沉淀块后加入15ml P缓冲液洗涤3次离心及去上清。

实施例8  基因工程菌NwIB-201、NwIB-202、NwIB-203、NwIB-204、NwIB-205、与NwIB-206在甾醇降解制备AD或ADD的应用。

基因工程菌株的培养条件与甾体的转化条件，可参照实施例1。植物甾醇投料量为0.5-3％的条件下，转化时间为5-10天，这些工程菌株转化植物甾醇的结果如图10所示，植物甾醇转化率均在95％以上，产物积累量均为投料量的85％以上(按摩尔比计算)。其中NwIB-201的主要产物是AD且基本无ADD积累、NwIB-202的主产物也是AD但有小量ADD积累；NwIB-203、NwIB-204、NwIB-205与NwIB-206转化植物甾醇的主产物为ADD，其中NwIB-203、NwIB-204与NwIB-206基因不积累AD，NwIB-205有少量AD积累。

实施例9  基因工程菌NwIB-203、NwIB-204、NwIB-205、NwIB-206、NwIB-207、NwIB-208、NwIB-209与NwIB-2010在对3-酮-4-烯类甾体化合物进行△¹-脱氢反应制备3-酮-1，4-二烯类甾体化合物中的应用。

以AD脱氢制备ADD为例(如图11)。

基因工程菌NwIB-203、NwIB-204、NwIB-205、NwIB-206、NwIB-207、NwIB-208、NwIB-209与NwIB-2010均可转化AD制备ADD，图11以NwIB-209与NwIB-2010对AD的转化为例。基因工程菌株的培养条件与甾体的转化条件，可参照实施例1。底物AD的投料量为0.5-3％的条件下，转化时间为2-6天，这些工程菌株AD转化率均在98％以上。

综上所述，采用本发明的无3-甾酮-△¹-脱氢酶活性或高3-甾酮-△¹-脱氢酶活性的菌株可以有选择地制备雄甾-4-烯-3，17-二酮和9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮和3-酮-1，4-二烯类甾体化合物，从而实现单产AD或ADD的目的，可以大大提高类固醇药物的生产效率与产品品质，有助于降低类固醇药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，适合于大力推广应用，具有较高的经济效益和社会效益。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

序列表

<110>华东理工大学

<120>3-甾酮-△¹-脱氢酶基因、相关载体和工程菌及应用

<160>2

<210>1

<211>2779

<212>DNA

<213>新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)

<220>

<221>gene

<222>(807)..(2507)

<223>3-甾酮-△¹-脱氢酶基因

gcatccacag cccgcataca cgcacccggc aacacgatgt cccccgcacg cagacgcacc     60

ccgaactgat cgacctttgc gcgccaacca cgccaccgag gtcaccggat tacccaacac    120

cgcatcactg cgaccctcag cgaccacctc accattgcgt gtcaagacgg catcgatggc    180

ctttatatcg atgtccttgg gcgacacccg ttccgggccc agcacccacc ccgccgacga    240

cgcattatcg gcgatcgtgt cgcacaactt gatcttccag tccgtgatcc gggtatcgat    300

cagctcgatc gacggtgcga acgccgccgt ggcggccaac acatcatcct cggtacaccc    360

cgccccgggc agatcatcgg ccaagatgaa ccccacctca acctccaccc gcggatacaa    420

aaaccggccc gccgcaaccg gtttgtcctc gaacacctcc atatcagcga gcagatgacc    480

gtaatcaggc tcatcaaccc ccatcatctt ctgcatcgcc tccgaggaca gccccacctt    540

gtgcccgatc acccgcgcac cctcagccac ccgctgccga atattgatca actggatctc    600

gtaggcatcc accacatcga tatcgggata ccgatccgtc aacggagtgg tcggcacccg    660

actacgctcc gcctcggcca aatcagccgc gagcacctcg cgcacctcga cactgagcat    720

gttggtgaat tcccctcgta atctcatcag gccctcgacc ggcacagttg tgggcctgtt    780

gtcgaaaggc actgcaattc tataacgtgt tctacatgac tgcccaggac tacagtgtct    840

ttgacgtagt ggtggtaggg agcggtgctg ccggcatggt cgccgccctc accgccgctc    900

accagggact ctcgacagta gtcgttgaga aggctccgca ctatggcggt tccacggcgc    960

gatccggcgg cggcgtgtgg attccgaaca acgaggttct gcagcgtgac ggggtcaagg   1020

acacccccgc cgaggcacgc aaatacctgc acgccatcat cggcgatgtg gtgccggccg    1080

agaagatcga cacctacctg gaccgcagtc cggagatgtt gtcgttcgtg ctgaagaact    1140

cgccgctgaa gctgtgctgg gttcccggct actccgacta ctacccggag acgccgggcg    1200

gtaaggccac cggccgctcg gtcgagccca agccgttcaa tgccaagaag ctcggtcccg    1260

acgagaaggg cctcgaaccg ccgtacggca aggtgccgct gaacatggtg gtgctgcaac    1320

aggactatgt ccggctcaac cagctcaagc gtcacccgcg cggcgtgctg cgcagcatca    1380

aggcgggtgt gcggtcggtg tgggccaacg ccaccggcaa gaacctggtc ggtatgggcc    1440

gggcgctgat cgcgccgctg cgcatcggcc tgcagaaggc cggggtgccg gtgctgttga    1500

acaccgcgct gaccgacctg tacctcgagg acggggtggt gcgcggaatc tacgttcgcg    1560

aggccggcgc ccccgagtct gccgagccga agctgatccg agcccgcaag ggcgtgatcc    1620

tcggttccgg tggcttcgag cacaaccagg agatgcgcac caagtatcag cgccagccca    1680

tcaccaccga gtggaccgtc ggcgcagtgg ccaacaccgg tgacggcatc gtggcggccg    1740

aaaagctcgg tgcggcattg gagctcatgg aggacgcgtg gtggggaccg accgtcccgc    1800

tggtgggcgc cccgtggttc gccctctccg agcggaactc ccccgggtcg atcatcgtca    1860

acatgaacgg caagcggttc atgaacgaat cgatgcccta tgtggaggcc tgccaccaca    1920

tgtacggcgg tcagtacggc caaggtgccg ggcctggcga gaacgtcccg gcatggatgg    1980

tcttcgacca gcagtaccgt gatcgctata tcttcgcggg attgcagccc ggacaacgca    2040

tcccgaagaa atggatggaa tcgggcgtca tcgtcaaggc cgacagcgtg gccgagctcg    2100

ccgagaagac cggtcttgcc cccgacgcgc tgacggccac catcgaacgg ttcaacggtt    2160

tcgcacgttc cggcgtggac gaggacttcc accgtggcga gagcgcctac gaccgctact    2220

acggtgatcc gaccaacaag ccgaacccga acctcggcga gatcaagaac ggtccgttct    2280

acgccgcgaa gatggtaccc ggcgacctgg gcaccaaggg tggcatccgc accgacgtgc    2340

acggccgtgc gttgcgcgac gacaactcgg tgatcgaagg cctctatgcg gcaggcaatg    2400

tcagctcacc ggtgatgggg cacacctatc ccggcccggg tggcacaatc ggccccgcca    2460

tgacgttcgg ctacctcgcc gcgttgcatc tcgctggaaa ggcctgatat gcccatcgat    2520

gtcgagcagg cgctcgccgc cgaccttgat ccgatcgagt tctcctggac cagcagcgat    2580

atccagctgt accacctggg cctgggcgcc ggttcggacc cgatggacga gcgcgaactg    2640

cgctacctga ccgataacac cccgcaggtg ctgcccacct tcggcaatgt cgcggccagc    2700

ttccacatga cccaggcgcc gaccgtgcag ttccccggca tcgatatcga gctgtccagg    2760

gtgctgcacg ccagcgagg                                                 2779

<210>2

<211>566

<212>PRT

<213>新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)

<400>2

Val Phe Tyr Met Thr Ala Gln Asp Tyr Ser Val Phe Asp Val Val Val

1                5                   10                  15

Val Gly Ser Gly Ala Ala Gly Met Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala His

            20                  25                  30

Gln Gly Leu Ser Thr Val Val Val Glu Lys Ala Pro His Tyr Gly Gly

        35                  40                  45

Ser Thr Ala Arg Ser Gly Gly Gly Val Trp Ile Pro Asn Asn Glu Val

    50                  55                  60

Leu Gln Arg Asp Gly Val Lys Asp Thr Pro Ala Glu Ala Arg Lys Tyr

65                  70                  75                  80

Leu His Ala Ile Ile Gly Asp Val Val Pro Ala Glu Lys Ile Asp Thr

                85                  90                  95

Tyr Leu Asp Arg Ser Pro Glu Met Leu Ser Phe Val Leu Lys Asn Ser

            100                 105                 110

Pro Leu Lys Leu Cys Trp Val Pro Gly Tyr Ser Asp Tyr Tyr Pro Glu

        115                 120                 125

Thr Pro Gly Gly Lys Ala Thr Gly Arg Ser Val Glu Pro Lys Pro Phe

    130                 135                 140

Asn Ala Lys Lys Leu Gly Pro Asp Glu Lys Gly Leu Glu Pro Pro Tyr

145                 150                 155                 160

Gly Lys Val Pro Leu Asn Met Val Val Leu Gln Gln Asp Tyr Val Arg

                165                 170                 175

Leu Asn Gln Leu Lys Arg His Pro Arg Gly Val Leu Arg Ser Ile Lys

            180                 185                 190

Ala Gly Val Arg Ser Val Trp Ala Asn Ala Thr Gly Lys Asn Leu Val

        195                 200                 205

Gly Met Gly Arg Ala Leu Ile Ala Pro Leu Arg Ile Gly Leu Gln Lys

    210                 215                 220

Ala Gly Val Pro Val Leu Leu Asn Thr Ala Leu Thr Asp Leu Tyr Leu

225                 230                 235                 240

Glu Asp Gly Val Val Arg Gly Ile Tyr Val Arg Glu Ala Gly Ala Pro

                245                 250                 255

Glu Ser Ala Glu Pro Lys Leu Ile Arg Ala Arg Lys Gly Val Ile Leu

            260                 265                 270

Gly Ser Gly Gly Phe Glu His Asn Gln Glu Met Arg Thr Lys Tyr Gln

        275                 280                 285

Arg Gln Pro Ile Thr Thr Glu Trp Thr Val Gly Ala Val Ala Asn Thr

    290                 295                 300

Gly Asp Gly Ile Val Ala Ala Glu Lys Leu Gly Ala Ala Leu Glu Leu

305                 310                 315                 320

Met Glu Asp Ala Trp Trp Gly Pro Thr Val Pro Leu Val Gly Ala Pro

                325                 330                 335

Trp Phe Ala Leu Ser Glu Arg Asn Ser Pro Gly Ser Ile Ile Val Asn

            340                 345                 350

Met Asn Gly Lys Arg Phe Met Asn Glu Ser Met Pro Tyr Val Glu Ala

        355                 360                 365

Cys His His Met Tyr Gly Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Ala Gly Pro Gly

    370                 375                 380

Glu Asn Val Pro Ala Trp Met Val Phe Asp Gln Gln Tyr Arg Asp Arg

385                 390                 395                 400

Tyr Ile Phe Ala Gly Leu Gln Pro Gly Gln Arg Ile Pro Lys Lys Trp

                405                 410                 415

Met Glu Ser Gly Val Ile Val Lys Ala Asp Ser Val Ala Glu Leu Ala

            420                 425                 430

Glu Lys Thr Gly Leu Ala Pro Asp Ala Leu Thr Ala Thr Ile Glu Arg

        435                 440                 445

Phe Asn Gly Phe Ala Arg Ser Gly Val Asp Glu Asp Phe His Arg Gly

    450                 455                 460

Glu Ser Ala Tyr Asp Arg Tyr Tyr Gly Asp Pro Thr Asn Lys Pro Asn

4654                 70                 475                 480

Pro Asn Leu Gly Glu Ile Lys Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Lys Met

                485                 490                 495

Val Pro Gly Asp Leu Gly Thr Lys Gly Gly Ile Arg Thr Asp Val His

            500                 505                 510

Gly Arg Ala Leu Arg Asp Asp Asn Ser Val Ile Glu Gly Leu Tyr Ala

        515                 520                 525

Ala Gly Asn Val Ser Ser Pro Val Met Gly His Thr Tyr Pro Gly Pro

    530                 535                 540

Gly Gly Thr Ile Gly Pro Ala Met Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Ala Leu

545                 550                 555                 560

His Leu Ala Gly Lys Ala

                565

Claims (27)

1.一种3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

2.根据权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第807～2507位核苷酸序列具有70％以上的一致性或与所述SEQ ID NO：1所示序列具有60％以上的一致性。

3.根据权利要求2所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因与SEQ ID NO：1所示序列的第807～2507位核苷酸序列具有85％以上的一致性。

4.根据权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性。

5.根据权利要求4所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有89％以上的一致性。

6.根据权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因来源于分枝杆菌属微生物。

7.根据权利要求6所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述分枝杆菌属微生物是快速生长型分枝杆菌。

8.根据权利要求7所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRL B-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium gilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

9.根据权利要求7所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其特征在于，所述快速生长型分枝杆菌是Mycobacterium neoaurum NwIB-01，保藏编号是CCTCC M 209094。

10.一种3-甾酮-Δ¹-脱氢酶，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其无义突变序列。

11.根据权利要求10所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶与所述氨基酸序列具有75％以上的一致性。

12.根据权利要求11所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶，其特征在于，所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶与所述氨基酸序列具有89％以上的一致性。

13.一种基因工程表达载体，其特征在于，所述表达载体整合有权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因。

14.根据权利要求13所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述表达载体是细菌表达载体、酵母表达载体或哺乳动物表达载体。

15.根据权利要求14所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体。

16.根据权利要求15所述的基因工程表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体或pLMJ72链霉菌整合表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体。

17.一种基因工程表达菌株，其特征在于，所述基因工程表达菌株含有权利要求10所述的基因工程表达载体或者整合有权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，其中所述基因工程表达载体是细菌表达载体。

18.根据权利要求17所述的基因工程表达菌株，其特征在于，所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体、链霉菌表达载体或分枝杆菌表达载体，相应地，所述基因工程表达菌株是大肠杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

19.根据权利要求18所述的基因工程表达菌株，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体是pET表达载体，所述链霉菌表达载体是pLMJ链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体或pLMJ72链霉菌整合表达载体，所述分枝杆菌表达载体是pFZ36分枝杆菌整合载体或pAL5000或pFZ2分枝杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体，相应地，所述大肠杆菌是BL21菌株，所述链霉菌是变铅青链霉菌Streptomyces lividans，所述分枝杆菌是Mycobacterium sp.NRRLB-3683与B-3805、Mycobacterium smegmatism、Mycobacterium fortuitum、Mycobacteriumgilvum、Mycobacterium neoaurum、Mycobacterium Phlei、Mycobacterium avium、Mycobacterium vanbaalenii或Mycobacterium vanbaalenii。

20.根据权利要求17所述的基因工程表达菌株在降解甾醇制备雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮中的应用。

21.根据权利要求17所述的基因工程表达菌株在对3-酮-4-烯类甾体化合物进行Δ¹-脱氢反应制备3-酮-1，4-二烯类甾体化合物中的应用。

22.一种分枝杆菌基因工程突变菌株，其特征在于，通过突变权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因，并通过同源重组构建获得。

23.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株，其特征在于，所述突变是缺失或点突变所述3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因。

24.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备雄甾-4-烯-3，17-二酮中的应用。

25.根据权利要求22所述的分枝杆菌基因工程突变菌株在降解甾醇制备9α-雄甾-4-烯-3，17-二酮中的应用。

26.一种新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，所述新金分枝杆菌的保藏编号是CCTCC M 209094。

27.根据权利要求26所述的新金分枝杆菌，其特征在于，包括权利要求1所述的3-甾酮-Δ¹-脱氢酶基因。

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