WO2005054474A1

WO2005054474A1 - ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法

Info

Publication number: WO2005054474A1
Application number: PCT/JP2004/018665
Authority: WO
Inventors: Katsura Izui; Limei Chen; Nobuo Kato; Yasuyoshi Sakai; Hiroya Yurimoto
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2005-06-16
Also published as: EP1698700A1; US7973222B1; JP4487071B2; CA2546666A1; EP1698700A4; JPWO2005054474A1; EP1698700B1

Abstract

　本発明により、ヘキスロース-6-リン酸合成酵素の遺伝子及び6-ホスホヘキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現させることにより、カルビン回路を介してホルムアルデヒドを代謝させる経路を有する形質転換植物が与えられた。本発明の形質転換植物は、ホルムアルデヒドに対する耐性を有し、かつ環境中のホルムアルデヒドを有意に低減させることが可能である。よって本発明の形質転換植物を住居やオフィスなどに設置することにより、環境浄化を行うことができると考えられる。

Description

ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法技術分野

明

本発明は、ホルムアルデヒド代謝系酵素の遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することにより、ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法及ぴ該方法により作製された形質転 «物に関する。更に本発明は、書

ホルムアルデヒド代謝系酵素の遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化させる能力を該植物に付与することよりなる、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法及ぴ該方法により作製された形質転 «物に関する。背景技術

ホルムアルデヒドは建築資材などに存在している化学物質であり、大気中においてごく微量であつても人体に影響を及ぼすために、シックハウス症候群などの原因物質とされている。平成 15年 7月 1日の建築基準法の改正により、ホルムァルデヒドを放散する建築資材の使用が禁止されるなど、環境基準の規制は今後より厳しくなることが予想される。そこで環境汚染物質の低減（例えば植物を利用したフアイトレメディエーシヨン）の観点から環境中のホルムアルデヒド濃度を低減し、除去する方法が求められていた。

なお、環境中のホルムアルデヒド濃度を生物学的な手段により低減させる技術として、ホルムアルデヒドを分解する微生物などを用いた方法が知られている。しカゝし、植物の代謝系の酵素を組み込んだ形質転■物を作製することにより、該植物を用、てホルムァルデヒド濃度を低減させる技術はこれまで知られていない。また植物において遺伝子組み換えを行うことにより、各種ストレスに対する耐性を付与する技術は存在するが、環境浄化という観点カゝら代謝遺伝子系を組み込んでレ、る例は見出されな、。

なお植物を用いた環境浄ィ匕の報告の一例として、ナス科、アブラナ科、セリ科、ァカザ科、マメ科、キク科、ユキノシタ科の植物に、ァグロバタテリゥム ' リゾゲネス由来の R iプラスミドを導入して誘導される毛状根に、ダイォキシン含有媒体を接触させて、ダイォキシンを毛状根又は再生植物体に吸収 ·分解させることを特 ί敷とするダイォキシン含有媒体の浄化方法（特開 2000 - 176433号公報）がある。しかしこの報告はホルムアルデヒドに関するものではない。

また植物におけるホルムアルデヒドの代謝に関する知見としては、シロイヌナズ由来のグルタチオン依存性のホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ (FALDH)の発現量を操作した植物体を作製したことが報告されている（Plant Physiol. 2003)。その結果 FALDHを過剰発現させた植物体においてはホルムアルデヒドの取り込みが促進されたが、 FALDH の発現量を低下させた植物体においてはホルムアルデヒドの取り込みが明らかに低下し、この結果より FALDHがホルムアルデヒドの解毒に関与していることが示唆される。

ところで微生物において、メタノールなどの炭素数 1つの化合物（C1化合物）を炭素現として生育できるメタノール資化性菌の存在が知られている。かかる微生物においてはメタノールから生じるホルムアルデヒドを炭素源として固定することができる代謝経路を備えている。そしてへキスロース- 6-リン酸合成酵素と 6_ホスホへキスロースィソメラーゼはメタノール資化性菌におけるその様な代謝経路に関与している。

それに関して、メタノール資化能を有さない微生物である Burkholderia capacia TM1 に、メタノール資化性菌由来の上記遺伝子の酵素を導入して過剰発現させたところ、ホルムアルデヒドの取り込みが増加し、バニリン酸を代 ITしてホルムアルデヒドを生成する代謝経路も活性化していることが報告されている

(Appl. Environ Microbiol. 2003) ₀ かかる知見は、非メタノール資化性菌においてもへキスロース- 6-リン酸合成酵素 Z6-ホスホへキスロースィソメラーゼの経路により、バニリン酸の分解能を改善することができることを示している。発明の開示

よって本発明の課題は、環境中におけるホルムアルデヒド濃度を低減させるために、ホルムアルデヒドの代謝系を植物などに組み込むことにより該植物においてホルムアルデヒド吸収能を高める手段を提供することである。かかる植物はホルムアルデヒドに対する耐性を有していると考えられるが、植物などにおいてホルムアルデヒド耐性を高める手段を提供することもまた本発明の課題である。また、かかる手法を植物のみならず自家栄養生物一般に拡張することも本発明の課題である。

よって本発明は、カルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を人工的に発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドに対する耐性を付与する方法を提供するものである。かかる形質転換自家栄養生物もまた本発明の範囲内である。

更にカルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドを吸収させる方法を提供するものである。かかる形質転換自家栄養生物もまた本発明の範囲内である。

更に本発明は、へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及ぴ 6-ホスホへキスロースィソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よつてホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法を提供するものである。かかる形質転換植物もまた本発明の範囲内である。更に本発明は、へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及び 6-ホスホへキスロースィソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よつてホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該核物に付与することよりなる、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方を提供するものである。かかる形質転物もまた本発明の範囲内である。

本発明により、へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及ぴ 6-ポスホへキスロースィソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現させることにより、カルビン回路を介してホルムアルデヒドを代謝する経路をする形質転物を作製することが可能となった。そのような形質転,物は、ホルムアルデヒドに対する耐性を有し、カゝっ環境中のホルムアルデヒドを有意に低減させることが可能である。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の方法によりホルムアルデヒド資化能を付与する fこめのストラテジーを示した図である。

第 2図は、実施例で使用した rmpA遺伝子または rmpB遺伝子を含む DJ Aコンストラタトの構造を示す図である。

第 3図は、 rmpA遺伝子を含むプラスミドを構築するストラテジ一をす図である。第 4図は、 rmpB遺伝子を含むプラスミドを構築するストラテジーを示す図である。第 5図は、 rmpA遺伝子を含むプラスミドのプライマー、トランジットペプチド、 rmpA遺伝子の配列を示す図である。

第 6図は、 rmpB遺伝子を含むプラスミドのプライマー、トランジットペプチド、 rmpB遺伝子の配列を示す図である。

第 7図は、シロイヌナズナにおいて、形質転換植物とコントロール植物の植物体の新鮮重量に対してホルムアルデヒドが及ぼす影響を示すグラフである。

第 8図は、シロイヌナズナにおいて、形質転物とコントロール植物における HPS活性と PHI活性を示すグラフである。

第 9図は、シロイヌナズナにおいて、形質転換植物とコント口一ノレ植物における、ホルムアルデヒド耐性とホルムアルデヒドの取り込みを示す写真である。

第 1 0図は、シロイヌナズナにおいて、形質転物とコントロール植物における液体ホルムアルデヒドの取り込みの取り込み率を示すグラフである。

第 1 1図は、タバコにおいて、形質転換植物とコントローノレ植物における HPS活性と PHI活性を示すグラフである。

第 1 2図は、タバコにおいて、形質転換植物とコントローノレ植物における、ホルムアルデヒド耐性とホルムアルデヒドの取り込みを示す写真である。

第 1 3図は、タバコにおいて、形質転換植物とコントローノレ植物における、ホルムアルデヒドに対する耐性を示す写真である。

第 1 4図は、タバコにおいて、ホルムアルデヒドが形質転^ I 物とコントロール植物の根の生育に及ぼす影響を示す写真である。

第 1 5図は、 rmpA遺伝子が発現している植物系統（A-l)、 rmpB遺伝子が発現している植物系統（B - 1)、それらの交雑種 (A-1 XB-1) におけるホルムアルデヒド耐性を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

本発明者らは、へキスロース- 6 -リン酸合成酵素（Hexulose-phosphate synthase :以下 HPS と称する）遺伝子及ぴ 6_ホスホへキスロースイソメラーゼ (Phosphohexuloisomerase :以下 PHIと称する）遺伝子を植物に導入することにより、該植物にホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を付与することができることを見出した。

即ち、有害な化学物質であるであるホルムアルデヒドがカルビン回路に取り込まれて資化されるので、環境中のホルムアルデヒドを該植物により吸収させ、ホルムアルデヒド濃度を低減させることが可能である。言い換えれば、本発明の形質転,物は、カルビン回路を通じてホルムアルデヒドを代謝する経路を有しているので、環境中のホルムアルデヒドを処理することができる。また、かかる形質転■物はホルムアルデヒドに対する耐性を有すると考えられる。

本発明のストラテジーを図 1に示す。カルビン回路の中間生成物であるリブロース- 5 -リン酸（Ru5P) 、 HPSによって触媒される酵素反応によりホルムァノレデヒド（HCH0) と結合し、 3 -へキスロース - 6 -リン酸が生成する。そして生成した 3-へキスロース- 6-リン酸は PHIの作用によってフルクトース- 6-リン酸（Fru6P) に変換される。 Fru6P はカルビンサイクルの中間生成物でもあるために、結果としてホルムアルデヒドはカルビン回路の中間体に組み込まれてカルビンサイクルの代謝系を介して資化される。

なお図 1において RuBPはリブロース- 1. 5-ビスリン酸を、 FBPはフルクトース - 1. 6-ビスリン酸を、 Xu5Pはキシルロース- 5-リン酸を示す。また rmpAは HPS をコードする遺伝子であり、 rmpBは PHIをコードする遺伝子であり、これらの遺伝子を含むコンストラクトを構築した。上記の rmpA遺伝子と rmpB遺伝子を含むコンストラタトを構築するためのストラテジ一については、下記の実施例にぉレ、て詳しく述べる。

HPSの遺伝子と PHIの遺伝子が導入されることによりそれらの酵素を過剰発現している形質転 m«物は、環境中のホルムアルデヒドの処理能力が高められている。 HPS と PHIを発現させることにより、カルビンサイクルの経路を介してホルムアルデヒドを代謝するための新たな代謝経路を与えたという点に本発明の最も顕著な特徴がある。そのような本発明の思想の範囲内で種々の改変を適宜施して本発明を実施することが可能である。

下記の実施例で詳しく述べるように、力かる形質転物は空気中のホルムァルデヒドの濃度を低減させるのに有効であった。またかかる形質転 «物はホノレムアルデヒドに対して耐性を示した。なお本発明に係る酵素である HPSと PHIのァミノ酸配列、およびそれらの酵素をコ一ドする遺伝子の塩基配列自身は既知である（accession No.： AB034913)。

環境中のホルムアルデヒド濃度を低減することを可能とする本発明に係る技術は、種々の用途に応用することができると考えられる。例えば、観葉植物、ガーデニング植物や街路樹などに HPSの遺伝子と PHIの遺伝子を導入すること力 Sできる。力かる遺伝子導入植物は大気、土壌、水等環境中の環境汚染物質の低減（フアイトレメディエーシヨン）に有効である。また、農業、水産業、工業などで用いられた残留ホルムアルデヒドの処理に、本発明に係る形質転 m¾物は有用である。

本発明の形質転^ tt物を作製するために、 HPSの遺伝子を発現させるための DNA コンストラクトと、 PHIの遺伝子を発現させるための DNAコンストラクトを構築する。かかる DNAコンストラタトは、 HPSをコードする遺伝子又は PHIをコードする遺伝子を当然に有するが、これらの遺伝子の上流に、該遺伝子の植物における発現を促進するためのプロモーター配歹 IJ、および該遺伝子を目的部位（例えば葉緑体）で発現させるためのトランジットペプチド、更には薬剤耐性によって形質転換体を選抜するための薬剤耐性遺伝子も更に有する。本発明の方法は光合成に関連しているカルビン回路を利用したものであるので、 HPSと PHIを葉緑体において発現させることは本発明において好ましい態様である。

使用するプロモーター配列は特に限定されるものではないが、下記の実施例で使用した PrbcSは、作用が強力であり且つ光合成と相関性が高いために特に好適である。し力し、その他の本技術分野で汎用されている種々のプロモーターを使用することもできる。また使用する薬剤耐性遺伝子も特に限定されるものではないが、下記の実施例で使用したゲンタマイシン耐性遺伝子と力ナマイシン耐性遺伝子は好適であり、その他本技術分野で汎用されている種々の薬剤耐性遺伝子を使用することができる。なおこれらの薬剤耐性遺伝子は形質転換体の選抜については有効であるが、抗生物質耐性の拡散は社会的には好ましくないことを考えると、形質転換体が市場にお力ゝれる段階においては薬剤耐性が除去されていることが望ましいと考えられる。

上記の DNAコンストラクトを、植物の芽やカルスに導入することにより幵質転換を行う。形質転換の方法としては、ァグロパクテリゥム法、プロトプラスト法、 PEG法、エレクト口ポレーシヨン法、パーティクルガン法などの種々の方法が知られている。好適な実施態様として下記の実施例においてはァグロパクテリゥム EHA101 pMP90を用いているが、必要に応じて種々の遺伝子導入方法を適宜用いることができる。そして薬剤耐性を指標として遺伝子が導入された形質転換体を選抜することにより、形質転 m¾物を得ることができる。また一般的に外来遺伝子の発現は高くはないが、これら.のコンストラクトに揷入されているプロモーターの作用のために HPSをコードする遺伝子と PHIをコードする遺伝子の発現は増強され、その効果を発揮することができる。

ここで遺伝子を導入する対象の植物は特に限定されるものではない。下言己の実施例にぉレ、ては代表的な植物としてシロイヌナズナとタパコに酵素の遺伝子を導入しているが、他の多くの植物にも HPSをコードする遺伝子と PHIをコードする遺伝子を同様に導入し、ホルムアルデヒドの除去 ·吸収能を付与できることは当業者ならば理解できることである。好適な植物にはナス科の植物ゃァブラナ科の植物、その他種々の双子 ¾t物が含まれるが、植物の種類はそれに限定されるものではなく、例えば単子葉植物にも理論的には本発明の方法を適用できるものと考えられる。

具体的な植物の例としては、観葉植物やガーデニング植物としては、ポトス、パキラ、ベンジャミン、コンシンネ、クレストゴールド、サンスベリアなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。また街路樹としては、サクラ、ケャキ、イチヨウ、プラタナス、ユリノキ、ポプラ、力エヂなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。

また本発明の方法は植物のみならず、カルビン回路を有する自家栄養生物一般に適用可能であると思われる。ここで自家栄養生物とは光合成又はそれに類似する反応を行う機能を有し、 0と co₂から有機物を作ることができる生物であって、従属栄養生物を除外する意味である。具体的な例としては、植物一般の他に、光合成細菌、ラン藻（シァノバクテリア）や藻類などが挙げられる。これらの自家栄養生物はカルビン回路を有するために、同様のストラテジーを用いてこれらの生物においてホルムアルデヒド資化能を付与することも可能である。

ホルムアルデヒドをカルビンサイクルの回路を通じて代謝するための具体的な手段としては、下記の実施例で行っているように、 HPSをコードする遺伝子と PHI をコードする遺伝子を植物に導入することが好ましい。し力し、その手段は上記の酵素をコードする遺伝子を導入することに必ずしも限定されるものではない。例えばメタノール資化性酵母はジヒドロアセトンシンターゼ（DHAS) 及ぴジヒドロアセトンキ^ "一ゼを有しており、酵母由来のこれらの酵素の働きによってホルムアルデヒドをキシロース 5_リン酸に固定してジヒドロキシアセトン 3 -リン酸と 3-ホスホダリセリン酸を生成する。この反応において基質 '生成物共にカルビン回路の中間体とほぼ共通であり、このような知見も本発明を実施するにあたつて利用できるものと考えられる。

即ち、使用することができる他の酵素遺伝子として、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DAS1) をコードする遺伝子とジヒドロキシアセトンキナーゼをコードする遺伝子 (DAK1) の組み合わせを採用することも可能である。上記において述ベた様に、この場合には、ジヒドロアセトンシンターゼにより、キシロース 5 -リン酸とホルムアルデヒドの反応が触媒されて 3 -ホスホダリセリン酸とジヒドロキシアセトンが生成し、後者の生成物はジヒドロキシアセトンキナーゼ (DHAK) による酵素反応の触媒によりジヒドロキシアセトン 3-リン酸に変換され、よって力ルビン回路を介して代謝系に組み込まれる。かかる態様も本発明において実施することが可能である。

このような態様も本発明の範囲内であり、本願明細書において「ホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子」とは、 HPSをコードする遺伝子と PHIをコードする遺伝子のみならず、例えば上記において述べたような、ホルムアルデヒドを代謝してカルビン回路に組み込むのに有用な他の酵素遺伝子も含む意味である。

下記の実施例において本発明を更に詳細に説明するが、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例

実施例 1 ：シロイヌナズナを用いた解析

(コンストラタトの構築）

シロイヌナズナにおいて HPS と PHIを発現させるためのベクターとして、 HPS をコードする遺伝子（_rmpA) と PHIをコードする遺伝子（rmpB) を含む DNAコンストラクトを作製した。作製した 2つの DNAコンストラクトの構造を図 2に示す。なお、これらの DNAコンストラクトに、 HPSと PHIをコードする遺伝子の他に、 HPSと PHIを葉緑体において発現させるためのトランジットペプチドと、形質転換体を選抜するために薬剤耐性遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子）も挿入した。

そこで、 rmpA遺伝子を含む HPS発現用のコンストラクトと、 rmpB遺伝子を含む PHI発現用のコンストラタトを作製するためのストラテジーを図 3と図 4に示す。その m_PA遺伝子と rmpB遺伝子はマイコバクテリウム属のメタノ一ル資化性菌である Mycobacterium gastri MB19 の同一オペ口ン内に位置している。なお本菌 fま原核生物であり、本菌のプロモーターは植物内においては作動しない。そのために rmpA遺伝子と rmpB遺伝子のコード領域のみを採って、形質転換用の植物プロモーターを含むキメラ遺伝子を構築した。

PCRにより rmpA遺伝子を増幅し（rmpA sense GCTTGCAAGGGGTAACCATGACG：配歹 lj 番号 1、 rmpA ant i sense : TCTAGAGGATCAGGCGATCGC：配列番号 2 )、 Sphlと BamHI によって PCR生成物と pUC- Rbcs-3Cを切断した。単離した 624bpの rmpA遺伝子と 4. 6kb のベクター断片を単離し、該ベクターに rmpA 遺伝子を結合し、 pUC- RbcS - rmpAプラスミドを作製した。 Hindi IIと BamHIによって pUC - RbcS- rmpA とバイナリ一べクタ一 pPZP221を消化し、 2. 4kbの pRbcS - rmpAィンサートと 10kb のベクターバンド PPZP211を単離し、それらを結合させて pPZP221 rmpAプラスミドを作製した。

なおトランジットぺプチドの配列として使用した部分は accession No : X05986 の塩基番号 298-468であり、 rmpA遺伝子の配列として使用した部分は accession No : AB034913の塩基番号 2518- 2150である。このコンストラクトのプライマー、トランジットぺプチド、 rmpA遺伝子の配列をまとめたものを図 5に示す。

また PCRにより rmpB遺伝子を増幅し（rmpB sense GCTTGCAAGGGGTAACCATGACG：配列番号 3、 rmpB antisense： TCTAGATCCGGGTCACTCGAG：配列番号 4 )、 Sphlと Xbal によって PCR生成物と pUC - Rbcs - 3Cを切断した。単離した 600bpの rmpB遺伝子と 4. 6kbのベクター断片を単離し、該ベクターに rmpB遺伝子を結合し、 pUC-RbcS - rmpBプラスミドを作製した。 Hindlllと Xbalによって pUC_RbcS - rmpBとバイナリ一べクター pPZP221を消化し、 2. 4kbの pRbcS- rmpBィンサートと 10kbのべクターバンド PPZP221を単離し、それらを結合させて pPZP221 rmpBプラスミドを作製した。

なおトランジットぺプチドの配列として使用した部分は accession No : X05986 の塩基番号 298-468であり、 rmpB遺伝子の配列として使用した部分は accession No : AB034913の塩基番号 1845-2456である。このコンストラクトのプライマー、トランジットぺプチド、 rmpB遺伝子の配列をまとめたものを図 6に示す。

(形質転換体の選抜）

このようにして構築したプラスミドにより、ァグロパクテリゥム法を用いてシロイヌナズナを形質転換した。具体的にはシロイヌナズナ rmpAで形質転換した後に形質転換体を rmpAと共に導入したカナマイシン耐性により選抜し、更に、 rmpB で形質転換した後に形質転換体を rmpB と共に導入したゲンタマィシン耐性により選抜することにより、 rmpAと rmpBの両者の遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。あるいは逆に、シロイヌナズナ rmpBで形質転換した後に形質転換体を rmpBと共に導入したゲンタマイシン耐性により選抜し、更に、 rmpAで形質転換した後に形質転換体を rmpA と共に導入したカナマイシン耐性により選抜することにより、 rmpAと rmpBの両者のコンストラクトが導入された形質転換体を選抜した。

(導入された遺伝子の確認）

なおこのようにして作製したシロイヌナズナの形質転換植物について、 RT- PCR とノザン解析により遺伝子が導入されているか検討を行った。その結果、 rmpA遺伝子と rmpB遺伝子を含むコンストラクトで処理することにより、両者の遺伝子が導入された形質転^ f 物が得られていることが確認された。更に HPSに対する抗体を用いてゥエスタン解析により導入された遺伝子の酵素蛋白質が発現してレ、る力、確認をしたところ、 rmpA遺伝子に由来した HPS蛋白質の発現が確認された。

(ホルムアルデヒドに対する耐性）

これらの遺伝子（rmpA、 rmpB) を導入した形質転物とコントロール植物におけるホルムアルデヒド耐性を、植物体の新鮮重量により検討した（図 7 )。抗生物質による選抜の後に抗生物質を含まない新たな寒天培地に苗を移し 1週間生育させた。その後、ホルムアルデヒド (37%) を 100 mlあたり 50 1添加した寒天培地に移し、 4-5週間生育させた後に新鮮重量を測定した。図 7において上段はホルムアルデヒドを添加していない寒天培地における結果を、中段はホルムァルデヒドを 50 μ ΐ添加した寒天培地における結果を、下段はホルムアルデヒドを 80 添加した寒天培地における結果を、それぞれ示す。また図 7において AB1 から ΑΒ5は rmpA遺伝子と rmpB遺伝子の両者が導入された形質転^ ίϊ物を、 CK1 から CK5はコントロール植物を示す。

その結果、ホルムアルデヒドを含まない環境下における植物体の新鮮重量は、コント口ール群 (CK1-CK5)と両酵素の遺伝子が導入された形質転換体群 (AB1-AB5) の間で差が見られなかった（上段)。一方、ホルムアルデヒドを含む環境下では、形質転換体 (AB1-AB5) は良く生育したが、コントロール（CIQ- CK5) では生育が阻害され、植物体の新鮮重量に差が認められた（中段、下段)。この結果は、形質転換体はホルムアルデヒドに耐性を有していることを示している。

(酵素活性の測定）

HPSと ffllの酵素活性を 30°Cで分光学的に測定した。具体的にはリボース 5 -リン酸を出発基質とし、 HPSや PHIによる酵素反応を介してホルムアルデヒドに依存的に生成する NADPHを 340 nmで検出することにより、酵素活性を測定した。即ち、 30°Cで 2-3分プレインキュベートを行い、蛋白抽出物とホルムアルデヒド（50 mM) 50 / lを添加して下記の酵素反応溶液中で酵素反応を行った。酵素反応溶液 1 mlの糸且成は以下の通りである。

KPB (カリウムリン酸緩衝液）， pH7. 5 50 mM

MgCl₂ 2. 5 mM

Ri5P (リボース- 5リン酸） 2. 5 raM

HCH0 (ホルムアルデヒド） 2. 5 mM

NADP+ 2. 5 nil

PRI (ホスホリボイソメラーゼ) 10 U/ml

PGI (ホスホグ^/コィソメラーゼ） 10 U/ml

GDH (グルコースホスフェートデヒドロゲナーゼ） 10 U/ml

HPS (3-へキスロース- 6-ホスフェイト合成酵素 ) 10 U/ml (植物蛋白

抽出物 0. 05 ml)

PHI (6-ホスホへキスロースィソメラーゼ） 10 U/ml (植物蛋白

抽出物 0. 05 ml) d¾0 0. 55 ml なおこの反応液において、 HPS の酵素活性を測定する際にはオーセンティックな PHIを使用し、 PHIの酵素活性を測定する際にはオーセンティックな HPSを使用した。

このようにして測定した HPS活性と PHI活性を図 8に示す（図 8左： HPS活性、右： PHI活性)。なお図 8の上において酵素活性のアツセィの原理を示す。図 8に見られるように、 rmpA遺伝子と rmpB遺伝子の両方が導入されている AB1と AB2 においては両者の酵素活性が検出された。また rmpA遺伝子が導入されている A1 においては HPS活 1"生のみが、 rmpB遺伝子が導入されている A2においては PHI活性のみが検出された。

(ホルムアルデヒドの取り込み）

シロイヌナズナの苗（各群 20個体）を植物箱（370 ml) の中に移し、ポルティング段階に達するまで 3-4週間生育させた。その後 50 μ ΐのホルムアルデヒド (37%) を 500 μ ΐのマイクロチューブに添加して植物箱の角に置いた。 3- 4週間後に植物箱のカバーを、中央に孔を有している新しいものに交換した。ホルムァルデヒド検出器をその孔に設置し、ホルムアルデヒドの取り込みを検出した。検知菅を設置して 3. 5時間後に測定を停止し、写真を撮影した。

形質転換体である AB1 (左側）と ΑΒ2 (中央）、更にコントロール（HPSの遺伝子と ΙΉΙの遺伝子を含まない空のベクターで形質転換した植物体）である CK (右側）における結果を図 9に示す。図 9の写真より、形質転換体において苗は良く生育しているが、コントロールにおいては生育が阻害されており、形質転換体はホルムアルデヒド耐性を示した。また 3. 5時間後におけるホルムアルデヒド濃度は、 AB1と AB2については 4 ppm程度であった。一方コントロール植物については 20 ppm以上であり、 AB1と AB2においては空気中のホルムアルデヒドが吸収されていることが確認された。なお検知管により検出される量は検出時間に比例するために、実際のホルムアルデヒド濃度は検知管の検出値を検出時間で割った値である。

更に水溶液中のホルムアルデヒドの取り込みについて検討を行った。抗生物質で選抜を行った後に、抗生物質を含まない MS寒天培地上で苗を 2週間生育させた。植物体 0. 3 gを 10 mlのホルムアルデヒド溶液に浸し、 30時間後に溶液中のホルムアルデヒド濃度を測定した。

その結果、コントロール（CK :左カラム）と比較して、形質転換体 (AB：右カラム）においては顕著にホルムアルデヒドが減少していることが観察された（図 1 0 )。なお図 1 0において縦軸はホルムアルデヒドの残存率を示す。こと ίこホノレムアルデヒドの初期濃度が 5 mMである場合において、形質転換体におけるホルムアルデヒドの残存率は約 10%まで低下し、コントロールと比較して顕著な相違が認められた。この結果もまた、形質転換体がホルムアルデヒドを取り込んでいることを示している。

実施例 2 ：タノコを用！/ヽた解析

(遺伝子の導入およびその確認）

シロイヌナズナにおける実験と同様に、 rmpA遺伝子と rmpB遺伝子をタノくコに導入して形質転換したタバコを作製した。 PCR、ノザン解析により検討を行ったところ、 rmpA遺伝子と rmpB遺伝子を導入した形質転換植物について、両者の遺伝子の存在が確認された。更にウェスタン解析により導入された遺伝子による蛋白質の発現を確認したところ、 rmpA遺伝子に由来して HPS蛋白質が発現してレヽることが確認された。

(酵素活性の測定）

作製した形質転換タバコ植物における HPS と PHI の酵素活性を図 1 1に示す (上： HPS活性、下： PHI活性)。図 1 1に見られるように、 rmpA遺伝子と rmpB 遺伝子が両方とも導入されている AB2、 AB5、 AB6において、 HPSと PHIの両者の酵素活性が検出された。また野生型 (WT) とコントロール（CK) においては HPS と PHIの酵素活性は低かった。

(ホルムアルデヒドの取り込み)

形質転換したタバコを差し芽により増殖させ、抗生物質を含まない寒夭培地中に移植して根を成長させた。 2週間後に 100 のホルムアルデヒド（37。/₀) を植物箱（370 ml) の中に入れて空気中に消散させた。 2 力月後にシロイヌナズナの場合と同様にホルムアルデヒド検出器を設置し、設置 4時間後に測定を停止し、写真を撮影した。

形質転換体である AB5 (左側）と、コントロールである CK (右側）における結果を図 1 2に示す。図 1 2の写真より、形質転換体において苗は良く生育しているが、コントロールにおいては生育が阻害されており、形質転換体はホルムアルデヒド耐性を示した。また検知菅を設置してから 3. 5時間後における発色の程度から、植物箱内のホルムアルデヒド濃度は AB5については 3 ppm程度であった。一方コントロール植物については 20 ppm以上であり、その差から、 AB5においては空気中のホルムアルデヒドが吸収されてヽることが確認された。

(ホルムアルデヒドに対する耐性)

抗生物質による選抜を行った後に、形質転換したタバコの芽を抗生物質を含まない MS培地上に移し、 1週間生育させた。 10 の 37%ホルムアルデヒド、をマィクロチューブに添加して植物箱の中に入れた。 2週間後、 10 μ 1のホルムアルデヒドを同じマイクロチユーブ中に再補給した。更に 2週間後にこの操作り返した。 4週間植物を生育した後に写真を撮影した（図 1 3 )。図 1 3において上段は形質転換体を、下段は野生型植物又はコントロール植物を示す。その結果、形質転換体（ΑΒ7，ΑΒ8) においてはホルムアルデヒト処理（図 1 3 ：上段の中矢と右側）による影響は認められず、非処理群（図 1 3：上段の左側）と差がなかった。一方、野生型（WT) とコントロール（CK) においてはホルムアルデヒト処理により、非処理群との比較において明らかに成長阻害が認められた（図 1 3 _: 段の中央と右側)。

(タパコ植物における根の成長に対するホルムアルデヒドの影響）

抗生物質により選抜を行った後に、形質転換した芽を抗生物質を含まなレヽ MS 培地に移して 1週間生育させた。ホルムアルデヒドをマイクロチューブに添カロして植物箱に入れた。 2週間後に植物を取り出して、ホルムアルデヒドが根の生育に及ぼす影響を検討した（図 1 4 )。その結果、形質転換植物 (AB5) においては 2 のホルムアルデヒド（37%) 処理は殆ど根の成長に影響せず、 10 μ ΐのホルムアルデヒド（37%) 処理においても根の成長が認められた（図 1 4 ：上段)。一方コントロール植物 (CK) においては、 2 μ ΐ のホルムアルデヒド（37%) 処理により、根の成長は明らかに抑制された（図 1 4 ：下段)。

(植物系統の交雑の検討）

rmpA遺伝子が発現している植物系統（A- 1) と、 rmpB遺伝子が発現している植物系統（B- 1) を掛け合わせる交雑 (A-1 XB-1) を行い、その種子を採取した。抗生物質を含まなレ、寒天培地上で 3週間生育を行レ、、 4週間後に写真を撮影した (図 1 5 )。左側に 20 のホルムアルデヒドで処理したサンプルを、右側にホルムアルデヒド処理を行わなかったサンプノレを示す。

その結果、 HPSのみが発現している A- 1 (図 1 5：上段）と PHIのみが発現している B - 1 (図 1 5 ：中段）においては、 20 1のホルムァノレデヒド（37%) 処理により生育が阻害された。一方両酵素が発現していると思われる A - 1 XB-1 (図 1 5 ：下段）においては、ホルムアルデヒド処理により生育は影響されなかった。よってホルムアルデヒド耐性を獲得するには、 HPSと PHIの両者が発現していることを要することが確認された。産業上の利用可能性

本発明により、へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及び 6-ホスホへキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現させることにより、カルビン回路を介してホルムアルデヒドを代謝させる経路を有する形質転物が与えられた。本発明の形質転^ ft物は、ホルム： rルデヒドに対する耐性を有し、かつ環境中のホルムアルデヒドを有意に低減させることが可能である。よつて本発明の形質転 m¾物を住居やオフイスなどに設置することにより、環境浄ィ匕を行うことができると考えられる。

Claims

請求の範囲

1 . カルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドに対する耐性を付与する方法。

2 . カルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドに対する耐性を付与された、ホルムアルデヒドに対する耐性を有する形質転換自家栄養生物。

3 . カルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を発現せしめ、よって該自家栄養生物にホルムアルデヒドを吸収させる方法。

4 . カルビン回路を有する自家栄養生物においてホルムアルデヒドの代謝酵素系の遺伝子を導入して該代謝酵素系を発現せしめ、よつて該自家栄養生物にホルムアルデヒドに対する耐性を付与された、ホルムアルデヒド吸収能を有する形質転換自家栄養生物。

5 . へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及び 6-ホスホへキスロースイソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、ホルムアルデヒドに対する耐性を植物に付与する方法。

6 . 前記へキスロース -6-リン酸合成酵素の作用によりリプリース- 5-リン酸とホルムアルデヒドから 3 -へキスロース- 6-リン酸を生成し、更に前記 6-ホスホへキスロースイソメラーゼの作用により 3 -へキスロース- 6-リン酸をフルクトース -6-リン酸に変換することよりなる、請求項 5記載の方法。

7 . へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及ぴ 6-ホスホへキスロースィソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を付与された、ホルムアルデヒドに対する耐性を有する形質転■物。

8 . 前記植物が双子葉植物である、請求項 7記載の形質転 «物。

9 . 前記植物がナス科植物である、請求項 8記載の形質転,物。

1 0 . 前記植物がタバコである、請求項 9記載の开質転換植物。

1 1 . 前記植物がアブラナ科植物である、請求項 8記載の形質転,物。

1 2. 前記植物がシロイヌナズナである、請求項 1 2記載の形質転物。

1 3 . へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及び 6-ホスホへキスロースィソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資化する能力を該植物に付与することよりなる、環境中のホルムアルデヒドを植物に吸収させる方法。

1 4 . 前記へキスロース- 6_リン酸合成酵素の作用によりリブリース- 5-リン酸とホルムアルデヒドから 3-へキスロース _6_リン酸を生成し、更に前記 6-ホスホへキスロースィソメラーゼの作用により 3-へキスロース- 6-リン酸をフルクトース- 6-リン酸に変換することよりなる、請求項 1 3記載の方法。

1 5 . へキスロース- 6-リン酸合成酵素の遺伝子及ぴ 6-ホスホへキスロースィソメラーゼの遺伝子を植物に導入して葉緑体内において発現せしめ、よってホルムアルデヒドをカルビン回路の中間体に資ィ匕する能力を付与された、ホルムアルデヒド吸収能を有する形質転物。

1 6 . 前記植物が双子葉植物である、請求項 1 5記載の形質転 ^¾物。

1 7 . 前記植物がナス科植物である、請求項 1 6記載の形質転,物。

1 8 . 前記植物がタバコである、請求項 1 7記載の形質転,物。

1 9 . 前記植物がアブラナ科植物である、請求項 1 6記載の形質転^ f 物。

2 0 . 前記植物がシロイヌナズナである、請求項 1 9記載の形質転物。