KR101244995B1 - 글리코마크로펩타이드로부터의 혈압 강하 펩타이드 - Google Patents

Abstract

-I-P-P-서열을 갖고 단백질 아미노산 서열 중에 -V-P-P-보다 6 배(몰 기준) 이상 더 많은 -I-P-P-가 존재하는 단백질을 포함하는 단백질 공급원으로부터 IPP를 제조하는 방법으로, 상기 단백질 공급원을 가수분해시켜 상기 I-P-P-서열의 40% 이상을 펩타이드 IPP로 유리시킴을 포함하며, 상기 단백질 공급원 중에 존재하는 프롤린 잔기의 카복시 말단에서 절단하는 단백질 분해 효소를 사용하고, 상기 효소는 바람직하게는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 또는 프롤린 특이적 올리고펩티다제, 보다 바람직하게는 프롤린 특이적 엔도프로테아제, 및 임의로 아미노 펩티다제이다.

Description

글리코마크로펩타이드로부터의 혈압 강하 펩타이드{BLOOD PRESSURE LOWERING PEPTIDES FROM GLYCOMACROPEPTIDE}

본 발명은 IPP의 제조에 관한 것이다.

고혈압은 인간에서 비교적 흔한 질병 상태이며 심혈관 질병, 신부전 및 발작의 우세한 위험 인자를 제공한다. 다수의 약품들, 예를 들어 칼슘 차단제, 베타 차단제, 이뇨제, 알파 차단제, 중추 알파 길항물질, 안지오텐신 II 길항물질 및 ACE 억제제의 유효성은 고혈압의 근원적인 생리 기전이 다방면에 걸쳐 있음을 예시한다.

고혈압의 생리 기전들 중에서, 특히 레닌-안지오텐신 기전이 많은 과학적 주목을 받아왔다. 상기 기전에서, 안지오텐신은 간에 의해 분비되고 펩티다제 레닌에 의해 절단되어 생물학적으로 불활성인 데카펩타이드 안지오텐신 I을 생성시킨다. 안지오텐신 I이 폐 모세혈관을 통과함에 따라, 안지오텐신 전환 효소(이후부터는 ACE라 칭함)라 지칭되는 또 다른 펩티다제가, 상기 안지오텐신 I의 최종 2 개의 잔기(His-Leu)를 제거하여 옥타펩타이드 안지오텐신 II를 형성시킴으로써 안지 오텐신 I에 작용한다. 상기 안지오텐신 II 옥타펩타이드는 강한 혈관수축 활성을 나타내며 따라서 혈압을 상승시킨다. 보다 낮은 안지오텐신 II 수준을 유도하는 ACE 억제는 혈관수축을 방지하며 따라서 고혈압을 예방한다.

ACE는 안지오텐신 I의 절단과 별개로, 혈압 조절에 또한 관여하는 노나펩타이드인 브래디키닌을 또한 가수분해할 수 있다. 후자의 기전에서 ACE 억제는 브래디키닌 수준을 증가시키며 이는 혈관확장을 촉진하고 또한 혈압을 강하시킨다. 따라서 ACE 억제는 2 개 이상의 별도의 기전들을 통해 혈압 강하 효과를 도출시킨다.

옥타펩타이드 안지오텐신 II가 부신피질에 의한 알도스테론의 방출을 자극함이 또한 공지되어 있다. 알도스테론에 대한 표적 기관은 신장으로, 여기에서 알도스테론은 신 세뇨관으로부터 나트륨의 증가된 재흡수를 촉진시킨다. 또한 ACE 억제는 상기 세 번째 기전을 통해 혈압을 감소시키지만 이 경우에는 나트륨 재흡수를 감소시킴으로써 감소시킨다.

ACE의 단백질 분해 활성의 억제는 그의 다수의 생리학적 효과들로 인해 혈압을 강하시키는 유효한 방법이다. 이러한 관찰은 다수의 유효한 약학적 혈압 강하 제품, 예를 들어 캅토프릴 및 에날라프릴을 생성시켰다(Ondetti, M.A. et al., 1977, Science, Washington DC, 196, 441-444).

고혈압은 비교적 흔한 질병 상태이기 때문에 이러한 현대식 생활 방식의 바람직하지 못한 결과를 순한 활성의 천연 성분으로 중화시키는 것이 유리할 것이다. 특히 순한 활성의 천연 성분들을 식품이나 음료 제품에 혼입시킬 수 있는데, 그 이유는 상기와 같은 제품들은 규칙적으로 소비되기 때문이다. 한편으로 상기와 같은 순한 활성의 천연 성분들을 식품 보조제에 혼입시킬 수 있다. 최근 수십 년 동안 발효유 중에 존재하는 특정한 펩타이드들이 ACE 억제 능력을 가지며 고혈압 환자에서 혈압 감소를 유도할 수 있음이 밝혀졌다. 오늘날 다수의 생체 외 및 몇몇 동물 시험들은 각종 단백질 공급원들로부터 수득된 상이한 펩타이드들의 ACE 억제 효과를 입증하였다. 생체 외 ACE 억제 분석이 많은 상이한 펩타이드 서열들을 밝혀냈지만, ACE 억제 펩타이드가 혈액 중에서 순환하여 생체 내 효과를 발휘할 필요가 있음은 강조되어야 한다. 이는 효능 있는 ACE 억제 펩타이드는 위장 단백질분해 소화계에 의한 분해에 견디고 장벽에 걸쳐 후속의 운반 과정 동안 완전한 채로 유지되어야 함을 암시한다.

다양한 ACE 억제 펩타이드들에 대한 구조-작용 연구는 이들이 종종 C-말단 서열에서 Pro-Pro, Ala-Pro 또는 Ala-Hyp를 갖는다고 제안하였다(Maruyama, S. and Suzuki, H., 1982; Agric Biol Chem., 46(5):1393-1394). 이러한 발견은 ACE가 프롤린이 포함된 펩타이드 결합을 절단할 수 없는 펩티딜 다이펩티다제(EC3.4.15.1)라는 사실에 의해 부분적으로 설명된다. 따라서 Xaa-Pro-Pro 구조를 갖는 트라이펩타이드로부터 다이펩타이드 Pro-Pro를 절단시킬 수 없는데, 그 이유는 Xaa-Pro 결합을 절단할 수 없기 때문이다. 따라서, 상기 Xaa-Pro-Pro 구조를 갖는 트라이펩타이드가 비교적 고 농도로 존재하는 경우 상기 구조는 ACE 활성을 억제할 것임을 생각할 수 있다. ACE뿐만 아니라 거의 모든 단백질 분해 효소들이 Xaa-Pro 또는 Pro-Pro 결합의 절단을 어려워하기 때문에, 펩타이드의 카복시말단 단부에 (다수의) 프롤린 잔기들이 존재하면 비교적 프로테아제 내성인 분자가 생성된다는 개념은 거의 자명하다. 유사하게 프롤린 대신에 하이드록시프롤린(Hyp)을 함유하는 펩타이드는 비교적 프로테아제 내성이다. 이로부터 카복시말단 단부에 하나 이상의 (하이드록시)프롤린 잔기를 수반하는 펩타이드들은 위장관에서 단백질 분해적 분해를 모면할 것이라는 추론을 할 수 있다. 이러한 결론은 우리로 하여금 특정한 ACE 억제 펩타이드의 현저한 생체 내 혈압 강하 효과, 즉 상기 펩타이드가 ACE 억제에 대한 구조적 요건을 충족시킬 뿐만 아니라 위장 단백질 분해 소화계에 의한 분해에 견디고 장 벽에 걸친 후속적인 운반 과정 동안 완전한 채로 남아 있음을 이해할 수 있게 도와줄 것이다.

트라이펩타이드 Leu-Pro-Pro(JP02036127), Val-Pro-Pro(EP 0 583 074) 및 Ile-Pro-Pro(J. Dairy Sci., 78:777-7831995)에 대한 강한 ACE 억제 활성들이 보고되었다. 처음에 모든 ACE 억제 펩타이드들은 ACE 활성에 대한 그들의 생체 외 효과를 근거로 특성화되었으며 트라이펩타이드 Ile-Pro-Pro(이후부터 IPP라 칭함), Val-Pro-Pro(이후부터 VPP라 칭함) 및 Leu-Pro-Pro(이후부터 LPP라 칭함)가, 그들의 강한 ACE 억제 효과가 비교적 낮은 IC50 값을 생성시키기 때문에 두드러졌다. 나중에 트라이펩타이드 VPP뿐만 아니라 IPP의 추정된 고혈압 억제 효과가 자발적으로 고혈압인 래트에서 확인될 수 있었다(Nakamura et al., J. Dairy Sci., 78:12531257(1995)). 이러한 실험에서 상기 억제성 트라이펩타이드는 젖산균 발효된 우유로부터 획득되었다. 상기 우유 발효 중에 바람직한 펩타이드들이 증식하는 젖산균에 의해 생산된 프로테이나제에 의해 생성된다. 이러한 발효 접근법의 결점은 젖산균이 분비된 효소의 유형과 양을 조절하기 어려운 살아있는 유기체라는 것 이다. 따라서 상기 ACE 억제 펩타이드의 생산은 거의 재현하기 어려우며 또한 목적하는 펩타이드의 최대 수율을 보장하기 위해 최적의 효소 세트를 생산하는 것도 가망이 없는듯하다. 또한 필요한 발효 시간이 비교적 길며, 이는 낮은 수율과 함께 상기 생물활성 펩타이드의 불리한 비용 구조를 내포한다. 더욱이 발효된 제품은 기타 고형 식품에의 직접적인 혼입에 덜 적합하며 엄격한 관능 제한을 발생시킨다. 상기와 같은 발효유 제품들의 불량한 풍미성 및 상기와 같은 발효된 브로쓰로부터 ACE 억제 펩타이드의 회수 중 접하게 되는 많은 가공 어려움들이 미국 특허 제 6,428,812 호에 개시되었다. 이러한 단점들에도 불구하고, 발효유 제품들은 경구 투여되는 혈관확장제로서 실제 적용되어 왔다. ACE 억제 펩타이드를 전기투석, 중공 섬유막 투석 또는 크로마토그래피 방법들에 의해 발효유 제품으로부터 농축시켜 정제 또는 로젠지와 같은 농축된 식품 보조제의 형태로 시판할 수 있었다.

상기 언급한 발효 생산 경로의 결점들은 기타 특허 출원 WO 01/68115 및 EP 1 231 279에서 인정되었다. 상기 후자의 출원에서 우유 카제인으로부터 트라이펩타이드 Val-Pro-Pro 및 Ile-Pro-Pro를 회수하는 순수하게 효소에 의한 공정이 개시되어 있다. 상기 출원은 우유 카제인을 함유하는 물질을 프로테이나제 및 펩티다제로 절단함으로써 중간체 펩타이드를 경유하여 상기 트라이펩타이드를 제조하는 방법을 청구하고 있다. 이들 효소의 배양은 각각 12 시간 정도로 길게 걸릴 수 있으며 미생물 오염물질의 성장에 유리한 조건 하에서 수행된다. 상기 펩티다제와의 배양 전에, 상기 중간체 펩타이드를 바람직하게는 정제시키며 ACE 억제 펩타이드의 높은 최종 농도는 오직 상기 중간체 펩타이드의 추가적인 크로마토그래피 정제 단 계 후에만 수득될 수 있다.

발명의 요약

과학 문헌에서 다수의 상이한 펩타이드 및 가수분해산물은 혈압 강하 효과와 상관되었다. 더욱이, 많은 생리학적 기전들이 혈압 조절에 관여하는 것으로 공지되어 있다. 본 발명에 따라 상기 관련된 펩타이드 및 생리학적 기전들을, 주요 혈압 강하 성분으로서 가수분해 후 IPP를 갖는 펩타이드 분획을 생성시키는 적합한 단백질 기질을 선택함으로써 최소화한다. 본 발명자들은 상기와 같은 펩타이드 분획 카파 카제인 및 보다 바람직하게는 카파-카제인으로부터의 글리코마크로펩타이드(GMP)가 바람직한 출발점을 형성함을 발견하였다. 혈압 강하에서 상기와 같이 생성된 펩타이드 혼합물 또는 분획, 특히 IPP는 중요한 역할을 한다. IPP, VPP 및 다수의 다른 잠재적으로 생물활성인 펩타이드들의 혼합물을 생성시키는 종래 기술의 가수분해 방법과 대조적으로, 본 발명의 방법은 IPP의 생산에 의해 예를 들어 VPP의 생산을 방지하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따라서 바람직하게는 아미노산 서열에 -I-P-P- 서열을 포함하는 20 kDa 미만, 바람직하게는 10 kDa 미만의 분자량을 갖는 단백질을 출발 단백질로서 사용한다. 상기 언급한 바와 같이 GMP는 바람직한 기질 단백질이다. GMP를 본 발명에서 하기에 개시하는 바와 같이 카파-카제인으로부터 수득할 수 있다. 우유가 카파-카제인의 바람직한 기원이다. 다른 포유동물로부터의 젖, 예를 들어 염소 젖도 또한, 카파 카제인 분자의 GMP 부분이 -IPP- 서열을 포함한다면 사용될 수 있다. 모든 카파 카제인들이 소 키모신에 의해 절단될 수 있는 것이 아니기 때문에, 상기 GMP 부분을 수득하는 것은 보다 적합한 응고 효소의 사용을 필요로 할 수 있다.

본 발명은 아미노산 서열에 -V-P-P보다 6 배 이상 더 많은 -I-P-P-가 존재하는 단백질(또는 단백질들 또는 펩타이드들의 혼합물)의 용도를 개시한다. 바람직하게는 상기 -V-P-P- 서열은 상기 단백질 또는 펩타이드 서열(또는 가수분해용 기질로서 사용되는 단백질 또는 펩타이드 혼합물의 서열) 중에 존재하지 않는다. 바람직한 단백질 공급원은 -V-P-P-가 없는 단백질 또는 펩타이드 또는 -V-P-P가 없는 상기 단백질을 포함하는 단백질 또는 펩타이드의 혼합물이다. 따라서 상기 혼합물은 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 95% 이상(w/w)의, -V-P-P-가 없는 단백질(들) 또는 펩타이드들을 포함한다. 보다 바람직하게는 상기 -V-P-P- 서열은 -P-V-P-P- 또는 -A-V-P-P- 서열의 일부이다.

상기와 같은 단백질의 바람직한 예는 GMP(우유로부터 수득할 수 있는 글리코마크로펩타이드)이다.

본 발명의 목적은 혈압 강하 펩타이드 IPP를 순수한 상태로, 즉 상기 펩타이드 VPP에 의한 현저한 양의 오염 없이 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 혈압 강하 펩타이드 IPP를 값비싼 정제 단계를 사용하지 않고 매우 농축된 형태로 제공하는 것이다.

본 발명의 더욱 또 다른 목적은 상기 혈압 강하 펩타이드 IPP를 쓰지 않은 맛의 제형으로 제공하는 것이다. 이러한 쓰지 않은 맛의 제형은 바람직하게는 실시예 8에 정의된 바와 같이 2 이하의 쓴맛 강도를 갖는다.

본 발명의 더욱 또 다른 목적은 IPP를 바람직하게는 프롤린 특이적 프로테아제, 보다 바람직하게는 프롤린 특이적 엔도프로테아제, 및 가장 바람직하게는 최적의 산 pH를 갖는 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 사용하여 카파 카제인의 GMP 부분으로부터 선택적으로 절제하는 효소적 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 IPP를 GMP로부터 선택적으로 생성시키는 효소적 방법을 제공하는 것이며, 여기에서 상기 GMP를 바람직하게는 먼저 아미노펩티다제와 함께 배양하고 후속적으로, 바람직하게는 상기 아미노펩티다제가 더 이상 활성이지 않은 조건 하에서, 프롤린 특이적 프로테아제와 함께 배양한다.

본 발명의 목적은 또한 동일 제형 중에 오피오이드 펩타이드가 존재하지 않는 IPP 함유 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 IPP 함유 조성물을 저자극성 제형으로 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 15% 미만의 가수분해도를 갖는 펩타이드 혼합물 중의 IPP를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 가수분해산물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이며, 이때 상기 가수분해산물은 IPP를 포함하고 30% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 15% 미만의 가수분해도를 갖는다. 바람직하게는 상기 가수분해산물은 1% 이상, 보다 바람직하게는 2% 이상의 가수분해도를 갖는다.

본 발명의 목적은 또한 IPP를 포함하고 10%(w/)를 초과하지 않는, 바람직하 게는 7%를 초과하지 않는, 가장 바람직하게는 3%를 초과하지 않는 유리 아미노 수준을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 산 침전된 카제인으로부터 카파 카제인의 GMP 부분을 회수하는 방법을 제공하는 것이다.

더욱이 본 발명은 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제로서, 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제의 제조, 건강의 개선 또는 질병의 예방 및/또는 치료, 또는 높은 혈압(고혈압), 심부전, 전 당뇨병 또는 당뇨병, 비만, 내당능 장애(impaired glucose tolerance) 또는 스트레스와 같은 질병의 치료 또는 예방을 위한 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제의 제조를 위한, 본 발명의 조성물의 용도 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물의 용도를 제공한다.

바람직하게는 본 발명의 조성물은 식품 보조제의 형태, 로션, 젤, 또는 유화액 형태의 국소 도포제를 포함한 개인 보호 도포제의 형태, 또는 식품, 사료 또는 애완동물 식품 성분으로서 제공된다.

본 발명의 조성물을 또한 비만의 예방 또는 체중 조절을 위한 기능성 식품의 제조 또는 심혈관 건강 유지를 위한 기능성 식품의 제조를 위해 사용할 수 있으며, 바람직하게는 상기 심혈관 건강 유지는 안지오텐신-전환 효소의 억제 또는 혈중 콜레스테롤 수준의 조절을 포함한다.

본 발명의 조성물을 그의 소비자에게 건강상 이점을 제공할 수 있는 기능성 식품 중에 사용할 수 있으며, 상기 건강상 이점은 바람직하게는 비만의 예방, 체중 조절 및 심혈관 건강 유지 중에서 선택된다.

상기 기능성 식품은 바람직하게는 하나 이상의 B-비타민류 또는 3 내지 25 중량%의 스테롤을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해 생성된 조성물의 제조 및 상기 조성물의 식품, 음료 제품 또는 식품 보조제에의 혼입을 포함하는 상기 식품, 음료 제품 또는 식품 보조제의 제조 방법을 제공한다.

바람직하게는 상기 식품, 음료 제품 또는 식품 보조제를 마가린, 스프레드, 버터, 낙농 제품 또는 유장 함유 음료수, 바람직하게는 요구르트 또는 유제품, 예를 들어 요구르트 또는 유유의 그룹 중에서 선택한다.

본 발명은 펩타이드 IPP를, 아미노산 서열 중에 -V-P-P-에 비해 -I-P-P-를 다량으로 갖는, 바람직하게는 작은 분자량 단백질로부터 고 수율로 생성시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 카파 카제인, 보다 바람직하게는 카파 카제인의 GMP 분획을 사용한다. 상기 방법은 바람직하게는 단일 효소 배양 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 사용되는 단백질 기질에 대해 매우 특이적이지만, 다양한 단백질 분해 효소 제제를 사용하여 혈압 강하 활성을 비교적 순수한 상태로 획득할 수 있다. 단일 효소에서부터 복합 효소 혼합물에 이르는 범위의 적합한 단백질분해 효소 제제를 사용할 수 있다. 바람직하게는 프롤린의 카복시 말단에서 절단하는 단일 효소를 사용하며, 바람직하게 상기 효소는 프롤린 특이적 프로테아제 또는 프롤린 특이적 올리고펩티다제이다. 바람직하게는 상기 기질 분자는 -A-I-P-P- 또는 -P-I-P-P- 서열을 포함한다. 또한 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 적합한 아미노펩티다제와 함께 사용할 수 있다. 후자의 경우, 상기 GMP 함유 분획을 바람직하게는 먼저 예를 들어 pH 5 내지 8의 중성 부근의 조건 하에서 아미노펩티다제와 함께 배양한다. 이러한 접근방법은 또한 -X-I-P-P- 서열(여기에서 X는 임의의 아미노산 잔기를 나타낸다)을 포함하는 기질의 사용을 허용한다. 바람직하게는 상기 아미노펩티다제의 불활성화 후 또는 상기 아미노펩티다제가 불활성인 pH 조건 하에서, 상기 N-말단 절단된 GMP 분자를 프롤린 특이적 프로테아제와 배양한다. 바람직하게는 프롤린의 카복시말단에서 절단하는 프로테아제, 예를 들어 프롤린 특이적 엔도프로테아제뿐만 아니라, 아미노펩티다제 활성은 어떠한 오염성 엔도프로테아제 활성도 갖지 않는다. 바람직하게는 프롤린의 카복시말단에서 절단하는 프로테아제, 예를 들어 프롤린 특이적 엔도프로테아제뿐만 아니라, 아미노펩티다제 는 오염성 카복시펩티다제 활성을 갖지 않는다. 오염성 엔도프로테아제 활성이 없는 프롤린 특이적 엔도 프로테아제는 바람직하게는 1 초과, 보다 바람직하게는 100 초과의 프롤린 특이 활성/엔도 비를 갖는 효소 제제이다. 오염성 엔도프로테아제 활성이 없는 아미노펩티다제는 바람직하게는 0.1 이상, 보다 바람직하게는 0.5 이상 및 가장 바람직하게는 1 이상의 AP/엔도 비를 갖는 효소 제제이다.

오염성 카복실 펩티다제 활성이 없는 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 바람직하게는 1 이상, 보다 바람직하게는 10 이상의 프롤린 특이 활성/CPD 비를 갖는 효소 제제이다.

오염성 카복실 펩티다제 활성이 없는 아미노 펩티다제는 바람직하게는 0.1 이상, 보다 바람직하게는 0.3 이상의 AP/CPD를 갖는 효소 제제이다. 상기 언급한 비는 실시예 5에 개시된 바와 같이 측정된다.

상기 단백질 서열 중에 존재하는 -I-P-P- 서열의 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 또는 훨씬 더 바람직하게는 60% 이상 및 가장 바람직하게는 70% 이상은 펩타이드 IPP로 전환된다. 상기 프롤린 특이적 프로테아제는 바람직하게는 기질 단백질 자체와 같은 큰 단백질 분자를 가수분해시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 일반적으로는 24 시간 미만의 배양 시간을 가지며, 바람직하게는 상기 배양 시간은 10 시간 미만, 보다 바람직하게는 4 시간 미만이다. 상기 배양 온도는 일반적으로는 30 ℃ 초과, 바람직하게는 40 ℃ 초과, 보다 바람직하게는 50 ℃ 초과이다. 본 발명의 또 다른 태양은 상기 IPP 함유 펩타이드 혼합물을 경사분리, 원심분리 또는 여과에 의해 정제시켜 용해성 가수분해산물을 제조하는 방법이다.

본 발명은 또한

-1 내지 5 ㎎ IPP/g(건조 물질 및 단백질 기준) 또는 20 내지 50 ㎎ IPP/g(건조 물질 및 단백질 기준)을 포함하는 펩타이드 조성물, 및

-15 내지 90%(건조 물질 중량) 펩타이드 및 20 ㎎ IPP/g(건조 물질 및 단백질 기준), 바람직하게는 20 내지 100 ㎎ IPP/g(건조 물질 및 단백질 기준)을 포함하는 펩타이드 조성물

을 개시한다.

종래 기술에서 상기 트라이펩타이드 IPP, VPP 및 LPP는 유효 ACE 억제제로서 개시되었다. 공지된 아미노산 서열로부터 판단할 수 있는 바와 같이, 우유의 유장 단백질은 상기 3 개의 ACE 억제 트라이펩타이드들 중 임의의 것에 상응하는 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 따라서 펩타이드 IPP, VPP 및 LPP를 유장 단백질로부터 단리할 수 없다. 그러나, 상기 펩타이드는 우유의 카제인 분획 중에 존재한다. 예를 들어, 베타 카제인은 -I-P-P-(74-76), -V-P-P-(84-86)뿐만 아니라 -L-P-P-(151-153) 서열을 포함한다. 더욱이, 카파 카제인은 또한 -I-P-P-를 포함하지만 다른 2 개의 서열은 포함하지 않는다. 카파 카제인 중에 존재하는 상기 IPP 서열은 109-110 위치, 즉 카파 카제인 중의 독특한 키모신 Phe(105)-Met(106) 절단 부위의 몇몇 아미노산 카복시말단에 위치한다. 따라서 카파 카제인에서 상기 -I-P-P- 서열은 상기 분자의 GMP 부분 상에 위치한다. 본 발명자들은 효소 응고된 우유에서 상기 카파 카제인 유래된 IPP 존재가 치즈 유장 및 산 응고된 우유에서 침전된 카제인 부분에서 발견될 수 있음을 발견하였다.

중량-방식의 카파 카제인이 카제인의 중요한 분획은 아니라는 사실에도 불구하고, 본 발명자들은 분자의 관점에서 그의 존재가 매우 중요함에 주목하였다. 예를 들어 베타 카제인은 우유 ㎥ 당 거의 400 밀리몰의 농도로 존재하고 카파 카제인은 우유 ㎥ 당 180 밀리몰의 농도로 존재한다. 또한 치즈 유장에서 GMP는 중요한 분획을 나타낸다. 상기 합한 혈청 단백질의 농도가 ㎥ 당 320 밀리몰인 반면, GMP는 치즈 유장 ㎥ 당 400 밀리몰의 농도로 존재한다.

놀랍게도, GMP를 쉽게 수득할 수 있다. 본 발명에 따라 GMP를 선택된 pH 조건 하에서 키모신에 의한 효소 처리에 의해 산 침전된 카제인으로부터 선택적으로 유리시킬 수 있다. 치즈 유장으로부터 GMP의 단리는 보다 어렵지만, GMP 풍부 유장 분획을 수득하는 산업적인 공정들은 공지되어 있다. 상기 공지된 공정으로부터 수득된 이러한 상업적으로 입수할 수 있는 GMP 풍부 분획들이 현재 다양한 뉴트라슈티칼 용도에 사용되고 있다.

본 출원에서 혈압 강하 IPP를 매우 정제된 상태로 수득하기 위한 바람직한 출발 물질로서 GMP의 용도를 개시한다.

우유의 단백질 분획은 전형적으로는 마이셀성(micellar) 카제인 분획 및 용해된 유장 단백질 분획을 포함한다. 상기 유장 단백질 중에서 베타 락토글로불린 및 알파-락트알부민이 정량적으로 가장 중요하다. 상기 카제인 단백질 중에서 비교적 소수성인 알파- 및 베타-카제인이 정량적으로 우세하다. 카제인 마이셀은 카파 카제인에 의해 용액 중에서 유지된다. 카파 카제인의 친수성 부분(소위 글리코마크로펩타이드(GMP)라 칭함)은 상기 마이셀 표면으로부터 돌출되고 이에 의해 상기 소수성 카제인을 수성 용액 중에서 안정화시킨다.

다수의 잘 확립된 산업 공정에 따라, 상기 카제인 분획을 예를 들어 치즈의 제조를 위해 우유로부터 단리시킬 수 있다. 이러한 공정들 중 하나에서 우유를 산성화시켜 상기 우유로부터 카제인 분획을 선택적으로 침전시킨다. 상기 산 침전된 물질은 모든 카제인, 즉 알파, 베타, 카파 및 감마 카제인을 포함한다. 상기 침전되지 않은 산성화된 우유 분획을 "유청"이라 칭한다. 또 다른 공정에서 우유를 우유 응고 효소, 예를 들어 송아지 키모신("레닛")과 배양시킨다. 키모신은 상기 카파-카제인의 Phe(105)-Met(106) 펩타이드 결합을 매우 선택적으로 절단하는 프로테아제이다. 상기 반응에 의해 상기 카파-카제인의 친수성 GMP 부분을 절단하며 이에 의해 상기 마이셀성 카제인 분획이 즉시 응집되고 침전된다. 이 경우 상기 침전된 카제인 분획을 "커드(curd)"라 칭한다. 상기 카파 카제인의 GMP 부분이 잘라짐에 따라, 상기 효소적 접근법에서 친수성 GMP 단편은 용액 중에서 다양한 혈청 단백질들과 함께 남아 소위 "치즈" 또는 "스위트" 유장을 형성한다.

다양한 공보들이 GMP-풍부 우유 분획의 소비로부터의 생리학적 이점을 청구한다. 더욱 또한 GMP-풍부 치즈 유장 분획을 단리하기 위한 비용 효과적인 경로들을 개시하는 다양한 공보들이 존재한다. 예를 들어 한외 여과의 사용이 EP 1037537에 개시되어 있고 음이온성 수지의 용도가 미국 특허 제 6787158 호에 개시되어 있다.

본 발명의 하나의 태양은 혈압 강하제로서 GMP의 가수분해 산물의 용도에 관한 것이다. 본 발명자들은 GMP 중의 IPP 및 카복시말단 프롤린을 갖는 다른 펩타이드들의 비교적 높은 수준이 혈압 강하 효과와 관련될 수 있음을 발견하였다.

가수분해산물은 기질 단백질(단백질 가수분해산물 또는 가수분해된 단백질)의 가수분해에 의해 형성되는 생성물을 의미하며, 용해성 가수분해산물은 본 발명에서 또한 용해성 펩타이드 함유 조성물 또는 용해성 펩타이드, 또는 단백질 가수분해산물 및 용해성 가수분해산물의 혼합물을 포함하는 조성물로서 개시되는 단백질 가수분해산물의 (수)용해성 분획이다.

"펩타이드" 또는 "올리고펩타이드"는 본 발명에서 펩타이드 결합을 통해 결합된 2 개 이상의 아미노산의 쇄로서 정의된다. "펩타이드" 및 "올리고펩타이드"란 용어는 동의어(통상적으로 인식되는 바와 같이)로 간주되며 각각의 용어를 상황에 따라 호환적으로 사용할 수 있다. "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 본 발명에서 30 개 초과의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄로서 정의된다. 본 발명에서 모든 (올리고)펩타이드 및 폴리펩타이드 화학식 또는 서열을 통상적인 관행에 따라, 아미노 말단에서부터 카복시 말단의 방향으로 왼쪽에서부터 오른쪽으로 기입한다. 본 발명에 사용된 1 자 아미노산 코드는 당해 분야에 통상적으로 공지되어 있으며 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에서 찾을 수 있다.

오피오이드 펩타이드는 오피에이트 수용체에 결합할 수 있는 펩타이드이다.

IUMB로부터 모든 효소들의 분류 및 명칭에 대해 국제적으로 승인된 도표는 프로테아제들을 포함한다. 프로테아제 EC 번호에 대해 최근 경신된 IUMB 텍스트를 인터넷 사이트에서 찾을 수 있다: http://www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/4/11/. 상기 시스템에서 효소는 상기가 단일 반응을 촉진한다는 사실로 정의된다. 이는 여러 가지 상이한 단백질들이 모두 동일한 효소로서 개시되고, 하나보다 많은 반응을 촉진시키는 단백질이 하나보다 많은 효소로서 처리된다는 중요한 암시를 갖는다. 상기 시스템은 프로테아제를 엔도- 및 엑소프로테아제로 분류한다. 엔도프로테아제는 내부 펩타이드 결합을 가수분해하고, 엑소프로테아제는 말단 α-아미노 그룹에 인접한 펩타이드 결합("아미노펩티다제"), 또는 말단 카복실 그룹과 끝에서 두 번째 아미노산 사이의 펩타이드 결합("카복시펩티다제")을 가수분해하는 효소들이다. 상기 엔도프로테아제는 촉매 기전을 근거로 하위-하위 부류로 분류된다. 세린 엔도프로테아제(EC 3.4.21), 시스테인 엔도프로테아제(EC 3.4.22), 아스파트산 엔도프로테아제(EC 3.4.23), 메탈로엔도프로테아제(EC 3.4.24) 및 쓰레오닌 엔도프로테아제(EC 3.4.25)의 하위-하위 부류가 존재한다.

상기 아미노펩티다제는 3.4.11 부류이다. 하위 분류는 20 개의 상이한 아미노산들을 제거하는 상대적인 효율을 기준으로 한다. 좁은 특이성과 넓은 특이성을 갖는 아미노펩티다제들을 구분할 수 있다. 아미노펩티다제들은 단일 아미노 말단 아미노산들을 단백질 및 펩타이드 기질로부터 순차적으로 제거할 수 있다. 좁은 특이성을 갖는 아미노펩티다제는 P1 위치에서 상기 기질 펩타이드로부터 유리되는 아미노산 잔기의 유형에 대해 강한 선호를 나타낸다. 넓은 특이성을 갖는 아미노펩티다제는 N-말단 또는 P1 위치에서 일정 범위의 상이한 아미노산들을 방출시킬 수 있다(쉐쳐의 명명법에 따라: Schechter, I. and Berger, A. 1967. Biochem Biophys Res Commun 27:157-162). 카복시펩티다제는 단일 카복시 말단 아미노산들을 단백질 및 펩타이드 기질들로부터 순차적으로 제거할 수 있다. 상기 엔도프로테아제의 상황에 필적할만하게, 카복시펩티다제를 촉매 기전을 근거로 하위-하위 부류로 분류한다. 세린 유형 카복시펩티다제는 EC 3.4.16 부류이고, 메탈로카복시펩티다제는 EC 3.4.17 부류이며 시스테인 유형 카복시펩티다제는 EC 3.4.18 부류이다. 상기 EC의 값은 다양한 유형의 프로테아제 활성에 대한 표준 용어를 제공하고 특히 독특한 식별 번호 및 각각의 프로테아제에 대해 권장되는 명칭을 할당하는데 있어서 프로테아제 잔기를 목록으로 나타낸다.

상기 카파 카제인 분자의 GMP 부분은 길이가 64 아미노산 잔기인 폴리펩타이드이다. 모든 IPP가 정량적으로 회수되는 경우, 순수한 GMP 제제는 IPP를 VPP나 LPP에 의한 현저한 오염 없이 거의 5%(w/w)의 농도로 제공할 수 있다. 본 출원에서 임의로 단일 배양 단계에서 고 수율로 상기 IPP 트라이펩타이드를 상기 GMP 폴리펩타이드로부터 단리하는 여러 가지 단백질분해 방법들을 개시한다. 따라서 본 발명의 방법에 따라 IPP를 포함하는 조성물을 수득할 수 있으며, 이때 상기 IPP 농도는 복잡하고 비용이 드는 정제 공정, 예를 들어 크로마토그래피 단리 또는 정제의 필요 없이 간단한 정제 단계 후에 직접 또는 간접적으로 사용되기에 매우 충분하다.

첫 번째 단백질분해 방법에 따라 상기 단리된 GMP 분자를 복잡한 미생물 프로테아제 효소 제제, 예를 들어 스미자임(Sumizyme) FP(Shin Nihon) 또는 플라보자임(Flavorzyme)(NOVO) 또는 우마미자임(Umamizyme)(Amano)과 배양한다. 스미자임 FP, 플라보자임 및 우마미자임은 다양한 엔도단백질분해 효소 + 엑소단백질분해 활성을 함유하는 효소 제제, 예를 들어 아미노펩티다제 및 카복시펩티다제이다. 상기 효소 투여량 및 pH 조건을 조심스럽게 선택함으로써 본 발명자들은 상기 IPP 트라이펩타이드를 스미자임 FP이나 플라보자임 제제를 사용하여 단일 배양 단계로 수득할 수 있었다. 그러나, 상기 첫 번째 단백질 분해 전략의 단점은 존재하는 다양한 효소 활성들에 의해 다양한 상이한 펩타이드들이 형성될 수 있다는 것이다. 더욱이, 비교적 많은 양의 유리 아미노산이 생성되며, 이는 상기 가수분해산물을 추가로 정제하지 않는 경우 최종 IPP 함유 생성물에 대해 브로쓰 맛의 이미(off-taste)를 부여할 것이다.

두 번째 단백질 분해 방법에 따라 상기 단리된 GMP 분자를 프롤린 특이적 올리고펩티다제(EC 3.4.21.26) 또는 프롤린 특이적 엔도펩티다제와 함께 배양한다. 상기 접근법에서 상기 2 가지 유형의 효소의 독특한 특이성은 유리하게 사용된다. 상기 두 유형의 프롤린 특이적 프로테아제는 모두 바람직하게는 프롤린 잔기의 C-말단 펩타이드 결합을 가수분해시킨다. 그러나, 이들 2 개 효소의 고유한 부 활성은 알라닌 잔기의 C-말단의 가수분해에 관한 것이다. 상기 -I-P-P- 서열은 GMP 중에 존재 시 N-말단에서 알라닌 잔기가 선행하므로, GMP를 순수한 프롤린 특이적 올리고펩티다제 또는 순수한 프롤린 특이적 엔도펩티다제와 배양하면 IPP가 직접 생성된다. 이러한 경로의 중요한 이점은 매우 쓴 이미를 도출시키고 심지어 바람직하지 못한 생물활성을 발휘하게 할 수 있는 다수의 다른 펩타이드들의 동시적인 발생 없이 높은 IPP 수율이 획득된다는 것이다. 더욱 또한 상기 공정 중에 거의 어떠한 유리 아미노산도 생성되지 않으며 따라서 고 농도의 IPP를 갖는 맛이 좋은 제품이 수득된다.

추가의 단백질분해 방법에 따라 상기 단리된 GMP 분자를 먼저 아미노펩티다제와 배양하여 GMP에서 상기 IPP 서열에 선행하는 GMP N-말단 아미노산(Met 및 Ala)을 제거한다. 오직 상기 배양 후에만 상기 프롤린 특이적 프로테아제를 반응 혼합물에 가하여 상기 IPP 펩타이드를 방출시킨다. 바람직하게는 상기 아미노펩티다제는 상기 프롤린 특이적 프로테아제와 배양 중에 또는 상기 배양 후에 더 이상 활성이 아니다. 본 발명자들은 상기 접근법이 보다 높은 IPP 수율은 유도하지만 이맛 생성은 유도하지 않으며 최종 생성물 중에 존재하는 유리 아미노산의 양에 거의 기여하지 않음을 발견하였다. 더욱이, IPP는 또한 다른 펩타이드에 비해, 특히 트라이펩타이드에 비해 다량으로 존재한다. 상기 제조된 IPP를 보다 큰 펩타이드로부터 추가로 분리시킬 수 있다. 아미노펩티다제가 아미노산들을 펩타이드의 N-말단 단부로부터 순차적으로 제거할 수 있으므로, 상기 IPP 서열에 선행하는 메티오닌("M") 및 알라닌("A") 잔기를 효율적으로 유리시킬 수 있는 아미노펩타이드분해적 효소 활성이 필요하다. IPP 트라이펩타이드 중에 존재하는 I-P 및 P-P 펩타이드 결합은 효소 절단에 견디며 완전한 GMP 분자의 배양 후에 상기와 같은 아미노펩타이드 분해 활성은 상기 GMP 분자의 N-말단을 불활성화시켜 서열 IPP로 출발할 것이다.

목적하는 아미노펩티다제 활성을 갖는 상업적인 효소 제제는 코롤라제(Corolase) LAP(AB Enzymes)이다. 코롤라제 LAP는 아스퍼질러스로부터의 비교적 순수한, 클로닝되고 과발현된 류신 아미노펩티다제를 나타낸다. 상기 제제는 특이화되지 않은 엔도단백질 분해 및 카복시펩타이드분해 활성이 부족하므로, 상기 GMP 기질 분자의 바람직하지 못한 절단이 방지된다. 비교적 넓은 특이성을 갖는 또 다른 클로닝되고 과발현된 아미노펩티다제는 에이. 니거로부터의 아미노펩티다제(서열식별번호 171, WO 02/068623)이다.

최종적으로 본 발명자들은 GMP가 IPP를 발효 경로에 의해 생산하는 방법들에 유리하게 사용됨에 주목하였다. 실시예에 예시된 바와 같이, GMP를 특정한 락토바실러스와 배양하면 전유 발효의 특징인 이맛의 생성 없이 IPP가 생성된다.

모든 상기 언급한 태양들은 이들이 불필요한 생물활성 또는 맛 또는 냄새 프로파일 없이 고도로 표준화된 생성물을 생산하게 하므로 특히 중요하다. 상기와 같은 고도로 표준화된 생성물을 후속의 정제 단계 없이 다양한 식품 용도 또는 농축된 식이성 제품들, 예를 들어 정제 또는 로젠지에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어 보다 작은 정제 또는 로젠지를 제조하기 위해서, 훨씬 더 높은 IPP 농도를 함유하는 고도로 표준화된 생성물들은 IPP 이외의 펩타이드들을 선택적으로 제거함으로써 수득할 수 있다. 현저한 혈압 강하 활성이 없는 상기와 같은 펩타이드들의 제거는 예를 들어 상기 불활성 펩타이드들을 침전시킨 다음 (한외) 여과 또는 경사분리 단계에 의해 수행될 수 있다. 더욱 또 다른 접근법에서, 상기 생물활성 성분의 농도를, 펩타이드 IPP의 매우 소수성인 특성을 이용하는 후속 정제에 의해 추가로 증가시킬 수 있다. 이러한 정제 방법은 나노여과, 예를 들어 부탄올에 의한 추출에 이은 증발/침전 또는 수득된 산성화된 가수분해산물을 활성탄 또는 크로마토그래피 수지(예를 들어 Amberlite XAD 범위(Rohm))와 같은 결합제와 접촉시킴을 포함한다. 또한, 예를 들어 파마시아(Pharmacia)에 의해 공급된 부틸-세파로스 수지를 사용할 수 있다. 상기와 같은 물질로부터 혈압 강하 펩타이드의 탈착을 유기 용매, 예를 들어 메탄올/에탄올 혼합물 또는 프로판올에 의해 수행할 수 있다. 더욱 또한 CO₂ 또는 N₂O를 사용한 초임계 추출을 사용하여 고도로 정제된 생물활성 펩타이드를 수득할 수 있다.

EP 1 231 279에는 우유 카제인으로부터 트라이펩타이드 VPP 및 IPP를 회수하는 순수한 효소 방법이 개시되어 있다. 상기 출원은 우유 카제인을 함유하는 물질을, 서열 -V-P-P-는 함유하지만 상기 서열 중의 것 이외에 Pro는 함유하지 않는 펩타이드뿐만 아니라 서열 -I-P-P-는 함유하지만 상기 서열 중의 것 이외에 Pro는 함유하지 않는 펩타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 소위 "중간체 펩타이드"를 통해 프로테이나제 및 펩티다제로 절단하여 트라이펩타이드를 제조하는 방법을 청구한다. EP 1 231 279의 실시예에 개시된 바와 같이 상기 방법은 2 단계 공정을 수반한다. 먼저 VPP 또는 IPP를 포함하는 중간체 펩타이드를 제조한다. 이는 실시예들 중 하나에 따라 37 ℃에서 12 시간의 기간 동안 카제인을 적합한 프로테이나제와 배양함으로써 수행된다. 이어서 상기 사용된 프로테이나제를, 상기 첫 번째 가수분해산물을 100 ℃로 3 분간 가열함으로써 불활성화시키며, 다시 냉각시킨 후에, 또 다른 효소 제제(실제로 엑소단백질 분해 활성을 갖는 제제)를 가한다. 상기 다른 효소 제제와 37 ℃에서 추가로 12 시간 배양 후에 상기 트라이펩타이드 VPP 및 IPP의 존재를 입증할 수 있다. 보다 높은 수율의 상기 ACE 억제 펩타이드를 수득하기 위해서, EP 1 231 279 호는 상기 중간체 펩타이드를 상기 엑소단백질 분해 활성에 노출시키기 전에 정제 및 농축시킬 것을 또한 제안한다. EP 1 231 279는 또한 상기 중간체 펩타이드를 수득한 후 및 상기 중간체 펩타이드를 상기 펩티다제와 접촉시키기 전에 상기 과정에서 다양한 작업들, 예를 들어 5000 내지 20000 rpm에서 3 내지 10 분간의 원심분리에 의해, 반응하지 않은 단백질들의 제거를 임의로 수행할 수 있다. 따라서 목적하는 트라이펩타이드들의 복합 혼합물을 비실제적인 2 단계 효소 방법보다는 산업적으로 수득한다. 상기 각각의 효소 배양은 pH 4.5 내지 7.0 및 25 내지 50 ℃의 온도에서 12 시간 정도가 걸릴 수 있으므로, 상기 과정도 또한 미생물학적 관점에서 허용될 수 없음은 자명하다. 25 내지 50 ℃의 낮은 배양 온도와 병행된 이러한 긴 배양 시간은 상기 단백질 함유 용액을 쉽게 감염시킬 수 있다.

EP 1 231 279에 개시된 방법과 비교 시, 본 출원에 명시된 본 발명 단계의 간결함은 분명해질 것이다. 무엇보다도, 본 출원은 단지 카파 카제인의 GMP 단편만을 사용할 것을 개시한다. 그 결과, 오직 IPP만이 방출될 것이며 카제인에 의해 포함되는 것으로 공지된 다수의 다른, 잠재적으로는 매우 쓴맛의 펩타이드가 생성되지 않는다. 두 번째로, 프롤린 특이적인 프로테아제를 사용하는 본 발명에 따른 배양을 단일 배양 단계에서 단일의 순수한 효소에 의해 수행한다. 상기 프롤린 특이적 프로테아제의 매우 선택적인 절단 패턴(이는 상기 특정한 엔도프로테아제 고유의 것이다)으로 인해, 목적하는 IPP 펩타이드가 매우 제한된 수의 다른 펩타이드들과 동시에 바로 방출된다. 놀랍게도, EP 1 231 279에 언급된 바와 같은 "중간체 펩타이드"는 형성되지 않는다. 세 번째로, GMP 카제인 단편을 먼저 순수한 아미노펩티다제와 배양한 다음 프롤린 특이적 프로테아제와 배양하는 본 발명에 따른 배양은 EP 1 231 279에 개시된 경로와 본질적으로 상이하며 여전히 IPP를 높은 효율 및 최소의 펩타이드 오염 및 유리 아미노산 수준으로 방출시킨다. 바람직한 배양은 프로테이나제 대신에 아미노펩티다제(EP 1 231 279에 따른 "펩티다제")로 출발하며 "중간체 펩타이드"를 생성시키지 않는다. 하기의 단계에서 프로테이나제 대신에 엔도프로테아제를 사용하며 다시 "중간체 펩타이드"는 형성되지 않는다.

종래 기술의 제품에 대해 언급된 모든 단점들에도 불구하고, 발효유 제품은 경구 투여되는 혈관확장제로서 실제 적용되어 왔다. ACE 억제 펩타이드를 또한 전기투석, 중공 섬유막 투석 또는 크로마토그래피 방법들에 의해 발효유 제품으로부터 농축시켜 정제 또는 로젠지와 같은 농축된 식품 보조제의 형태로 시판할 수 있었다.

본 발명의 목적은 상기 펩타이드 IPP를 순수한 상태로, 즉 VPP 또는 LPP와 같은 상기 펩타이드에 의한 현저한 오염 없이 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 IPP를 값비싼 정제 단계를 사용하지 않고 매우 농축된 형태로 제공하는 것이다.

본 발명의 더욱 또 다른 목적은 상기 혈압 강하 펩타이드 IPP를 쓰지 않은 맛의 제형으로 제공하는 것이다.

본 발명은 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제로서 사용하기 위한 펩타이드 함유 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제로서 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 건강의 개선 또는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 뉴트라슈티칼, 바람직하게는 약제의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 고혈압 및 심부전과 같은 심혈관 질병의 치료를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 전 당뇨병 또는 당뇨병의 치료를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 비만의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 혈장 인슐린의 증가 또는 혈장 인슐린에 대한 민감성의 증가를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 혈장 인슐린의 증가, 또는 2형 당뇨병 또는 전 당뇨병의 혈장 인슐린에 대한 민감성의 증가를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 2형 당뇨병 또는 전 당뇨병의 식후 혈당 농도의 강하를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 2형 당뇨병 또는 전 당뇨병의 식후 혈중 인슐린 분비의 증가를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 식품 보조제의 형태로 존재하는 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 스트레스의 영향을 치료하기 위한 기능성 식품의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 바람직하게는 개인용 보호 용도의 국소 적용에서 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도, 및 사료 및 애완동물 식품에서 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도에 관한 것이다.

더욱 또한 본 발명은 1형 및 2형 당뇨병의 치료, 및 전 당뇨병 또는 내당능 장애(IGT)를 갖는 개인에서 2형 당뇨병의 예방 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 투여함을 포함하며, 또한 본 발명은 고혈압 또는 심부전을 앓고 있는 사람의 치료 또는 그의 예방 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 투여함을 포함하고, 따라서 상기 방법은 혈압 강하 효과를 나타낸다. ACE 억제는 혈관수축을 감소시키고, 혈관확장을 향상시키며, 나트륨 및 물 분비를 개선시키고, 이들은 차례로 말초 혈관 내성 및 혈압을 감소시키고 국소 혈행을 개선시킨다. 따라서, 펩타이드를 포함하는 본 발명의 가수분해산물은 ACE 억제에 의해 영향을 받을 수 있는 질병들, 예를 들어 비 제한적으로 고혈압, 심부전, 협심증, 심근 경색, 발작, 말초 동맥 폐쇄 질병, 동맥 경화증, 신장병증, 신부전, 발기 기능장애, 혈관내피세포손상, 좌심실 비대증, 당뇨성 혈관병증, 수액 정체, 및 고알도스테론혈증의 예방 및 치료에 특히 효능이 있다. 상기 조성물은 또한 위장 장애(설사, 과민성 장 증후군), 염증, 당뇨병, 비만, 치매, 간질, 노인성 착란, 및 메니에르 병의 예방 및 치료에 유용할 수 있다. 더욱 또한, 상기 조성물은 인지 기능 및 기억력(알쯔하이머 병 포함), 포만감, 제한 허혈성 손상을 향상시키고, 우회술 또는 혈관성형술 후 동맥의 재폐쇄를 예방할 수 있다.

당뇨병은 지금까지 치유되지 않고 있는 만연된 만성 질병이다. 당뇨병의 발병률 및 만연성은 기하급수적으로 증가하고 있으며 선진국 및 개발도상국에서 가장 흔한 대사 장애 중 하나이다. 당뇨병은 다수의 원인 인자들로부터 유래하는 복잡한 질병이며 인슐린 분비 및/또는 인슐린 내성의 결핍과 관련된 손상된 탄수화물, 단백질 및 지방 대사를 특징으로 한다. 이는 상승된 금식 및 식후 혈청 글루코스 농도를 발생시켜, 치료되지 않고 방치되는 경우 합병증을 유발시킨다. 상기 질병의 2 가지 큰 범주, 즉 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM, T1DM) 및 비 인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM, T2DM)이 존재한다. T1DM = 1형 당뇨병. T2DM = 2형 당뇨병.

T1DM 및 T2DM 당뇨병은 고혈당증, 고콜레스테롤혈증 및 고지질혈증과 관련이 있다. 각각 T1DM 및 T2DM에서 절대 인슐린 결핍 및 인슐린에 대한 둔감성은 간, 근육 및 지방 조직에 의한 글루코스 이용을 감소시키고 혈당 수준을 증가시킨다. 조절되지 않는 고혈당증은 미세혈관 및 거대혈관 질병, 예를 들어 신장병증, 신경병증, 망막병증, 고혈압, 발작 및 심장병의 증가된 위험으로 인한 증가된 사망률 및 조기 사망률과 관련된다. 최근의 증거는 엄격한 혈당 조절이 T1DM 및 T2DM 모두에서 상기 합병증들의 예방에 주요 인자임을 입증하였다. 따라서, 약물 또는 치료 섭생에 의한 최적의 혈당 조절은 당뇨병의 치료에 중요한 접근 방법이다.

T2DM의 치료는 처음에 식이요법과 생활방식의 변화를 수반하며, 상기 수단들이 적합한 혈당 조절을 유지하는데 실패하는 경우 환자들을 경구 혈당강하제 및/또는 외부 인슐린으로 치료한다. T2DM의 치료를 위한 현행 경구 약제는 인슐린 분비를 강화하는 약제(설포닐유레아제), 간에서 인슐린의 작용을 개선시키는 약제(바이구아나이드제), 인슐린 증감제(티아졸리딘다이온) 및 글루코스의 흡수를 억제하는 작용을 하는 약제(α-글루코시다제 억제제)를 포함한다. 그러나, 현재 입수할 수 있는 작용제들은 일반적으로는 췌장 세포 기능의 점진적인 상실로부터 발생하는 고혈당증의 점진적인 악화로 인해 장기적인 적합한 혈당 조절의 유지에 실패한다. 표적 혈당 수준을 유지할 수 있는 환자의 비율은 시간이 지남에 따라 현저하게 감소하는데, 이는 추가적인/또 다른 약제의 투여를 필요로 한다. 더욱 또한, 상기 약물은 불필요한 부작용을 가질 수 있고 높은 1 차 및 2 차 실패율과 관련된다. 마지막으로, 혈당강하 약물의 사용은 혈당 수준의 조절에 유효할 수 있지만, 당뇨병의 모든 합병증들을 예방할 수는 없다. 따라서, 모든 유형의 당뇨병에 대한 현행 치료 방법은 이상적인 정상혈당 및 당뇨 합병증의 예방을 성취하지 못한다. 따라서, T1DM 및 T2DM의 치료에서 선택되는 요법은 필수적으로 인슐린 및 경구 혈당강하 약물의 투여를 기본으로 하지만, 최소의 부작용으로 당뇨병을 치료 및 예방하기 위한 안전하고 유효한 영양 보충제가 필요하다. 많은 환자들은 고 용량의 약물과 관련된 부작용을 최소화할 수 있고 추가적인 임상적 이점을 생성시킬 수 있는 대체 요법에 관심이 있다. 당뇨 환자들은 순한 당뇨병 억제 효과를 갖고 큰 부작용이 없는 "천연"으로서 간주되는 치료(보조 치료로서 사용될 수 있다)에 특별한 관심을 갖는다. T2DM은 진행성이고 만성인 질병으로, 대개는 인슐린 생산에 기여하는 췌장 세포(랑게르한스 섬의 β 세포)에 현저한 손상이 나타날 때까지 인지하지 못한다. 따라서, β 세포 손상을 예방하고 따라서 위험군인 사람들, 특히 높은 T2DM 발병 위험이 있는 노인들에서 명백한 T2DM으로 진행하는 것을 방지하는데 사용될 수 있는 식품 보조제의 개발에 대한 관심이 증가하고 있다. 췌장 β-세포의 보호는 글루코스 및 지질이 β 세포에 대해 손상 효과를 발휘하므로 혈중 글루코스 및/또는 지질을 감소시킴으로써 성취될 수 있다. 혈당 수준의 감소는 상이한 기전들을 통해, 예를 들어 인슐린 민감성을 향상시키고/시키거나 간 글루코스 생산을 감소시킴으로써 성취될 수 있다. 혈중 지질 수준의 감소는 상이한 기전들을 통해, 예를 들어 지질 산화 및/또는 지질 저장을 향상시킴으로써 또한 성취될 수 있다. 췌장 β 세포를 보호하기 위한 또 다른 가능한 전략은 산화 스트레스를 감소시키는 것일 수 있다. 산화 스트레스는 또한 β 세포 손상을 유발하며 후속적으로 인슐린 분비를 상실시키고 분명한 T2DM으로 진행시킨다.

따라서, T2DM은 다수의 기관 부위들에서 공존하는 결함, 즉 근육 및 지방 조직에서 인슐린 작용에 대한 내성, 결함성 췌장 인슐린 분비, 억제되지 않는 간 글루코스 생산으로부터 발생하는 복잡한 질병이다. 상기 결함들은 종종 지질 이상 및 혈관내피세포손상과 관련된다. T2DM에서 다수의 병태생리학적 병변들이 제공되는 경우, 복합 요법이 그의 관리에 매력적인 접근방법이다.

본 발명은 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 포함하는 신규의 뉴트라슈티칼 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 포함하는 뉴트라슈티칼 조성물은 당뇨병, 또는 내당능 장애와 관련된 다른 질병, 예를 들어 증후군 X의 치료 또는 예방을 위한 활성 성분으로서 가수분해되지 않은 단백질 및 탄수화물을 또한 포함할 수 있다. 또 다른 태양에서 본 발명은 상기 치료 또는 에방을 위한 영양 보충제로서, 예를 들어 정상적인 대사 기능의 유지에 필수적이지만 체 내에서 합성되지 않는 비타민과 무기질을 포함하는 멀티 비타민 제제에 대한 첨가제로서 상기와 같은 조성물의 용도에 관한 것이다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 1형 및 2형 당뇨병 모두의 치료, 및 전 당뇨병 또는 내당능 장애(IGT) 또는 비만이 있는 개인들에서 T2DM의 예방을 위한 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기와 같은 치료가 필요한 환자에게 본 발명의 펩타이드 함유 조성물 및 단백질 가수분해산물 또는 가수분해되지 않은 단백질 및/또는 탄수화물을 투여함을 포함한다.

본 발명의 조성물을 T1DM 및 T2DM 모두의 치료, 및 전 당뇨병 또는 내당능 장애(IGT)를 갖는 개인에서 T2DM의 예방을 위해 특별히 사용하고자 한다.

본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 바람직하게는 식후 글루코스 농도를 강하시키거나 또는 식후 혈중 인슐린 분비를 증가시키기 위해 2형 당뇨병 또는 전 당뇨병에 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

펩타이드 및 임의로 탄수화물을 포함하는 조성물은 인슐린 분비를 자극하며 인슐린 민감성 표적 조직, 예를 들어 지방 조직, 골격근 및 간으로의 글루코스 배치를 증가시키고 따라서 당뇨병의 치료에서 상승효과를 제공한다.

일반적으로 스트레스 관련된 질병, 및 신체에 대한 스트레스의 부정적인 영향은 많은 사람들에게 중대한 영향을 미치는 것으로 인식되고 있다. 최근 수년간 스트레스의 영향, 및 다양한 질병 및 질환들의 발생에 대한 그의 기여는 의학 및 과학 사회에서 보다 광범위하게 받아들여졌다. 소비자들은 현재 이러한 잠재적인 문제점들을 점점 더 크게 인식하고 있는 중이며 그들의 건강에 대한 스트레스의 가능한 부정적인 영향을 감소 또는 예방하는데 점점 더 관심을 가져가고 있는 중이다.

본 발명의 추가의 목적은 신체가 스트레스의 영향을 다룰 수 있게 돕는데 사용하기에 적합한 식품 또는 상기 중에 혼입시킬 수 있는 성분을 제공하는 것이다.

추가의 목적은 신체가 스트레스의 부정적인 영향을 다룰 수 있게 돕는 바와 같은 건강상 이점을 제공하는 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 포함하는 식품을 제공하는 것이다.

본 발명에 사용된 바와 같은 뉴트라슈티칼이란 용어는 영양학 및 약학 적용 분야 모두에서 유용성을 나타낸다. 따라서, 상기 신규의 뉴트라슈티칼 조성물은 식품 및 음료수에 대한 보충제로서, 및 캡슐 또는 정제와 같은 고체 제형, 또는 용액 또는 현탁액과 같은 액체 제형일 수 있는 경구 또는 비 경구용 약제 또는 약학 제형으로서 사용될 수 있다. 상기로부터 자명한 바와 같이, 상기 뉴트라슈티칼 조성물이란 용어는 본 발명의 펩타이드 함유 조성물 및 임의로 탄수화물뿐만 아니라 상기 활성 성분을 포함하는 보충 조성물, 예를 들어 식품 보조제를 포함하는 식품 및 음료수를 또한 포함한다.

본 발명에 사용된 바와 같은 식품 보조제란 용어는 음식물을 보충하고자 사용되는 "식이성 성분"을 함유하는, 입으로 섭취되는 제품을 나타낸다. 상기 제품에서 "식이성 성분"은 비타민, 무기질, 허브 또는 다른 식물, 아미노산, 및 효소, 기관 조직, 선 및 대사산물과 같은 물질들을 포함할 수 있다. 식품 보조제는 또한 추출물이거나 농축물일 수 있으며, 정제, 캡슐, 연질젤, 젤캡, 액체 또는 분말과 같은 다수의 형태들로 발견될 수 있다. 이들은 또한 다른 형태, 예를 들어 막대형일 수 있지만, 이러한 경우 상기 식품 보조제의 표지상의 정보는 일반적으로 상기 제품을 통상적인 식품이나 식사 또는 음식물의 단일 품목으로서 나타내지 않을 것이다.

멀티 비타민 및 무기질 보충제를 본 발명의 뉴트라슈티칼 조성물에 가하여 일부 식품에 빠진 적합한 양의 필수 영양소를 획득할 수 있다. 상기 멀티 비타민 및 무기질 보충제는 또한 질병 예방 및 영양 손실에 대한 보호, 및 생활방식 패턴 및 당뇨환자들에서 때때로 관찰되는 통상적인 부적합한 식사 패턴으로 인한 영양소 결핍에 유용할 수 있다. 더욱이, 산화 스트레스는 인슐린 내성의 발생에 연루되어 왔다. 반응성 산소 종들은 인슐린 수용체 신호전달 연쇄반응을 방해함으로써 인슐린 자극된 글루코스 흡수를 손상시킬 수 있다. α-토코페롤(비타민 E) 아스코르브산(비타민 C)과 같은 산화방지제에 의한 산화 스트레스의 조절은 당뇨병의 치료에 중요할 수 있다. 따라서, 멀티 비타민 보충제의 섭취량을 상기 언급한 활성 물질에 첨가하여 잘 균형잡힌 영양공급을 유지시킬 수 있다.

더욱 또한, 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 마그네슘(Mg^{2 +}), 칼슘(Ca^{2 +}) 및/또는 칼륨(K⁺)과 같은 무기질과의 조합을 건강 개선 및 비 제한적으로 심혈관 질병 및 당뇨병을 포함한 질병의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양에서, 본 발명의 뉴트라슈티칼 조성물은 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 함유한다. IPP는 본 발명에 따른 조성물 중에 상기 조성물이 투여되는 환자의 체중 ㎏ 당 약 0.001 g 내지 약 1 g의 1일 투여량을 제공하는 양으로 존재한다. 식품 또는 음료수는 적합하게는 1 회분당 약 0.05 g 내지 약 50 g의 IPP를 함유한다. 상기 뉴트라슈티칼 조성물이 약학 제형인 경우, 상기와 같은 제형은 IPP를 투여 단위, 예를 들어 캡슐 또는 정제 당 약 0.001 내지 약 1 g, 또는 액체 제형의 1일 용량당 약 0.035 g 내지 약 70 g의 양으로 함유할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 함유 조성물은 적합하게는 본 발명에 따른 조성물 중에 상기 조성물이 투여되는 환자의 체중 ㎏당 약 0.01 내지 약 3 g의 1일 투여량을 제공하는 양으로 존재한다. 식품 또는 음료수는 적합하게는 1 회분당 약 0.1 g 내지 약 100 g의 단백질 가수분해산물을 함유한다. 상기 뉴트라슈티칼 조성물이 약학 제형인 경우, 상기와 같은 제형은 펩타이드 함유 조성물을 투여 단위, 예를 들어 캡슐 또는 정제 당 약 0.01 내지 약 5 g, 또는 액체 제형의 1일 용량당 약 0.7 g 내지 약 210 g의 양으로 함유할 수 있다.

본 발명의 더욱 또 다른 바람직한 태양에서 조성물은 상기 명시한 바와 같은 본 발명의 펩타이드 및 임의로 탄수화물을 포함한다. 탄수화물은 적합하게는 본 발명에 따른 조성물 중에 상기 조성물이 투여되는 환자의 체중 ㎏당 약 0.01 내지 약 7 g의 1일 투여량을 제공하는 양으로 존재한다. 식품 또는 음료수는 적합하게는 1 회분당 약 0.5 g 내지 약 200 g의 탄수화물을 함유한다. 상기 뉴트라슈티칼 조성물이 약학 제형인 경우, 상기와 같은 제형은 탄수화물을 투여 단위, 예를 들어 캡슐 또는 정제 당 약 0.05 내지 약 10 g, 또는 액체 제형의 1일 용량당 약 0.7 g 내지 약 490 g의 양으로 함유할 수 있다.

투여량 범위(70 ㎏인 사람의 경우)

IPP: 0.005 내지 70 g/일(각각)

단백질 가수분해산물: 0.07 - 210 g/일

가수분해되지 않은 단백질: 0.07 - 210 g/일

탄수화물: 0.1 - 490 g/일

본 발명의 목적은 식용 물질을 소비하는 환자에게 건강상 이점을 제공하는데 사용될 수 있는 상기 물질을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 편의상 단리된 형태로 소화되거나 또는 식품에 혼입될 수 있는 상기와 같은 식용 물질을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 체중 조절 프로그램에 사용하기에 적합한 식품, 또는 상기 중에 혼입할 수 있는 성분을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가의 목적은 예를 들어 ACE 억제를 통해 심혈관 건강을 유지하는 것을 돕는데 적합한 식품, 또는 상기 중에 혼입할 수 있는 성분을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 허용 가능한 안정성 및/또는 관능 성질, 특히 좋은 맛, 예를 들어 허용 가능한 수준의 쓴맛이 존재하지 않는 식품, 또는 상기 중에 혼입할 수 있는 성분을 제공하는 것이다. 추가의 목적은 건강상 이점을 제공하는, 예를 들어 비만의 예방/체중 조절을 돕고/돕거나 심혈관 건강의 유지를 돕는 고 농도의 성분을 갖는 식품을 제공하는 것이다.

놀랍게도, 상기 목적들 중 하나 이상을 소비 시 건강상 이점을 제공하는 식품의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 사용에 의해 본 발명에 따라 획득한다.

첫 번째 태양에 따라 본 발명은 비만의 예방 또는 체중 조절을 위한 기능성 식품의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도를 제공한다.

두 번째 태양에 따라 본 발명은 심혈관 건강 유지를 위한 기능성 식품의 제조를 위한 본 발명의 펩타이드 함유 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명에 따라 특히 바람직하게 심혈관 건강 유지는 안지오텐신-전환(ACE) 효소의 억제 및/또는 혈당 수준의 조절을 포함한다.

세 번째 태양에 따라 본 발명은 소비자에게 건강상 이점을 제공할 수 있고 본 발명의 펩타이드 함유 조성물을 포함할 수 있는 기능성 식품을 제공하며, 상기 건강상 이점은 비만의 예방, 체중 조절 및 심혈관 건강 유지 중에서 선택된다.

본 발명에 따른 펩타이드 함유 조성물의 추가의 이점은 상기 펩타이드 함유 조성물을 편의상 식품에 혼입시켜, 상기 식품의 안정성 및/또는 그의 관능 특성에 허용 가능하지 않은 영향을 미치지 않으면서 기능성 식품을 제공할 수 있다는 것이다.

본 발명에 따른 "건강상 유리한 작용제(들)"는 건강상 이점을 제공하는, 즉 섭취 시 건강의 태양에 긍정적인 효과를 갖거나 양호한 건강의 태양을 유지하는데 일조하는 물질이며, 이러한 양호한 건강의 태양은 비만의 예방, 체중 조절 및 심혈관 건강 유지이다. "건강상 이점"은 건강의 태양에 긍정적인 영향을 미치거나 양호한 건강의 태양을 유지하는데 일조함을 의미한다.

본 발명에 따른 "기능성 식품"은 인간 소비에 적합한 식품(의심을 피하기 위해서 음료수를 포함함)으로서 정의되며, 여기에서 본 발명의 펩타이드 함유 조성물이 유효량의 성분으로서 사용되며, 따라서 상기 식품의 소비자에게 현저한 건강상 이점이 획득된다.

본 발명에 사용된 "포함하는"이란 용어는 임의의 후속적으로 서술되는 요소들로 제한되지 않고 작용상 크게 중요하거나 적게 중요한 지정되지 않은 요소들을 포함함을 의미한다. 즉 나열된 단계, 요소 또는 선택사항들을 총망라할 필요는 없다. "함유하는" 또는 "갖는"이란 어휘를 사용할 때마다, 이러한 용어들은 상기 정의한 바와 같은 "포함하는"과 동등한 의미를 갖는다.

본 발명의 더욱 또 다른 목적은 바람직하게는 프롤린 특이적 프로테아제, 보다 바람직하게는 프롤린 특이적 엔도프로테아제 및 가장 바람직하게는 최적의 산 pH를 갖는 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 사용하여 카파 카제인의 GMP 부분으로부터 IPP를 선택적으로 절제하는 효소적 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 산 침전된 카제인으로부터 카파 카제인의 GMP 부분을 회수하는 방법을 제공하는 것이다.

유효한 혈압 강하 펩타이드 IPP는 상기 펩타이드의 카복시말단 단부에 2 개의 프롤린 잔기를 갖는다. 프롤릴 잔기를 포함하는 펩타이드 결합은 단백질 분해적 절단에 내성인 것으로 공지되어 있으므로, 혈압 강하 펩타이드 중의 2 개의 프롤린 잔기의 존재는 상기와 같은 펩타이드에 단백질 분해적 분해에 대한 증가된 내성을 부여할 것이다. 이러한 태양은 적합한 트라이펩타이드가 복합 효소 제제와 함께 배양 중에 완전한 가수분해를 피할 확률을 증가시킨다. 유사하게 IPP는 위장 소화에 살아남아 상기 펩타이드가 손상되지 않고 혈류에 도달할 보다 나은 기회를 가질 듯하다. 카복시말단 단부에 하나 이상, 바람직하게는 다수의 프롤린 잔기를 갖는 펩타이드를 수득하기 위해서, 프롤린 잔기의 카복시말단 쪽을 절단할 수 있는 프로테아제를 사용하는 것은 흥미로운 선택권을 제공한다. 소위 프롤릴 올리고펩티다제(EC 3.4.21.26)는 펩타이드를 프롤린 잔기의 카복실 쪽에서 우선적으로 절단하는 독특한 가능성을 가지며, 알라닌의 카복실 쪽에서는 그 효율이 보다 낮다. 포유동물뿐만 아니라 미생물 공급원으로부터 단리된 모든 적합하게 특성화된 프롤린 특이적 프로테아제에서, 상기 효소의 활성 부위로부터 큰 펩타이드를 제외한 독특한 펩티다제 도메인이 확인되었다. 실제로 상기 효소는 약 30 개를 초과하는 아미노산 잔기를 함유하는 폴리펩타이드를 분해할 수 없으며, 따라서 상기 효소를 현재 "프롤릴 올리고펩티다제"라 칭한다(Fulop et al: Cell, Vol. 94, 161-170, July 24, 1998). 결과적으로 이러한 프롤릴 올리고펩티다제는 상기가 그의 가수분해 작용을 발휘할 수 있기 전에 다른 엔도프로테아제들에 의한 광범위한 사전 가수분해를 필요로 한다. 그러나, WO 02/45523에 개시된 바와 같이, 심지어 상기와 같은 또 다른 엔도프로테아제와 프롤릴 올리고펩티다제와의 조합은 카복시말단 프롤린 잔기를 갖는 펩타이드의 현저하게 향상된 비율을 특징으로 하는 가수분해 산물을 생성시킨다. 이로 인해, 상기와 같은 가수분해산물은 생체 외 ACE 억제 효과뿐만 아니라 개선된 위장 단백질 분해 내성을 갖는 펩타이드의 단리를 위한 탁월한 출발점을 형성한다. 이러한 잠재적인 이점에도 불구하고, 본 발명자들은 IPP의 선택적인 생산은 말할 것도 없이 혈압 강하 펩타이드의 회수를 위한 프롤린 특이적 프로테아제의 용도를 명시하는 출원을 알고 있지 못하다.

WO 02/45524에는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로부터 수득할 수 있는 프롤린 특이적 프로테아제가 개시되어 있다. 상기 에이. 니거 유래된 효소는 프롤린의 카복시말단에서 우선적으로 절단하나, 상기는 또한 하이드록시프롤린의 카복시말단에서도 절단할 수 있으며, 알라닌의 카복시말단에서는 효율이 보다 낮다. WO 02/45524는 또한 상기 에이. 니거 유래된 효소와 다른 미생물 또는 포유동물 공급원으로부터 공지된 프롤릴 올리고펩티다제 사이에 분명한 상동성이 존재하지 않음을 교시한다. 공지된 프롤릴 올리고펩티다제와 대조적으로, 상기 에이. 니거 효소는 최적의 산 pH를 갖는다. 상기 공지된 프롤릴 올리고펩티다제뿐만 아니라 상기 에이. 니거 유래된 효소들은 소위 세린 프로테아제들이지만, 본 발명자들은 실시예 1에서 상기 에이. 니거 효소가 완전히 상이한 아과에 속함을 보인다. 상기 분비된 에이. 니거 효소는 대부분의 시토졸 프롤릴 올리고펩티다제들이 분류되는 S9 계열이라기보다는 세린 펩티다제들의 S28 계열의 구성원인 듯하다(Rawlings, N.D. and Barrett, A.J.; Biochim. Biophys. Acta 1298(1996) 1-3).

실시예 2에서 본 발명자들은 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 최적 pH 및 온도를 미생물 플라보박테리움 메닝고셉티컴(Flavobacterium meningosepticum)으로부터 수득되는 프롤린 특이적 올리고펩티다제와 비교하여 나타낸다. 단백질을 함유하는 수용액은 특히 수 시간 동안 5.0 초과의 pH 값 및 50 ℃ 이하의 온도에서 보관하는 경우 미생물 감염에 매우 민감할 수 있다. 특히 상기와 같은 연장된 배양 단계 동안 생성될 수 있고 후속의 가열 단계에서 살아남을 것 같은 미생물 독소는 식품 등급 과정들에 잠재적인 위협을 형성한다. EP 1 231 279에 개시된 조건들과 달리 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 50 ℃ 초과의 배양 온도를 사용한다. 상기 효소 배양을 24 시간 미만, 바람직하게는 8 시간 미만, 보다 바람직하게는 4시간 미만의 기간 동안 수행하는 1 단계 효소 과정과 함께, 본 발명에 따른 방법은 개선된 미생물 안정성의 이점을 제공한다.

실시예 3에서 본 발명자들은 본 발명의 방법에 사용되는 에이. 니거 유래된 효소 제제가 매우 좁은 기질 특이성을 나타냄을 입증하며, 이는 프롤린 또는 알라닌 잔기를 수반하는 펩타이드 결합에 대한 것 이외의 현저한 엔도단백질 분해 활성이 존재하지 않음을 의미한다. 본 출원의 실시예 4에서 본 발명자들은 상기 아스퍼질러스 효소가 올리고펩티다제가 아니고 완전한 단백질, 큰 펩타이드뿐만 아니라 보다 작은 펩타이드 분자를 보조 엔도프로테아제의 필요 없이 가수분해할 수 있는 진정한 엔도펩티다제임을 보인다. 이러한 신규의 놀라운 발견은 우리로 하여금 보조 엔도프로테아제의 사용을 생략시켜 전례없는 고 함량의 카복시말단 프롤린 잔기를 갖는 펩타이드를 생성시킬 수 있게 한다. 더욱 또한 보조 엔도프로테아제의 생략은 바람직하게는 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드의 가수분해 시 매우 제한된 수의 펩타이드를 생성시킨다. 그 결과 존재하는 펩타이드들의 대부분이 카복시말단 프롤린 잔기를 갖는다는 점을 특징으로 하는 비교적 간단한 펩타이드 혼합물이 수득된다.

실시예 5에서 본 발명자들은 존재하는 엔도단백질 분해, 아미노펩타이드분해 및 카복시펩타이드 분해 활성과 관련하여 사용되는 효소 제제를 특성화한다. 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 무시할 정도의 부 활성을 갖는 반면, 스미자임 FP 및 플라보자임 제제는 다수의 상이한 효소 유형들의 풍부한 공급원을 형성한다.

실시예 6에서 본 발명자들은 GMP의 단리, 즉 상업적으로 입수할 수 있는 카제이네이트로부터의 단리에 대한 또 다른 경로를 개시한다. 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 사용으로, 본 발명자들은 또한 IPP를 상기와 같이 단리된 GMP로부터 회수한다. 상기 에이. 니거 유래된 효소가 현저한 아미노 펩티다제 활성을 함유하지 않는다는 사실(실시예 5 비교)은 상기 형성된 IPP가 카파 카제인 중에 존재하는 -A107-I108-P109-P110- 서열로부터 방출됨을 강하게 시사한다. 추정 상 IPP의 펩타이드 결합 카복시말단은 에이. 니거 유래된 프롤릴 엔도프로테아제의 주 활성에 의해 절단되는 반면, 선행 Ala-Ile 결합의 절단은 그의 Ala-특이적 부 활성에 의해 수행된다. 상기 경로의 이점은 상기 GMP의 선택적인 절단 후에, 나머지 카제이네이트 분획을 또 다른 용도에 사용할 수 있다는 것이다.

실시예 7에서 본 발명자들은 복합 스미자임 FP 제제뿐만 아니라 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 모두 상업적으로 수득된 GMP로부터 IPP를 유리시키는데 사용할 수 있음을 보인다. 바람직하게는 상기 조성물은 0.1 내지 100 ㎎/g IPP(건조 물질 및 단백질 기준), 보다 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/g IPP(건조 물질 및 단백질 기준), 및 가장 바람직하게는 2 내지 35 ㎎/g IPP(건조 물질 및 단백질 기준)를 포함한다. 본 발명자들은 또한 GPM를 가수분해한 결과 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 사용되는 경우에 트라이펩타이드 IPP 및 테트라펩타이드 TSTP를 거의 동량으로 포함하는 조성물이 생성됨을 발견하였다. 따라서 본 발명은 또한 IPP 및 TSTP를 포함하는 조성물에 관한 것이며 이때 IPP:TSTP의 몰 비는 1.5 내지 0.5, 바람직하게는 1.3 내지 0.7, 및 보다 바람직하게는 1.2 내지 0.8이다. 바람직하게는 상기 조성물은 0.1 내지 100 ㎎/g IPP(건조 물질 및 단백질 기준), 보다 바람직하게는 1 내지 50 ㎎/g IPP(건조 물질 및 단백질 기준), 및 가장 바람직하게는 2 내지 35 ㎎/g IPP(건조 물질 및 단백질 기준)를 포함한다.

실시예 8에서 본 발명자들은 GMP 가수분해산물을 사용하는 관능 이점을 입증한다.

실시예 9에서 본 발명자들은 GMP의 사용이 발효 접근법에 의해 IPP 함유 제품을 제조할 수 있게 함을 예시한다.

따라서 본 발명은 종래기술에 대해 여러 가지 이점을 생성시킨다. 가장 중요하게는 본 발명에 따른 방법은 보다 덜 다양한 수용성 펩타이드들을 생성시키며 이들 중에서 수용성 펩타이드 IPP가 다량으로 존재한다. 이는 고농도의 IPP가 맛이 좋은 제품에 필요한 경우 특히 중요하다. 본 발명의 방법에 따라 단백질 중에 존재하는 -A-I-P-P- 서열의 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 가장 바람직하게는 40% 이상이 IPP로 전환된다.

가수분해 후에 상기 용액을 가열할 수 있다. 임의로 상기 용액의 pH를 변경시키거나 또는 상기 용액을 용매와 혼합할 수 있다.

본 발명의 하나의 태양에 따라, 단백질 공급원의 가수분해 도중 형성되는, IPP를 포함한 용해성 펩타이드를 분리시키고 임의로 건조시킨다. 예를 들어 경사분리, 여과 또는 저속 원심분리로 형성된 침전물을 제거한 후에, 생물학적으로 활성인 용해성 펩타이드를 함유하는 상등액을 예를 들어 역 삼투 또는 증발에 의해, 임의로 추가적인 여과 단계에 이어서 임의로 분무 건조 단계와 함께 회수하여 높은 생물 활성 및 양호한 수용해도를 갖는 식품 등급의 페이스트 또는 분말을 수득하기 위한 경제적인 경로를 생성시킬 수 있다. 프롤린 특이적인 엔도프로테아제에 의한 GMP와 같은 적합한 기질 단백질의 절단 시 고농도의 IPP 및 놀랍게도 낮은 가수분해도를 갖는 백색, 무취 분말이 수득된다.

뉴트라슈티칼 용도 및 식품 및 음료수 용도에서, 본 발명의 가수분해산물이 유리하게 사용된다. 단백질 가수분해산물, 용해성 가수분해산물뿐만 아니라 이들의 혼합물을 뉴트라슈티칼 용도, 식품 용도 또는 음료수에 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 용해성 가수분해산물을, 존재하는 고 함량의 활성 펩타이드로 인해 뉴트라슈티칼 용도, 식품 용도 또는 음료수에 사용한다.

올바른 트라이펩타이드 농도로 적합하게 희석된 경우, 모든 종류의 식품 및 음료수에 혈압 강하 성질을 부여하기에 적합한 탁월한 풍미성을 갖는 다방면의 출발 물질이 수득된다.

예를 들어 크로마토그래피와 같은 추가적인 정제 단계 전 또는 후에 수득되는 펩타이드 혼합물을 규칙적으로 광범위하게 소비되는 식품에 혼입시키기 위해 사용할 수 있다. 상기와 같은 제품의 예로는 마가린, 스프레드, 다양한 낙농 제품, 예를 들어 버터 또는 요구르트 또는 우유 또는 유장 함유 음료수, 제과 품목, 예를 들어 케이크 및 쿠키, 액체 식품, 예를 들어 수프뿐만 아니라 캔디 및 감미제 및 각설탕이 있다. 본 발명에 따른 IPP 함유 가수분해 산물의 매우 좋은 맛의 결과로서, 상기 가수분해 산물을 존재하는 모든 종류의 음료수, 예를 들어 생수, 청량 음료, 스포츠용 음료, 과일 주스, 레몬에이드 및 인스턴트 차와 커피에 혼입시킬 수 있다.

스포츠용 음료는 운동선수를 재수화시킬뿐만 아니라 전해질, 당 및 다른 영양소를 복구시키는 것을 전제로 하는 음료수이다. 스포츠용 음료는 대개 등장성이며, 이는 상기가 인체에서 발견되는 바와 동일한 비율의 영양소를 함유함을 의미한다(출처: http://en.wikipedia.org/wiki/Sports_drink).

에너지 음료는 (적법한) 흥분제, 비타민(특히 비타민 B) 및 무기질을 사용자에게 폭발적인 에너지를 제공하고자 함유하는 음료수이다. 통상적인 성분으로는 카페인, 구아라나(구아라나 식물로부터의 카페인), 타우린, 다양한 형태의 인삼, 말토덱스트린, 이노시톨, 카르니틴, 크레아틴, 글루쿠로놀락톤 및 은행나무가 포함된다. 일부는 다량의 당 또는 글루코스를 함유할 수 있다. 다수의 상기와 같은 음료수들은 풍미가 있고/있거나 착색된다(출처:http://en.wikipedia.org/wiki/Energy_drink).

청량 음료는 알콜을 함유하는 독주와 반대로 알콜을 함유하지 않는 음료이다. 일반적으로, 상기 용어는 찬 음료수에만 사용한다. 핫쵸코, 차 및 커피는 청량음료로 간주하지 않는다. 상기 용어는 원래 탄산 음료만을 독점적으로 지칭하였으며 여전히 이러한 식으로 통상 사용된다(출처:http://en.wikipedia.org/wiki/Soft_dirnk).

상기와 같은 조성물을 전형적으로는 인간에게 투여하지만, 상기를 또한 동물, 바람직하게는 포유동물에게 투여하여 고혈압을 완화시킬 수 있다. 더욱 또한 수득된 바와 같은 상기 제품 중의 고농도의 혈압 강하 펩타이드는 상기 제품을 식품 보조제에 환제, 정제 또는 고도로 농축된 용액 또는 페이스트 또는 분말 형태로 혼입하기에 매우 유용하게 만든다. 상기 펩타이드의 연속 방출을 보장하는 느린 방출 식품 보조제가 특히 중요하다. 본 발명에 따른 펩타이드를 예를 들어 환제, 정제, 과립, 향낭 또는 캡슐 중의 건조 분말로서 제형화할 수 있다. 한편으로 본 발명에 따른 펩타이드 혼합물을 예를 들어 시럽 또는 캡슐 중의 액체로서 제형화할 수 있다. 본 발명에 따른 효소를 함유하고 다양한 제형에 사용되는 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체, 보조제, 부형제, 안정제, 완충제 및 희석제로 이루어진 그룹 중 하나 이상의 화합물을 또한 포함할 수 있으며, 이들 용어는 패키징, 전달, 흡수, 안정화를 지원하는 물질을 가리키기 위해, 또는 보조제의 경우 생리학적 효과를 향상시키는 통상적인 의미로 사용된다. 분말화된 형태의 본 발명에 따른 펩타이드 혼합물과 함께 사용될 수 있는 다양한 화합물들에 대한 관련 배경을 문헌["Pharmaceutical Dosage Forms", second edition, Volumes 1,2 및 3, ISBN 0-8247-8044-2 Marcel Dekker, Inc., 또는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition Williams & Wilkins, PA, USA]에서 찾을 수 있다. 경구 투여를 위해서, 적합한 결합제, 예를 들어 젤라틴 또는 폴리비닐 피롤리돈, 적합한 충전제, 예를 들어 락토오스 또는 전분, 적합한 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트, 및 임의로 추가의 첨가제를 함유하는 정제 및 캡슐을 사용하는 것이 바람직하다.

비교적 신규의 경구용 형태는 다양한 유형의 젤라틴 캡슐 또는 젤라틴 기재 정제의 사용이다.

본 발명의 추가의 태양에 대해서, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 없는 가수분해 산물을 제공한다. 출발 단백질로서 GMP를 사용함으로써, 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신이 결여된 가수분해 산물을 수득한다. 이로 인해 상기 가수분해 산물이 페닐케톤뇨증(PKU)이 있는 개인에게 안전하게 된다.

고혈압에 대적하는 천연 펩타이드의 관련성에 비추어, 본 발명의 새롭고 비용 효과적인 경로는 순한 혈압강하 영양 또는 심지어 수의학 제품에 매력적인 출발점을 제공한다. 본 발명의 경로는 놀랍게도 간단한 정제 단계를 포함하므로, 혈압 강하 농축된 식품 보조제의 가능성을 또한 확장시킨다.

본 발명에 따른 방법을 임의의 프롤린 특이적 올리고- 또는 엔도프로테아제를 사용하여 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 프롤린 특이적 올리고펩티다제는 EC 3.4.21.26에 속하는 효소를 의미한다. 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 사용되는 프롤린 특이적 엔도 프로테아제는 세린 프로테아제의 S28 계열(Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A.J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, London, UK, 1998, 369-415), 또는 보다 바람직하게는 WO 02/45524의 청구항 1 내지 5, 11 및 13에 언급된 바와 같은 폴리펩타이드에 속하는 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 의미한다. 따라서, 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 하기로 이루어진 그룹 중에서 선택된, 프롤린 특이적 엔도단백질 분해 활성을 갖는 폴리펩타이드이다:

(a) 40% 이상의, 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 526과 일치하는 아미노산 서열을 갖는 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 폴리펩타이드;

(b) 낮은 정도의 엄격한 조건 하에서 (i) 60 개 이상, 바람직하게는 100 개이상의 뉴클레오타이드에 대해 80% 또는 90% 이상, 보다 바람직하게는 200 개 이상의 뉴클레오타이드에 대해 90% 이상 일치하는 서열식별번호: 1의 핵산 서열 또는 그의 단편, 또는 (ii) 서열식별번호: 1의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 폴리펩타이드.

서열식별번호: 1 및 서열식별번호:2는 WO 02/45524에 나타낸 바와 같다. 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 단리된 형태이다.

본 발명에 따라 사용되는 바람직한 폴리펩타이드는 서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 526과 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상, 및 심지어 가장 바람직하게는 약 97% 이상 일치하는 아미노산 서열을 갖거나 또는 서열식별번호: 2의 아미노산서열을 포함한다.

바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 낮은 엄격한 조건, 보다 바람직하게는 중간 엄격한 조건, 및 가장 바람직하게는 매우 엄격한 조건 하에서 (i) 서열식별번호: 1의 핵산 서열 또는 그의 단편, 또는 (ii) 서열식별번호: 1의 핵산 서열에 상보적인 핵산 서열과 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된다.

"하이브리드화할 수 있는"이란 용어는 본 발명의 표적 폴리뉴클레오타이드가 탐침으로서 사용되는 핵산(예를 들어 서열식변번호: 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열, 또는 그의 단편, 또는 서열식변번호: 1의 상보물)에 배경보다 현저하게 높은 수준으로 하이브리드화할 수 있음을 의미한다. 본 발명은 또한 본 발명의 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 상기에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 RNA 또는 DNA, 예를 들어 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 cDNA일 수 있다. 바람직하게는, 상기 뉴클레오타이드 서열은 DNA이고, 가장 바람직하게는 게놈 DNA 서열이다. 전형적으로는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 선택적인 조건 하에서 서열식별번호: 1의 암호화 서열 또는 상기 서열의 상보물과 하이브리드화할 수 있는 뉴클레오타이드의 연속되는 서열을 포함한다. 상기와 같은 뉴클레오타이드를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 합성할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 서열식별번호: 1의 암호화 서열 또는 그의 상보물에 배경보다 현저하게 높은 수준으로 하이브리드화할 수 있다. 배경 하이브리드화는 예를 들어 다른 cDNA가 cDNA 라이브러리 중에 존재하기 때문에 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 서열식별번호: 1의 암호화 서열 또는 그의 상보물간의 상호작용에 의해 발생하는 신호 수준이 다른 폴리뉴클레오타이드와 서열식별번호: 1의 암호화 서열 간의 상호작용만큼, 전형적으로는 10 배 이상, 바람직하게는 20 배 이상, 보다 바람직하게는 50 배 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 100 배 이상 강하다. 상기 상호작용의 세기를 예를 들어 상기 탐침을 32P로 방사성 표지함으로써 측정할 수 있다. 선택적인 하이브리드화를 전형적으로는 낮은 엄격성(약 40 ℃에서 0.3M 염화 나트륨 및 0.03M 시트르산 나트륨), 중간 엄격성(예를 들어 약 50 ℃에서 0.3M 염화 나트륨 및 0.03M 시트르산 나트륨), 또는 높은 엄격성(예를 들어 약 60 ℃에서 0.3M 염화 나트륨 및 0.03M 시트르산 나트륨)을 사용하여 성취할 수 있다.

UWGCG 패키지는 일치율의 계산에 사용될 수 있는(예를 들어 그의 기본값 설정에 사용되는) BESTFIT 프로그램을 제공한다.

PILEUP 및 BLAST N 연산을 또한 서열 일치율을 계산하거나 서열을 정렬시키는데(예를 들어 기본값 설정에 대해 동등하거나 상응하는 서열의 확인에) 사용할 수 있다.

BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어를 국립 생물공학 정보 센터를 통해 공개적으로 입수할 수 있다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 상기 연산은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬시킬 때 일부 양의 값의 임계 점수 T와 일치하거나 상기를 만족시키는 문제의 서열에서 짧은 길이의 단어 W를 식별함으로써 높은 득점 서열 쌍(HSP)을 식별함을 포함한다. T는 이웃 단어 점수 임계를 지칭한다. 상기 초기 이웃 단어 적중은 상기를 함유하는 HSP를 찾는 탐색의 개시를 위한 시드로서 작용한다. 상기 단어 적중은 누적 정렬 점수를 증가시킬 수 있는 한 각 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 각 방향으로 상기 단어 적중의 연장은, 상기 누적 정렬 점수가 그의 최대로 성취된 값으로부터 X 량에 의해 줄어들거나; 상기 누적 점수가 하나 이상의 음의 득점 잔기 정렬들의 축적으로 인해 0 이하로 가거나; 또는 어느 한 서열의 끝에 도달할 때 멈춘다. 상기 BLAST 연산 매개변수 W, T 및 X는 상기 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. 상기 BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 득점 행렬 정렬(B), 10의 기대값, M=5, N=4, 및 양쪽 가닥의 비교를 사용한다.

상기 BLAST 연산은 2 개 서열간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다. 상기 BLAST 연산에 의해 제공된 유사성의 한 가지 척도는 최소 합계 확률(P(N))로, 이는 2 개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 간의 일치가 우연히 일어나는 확률을 가리킨다. 예를 들어, 제 1 서열과 제 2 서열의 비교에서 상기 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우 하나의 서열은 또 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.

상기 아스퍼질러스 속의 균주는 식품 등급의 상태를 가지며 상기 미생물로부터 유래된 효소들은 뜻밖의 식품 등급의 공급원인 것으로 공지되어 있다. 또 다른 바람직한 실시태양에 따라, 상기 효소는 비 분비성의, 소위 시토졸 효소보다는 그의 생산 세포에 의해 분비된다. 이런 식으로 효소를 값비싼 정제 단계 없이 필수적으로 순수한 상태로 세포 브로쓰로부터 회수할 수 있다. 바람직하게는 상기 효소는 우세한 pH 및 온도 조건 하에서 그의 기질에 대해 높은 친화성을 갖는다.

도 1은 다양한 pH 조건 하에서 형광 기질 Z-Gly-Pro-AMC 상에서 측정된 에프. 메닝고셉티컴의 프롤린 특이적 올리고펩티다제 및 에이. 니거로부터의 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 활성 프로파일이다. 형광성을 37 ℃에서 30 분 후에 측정하였다.

도 2는 에이. 니거 유래된 프롤릴 엔도프로테아제의 특이성 프로파일이다.

도 3은 크로마토그래피에 의해 정제된 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 배양한 후의 완전한 오브알부민과 합성 27-머 펩타이드의 SDS-PAGE이다.

물질 및 방법

식용 나트륨 및 칼륨 카제이네이트 스프레이(88%)를 DMV 인터내셔날(International, The Netherlands)로부터 수득하였다. GMP를 아를라(Arla, Denmark, Lacprodan CGMP-10, 로트# P340205)로부터 수득하였다. 합성 색원성 펩타이드를 펩스캔 시스템스 비브이(Pepscan Systems B.V., The Netherlands) 또는 바켐(Bachem, Switzerland)으로부터 수득하였다. 플라보자임 1000L 배치 HPN00218 을 노보자임스(Novozymes, Denmark)로부터, 스미자임 FP를 신 니혼(Shin Nihon, Japan)으로부터, 코롤라제 LAP Ch.:4123을 AB 엔자임스(UK)로부터 수득하였다.

에이. 니거로부터의 프롤린 특이적 엔도프로테아제

아스퍼질러스 니거로부터의 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 과 생산을 WO 02/45524에 개시된 바와 같이 수행하였다. 상기 효소의 활성을 37 ℃에서 시트레이트/인산 이나트륨 완충액(pH 4.6) 중에서 합성 펩타이드 Z-Gly-Pro-pNA상에서 시험하였다. 반응 생성물을 405 nM에서 분광광도측정에 의해 모니터하였다. 단위는 상기 시험 조건 하에서 0.37 mM Z-Gly-Pro-pNA의 기질 농도에서 분당 1 μ몰의 p-나이트로아닐리드를 유리시키는 효소의 양으로서 정의된다.

에이. 니거로부터 유래된 엔도프로테아제의 크로마토그래피 정제

과 생산 에이. 니거 균주로부터 수득한 배양 브로쓰를 상기 프로테아제의 크로마토그래피 정제에 사용하여 임의의 엔도- 및 엑소단백질 분해 활성 오염을 제거하였다. 그 때문에 상기 발효 브로쓰를 먼저 원심분리시켜 대부분의 진균 덩어리를 제거하고 이어서 상등액을 구멍 크기가 감소하는 다수의 필터에 통과시켜 모든 세포 단편들을 제거하였다. 최종적으로, 상기 수득된 한외여과물을 20 밀리몰/리터의 나트륨 아세테이트(pH 5.1)로 10 배 희석하고 Q-세파로스 FF 컬럼 상에 적용하였다. 단백질들을 20 밀리몰/리터의 나트륨 아세테이트(pH 5.1) 중의 0에서 0.4 몰/리터 NaCl의 구배로 용출시켰다. Z-Gly-Pro-pNA의 절단에 대해 활성을 나타내는 피크 분획들을 문헌[World Journal of Microbiology & Biotechnology 11, 209-212(1995)]에 개시된 프로토콜에 따라, 그러나 약간 변경된 분석 조건 하에서 수거 하고 모았다. 상기 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 최적 산 pH를 고려하여, 상기 효소 분석을 pH 4.6, 37 ℃에서 시트레이트/다이포스페이트 완충액 중에서 수행하였다. 최종적으로 상기 활성 분획들을 모은 다음 농축시켜 SDS-PAGE 상에 단지 단일 밴드만을 보이고 HP-SEC 상에서 하나의 피크를 보인 제제를 생성시켰다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가의 분석에 의해 상기 수득된 효소 제제의 순도를 확인하였다.

켈달 질소

전체 켈달 질소를 유동 주입 분석에 의해 측정하였다. TKN 방법 카세트 5000-040, SOFIA 소프트웨어를 갖는 펜티엄 4 컴퓨터 및 테카터(Tecator) 5027 자동샘플러가 구비된 테카터 FIASTAR 5000 유동 주입 시스템을 사용하여, 단백질 함유 용액으로부터 방출된 암모니아를 590 ㎚에서 정량분석하였다. 상기 방법의 동적인 범위에 상응하는 샘플 량(0.5 내지 20 ㎎ N/l)을 95 내지 97% 황산과 함께 절단 튜브에 넣고, 켈탭(Kjeltab)을 200 ℃에서 30 분에 이어 360 ℃에서 90 분의 절단 프로그램에 가한다. 상기 FIASTAR 5000 시스템에서 주입 후에 질소 피크를 측정하고 이로부터 측정된 단백질의 양을 추론할 수 있다.

아미노산 분석

정확하게 칭량한 단백질성 물질의 샘플을 묽은 산에 용해시키고 침전물을 에펜도르프 원심분리기에서 원심분리에 의해 제거하였다. 아미노산 분석을 워터스의 아미노산 분석 시스템(Milford MA, USA)의 작업 매뉴얼에 명시된 바와 같은 피코태그(PicoTag) 방법에 따라 등명한 상등액 상에서 수행하였다. 이를 위해, 적합한 샘플을 액체로부터 수득하고, 이어서 건조시키고 증기상 산 가수분해시키고 페닐아이소티오시아네이트를 사용하여 유도체화하였다. 존재하는 다양한 유도체화된 아미노산을 HPLC 방법을 사용하여 정량분석하고 칭량된 샘플 중의, 유도체화된 Ile를 포함한 유리 아미노산의 전체 수준을 계산하였다. 아미노산 Cys 및 Trp는 상기 분석에서 획득한 데이터에 포함시키지 않는다.

LC/MS/MS 분석

P4000 펌프(Thermoquest(등록상표), Breda, the Netherlands)에 커플링된 이온 트랩 질량 분광계(Thermoquest(등록상표), Breda, the Netherlands)를 사용하는 HPLC를 본 발명의 효소 혼합물에 의해 생산된 효소 단백질 가수분해 산물 중의 관심 펩타이드, 특히 트라이펩타이드 IPP, LPP 및 VPP의 정량 분석에 사용하였다. 상기 형성된 펩타이드를 용출을 위한 밀리 Q 워터(Millipore, Bedford, MA, USA) 중의 0.1% 포름산(용액 A) 및 아세토나이트릴 중의 0.1% 포름산(용액 B)의 구배와 함께 이너트실(Inertsil) 3 ODS 3, 3 ㎜, 150*2.1 ㎜(Varian Belgium, Belgium) 컬럼을 사용하여 분리시켰다. 상기 구배는 용액 A 100%에서 출발하여 상기에서 5 분간 유지시키고, 10 분간 5% B로 선형 증가시킨 다음 30 분간 용액 B 45%까지 선형 증가시키고 바로 시작 조건으로 가서 여기에서 15 분간 안정화를 위해 유지시켰다. 사용된 주입 부피는 50 마이크로리터이고, 유량은 200 마이크로리터/분이며 컬럼 온도는 55 ℃에서 유지시켰다. 상기 주입된 샘플의 단백질 농도는 대략 50 마이크로그램/밀리리터이었다.

개별적인 펩타이드에 대한 상세한 정보를 약 30%의 최적 충돌 에너지를 사용 하여, 관심 펩타이드에 대해 제공된 MS/MS를 사용함으로써 획득하였다. 정량분석을, 기질 효과를 보정하기 위한 표지된 내부 표준을 또한 갖는 눈금 선을 사용하여, C₁₃ + N₁₅ 표지된 IPP 표준을 갖는 전기분무 양 이온화 방식을 사용하는 LC/MS/MS 방식으로 수행한다. 체류 시간, 전구체 이온 및 특징적인 단편화의 비에 의해 식별을 수행한다.

트라이펩타이드 LPP(M=325.2)를 사용하여 MS 방식에서 최적의 민감도 및 MS/MS 방식에서 최적의 단편화에 대해 조정하고, 5 ㎎/㎖의 일정한 주입을 수행하여, MS 방식으로 양자화된 분자 및 MS/MS 방식으로 약 30%의 최적 충돌 에너지를 생성시켜 일련의 B- 및 Y-이온을 생성시켰다.

LC/MS/MS에 앞서, 효소 단백질 가수분해 산물을 주변 온도 및 13000 rpm에서 10 분간 원심분리시키고, 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과하고 상등액을 밀리Q 워터를 사용하여 1:100으로 희석하였다.

다양한 양성자이동 혼합물과의 배양 중에 획득된 가수분해도(DH)를 고속 OPA 시험(JFS, Vol 66, NO 5, 2001)을 사용하여 모니터하였다.

실시예 1

에이. 니거 로부터 수득된 효소는 새로운 부류의 프롤린 특이적 효소를 나타낸다.

WO 02/45524에 제공된 바와 같은 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 전체 암호화 서열로부터 526 개 아미노산의 단백질 서열을 측정할 수 있다. 상기 효소의 신규성은 SwissProt, PIR 및 trEMBL과 같은 데이터베이스의 BLAST 탐색에 의해 입증되었다. 놀랍게도, 상기 에이. 니거 효소와 공지된 프롤릴 올리고펩티다제 간의 분명한 상동성은 검출할 수 없었다. 그러나 상기 아미노산 서열의 보다 면밀한 검사는 프로-X 카복시펩티다제(EC3.4.16.2), 다이펩티딜 아미노펩티다제 I(EC3.4.14.2), 및 흉선 특이적 세린 프로테아제에 대한 낮지만 중요한 상동성을 밝혀내었다. 이러한 효소들은 모두 세린 펩티다제의 S28 계열로 할당되었다(Handbook of Proteolytic Enzymes; Barrett A.J.; Rawlings N.D.; Woessner J.F., Eds.; Academic Press, London, UK, 1998, 369-415). 또한 상기 세린 활성 부위 주변의 GxSYxG 배치는 또한 이들 효소들과 상기 에이. 니거 유래된 엔도프로테아제 사이에서 보존된다. 또한, S28 계열의 구성원들은 최적의 산성 pH를 가지며, 프롤린 잔기의 카복시 말단 쪽에서의 절단에 대한 특이성을 갖고, 신호 서열 및 상기 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 꼭 같은 프로펩타이드에 의해 합성된다. 또한 에이. 니거 효소의 크기는 S28 계열의 구성원들과 유사하다. 따라서, 상기 에이. 니거 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 플라보박테리움 메닝고셉티컴으로부터 수득한 효소들을 포함하는 대부분의 시토졸 프롤릴 올리고펩티다제가 분류되는 S9 계열이라기보다는 세린 프로테아제의 S28 계열의 구성원인 듯하다. 상기 구조 및 생리학적 특징을 근거로 상기 에이. 니거 효소는 세린 프로테아제의 S9 계열이라기보다는 S28에 속하는 것으로 결론지었다. 상기 S9 계열에 속하는 프롤릴 올리고펩티다제로부터 에이. 니거 유래된 효소를 구분하는 추가적인 특징은, 상기 전자의 계열에 속하는 시토졸 프롤릴 엔도프로테아제와는 다르게, 새로이 동정된 에이. 니거 효소가 생육 배지로 분비된다는 사실이다. 이는 보다 하등의 진핵생물로부터의 S28 계열의 구성원의 단리 및 특성화에 대한 최초의 보고이다.

실시예 2

에이. 니거 프롤린 특이적 엔도프로테아제 및 에프. 메닝고셉티컴 으로부터의 프롤린 특이적 올리고펩티다제의 pH 활성 스펙트럼

상기 아스퍼질러스 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 플라보박테리움 메닝고셉티컴으로부터의 프롤린 특이적 올리고펩티다제 사이에 존재하는 최적 pH 차이를 입증하기 위해서, 다양한 pH 조건 하에서 이들의 활성을 측정하였다. 상기 아스퍼질러스 유래된 엔도프로테아제를 상기 물질 및 방법 섹션에 개시한 바와 같이 수득하였다. 상기 플라보박테리움 유래된 올리고펩티다제를 ICN 바이오메디칼스로부터 구입하였다(35 단위/㎎; 목록 번호 32082; Ohio, US).

상기 두 효소의 pH 활성 스펙트럼을 확립시키기 위해서, 상이한 pH 값을 갖는 완충액들을 제조하였다. 0.1 몰/l 시트레이트를 사용하여 pH 2.0 내지 7.0 범위의 완충액을 제조하고, 0.1 몰/l 트리스를 사용하여 pH 6.0 내지 9.0 범위의 완충액을 제조하고, 0.2 몰/l 글리신을 사용하여 pH 8.0 내지 12.0 범위의 완충액을 제조하였다. 필요한 pH 값은 HCl 또는 NaOH를 사용하여 조절하였다. 색원성 합성 펩타이드 Z-Gly-Pro-AMC(Bachem, Switserland)를 상기 두 효소 모두에 대한 기질로서 사용하였다. 각각의 웰(Costar No. 3631 플레이트)에 완충액 85 ㎕, 효소 용액 10 ㎕ 및 기질(60% 메탄올 중의 4 mM Z-Gly-Pro-AMC) 5 ㎕를 도입하였다. 상기 에이. 니거 효소의 최종 농도는 32 ㎍/㎖(3.2 밀리 단위/㎖)이고, 에프. 메닝고셉티컴 효소의 최종 농도는 0.21 ㎍/㎖(7.4 밀리 단위/㎖)이었다. 혼합 후 반응을 37.0℃에서 30 분간 진행시키고 그 후에 퍼셉티브 바이오사이언스(PerSeptive Biosciences)의 사이토플로어(CytoFluor) 멀티 웰 플레이트 판독기에서 형광을 측정하였다. 수득된 상대적인 데이터를 도 1에 나타낸다. 또한 상기 프롤릴 엔도프로테아제의 최적 온도를 설정하였다. 이를 위해 상기 정제된 효소 제제를 기질로서 카제인 레소루핀(Roche version 3)을 사용하여 상이한 온도에서 2 시간 동안 0.02 몰/l CaCl2를 함유하는 0.1 몰/l Na-아세테이트, pH 5.0에서 배양하고 효소 활성을 574 ㎚에서 측정함으로써 정량분석하였다. 상기 수득된 결과에 따르면 에이. 니거로부터의 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 대략 50 ℃에서 최적 온도를 갖는다.

실시예 3

에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 특이성

다수의 발현 카세트 사본(WO 02/45524 참조)을 함유하는 에이. 니거 균주로부터 수득된 크로마토그래피 정제된 효소 샘플뿐만 아니라 조 샘플을 암호화된 엔도프로테아제의 특이성을 확립하기 위해 색원성 펩타이드 기질 수집물(collection)에 대해 시험하였다. 상기 효소의 엔도단백질 분해 활성을 AAXpNA 기질 상에서 시험하였다. 상기 "pNA"(p-나이트로아닐리드) 기질은 상기 X-pNA 펩타이드 결합이 절단되는 경우 색상 변화를 일으키며; "X"는 상이한 천연 아미노산 잔기를 나타낸다. AAX-pNA 기질의 모액(150 밀리몰/l)을 20 CaCl2를 함유하는 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4.0)으로 100배 희석하였다. 405 ㎚에서 테칸 제니오시(TECAN Genios) MTP 판독기(Salzburg, Vienna)에서 40 ℃에서 10 분의 동역학 측정은 광학 밀도의 증가를 기록하였으며, 이는 엑셀에서 처리되는 데이터를 통해 도 2에 나타낸 그림을 생성시켰다. 상기 결과로부터 에이. 니거 유래된 엔도프로테아제는 알라닐 결합에 대해 부 활성을 갖는 프롤릴 펩타이드 결합에 매우 특이적임이 분명하다. 조 및 크로마토그래피에 의해 정제된 제제는 유사한 활성 프로파일을 나타내었다. 에이. 니거 유래된 엔도프로테아제의 아미노펩티다제, 카복시펩티다제 또는 비 프롤린 특이적 엔도프로테아제에 의한 오염은 미미한 것으로 볼 수 있다(실시예 5 참조).

실시예 4

에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 작은 펩타이드뿐만 아니라 큰 단백질도 가수분해할 수 있으며 따라서 진정한 엔도프로테아제이다.

특정한 구조 특징으로 인해, S9 계열에 속하는 프롤릴 올리고펩티다제는 30 개 아미노산 보다 큰 펩타이드를 절단할 수 없다. 이러한 제한은 가능한 한 빠르고 효율적으로 상이한 단백질들을 가수분해하고자하는 효소의 경우 명백한 단점이다. 상기 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 기질 분자의 크기에 대해 동일한 제한을 나타내는 지를 보기 위해서, 에이. 니거로부터 크로마토그래피에 의해 정제된 프롤릴 엔도펩티다제를 작은 합성 펩타이드 및 큰 오브알부민 분자와 함께 배양하고 SDS-PAGE에 의해 형성된 가수분해 산물을 분석하였다.

상기 사용된 합성 펩타이드는 서열 NH2-FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-COOH의 27-머이고 펩스캔 캄파니(Lelystad, The Netherlands)의 선물이었다. 상기 펩타이드는 그의 아미노산 서열에 의해 나타난 바와 같이, 2 개의 프롤린 잔기, 즉 상기 펩타이드의 중간에 하나 및 카복시 말단 단부 부근에 하나를 함유한다.

상기 완전한 오브알부민 분자(Pierce Imject, 동결 건조된 물질 20 ㎎을 함유하는 바이알)는 42 750 Da의 분자량을 갖는 385 개 아미노산들로 이루어진다. 상기 분자는 14 개의 프롤린 잔기를 함유하고, 이들 중 하나는 상기 분자의 최종 C-말단 단부에 위치하며 프롤린 특이적 엔도프로테아제에 의해 절단될 수 없다. 오브알부민 및 올리고펩타이드를 50 ℃에서 정제된 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 별도로 배양하였다. 여러 시간 간격으로 샘플들을 취하고 이어서 상기를 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다.

4.5 단위/㎖의 활성을 갖는, 크로마토그래피에 의해 정제된 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 20 mM CaCl2를 함유하는 0.1M 아세테이트 완충액(pH 4)으로 100 배 희석하였다. 상기 오브알부민을 아세테이트 완충액(pH 4)에 1 ㎎/㎖(22 μM)의 농도로 용해시켰다. 상기 27-머를 동일한 완충액에 용해시켜 0.48 ㎎/㎖(152 μM)의 농도에 도달시켰다. 상기 오브알부민 및 27-머 용액의 몰 농도를 상기 두 용액이 동일한 몰 농도의 절단 가능한 프롤린 잔기를 함유하도록 하는 방식으로 선택하였다. 오브알부민은 13 개의 잠재적인 프롤린 절단 부위를 함유하는 반면, 상기 27-머 펩타이드는 단지 2 개만을 갖는다. 상기 두 기질 용액 모두의 0.5 ㎖을 50 ℃에서 에펜도르프 써모믹서에서 효소 용액 10 ㎕(0.45 밀리U)와 배양하였다. 수 시간 간격으로 10 ㎕ 샘플을 상기 배양 혼합물로부터 회수하고 SDS-PAGE까지 20 ℃에서 유지시켰다. SDS-PAGE 및 염색에 사용되는 모든 물질들을 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입하였다. 샘플을 제조사의 설명에 따라 SDS 완충제를 사용하여 제조하고 제조사의 설명에 따라 MES-SDS 완충 시스템을 사용하여 12% 비스-트리스 젤 상에서 분리시켰다. 염색을 심플리 블루 세이프 스테인(Simply Blue Safe Stain)(Collodial Coomassie G250)을 사용하여 수행하였다.

도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 오브알부민은 아스퍼질러스 유래된 효소에 의해 처음 4.75 시간의 배양 시간에서 약 35 내지 36 kD의 분리된 밴드로 절단된다(레인 3). 배양 기간을 연장시키면, 다양한 분자량의 보다 작은 생성물들로 추가로 절단된다(레인 7).

레인 2에 비해 레인 4, 6 및 8에서의 밴드가 보다 희미한 점으로 판단할 때, 상기 27-머 펩타이드 또한 절단된다. (레인 9 및 8에 비해) 상기 생성물의 매우 작은 분자량 이동은 대개 상기 펩타이드의 카복실 단부에서의 아르기닌 잔기의 절단에 기인하는듯하다. 상기 차이는 약 200 D(AlphaImager 2000 시스템상의 AlphaImager 3.3d 소프트웨어를 사용하여 측정)이며 아르기닌은 174의 MW를 갖는다. 이러한 작은 분자량 이동은 아마도 상기 펩타이드의 절단에서 첫 번째 단계이다.

상기 생성물의 추가적인 붕괴는 오직 SDS 젤 상의 밴드의 강도 감소에 의해서 볼 수 있다. 약 1000의 MW를 갖는 성분의 젤 염색이 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의해 가능하지 않기 때문에 추가적인 붕괴 산물은 볼 수 없다. 상기 실험으로부터, S9 계열에 속하는 공지된 프롤릴 올리고펩티다제와는 달리, 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 훨씬 더 큰 단백질에 비해 작은 크기 펩타이드를 특이적으로 선호하지 않는 것으로 결론지을 수 있다. 따라서, 상기 에이. 니거 유래된 효소는 그 자체가 진정한 엔도프로테아제를 나타내며 상이한 유형의 단백질들의 가수분해에 바람직한 효소이다.

실시예 5

혈압 강하 펩타이드의 생산에서 바람직한 효소 활성 및 오염성 효소 활성의 정량분석

본 발명에 따르면 GMP로부터 IPP를 회수함으로써 비교적 순수한 IPP를 간단한 1 단계 공정으로 수득할 수 있다. 상기 IPP 함유 분획을 다양한 상이한 효소 제제에 의해 GMP로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, GMP를 순수한 프롤린 특이적 엔도프로테아제, 또는 순수한 프롤린 특이적 엔도프로테아제 + 순수한 아미노펩티다제, 또는 미량의 또 다른 순수한 엔도펩티다제, 예를 들어 서브틸리신 또는 메탈로프로테아제(GMP를 보다 작은 단편들로 절단하여 올리고펩티다제에 대해 개선된 기질을 형성하기 위해서)와 병용된 순수한 프롤린 특이적 올리고펩티다제, 또는 프롤린 특이적 트라이펩티딜 아미노펩티다제(Amano, Japan으로부터의 상업적인 "우마미자임" 제제에 존재하는 바와 같은)와 병용된 순수한 아미노펩티다제, 또는 상이한 종류의 단백질 분해 활성을 함유하는 복합 효소 제제와 배양함으로써 수득할 수 있다. 본 실시예에서, 3 개의 상업적인 효소 제제, 즉 플라보자임 1000L 배치 HPN00218(Novozymes), 스미자임 FP(Shin Nihon, Japan) 및 코롤라제 LAP Ch.:4123(AB Enzymes, UK)를 그들의 다양한 단백질 분해 활성에 대해 시험하였다. 플라보자임 및 스미자임 FP는 모두 비 특이적인 엔도단백질 분해 및 카복시펩타이드 분해 활성 이외에 여러 가지 아미노펩타이드분해 효소 활성을 함유하는 복합 효소 제제인 것으로 공지되어 있다. 코롤라제 LAP는 아스퍼질러스로부터의, 비교적 순수한, 클로닝되고 과발현된 류신 아미노펩티다제 활성을 나타낸다.

필수적으로 순수한이란 사용되는 배양 조건 하에서 오염성 엔도프로테아제 활성 및 오염성 카복시펩티다제 또는 아미노펩티다제 활성이 최소이거나 바람직하게는 존재하지 않음을 의미한다. 하기의 시험 과정들은 상기와 같은 오염성 엔도-, 아미노- 및 카복시펩티다제 활성의 정량 분석을 위해 고안되었다.

상기 시험 과정을 위한 토대를 다양한 선택성 색원성 펩타이드 수집물에 의해 형성한다. 단지 프롤린 특이적 올리고- 및 엔도프로테아제만이 펩타이드 Z-AAAP-pNA로부터 pNA를 방출할 수 있으므로, 상기 특정 펩타이드를 사용하여 목적하는 프롤린 특이적 엔도단백질 분해 활성을 정량분석하였다. 다수의 엔도프로테아제들은 펩타이드 Z-AAAF-pNA 및 Z-AAAR-pNA로부터 pNA를 방출시킬 수 있으므로, 상기 2 개의 펩타이드를 사용하여 오염성 비 프롤린 특이적 엔도단백질 분해 활성을 정량분석하였다. 베타 카제인 분자 중에 존재하는 펩타이드 QNIPP 및 VVVPP의 각각 IPP 및 VPP로의 전환은 Gln 및 Val 잔기를 효율적으로 제거할 수 있는 아미노펩티다제를 필요로 하기 때문에, 펩타이드 Q-pNA 및 V-pNA를 사용하여 목적하는 아미노펩티다제 활성을 정량분석하였다. 다수의 카복시펩티다제들이 펩타이드로부터 Phe 및 Arg 잔기를 방출시킬 수 있기 때문에, 상기 잔기를 함유하는 펩타이드를 선택하여 오염성 카복시펩티다제 활성을 정량분석하였다. 그러나, 카복시펩티다제 활성을 측정하기 위해 이용할 수 있는 적합한 색원성 그룹이 없으며 따라서 합성 펩타이드 Z-AF 및 Z-AR을 사용하는 대체 방법이 개발되어야했다. 이러한 대체 방법을 바로 아래에 제공한다. 사용된 모든 합성 펩타이드들에서 "Z"는 벤질옥시카보닐을 나타내고, "pNA"는 발색단 파라-나이트로아닐리드를 나타낸다. 모든 색원성 펩타이드를 펩스캔(Lelystad, The Netherlands)으로부터 수득하였다. 펩타이드 Z-AF 및 Z-AR을 바켐(Switserland)으로부터 구입하였다. 모든 배양을 40 ℃에서 수행하였다. 희석된 효소 제제를 다시 상업적인 제품의 농도로 계산하였다.

아미노펩티다제 활성의 측정

100% DMSO 중의 V-pNA 및 Q-pNA 150 밀리몰/l의 모액을 0.1M 비스트리스 완충액(pH 6)으로 80 배 희석하여 V-pNA 및 Q-pNA를 1:1 비로 함유하는 V-pNA + Q-pNA-기질 용액 3.75 밀리몰/l를 제조하였다. 상기 아미노펩티다제 기질 용액 200 ㎕ 분액을 미세적정 플레이트(MTP)의 별도의 웰들에 피펫팅하였다. 상기 MTP를 마젤란(Magellan)4 소프트웨어 하에서 실행되는 테칸 제니오스 MTP(Salzburg, Vienna)에서 40 ℃에서 예비 배양한다. 상기 반응을 배양이 3 mM의 기질 농도에서 일어나도록 적합한 효소 용액 50 ㎕를 가하여 출발시켰다. 전형적으로는 액체 효소 샘플 플라보자임, 코롤라제 LAP 및 프롤린 특이적 엔도프로테아제 1:50 희석을 사용하였다. 건조 스미자임 FP 산물의 1% 용액을 사용하였다.

20 회 이상의 동역학 주기(약 10 분) 동안 상기 아미노산-pNA 결합의 절단의 결과로서 테칸 제니오스 MTP에 의해 405 ㎚에서 측정된 황색 색상이 전개되었다. 상기 소프트웨어는 OD₄₀₅/분으로서 수득된 데이터를 생성시켰다.

프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성의 측정

상기 측정을 상기 아미노펩티다제 분석과 필수적으로 동일하게 수행하였으나, 이 경우 Z-AAAP-pNA를 유일한 기질로서 3 밀리몰/l의 최종 농도로 사용하였다. 상기 기질을 pH 6 완충액 중의 현탁액을 50 내지 55 ℃로 가열함으로써 용해시켜 실온에서 등명한 용액을 생성시켰다. 측정을 40 ℃에서 수행하였다.

전형적으로는 상기 액체 효소 샘플 플라보자임 및 코롤라제 LAP의 1:50 희석액을 사용하였다. 스미자임 FP는 1% 용액으로 사용하였다. 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제는 전형적으로는 1:5000 희석 비로 사용하였다.

상기 소프트웨어는 OD₄₀₅/분으로서 수득된 데이터를 생성시켰다.

오염성 비 프롤린 특이적 엔도프로테아제 활성의 측정

또한 상기 측정을 상기 아미노펩티다제 분석에 대해 개시한 바와 필수적으로 동일하게 수행하였으나, 이 시험에서는 기질로서 Z-AAAF-pNA 및 Z-AAAR-pNA를 1:1 비 및 3 밀리몰/l의 최종 농도로 사용하였다. 상기 기질 Z-AAAF-pNA는 사용된 pH 6.0 시험 조건 하에서 불충분하게 용해성인 것으로 판명되었지만 서브틸리신과 배양한 결과 pNA 방출과 동시에 상기 기질이 급속히 용해되었다. 측정을 40 ℃에서 수행하였다. 그러나, 상기 불충분한 용해성을 보상하기 위해서 상기 MTP 판독기를 동역학 주기들 사이에서 진탕하도록 프로그램화하였다.

다시 상기 소프트웨어는 OD₄₀₅/분으로서 수득된 데이터를 생성시켰다.

오염성 카복시펩티다제 활성의 측정

민감한 색원성 펩타이드를 카복시펩티다제 활성의 측정에 이용할 수 없으므로, 카복시펩티다제 C의 정량분석을 위해 베링거 프로토콜을 기본으로 하는 방법을 사용하였다.

Z-A-F 및 Z-A-R의 에탄올 중의 2 x 150 밀리몰/l 모액을 0.1 몰/l 비스트리스 완충액(pH 6)으로 80 배 희석하여 Z-A-F 및 Z-A-R을 1:1 비로 함유하는 3.75 밀리몰/l의 Z-A-F + Z-A-R 기질 용액을 제조하였다. 이어서 상기 기질 용액 200 ㎕를 에펜도르프 바이알에 피펫팅하고 40 ℃에서 예비 배양하였다. 상기 반응을 적합한 효소 희석액 50 ㎕를 가하여 출발시켰다. 전형적으로 플라보자임 및 코롤라제 LAP 및 프롤린 특이적 엔도프로테아제의 1:50 희석을 사용한다. 스미자임 FP의 경우 1% 용액을 사용하였다. 5 분 후에 상기 반응을 닌하이드린 시약 250 ㎕를 가하여 중단시켰다. 닌하이드린 시약은 DMSO 15 ㎖에 용해된 닌하이드린(Merck) 400 ㎎ 및 하이드린단틴 60 ㎎으로 제조되었으며, 여기에 4.0 몰/l의 리튬 아세테이트 완충액(pH 5.2) 5 ㎖을 가하였다. LiOH(Sigma)를 용해시킨 후 상기 용액의 pH를 빙초산(Merck)을 사용하여 pH 5.2로 조절함으로써 상기 4.0 몰/l의 리튬 아세테이트 완충액을 제조하였다.

상기 반응을 정지시킨 후에, 각 샘플을 95 ℃에서 15 분간 가열하여 색상 형성을 촉진시키고 후속적으로 순수한 에탄올로 10 배 희석하였다. 형성된 색상을 578 ㎚에서 유비콘 분광광도계에서 측정하였다. 상기 활성 샘플과 동일한 방식으로 블랭크를 제조하였으나, 닌하이드린 시약 및 효소 첨가는 취소하였다. 상기 카복시펩티다제 활성에 의해 생성된 유리 아미노산의 양을 정량분석하기 위해서, 아미노산 L-페닐알라닌을 사용하여 눈금 곡선을 작성하였다. L-페닐알라닌(Sigma) 0.1875, 0.375, 0.75, 1.5 및 3.0 밀리몰/l를 함유하는 완충액(pH 6) 중의 용액을 상기 샘플들과 동일한 방식으로, 즉 바이알 중의 250 ㎕로 처리하였다. 획득된 OD578 값으로부터, 곡선을 엑셀에서 작성하였다. 상기 Z-A-F 및 Z-A-R 기질을 함유하는 샘플 중에 존재하는 유리 아미노산의 농도를 상기 곡선을 사용하여 계산하였다. 상기 수득된 값으로부터, 카복시 펩티다제 활성을 시험된 효소의 양에 대해 분당 마이크로몰로 계산하였다.

활성 비의 계산

본 발명에 따른 방법에 대한 다양한 효소 제제들의 적합성을 확립시키기 위해서, 적합한 효소 활성의 비율을 계산하였다. 상기 MTP 판독기에 근거한 분석에서, 효소 활성은 시간에 대한 pNA 방출, 즉 ΔOD₄₀₅/분을 특징으로 한다. 상기 MTP 판독기에 의해 획득된 효소 활성의 비율은 동일한 양의 효소에 대해 수득된 ΔOD/분 값을 단순히 나누어 계산하였다.

그러나, 카복시-펩티다제 분석의 경우에, 상기 MTP-pNA에 근거한 분석에 의해 생성된 ΔOD/분에 직접 비교할 수 없는 OD가 생성된다. 여기서 상기 측정된 OD를 먼저 분당 방출된 아미노산 μ몰(μ몰/분)로 전환시켰다. 이어서 방출된 pNA의 ΔOD/분을 μ몰/분으로 전환시켰다. 이를 위해 눈금 곡선이 MTP 판독기에서 생성되었으며, 여기에서 순수한 pNA(Sigma) 0.25, 0.125, 0.0625, 0.0312 및 0.015 밀리몰/l의 희석물을 웰당 250 ㎕로 측정하였다. 상기 수득된 데이터로부터 눈금 곡선을 엑셀로 작성하였다. 상기 눈금 곡선으로부터 ΔOD/분을, 상기 pNA 기본 측정을 닌하이드린 기본 측정과 비교할 수 있도록 μ몰/분으로 전환시켰다.

상기 언급한 시험에서 생성된 데이터를 근거로, 상기 사용된 다양한 효소 제제들을 특성화하였다. 제공된 바와 같은 각각의 효소 제제 중에 존재하는 프롤린 특이적 올리고- 또는 엔도단백질 분해 활성에 대한 데이터를 표 1의 컬럼 "프롤린 특이 활성" 컬럼에 나타낸다. 목적하는 아미노펩티다제 활성(AP/프롤린 특이 활성) 및 오염성 카복시펩티다제(CPD/프롤린 특이 활성) 및 엔도단백질 분해 활성(엔도/프롤린 특이 활성)에 대한 데이터를 상기 존재하는 프롤린 특이 활성에 대해 나타낸다. 각각의 제제 중에 존재하는 상기 오염성 카복시펩티다제 활성에 대한 목적하는 아미노펩티다제 활성을 (AP/CPD)로서 나타낸다.

상기 시험된 상업적인 효소 제제들 중 어느 것도 임의의 현저한 프롤린 특이적 올리고- 또는 엔도단백질 분해 활성을 함유하는 것은 없음이 분명하다. 더욱 또한 시험된 모든 상업적인 효소 제제는 카복시펩티다제 및 엔도단백질 분해 활성을 함유한다. 효소 조합 C1은 존재하는 단백질 기질의 g 당 적용되는 4 단위의 프롤린 특이적 엔도프로테아제 + 130 마이크로 리터의 상업적인 코롤라제 LAP의 혼합물로 이루어지며, 상기는 고 수율의 ACE 억제 IPP, VPP 및 LPP 펩타이드를 생성시키며, 이는 그의 매우 낮은 수준의 오염성 카복시펩티다제 및 엔도단백질 분해 활성으로 인해 현저하다.

아미노- 및 카복시펩티다제 활성의 높은 함량을 근거로, GMP와 복합 효소 혼합물 스미자임 FP 및 플라보자임과의 배양은 높은 수준의 유리 아미노산을 생성시킬 것으로 예상될 수 있다. 이러한 유리 아미노산들은 증가된 마이야르 반응의 결과로서 육즙 이미를 부여할 것으로 예상될 수 있다. 더욱 또한 이들 효소 제제 중의 비 프롤린 또는 비 알라닌 특이적 엔도단백질 분해 활성의 존재는 최종 제품에서 추가적이고 아마도 생물활성인 펩타이드의 용해를 유도할 것이며, 이에 의해 IPP의 순수한 혈압 강하 효과가 흐려질 것이다. 모든 이러한 바람직하지 못한 부 반응들을 최소화하기 위해서, 상기 필수적으로 순수한 프롤린 특이적 프로테아제와 필수적으로 순수한 아미노펩티다제와의 조합이 바람직하다. 필수적으로 순수한 프롤린 특이적 엔도프로테아제만을 사용하는 것이 훨씬 더 바람직하다.

실시예 6

카제이네이트로부터 GMP 및 IPP 의 단리

상업적으로 입수할 수 있는 GMP를 치즈 유장으로부터 수득한다. 이 공정에서 우유를 키모신과 배양하여 카파 카제인으로부터 수용성 GMP 부분을 유리시킨다. 그 결과 상기 카제이네이트가 침전되어 커드를 형성하고 이에 의해 상기 GMP 부분은 치즈 유장에서 끝나며 이로부터 다수의 상이한 공정들에 의해 단리될 수 있다. 본 실시예에서 본 발명자들은 GMP의 단리에 대한 또 다른 경로, 즉 상업적으로 입수할 수 있는 카제이네이트로부터의 단리를 개시한다. 상기 경로의 이점은 상기 GMP의 선택적인 제거 후에, 나머지 카제이네이트 분획을 또 다른 용도에 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 (탈지)유를 당해 분야에 공지된 방법에 따라 산성화시켜 상기 카제인 분획을 선택적으로 침전시킨다. 상기 침전된 분획은 모든 카제인, 즉 알파, 베타, 카파(GMP 부분 포함) 및 감마 카제인을 포함한다. 상기 형성된 카제인 커드를 상기 "스위트 유장" 분획으로부터 분리하고 세척하여 나머지 유장 성분을 제거하고 상기 산성화 공정에 의해 생성된 이온을 제거한다. 탈수 후에 상기 카제인 커드를 중화에 의해, 예를 들어 KOH를 사용하여 재용해시켜 적합한 "카제이네이트"를 생성시킨다.

10%(w/v) 칼륨-카제이네이트 용액(대략 pH 6.4)을 31 ℃에서 1 시간 동안 송아지 키모신과 배양하여 GMP 부분을 카파 카제인으로부터 방출시켰다. 이 경우에 카제이네이트 1그램당 2.2 IMCU 맥시렌(Maxiren, DSM Food Specialities, Delft, The Netherlands)을 사용하였다. 생성 용액에 1 회 이상의 여과 단계를 가하여 상기 용해된 저 분자량 GMP 부분을 카제인과 키모신을 모두 함유하는 큰 분자량 분획으로부터 분리시켰다. 상기 GMP 함유 투과물을 pH 4.5로 산성화하고 상기 에이. 니거 유래된 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 존재하는 단백질 그램 당 4 단위의 농도로 가하였다. 상기 온도를 55 ℃로 증가시켜 상기 효소의 활성을 극대화하고 배양을 3 시간 동안 수행하였다. 이어서 생성 용액을 증발에 의해 농축시키고 95 ℃로 5 분간 가열하여 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 불활성화하였다. 최종적으로 가열된 농축물을 한외 여과하여 침전된 단백질을 가능한 한 많이 제거하고 분무 건조시켰다. 상기 분무 건조된 물질의 LC/MS/MS 분석에 따라, IPP 농도가 카제이네이트 출발 물질 그램당 IPP 0.6 밀리그램인 것으로 정량분석되었다.

실시예 7

단일 배양 단계에서 GMP 로부터 IPP 의 유리

일련의 배양을 수행하여 에이. 니거 및 스미자임 FP로부터의 프롤린 특이적 엔도프로테아제가 GMP로부터 혈압 강하 트라이펩타이드 IPP를 유리시키기에 적합함을 입증하였다. 본 실험에서 상업적으로 입수할 수 있는 GMP 제제를 사용하였다(Lacprodan CGMP-10, 로트# P340205, Arla, Denmark로부터). 명세서에 따르면 상기 수득된 분말은 약 80%(존재하는 단백질의)의 GMP 함량을 갖는 대략 85% 단백질을 함유한다, 즉 1 그램의 라크프로단 CGMP-10 분말은 대략 0.85 x 0.8 = 0.7 그램의 순수한 GMP를 함유한다.

상기 GMP를 탈염수에 용해시켰다(450 ㎖ 중의 GMP 50 그램). 상기 용액의 pH는 6.7이다. 상기 용액 중 135 ㎖을 4N HCl을 사용하여 pH 4로 만들고 추가의 물을 가하여 150 ㎖의 부피 및 10% 고체의 GMP 농도에 도달시켰다. 상기 pH 6.7 용액 중 45 ㎖을 4N HCl로 pH 6으로 만들고 90 ㎖을 4N KOH를 사용하여 pH 8로 만들었다. 상기 두 용액 모두에 여분의 물을 가하여 또한 10% GMP 고체의 농도에 도달시켰다. pH 4.0의 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제와의 배양을 선택하였는데, 그 이유는 pH 4가 상기 효소에 최적임을 나타내기 때문이다. 스미자임 FP는 다양한 엔도프로테아제, 아미노펩티다제 및 카복시펩티다제(이들은 모두 자신의 최적 pH를 갖는다)의 혼합물로 이루어지기 때문에, 상기 배양을 상이한 pH 조건 하에서 수행하였다.

다양한 pH 값으로 조절된 상기 3 개의 용액을 사용하여, 다양한 효소들과의 배양을 표에 나타낸 바와 같이 수행하였다. 상기 프롤린 특이적 엔도프로테아제를 0.4 U/㎖(∼4.2 U/gr 단백질)의 농도로 사용하고 스미자임 FP를 1 ㎎/㎖의 최종 농도(∼10.4 ㎎/gr 단백질)로 사용하였다. 모든 배양을 온화한 진탕 하에 6 시간 동안 40 ℃, 수욕 세트에서 50 ㎖ 원추형 그레이너 튜브에서 수행하였다. 상기 배양 후 상기 샘플들을 LC/MS/MS 분석시까지 -20 ℃에서 동결 유지시켰다. 상기 후자의 분석에서 획득된 바와 같은 데이터를 표에 나타내며 이는 IPP, VPP 및 LPP 표준 용액을 사용하여 측정하였다.

상기 수득된 결과로부터 순수한 프롤린 특이적 엔도프로테아제와의 배양은 펩타이드 VPP 및 LPP가 없는 IPP 함유 생성물을 생성시킴이 분명하다. 상기 최적화되지 않은 배양에서 방출되는 IPP의 양은 GMP 중에 존재하는 IPP 잔기의 대략 50%를 차지한다.

가장 중요하게는 상기 복합 스미자임 FP 효소와의 배양이 또한 GMP로부터 IPP를 형성시킨다는 것이다. 본 발명의 데이터에 따르면 pH 8 이하의 조건이 가장 효율적이다. 스미자임 FP를 사용하는 경우 IPP 수율이 프롤린 특이적 엔도프로테아제와의 배양에서보다 더 낮다는 사실은 단지 본 실험에서 스미자임 FP 효소의 용량 이하 상황을 반영한다. 매우 놀랍게도 스미자임 FP는 상기 라크프로단 물질로부터 IPP뿐만 아니라 VPP 및 LPP를 생성시켰다. 상기 트라이펩타이드 VPP 및 LPP가 오직 베타 카제인 아미노산 서열에만 존재하므로, 이들의 존재는 분명히 상기 수득된 GMP 물질이 베타 카제인으로 오염되어 있다는 사실을 예시한다.

실시예 8

GMP로부터 수득된 IPP 함유 가수분해 산물의 관능 이점을 입증하기 위해서, 맛보기 실험을 수행하였다. 본 실험에서 3 개의 상이한 기질, 즉 GMP, 칼륨 카제이네이트 및 탈지유를 에이. 니거로부터의 프롤린 특이적 엔도프로테아제와 함께 배양하였다. 상기 순수한 효소를 사용하면, 카파 카제인 분자 중에 존재하는 IPP만을 절제할 수 있다(WO 2006/005757 참조). 3 개의 배양물은 모두 3.5%(w/w) 단백질의 동일한 단백질 농도를 함유하였으며 동일한 양의 효소, 즉 4 단위/g 단백질을 함유하였다. 상기 카제인의 침전을 방지하기 위해서, 상기 용액의 pH를 6.2로 조절하였다. 배양을 3 시간 동안 진행하고 이어서 짧은 열 처리에 의해 종결시켰다.

상기 3 개의 가수분해 산물 모두에서 상당한 침전물이 존재하였다. 원심분리시켜 상기 침전물을 제거한 후에, 등명한(IPP 함유) 상등액을 5 명으로 구성된 훈련된 패널들에게 시식시켰다. 패널 구성원들은 하기의 농도를 갖는 퀴닌 설페이트 용액으로 훈련되었다: 15 ㎎/L의 퀴닌 설페이트 > 쓴맛 강도 = 1, 20 ㎎/L의 퀴닌 설페이트 > 쓴맛 강도 = 2, 30 ㎎/L의 퀴닌 설페이트 > 쓴맛 강도 = 3 및 50 ㎎/L의 퀴닌 설페이트 > 쓴맛 강도 = 4. 상기 패널은 각 가수분해 산물의 쓴맛을 0(쓴맛 없음)에서 4(매우 씀)까지의 등급으로 점수를 매겼다. 15 ㎎/L 퀴닌 설페이트의 비교 샘플을 상기 맛보기 시험기간 전에 상기 패널들에게 제공하였으며, 패널들은 1의 쓴맛 강도 값을 할당하였다. 상기 카제인 가수분해 산물은 매우 쓴 것으로, 즉 상기 맛 패널의 모든 구성원들에 의해 4로 판정되었다. 탈지유 가수분해 산물도 또한 상기 패널의 모든 구성원들에 의해 3의 쓴맛 점수를 받았다. 상기 GMP 가수분해 산물을 맛볼 때, 패널은 만장일치로 1의 점수를 주었다. 상기 GMP 가수분해 산물이 또한 최고 농도의 IPP를 제공하는 것으로 예상할 수 있음을 고려하였을 때, 본 발명에 따른 방법의 놀라운 이점은 명백히 입증된다.

실시예 9

발효에 의한 GMP 로부터 IPP 의 유리

발효된 유제품의 불량한 풍미 및 발효된 브로쓰로부터 ACE 억제 펩타이드의 회수 중에 접하게 되는 많은 가공 어려움은 미국 특허 제 6,428,812 호에 개시되었다. 본 실시예에서 본 발명자들은 상기 GMP 분자가 또한 발효에 의한 IPP의 생산에 적합한 기질임을 입증한다.

2 개의 락토바실러스 균주, 락토바실러스 애시도필루스 LAFTI(등록상표) L10 및 락토바실러스 카제이 LAFTI(등록상표) L26(DSM Food Specialties, Australia)을 본 연구에 사용하였다. 상기 두 균주를 모두 MRS 브로쓰(Oxoid)에서 37 ℃에서 24 시간 동안 CO₂ + N₂ 분위기(AnaeroGen^TM, Oxoid) 하에 혐기성 용기에서 증식시켰다. 이어서 생성된 예비배양물을 발효 브로쓰 "a" 또는 발효 브로쓰 "ay"에서 배양시켰다. 발효 브로쓰 "a"는 트윈 80(1 ㎖/l), K₂HPO₄(2 g/l), NaAc(3 g/l), (NH4)3시트레이트(2 g/l), MgSO4.7H2O(0.2 g/l), MnSO4.4H2O(0.05 g/l), 글루코스(20 g/l), GMP(Lacprodan, Arla; 22 g/l)를 함유하였다. 발효 브로쓰 "ay"는 효모 추출물(4.0 g/l)을 또한 함유하였다. 새로 접종한 발효 브로쓰 "a" 및 "ay"를 상기 개략된 조건 하에서 추가로 24 시간 동안 배양하였다. 그 후에, 상기 배양 브로쓰를 원심분리시키고 상등액을 트라이펩타이드 IPP, LPP 및 VPP의 존재에 대해 LC/MS에 의해 분석하였다. 표 4에 예시된 바와 같이, 균주 L10과의 배양에서만 IPP의 존재가 0.3 ㎎/l의 수준으로 검출될 수 있었다. LPP 및 VPP는 존재하지 않았다. 샘플 1 및 5의 맛보기는 현저한 이미를 나타내지 않았다.

Claims (39)

1. 카파 카제인의 GMP(글리코마크로펩타이드) 부분을 90%(w/w) 이상 포함하는 단백질 공급원으로부터 IPP(Ile-Pro-Pro)를 제조하는 방법으로서,

   상기 단백질 공급원을 가수분해시켜 -I-P-P-서열의 20% 이상을 펩타이드 IPP로 유리시킴을 포함하며,

   상기 단백질 공급원 중에 존재하는 프롤린 잔기의 카복시 말단에서 절단하는 단백질 분해 효소를 사용하는, 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 프롤린의 카복시 말단에서 절단하는 단백질 분해 효소 및 아미노 펩티다제를 단일 단계에서 함께 배양하는, 방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 프롤린의 카복시 말단에서 절단하는 단백질 분해 효소가 프롤린 특이적 엔도프로테아제 또는 프롤린 특이적 올리고펩티다제인, 방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 프롤린의 카복시 말단에서 절단하는 단백질 분해 효소가 프롤린 특이적 엔도프로테아제인, 방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 단백질 공급원이 -V-P-P-가 없는 단백질을 95%(w/w) 이상 포함하는 단백질들의 혼합물을 포함하는, 방법.
6. 제 1 항에 있어서,

   GMP 중에 존재하는 -I-P-P-서열의 40% 이상을 펩타이드 IPP로 전환시키는, 방법.
7. 제 1 항에 있어서,

   GMP를 아미노펩티다제 및 프롤린 특이적 프로테아제와 배양시킴을 포함하며,

   이때 GMP를 먼저 아미노펩티다제와 배양시키고 후속적으로 프롤린 특이적 프로테아제와 배양시키는, 방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 프롤린 특이적 프로테아제가 프롤린 특이적 엔도프로테아제인, 방법.
9. 제 7 항에 있어서,

   상기 프롤린 특이적 프로테아제를 첨가할 때 상기 아미노펩티다제가 활성이 아닌, 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 단백질 공급원의 가수분해 중에 형성되는, IPP를 포함하는 용해성 펩타이드를 분리시키고 건조시키는, 방법.
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