WO1986003779A1 - Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms - Google Patents

Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms Download PDF

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WO1986003779A1
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dna
polypeptide
vector
signal peptide
nucleotide sequence
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PCT/JP1985/000696
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Hideo Ohgai
Hiroshi Momota
Takeshi Kumakura
Noriyuki Kajifusa
Toshiki Kitazawa
Kazuhide Oshiden
Aizo Matsushiro
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Earth Chemical Company, Limited
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    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a vector for expressing a polypeptide secretion, a microorganism transformed with the vector, and production of the polypeptide by the microorganism.
  • polypeptides including interferon, growth hormone, etc.
  • host cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast. Manufacturing methods have already been established. However, there are still some unresolved problems with the established methods and even with the production of polypeptides that are exactly the same as natural products. It is not always easy. One of the most important of the above-mentioned problems is that it is difficult to make the N-terminus of polypeptide the same structure as natural products. Wear .
  • the translation of the gene into the polypeptide usually takes place at the initiation codon ( ATG)
  • the N-terminus of the resulting polypeptide will be a formylmethine-rich residue.
  • the method is not applicable to the production of other polypeptides having an N-terminus.
  • the above-mentioned formylmethine amine residue can be removed from the polypeptide by a chemical reaction using cyanogenogenide.
  • the polypeptide ⁇ itself is cleaved at the site where the amino acid residue has a methyl residue other than the N-terminus. Repeptides cannot be manufactured.
  • Another method is to combine a gene encoding a target polypeptide with a gene encoding another polypeptide to express it as a fusion polypeptide.
  • the separation of the target polypeptide from the resulting fusion polypeptide can be carried out by treatment with an enzyme such as trypsin or by shearing. It is based on chemical treatment using nogen bromide.
  • an enzyme such as trypsin or by shearing. It is based on chemical treatment using nogen bromide.
  • the amino acid used as the target of the enzyme or chemical used in the target polypeptide chain is present, that point is also found. As a result, the peptide chain is cleaved, and eventually the desired polypeptide cannot be produced.
  • the above method enables the separation of the target polypeptide from the fused polypeptide.
  • the process of separating the fusion polypeptide from the crude cell extract was usually performed, and the fusion polypeptide was cut off. Separation of the target polypeptide from the reaction composition requires two purification operations, which complicates the operation and the process itself, and lowers the yield of the target product. Inevitable .
  • An object of the present invention is to provide an improved method capable of directly producing a polypeptide that is completely in line with the natural type desired in the art directly from a host cell.
  • Another object of the present invention is to provide a novel vector for carrying out the method and a microorganism having the vector. Disclosure of light
  • a DNA base sequence encoding a signal peptide and a DNA base sequence encoding a target polypeptide are directly ligated to each other.
  • DNA encoding a signal peptide for secretory expression of the peptide A vector for secretion expression of a polypeptide characterized by containing a nucleotide sequence, a DNA nucleotide sequence encoding a signal peptide and a DNA nucleotide encoding a target polypeptide: The above vector containing a DNA base sequence encoding a fusion polypeptide directly linked to a sequence, the microorganism transformed with the vector, and culturing the microorganism
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide which collects a secreted polypeptide.
  • H is; histidine et;
  • Signal peptides are amino acid sequences that function to secrete extracellularly produced polypeptides inside cells, and are generally used by microorganisms to produce all cells. There are two types of peptides: those that stay inside the cell and perform their functions, and those that are secreted outside the cell, and those that are secreted outside the cell. First, it is produced in a cell as a precursor having a signal peptide consisting of a dozen or more tens of amino acid sequences added to its N-terminus, and is then produced in the cell. When passing through the cell membrane via the signal peptide due to the action of its own signal peptide, the signal peptide is turned around by the action of the signal peptide at the periphery.
  • the target polypeptide secreted extracellularly in this manner is called “mature polypeptide”).
  • the three lactamase of Escherichia coli becomes a ⁇ - lactamase precursor in the cell, which is composed of three lactamases and 23 amino acids.
  • the signal peptide After being produced as a fusion protein with the signal peptide, it is passed through the cell membrane by the action of the signal peptide, and between the cell membrane and the outer membrane, that is, between the cell membrane and the outer membrane.
  • the present inventors have focused on the characteristics of the above-mentioned signal peptide, and produced a foreign protein of interest as a fusion polypeptide with the signal peptide in the host cell using the signal peptide.
  • the idea is that exogenous proteins can be secreted extracellularly as mature polypeptides, and thus the desired polypeptides can be easily produced and obtained. They conducted diligent research.
  • a new vector capable of secreting extracellularly the target polypeptide as a mature polypeptide by actually introducing it into the host cell. Smid) and the vector for the expression of polypeptide secretion for the vector was successfully constructed, and the purpose of using this vector was Polypeptide was successfully manufactured.
  • the vector for expression of polypeptide secretion of the present invention comprises a signal peptide designed so that a DMA nucleotide sequence encoding the target polypeptide can be directly ligated.
  • DNAs also include bases that have been decorated in accordance with a conventional method such as methylation.
  • H is; C A T. C A C
  • a rg A G A, A G G, C G D, C G C, C G A
  • the DNA nucleotide sequence encoding the signal peptide contained in the vector of the present invention is based on the specific DNA nucleotide sequence as described above, and is located near the 3 'side thereof. Immediately, add a DNA sequence near the side to which the target polypeptide is to be ligated, preferably within 0 bases, or further up to 0 bases.
  • a restriction enzyme recognition sequence shall be included in the additional part of the above. This is essential for directly linking the DNA nucleotide sequence encoding the above-mentioned signal peptide to the DNA nucleotide sequence encoding the target polypeptide. is there .
  • the enzyme that recognizes the restriction enzyme recognition sequence may be any known restriction enzyme, but preferably recognizes a base sequence of 5 bases or more. The DNA base sequence in the vicinity of the 3 ′ side can be arbitrarily changed in response to this enzyme.
  • the amino acid at the C-terminal, Ala can be used as a code.
  • GCC is selected as the base sequence to be added, if G (3G base sequence is linked to This 6-base sequence of GCCGGC is recognized by the ocular antioxidant Nael.
  • the DNA sequence encoding the signal peptide is cut at its center by Nae I and thus has a 3 'end that is GCC (C-terminal amino acid of the signal peptide). (Corresponding to Ala) can be obtained, and immediately after that, any DNA base sequence encoding the target polypeptide can be directly ligated to the DNA.
  • TTCGCG is selected as the base sequence encoding Phe—AIa that constitutes the two amino acid sequences at the C-terminus of the signal peptide
  • TTCGCGA 3 In the 7-base sequence obtained by further ligating the adenine base (A) to the 'side
  • TCGCGA is recognized by the restriction enzyme N rul and is cleaved at the center.
  • the 3 'end of the DNA base sequence obtained as described above is TTCG.
  • the DNA sequence encoding the target polypeptide to be ligated is used.
  • a DNA nucleotide sequence of CT, CC, CA or CG By adding a further 2 nucleotide sequence of CT, CC, CA or CG to the 5 'side, a DNA nucleotide sequence encoding the desired fusion polypeptide can be obtained. .
  • the DNA base sequence thus obtained is obtained by further binding the 7 base sequence of AACTCAG to the 3 ′ side of the DNA base sequence encoding the signal peptide, and this 7 base sequence Among them, the first three nucleotide sequence AAC encodes A sn, the next three nucleotide sequence T ⁇ A encodes Ser, and the last guanine (G ⁇ Is the first base of the codon that encodes Aia, GlyVal, Asp or GIn. Therefore, it encodes the signal peptide.
  • a DNA base sequence for example, a polypeptide in which the N-terminal amino acid is Asn-Ser-Asp, such as in the case of 30-gastrostron, etc.
  • a DNA sequence that is the same as the DNA sequence coding for the peptide, except for the 7 'sequence on the 5' side for example, AACTCAG.
  • a DNA base sequence that encodes a desired fusion polypeptide a fusion polypeptide of 3 ⁇ gastrotron and signal peptide
  • the DMA base sequence encoding the signal peptide as a component of the vector of the present invention is as described above.
  • those further added with up to 10 DNA base sequences can also be used as preferred.
  • One specific example has a DMA base sequence represented by the following formula (3) to which the above-mentioned 0 base sequence is added.
  • the DNA base sequence or a base sequence containing the same is preferably prepared by various conventionally known methods, for example, a microorganism containing the same, a plasmid isolated therefrom, and the like. For example, it can be easily produced by cutting out and isolating from pBR322 etc. using a restriction enzyme, etc., chemically synthesizing it according to its DNA base sequence, or a combination of these methods. can do .
  • the DNA nucleotide sequence encoding the above-mentioned signal peptide and the DNA nucleotide sequence encoding the target polypeptide can be linked to or bound by various methods known in the art. For example, an enzymatic reaction using T4 DNA ligase or the like can be followed.
  • the vector of the present invention containing the following DNA base sequence can be obtained by converting the DNA base sequence into, for example, a plasmid, virus DNA or cosmid (eg, pJB8, Ish-H orowicz, D and B urke, J.F., Nucleic A cids Res., 9,
  • Plasmid PTUB 4 [Bacillus * subtilis ⁇ — — ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ H ⁇ H H UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB UB , 1 5 6, 3 2 7-3 3 7
  • Plasmid PHC 5 (Signal peptide of maltose-binding protein derived from Escherichia coli, H. Bedoue II e et aI., Nature, 28. 5, 78-81 (1980))
  • Plasmid PSN 518 (Signal peptide of phosphoric acid-binding protein derived from Escherichia coli, K agota et a to J. B acter io I., 1 5 7, 9 0 9-9 1 7
  • the vector for expression of polypeptide secretion containing the DNA base sequence encoding the signal peptide of the present invention obtained by the method described above can actually In order to introduce the target polypeptide into the host cell to secrete and express the target polypeptide, it is necessary to further introduce a DNA base sequence encoding the target polypeptide into the host cell.
  • transcriptional regulators such as promoters, ribosome binding sites, translation termination signals, transcription termination factors, and translational regulators. I don't have to.
  • Each of these factors may already be included in the source vector, in which case the three vectors derived from the source vector, for example, PBR322, are used. It is possible to use the maze regulatory factors, etc. as they are.
  • promoters include, for example, promoters such as Escherichia coli lactose extract, triple-fan operation, and phage PL.
  • transcription termination factor such as t L 1 of full ⁇ over di like
  • TAA transcription termination factor
  • TAG TAG
  • TGA transcription termination factor
  • the vector of the present invention which has the particularly preferred regulatory factor and a signal peptide
  • it is constructed using PBR322 as an origin vector.
  • PGH54 and PGH55 can be exemplified.
  • pGH54 is (3 lactamase following the promoter and ribosome binding site of 3 lactamase). It has a DNA base sequence that encodes the signal peptide of zein, and has Nru1 and PVIIII restriction enzyme recognition sequences at the 3 'end of this base sequence. Its characteristics are as shown in Fig. 1 along with its manufacturing outline operation.
  • pGH54 shows the restriction enzyme cleavage site shown in the figure. Characterized by the figure.
  • the size of the PGH 54 is about 3.9 Kb as measured by 1.0% agarose gel electrophoresis.
  • the Escherichia coli HB10 strain harboring the plasmid pGH54 was deposited with the Microorganisms and Industrial Technology Research Institute of the Ministry of International Trade and Industry under the designation "HB101 [PGH54]". Its deposit number is FERMBP-679 (FERMBP-679).
  • PGH 55 is a DNA base that encodes the 3 lactamase promoter and the ribosome binding site followed by the / 3 lactamase sidanal peptide. Although it has the same sequence as PGH54 in having the sequence, it lacks about 0.64 kb DNA including the second ⁇ restriction site in pGH54. Thus, the first PvuII restriction site is located near the 3 'end of the DNA sequence encoding the signal peptide. Its characteristics are as shown in Fig. 2 together with its manufacturing outline operation.
  • pGH55 is characterized by the restriction map shown in the figure, and its size is about 3.3 k, as measured by the above method. is there .
  • An E. coli strain carrying this plasmid, PGH55 was submitted to the Microbiological and Industrial Technology Research Institute of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry as "HB10. (GH55) ", and the deposit number is FERMBP-680.
  • the present invention comprising the above-mentioned various regulatory factors and having a DNA nucleotide sequence encoding a signal peptide and a DNA nucleotide sequence encoding an objective polypeptide directly bound thereto.
  • the polypeptide secretion expression vector of the present invention is constructed in the same manner as the above-described vector of the present invention, and the present invention also provides such a mature polypeptide secretion expression vector.
  • the fusion polypeptide which is linked to a DNA nucleotide sequence encoding a signal peptide, is added to the mature polypeptide secretion expression vector of the present invention to provide the fusion polypeptide.
  • any polypeptide and the DNA base sequence encoding the same are not included. They can also be used.
  • the above polypeptides include, for example, epidermal cell growth promoting factor, somatostatin, insulin, GIP, R-MSA, thymosin ⁇ I, growth formol Hormones, growth factors such as growth hormone release factor, interferon, interlokin 2, tumor necrosis factor, etc.
  • Substances Serum albumin, Plus Minogen Activator examples thereof include blood constituent substances such as apolipoprotein, antigen proteins for vaccines such as hepatitis B virus surface antigen, and the like.
  • the DNA base sequence encoding the various polypeptides may be extracted and isolated from the cells or the like from which they originate according to the usual method. It can also be chemically synthesized according to the amino acid sequence.
  • polypeptide and / or its DNA sequence are shown below.
  • Thymosin JSA Thymosin ⁇ &
  • the linkage between the above-described DNA sequence of the polypeptide and the DNA sequence of the signal peptide has, for example, the DNA sequence of the signal peptide.
  • the vector for polypeptide secretion and expression according to the present invention is prepared by converting the DNA base sequence of the polypeptide into an enzyme reaction using a restriction enzyme, for example, by using a restriction enzyme according to the method described above. A Enzyme reaction using DNA ligase It can be implemented by introducing it. Further, after chemically synthesizing the DNA base sequence of the fusion polypeptide of the above-described polypeptide and signal peptide in advance, the DNA base sequence is replaced with the DNA of the signal peptide. Similarly to the introduction of a nucleotide sequence, it can be carried out by introducing it into a vector.
  • the polypeptide secretion expression vector of the present invention having the DMA base sequence encoding the fusion polypeptide can be obtained.
  • This has a promoter and a liposome binding site in front of the DNA base sequence encoding the fusion polypeptide, and has a purpose to constitute the base sequence. It has a translation stop signal immediately after the DNA sequence of the peptide, which is transformed into a suitable host cell to transform the cell and secrete the polypeptide. It can be phenotypic.
  • a preferred specific example of the polypeptide secretion expression vector is pUG201.
  • the pUG201 contains 3 lactamase promoter, liposome binding site, 3 lactamase signal peptide DNA base sequence, 3)
  • the DNA base sequence and its translation termination signal of the logastrone (target polypeptide) are precisely arranged in this condylar structure. It has an aligned DNA base sequence. The sequence is as shown in Table 4 in Examples below.
  • the Escherichia coli HB101 strain having the vector (plasmid) PUG201 becomes "101 (PUG200)" at the Research Institute of Microorganisms and Technology of the Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry. Deposited with the label, the deposit number is FERMBP-681 (FERMBP-681).
  • the introduction of the polypeptide secretion expression vector of the present invention into a host cell can be performed according to various known methods, and the host cell to be used is not particularly limited. Rather, various known species of host cells that can be used as host cells include, for example, gram-negative bacteria such as Escherichia coli, gram-positive bacteria such as Bacillus subtilis, and actinic radiation. Of these, bacterial strains, yeast strains and the like can be exemplified. In particular, bacterial strains derived from Escherichia coli K12 such as HB101 strain are preferred. All of these host cells are signal peptides as a mechanism for secreting polypeptides necessary for maintaining normal cell function, such as extracellular secretory components and outer membrane components.
  • fusion polypeptides are produced in the cells, and then extracellularly or extracellularly. Is the secretion and accumulation of mature polypeptides in periplasm.
  • the mRNA is expressed by the action of the transcriptional regulatory factor in the vector and various factors in the host cell. Is produced.
  • a fusion polypeptide is produced from the mRNA by the action of translational control factors and various factors in the host cell.
  • the fusion polypeptide produced here is extracellularly or periplasmically secreted by the action of signal peptide, and at the same time, by the action of signal peptidase.
  • the signal peptide is separated from the fusion polypeptide.
  • mature polypeptides that do not contain signal peptides or any other unwanted amino acid sequences are secreted and accumulated extracellularly or periplasmically.
  • the separation and purification procedures include, for example, gel filtration and adsorption chromatography, from the culture supernatant or the periplasmic fraction prepared by the osmotic shock method. , An ion exchange chromatography, a high-performance liquid chromatography, or the like can be appropriately combined.
  • the target polypeptide obtained according to the present invention since the target polypeptide obtained according to the present invention is secreted, it has an advantage that its separation and purification are relatively easy.
  • each DNA is dissolved in an aqueous solution containing dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, and the amount of DNA polymerase I (crepe) is adjusted to 1 unit per DNAI ⁇ g. No fragment, Takara Shuzo) and react with 12 for 30 minutes.
  • 6.6 mM tris-hydrochloric acid (PH 7.5), 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM bovine serum Arve Mi emissions aqueous solution with the addition of a DNA fragment, as a I g equivalents are three Yoo two Tsu preparative and name Ru amount of T 4 DNA rigger over peptidase (Takara Shuzo Co., Ltd.) and 1 Incubate (circularize) the DNA by reacting at 2 ° C for at least 5 hours.
  • an HB101 strain derived from Escherichia coli K12 strain is used as a host cell.
  • the HB101 strain was grown on an LB medium ( ⁇ % peptitripton, 0.5% pakistorexit, 0.5% sodium chloride).
  • the cells are grown at 7 ° C until the absorbance at 60 nm reaches 0.25, and the culture is centrifuged (600 rotations X 10 minutes) at 40 ⁇ . And then cooled on ice. This was washed with 0.1 m2 magnesium chloride, 20 mfi, and then ice-cooled with 0.5 ml of iVI calcium chloride and 0.05 M magnesium chloride solution. Suspend in ⁇ and cool on ice for 1 hour. After centrifugation (600 rpm x 0 min), the cells were ice-cooled into 0.1 0 calcium chloride and 0.05 5 magnesium chloride solution 2 2 ⁇ . To resuspend ⁇ _ suspension 0.202,
  • the obtained transformant is selected based on the following antibiotic resistance.
  • a plate medium prepared by adding ampicillin 50, g / ⁇ or tetracycline 20 ⁇ g Zma to an L medium containing 5% agar. Then, spread 0.3 mS of each of the above-obtained reaction solutions, and incubate them overnight at 37 to isolate the colonies of the E. coli cells that grow. 6 Isolation of the plasmid
  • Strain containing plasmid was added to ampicillin 50 ⁇ g ⁇ or tetracycline 20 ⁇ g / ⁇ , and the medium was added to B medium at 500 ms for 6 ms. Incubate at 37 with shaking until the absorbance at 10 nm is about 0.6. Then, add 80 mg of chloramnicole, and culture with shaking at 37 ° C for 12 to 16 hours. This is centrifuged (600 rpm / min X 10 min) to collect the cells, and washed with a 0.85% aqueous sodium chloride solution.
  • the cells were suspended in a solution of 2096 sucrose and 50 mM tris-hydrochloric acid (pH 8.0) in 2.5 l ⁇ , and then suspended in 0.25% tris-hydrochloric acid containing 1% lysozyme. ⁇ 8.0) Add 0.513 solution and cool with water for minutes. 0.25 M E D T A
  • the nucleoside-carrying resin is obtained by reacting the sodium nucleoside with a monosuccinate ester. Next, the following operation is performed using a DNA synthesizer manufactured by Birchem.
  • the protected oligonucleotide was then purified using a 0.5 M pyridin solution of pyridin-monohydrate (1: 1) solution. From the tube. This is a Sephadex G-50 column (manufactured by Pharmacia, 2 x 100 cm), and a high-speed liquid chromatograph (pump: wool) Datars 600 A type, detector; 440 type detector, power ram; microponder pack C18, elution solvent; (5 ⁇ (40%) Acetonitrile 0. Purify with triethylammonium acetate (aqueous solution). Next, a deprotection reaction is performed with 80% hydrochloric acid, and purification is performed again by high performance liquid chromatography until a single peak is obtained. The conditions for this high-performance liquid chromatography are as follows: (5 ⁇ 25) %) Acetonitrile — 0. Same as above except that aqueous triethylammonium acetate solution is used. ⁇ 8. DNA sequence analysis
  • a single colorless plaque was taken out through a pasteur pit, and the culture medium 0.01 of the JM103 strain was added to a double-layer culture medium 1.
  • in8 shake culture at 37 ° C for about 5 hours to grow the replacement phage.
  • After culturing remove the cells by centrifugation and remove the supernatant to 20% polyethylen.
  • Mix 0.2 ⁇ of Recall 600 leave at room temperature for at least 15 minutes, collect phages that settle distantly, and extract phenol
  • a single-stranded DNA is extracted from the phage and used as a ⁇ -type single-stranded DNA.
  • ddA is a side chain of adenosine
  • fl C is a chain of a side chain
  • ddG is a chain of adenosine
  • dd T represents side-effect cistimidine 9.
  • agarose gel electrophoresis and separation of the DMA fragment from the gel after the electrophoresis are performed.
  • the electrophoresis power supply is a Contour Paper SJ1065 manufactured by Art One Co., Ltd.
  • the electrophoresis tank is a 12 x 15 cm plastic water tank (platinum).
  • Agarose I manufactured by Shuin Kagaku Kenkyusho
  • 40 mM Tris-HCl 5 mM
  • mM sodium acetate and 1 m DTA containing, PH 7.9 respectively.
  • polyacrylamide gel electrophoresis and the separation of DNA fragments from the gel after electrophoresis were performed. Separate.
  • As a swimming power supply use a Contower Power Model SJ1065 manufactured by Art One, and use a Satou Model SJ1060 SD as an electrophoresis tank.
  • As an acrylamide solution an aqueous solution of acrylamide and N, N'-methylbenzeneacrylamide (29: 1) is used to promote polymerization. N, N, N ',
  • N'-tetramethyleneethylenediamine is used as ammonium persulfate as a cocatalyst.
  • 90 mM tris-hydrochloric acid ⁇ 90 mM folic acid was used as the electrophoresis buffer.
  • Escherichia coli 3 For the synthesis of an oligonucleotide that has a DNA base sequence that encodes a part of the lactamase signal peptide, it has the following base sequence. Each of the species of lignonucleotides was synthesized by the solid phase phosphoric acid ester method described above.
  • each of the above-mentioned lignonucleotides ⁇ 2> and ⁇ 4> was phosphorylated using Ti polynucleiotidylkinase (manufactured by BRL). .
  • 1 ⁇ g of each oligonucleotide was added to a 50 mM aqueous solution of tris-hydrochloric acid (about 0 mM magnesium chloride, 5 iii iV1). , 1 mm Including ATP, pH 9.5) Dissolve in 50 5S, add 5 units of T4 polynucleotidylkinase, and incubate with 37 for 30 minutes. Then, the reaction was stopped by phenol extraction.
  • the plasmid PBR32 2 (Bolivar et aI, Gene, 2, 95- 13 (19777)) was used. .
  • plasmid PBR3222 Approximately 0 g of the plasmid PBR3222 was cut in a salt-buffered buffer using the restriction enzymes Pstl (Takara Shuzo) and Pvul (NEB). Then, a 0.04% agarose gel electrophoresis was performed to isolate a DNA fragment of about 4.24 kb.
  • FIG. 1 shows a plot of the source vector PBR322 with the synthetic oligonucleotides ⁇ 1>, ⁇ 2>, ⁇ 3>, and ⁇ 4> cloned.
  • FIG. 2 is a diagram showing a process for obtaining Smid PGH53 and the characteristics of pGH3 obtained by the process, in which b shows the nucleotide sequence derived from synthetic lignonucleotides. are doing .
  • the obtained PGH53 has a size of 4.3 Kb as a result of 1.0% agarose gel electrophoresis, and its DNA base sequence was determined by the method described in Section III.
  • the restriction site between Pstl and Pvul of PBR322 was deleted, and instead, as shown below, the human lignonucleotide ⁇ 1>, It was confirmed that ⁇ 2>, ⁇ 3>, and ⁇ 4> were inserted.
  • the PGH53 is listed on the Microorganisms and Industrial Technology Research Institute of the Ministry of International Trade and Industry by the Ministry of International Trade and Industry, with the designation "101 (GH53)”. ).
  • This fragment contains most of the DMA sequence derived from the synthetic oligonucleotide and the replication initiation region of the plasmid.
  • PBR322 was cut with restriction enzymes A val and Hind ffl (both from Takara Shuzo) using medium salt concentration buffer.
  • This fragment contains part of the promoter of the tetracycline resistance gene and all of the structural genes for tetracycline resistance.
  • PBR 3 2 2 is restricted to restriction enzyme F nu4 HI (NEB) using a low-salt buffer, followed by S1 nuclease to decompose and remove protruding bases at the ends of the DNA fragments.
  • F nu4 HI NEB
  • S1 nuclease S1 nuclease to decompose and remove protruding bases at the ends of the DNA fragments.
  • the DNA after phenol extraction was treated with 6 mM sodium peracid, 40 mM sodium chloride, and 1 mM zinc sulfate buffer (PH 4.5). It was dissolved in mS, added with 200 units of S1 nuclease (manufactured by BRL), and reacted at 20 for 30 minutes. .
  • This fragment contains the 3-lactamase promoter, the ribosome binding site, some of the genes encoding the signal peptide, and tetracyclase. It contains a part of the promoter of the resistance gene.
  • FIG. 4 is a diagram showing a process for obtaining a vector PGH54 for expressing a polypeptide of the present invention from GH53 and PBR322 and characteristics of the obtained vector PGH54.
  • ⁇ shows the nucleotide sequence encoding the signal peptide.
  • PGH 54 is characterized by a size of about 3.9 Kb as described above and a restriction enzyme cleavage map as shown in FIG. 2 and a base by the VI13 method. As a result of sequence analysis, it was confirmed that the gene had the 3 lactamase signal ⁇ peptide encoded by the nucleotide sequence represented by the above formula (3). . (C) Vector for expression of mature polypeptide secretion PGH
  • BR PBRH 02 a plasmid in which the base sequence between the AVaI and ⁇ VuI restriction sites of PBR32 was deleted, was prepared by the following procedure. . Immediately, 5 xg of PBR32 2 was added to the restriction enzymes AvaI and PvuI (any After cutting with phenol, DNA polymerase I (Klenow Fragment, Takara Shuzo) cuts the fragments into ends. did . Next 1. Separates 096 ⁇ moth B over sedge gel electrophoresis of about 3. 7 2 0 eight fragments, the fragments of the teeth was cyclized with T 4 DNA rigger over zero.
  • the HB101 strain is transformed with this reaction mixture, and one strain is selected from the resulting transformants showing ampicillin resistance and tetracycline resistance. Then, a plasmid was isolated to obtain pBRH02. The obtained PBRH 02, unlike PBR 32 2, was not cut by Aval or ⁇ .
  • This fragment contains a part of the tetracycline resistance gene and the replication initiation region of plasmid.
  • This fragment contains the 3/3 lactamase promoter, the liposome binding site, the DNA sequence encoding the signal peptide, and the tetracycline resistance gene. Is included.
  • Fig. 3 shows that PBR H 0 2 is obtained from PBR 32 2
  • FIG. 1 is a view showing a step of obtaining a polypeptide PGH55 for expression of polypeptide secretion of the present invention from PBRHO2 and PGH54, and the characteristics of the obtained PGH55.
  • PGH 55 is characterized by the restriction map shown in Fig. 3 above, and has a size of about 3.3 Kb as a result of electrophoresis of 1.0% agarose gel. Had.
  • the PGH 55 was the same as the PGH 54 except that it lacked about 0.64 kb of DNA including the second Pvul restriction site in PGH 54 as a result of nucleotide sequence analysis by the three methods.
  • the PGH 54 and Zhou Therefore, the first ⁇ II restriction site encodes a signal peptide. It was confirmed that the site was located near the 3 ′ end of the DNA base sequence.
  • This nucleotide sequence corresponds to the amino acid sequence [Nature, 2557, 325—32 7 (1975)] reported by H. Gregory. First, add a start codon, stop codon and restriction enzyme recognition site before and after the DNA sequence that encodes the 3 ⁇ -logatron, as described below.
  • the c DNA base sequence obtained by constructing the DNA base sequence shown in Table 3 has already been patented by the present inventors as Japanese Patent No. 59-137691. Has been published. Table 3
  • the HB101 strain that possesses the plasmid PUG3 of
  • the DNA fragment obtained by cutting pUG3 obtained in the above (B) with the restriction enzyme HnfI was inserted into the Pvul restriction site of PGH55, and the signal peptide was obtained.
  • / 3 PUG201 which is a secretory expression vector containing a DNA base sequence encoding the oral gastroin fusion polypeptide, was purified by the following method. Built.
  • This fragment contains the nucleotide sequence excluding the 7 'group at the 5' end of the DNA nucleotide sequence (including the translation termination codon) that encodes the 3 ⁇ gastrotron. Had been.
  • the PGH55 is the first 7 that encodes the N-terminal region of 3 ⁇ gastrotron after the DNA sequence that encodes the 3 lactamase signal peptide. DNA sequences that are directly linked to each other, and that are constructed so as to be cut immediately by the restriction enzyme PVIIE immediately after that. 5 / g of PGH55 was cut with Pvul in a medium salt concentration buffer to obtain a DNA fragment ⁇ G >> of about 3.26 kb.
  • This fragment has all the transfer information of pGH55.
  • FIG. 4 shows the DNA base encoding the fusion polypeptide of PGH55 and PUG3 with a signal peptide and a target polypeptide (jS-logastrone).
  • FIG. 2 is a view showing a step of obtaining a polypeptide secretion expression vector PUG201 of the present invention containing a sequence, and the characteristics of the obtained PUG201.
  • white arrows indicate -jS ⁇ Shows the message of the Logtron.
  • PUG 201 had a size of about 3.7 Kb as a result of 1.0% agarose gel electrophoresis. When this is cut with BamHI or HindI, two types of DNA fragments are obtained, respectively. Therefore, the PUG201 contains a three-mouth gastron gene. Was found, and the size of the fragment was examined. As a result, the fragment was found to be the desired plasmid.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment from the promoter portion of the 3 lactamase to the 3 rogastrone gene was determined. It was determined by nucleotide sequence analysis using the M13 method. As a result, the DNA base The sequence is as shown in the fourth section below.
  • P UG201 is a promoter, a ribosome binding site, and a / 3 lactamase signal peptide.
  • Nucleotide sequence that encodes and the nucleotide sequence that encodes the three-port gastroin are correctly sequenced in this order. And were confirmed.
  • Table 4 also shows the amino acid sequence corresponding to the DNA base sequence.
  • PUG 201 shows that it is retained in E. coli HB101, and this strain is displayed as ⁇ ⁇ 0 ⁇ [PGH210]. Deposited at the Industrial Research Institute. The deposit number is FEMKEN Article No. 681 (FEMBP-681).
  • the preculture solution of the PUG201 strain ( ⁇ ) was added to a flask containing 200 mQ of the modified ⁇ medium, and cultured with shaking at 37 ° C for 24 hours.
  • the cells were collected from the culture solution obtained in (A) by centrifugation (600 rotations, Z minutes X 10 minutes), and a 0.5-fold amount of a washing buffer ⁇ 0.5 m of the culture solution. After washing the cells with M tris hydrochloric acid and 3 ⁇ mM sodium chloride (pH 8.0), the osmotic shock method [H.C. Heppel, J. B. C., 240, 3685-3692 (19665)], and the extraction operation of oil from the periplasm fraction The first is wet
  • the resulting supernatant was used as the intracellular fraction.
  • Emulsified with ⁇ and injected subcutaneously into the chest of three rabbits. After immunization was repeated four times every two weeks, 50 g of the antigen was further injected intravenously, and three days later, whole blood was collected and serum was separated.
  • the titration cap for obtaining the dilution ratio of the antiserum used in the assay the incubation time for optimizing the assay conditions, and the antibody
  • the following measurement conditions were set.
  • the second antibody (anti-rabbit globulin serum) (1:20) 100 ⁇ 2
  • normal rabbit serum (1: 200) 100 ⁇ and 10% MPBS solution 900% containing 5% polyethylene glycol to 4 ° C.
  • the mixture was centrifuged at 300 rpm for 30 minutes, the supernatant was removed, and the sediment was counted. From the standard curve obtained from the standard human 3-mouth gastron, the content of human 3-logagastron immunologically active substance in the sample was determined.
  • Table 5 shows that, in place of the HB101 strain carrying PUG201, the transformation was carried out using PGH55 and pUG3, respectively, which were prepared in a similar manner. The results obtained by using the HB101 strain in a similar manner are also shown.
  • E. coli harboring a vector containing a DNA base sequence encoding only a signal peptide ( ⁇ 101 (G ⁇ 55)) and Escherichia coli (HB101 (UG3)) containing a plasmid containing a DMA nucleotide sequence that encodes only pergastron. Although virtually no immunologically active substance at the 3 ⁇ -gasoline port is detected in these culture extracts, the fusion polypeptide of the signal peptide and the 3- ⁇ gastrotron is not detected.
  • a mature polypeptide secretion expression vector of the present invention comprising a DNA base sequence encoding a peptide, preceded by a promoter and a ribosome binding site.
  • E. coli HB101 (UG210 :)
  • the purified polypeptide was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, amino acid analysis, and N-terminal analysis.
  • polyacrylamide gel electrophoresis SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • amino acid analysis amino acid analysis
  • N-terminal analysis N-terminal analysis.
  • microorganisms I column, c the documents containing the following items was attached
  • Higashi 1 chome Vatabe-macfti isukuba-gun Ibaraki-ken

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Description

明 細 ポ リ ペプ チ ド分泌発現ベ ク タ ー 、 該ベ ク タ 一 で形質転換 し た微生物及び該微生物 に よ る ポ リ ペプチ ド の製造
技 術 分 野
本発明 はポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー 、 該ベ ク タ 一 で形質転換 し た微生物及び該微生物 に よ る ポ リ ぺプチ ドの製造に 関 す る
背 景 技 術
遺伝子 工学的手法を用 い て 、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン 、 成長 ホルモ ン等を始め と す る様々 なポ リ ペプチ ドを大腸菌,、 枯草菌 、 酵母等の宿主細胞の利用 に よ り 製造す る方法 は 既 に 確立さ れて い る 。 し か し なが ら 確立さ れた 方法 と い え ど も未だ幾つ かの未解決の 問題点を有 し て お り 、 天然 品 と 全 く 同一 の ポ リ ペプチ ド を製造す る こ と は必ず し も 容易 で は な い 。 上記問題点の 中で最も重要な も の の ひ と つ と し て は 、 ポ リ ペプチ ド の N 末端を 、 天然品 と 周一の 構造 と す る の が困難な こ と を挙げる こ と がで き る 。 即 ち 之等の ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る遣伝子を宿主細胞内で 直接発現 さ せ る と き 、 遺伝子か ら ポ リ ペプ チ ド への 翻訳 は 、 通常開始 コ ド ン （ A T G ) か ら 始 ま る た め 、 発現さ れるポ リ ペプチ ドの N 末端は 、 ホル ミ ルメ チ才ニ ン残基 と なっ て し ま う 。 天然型ポ リ ペプチ ドの N 末端が ホル ミ ルメ チ才ニ ンであ る場合は少な く 、 他の N 末端を有する ポ リ ペプチ ド の製造に は こ の方法は利用 で きない 。 上記 ホル ミ ル メ チ才ニ ン残基 は 、 シ ァ ノ ゲ ンブ ロ マイ ドを用 い た化学反応に よ り ポ リ ペプチ ドか ら 除去す る こ と が で きる が 、 ポ リ ペプチ ドが N 末端の他 に もメ チ才 ニ ン残基 を有す る場合、 上記方法で は ポ リ ペプチ ド鏆自体が該個 所で切断さ れて し ま い 、 や は り 目 的の ポ リ ペプチ ド は製 造で きな い 。
ま た 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る遺伝子を 、 他の ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する遣伝子 と結合さ せて 、 融合ポ リ ペプチ ド と し て 発現させ る方法も知 ら れて い る の方 法で は 、 得 ら れる融合ポ リ ペプ チ ド か ら の 目 的 ポ リ ぺ プ チ ド の分離は 、 卜 リ プシ ン等の酵素に よ る処理や シ ァ ノ ゲ ンブ ロ マイ ド等を用 い た化学的処理 に よ っ て い る 。 し か し な が ら こ の方法 に お いて も 目 的のポ リ ペプチ ド鎖内 に使用 す る酵素又 は化学薬品 の標的 と な る ア ミ ノ 酸が存 在 す れば 、 そ の個所でペプチ ド鎖が切断さ れ 、 結局 目 的 ポ リ ベ プ チ ド は 製造 はで き な い 。 ま た 、 上記方法に よ り 融合ポ リ ペプチ ド か ら の 目 旳ポ リ ペプチ ド の分離が可能 な場合 と い え ども 、 目 的ポ リ ペプチ ド の単離のた め に は 通常菌体粗抽出液か ら 融合ポ リ ペプチ ド を分離す る 工程 及び融合ポ リ ペプチ ド を 切 断 し た反応組成物か ら 目 的ポ リ ペプチ ド を分離す る 工程の 2 回 の精製操作が必要と な り 、 そ の操作及び工程自体煩雑 と な り 、 し かも 目 的物 の 収率の低下 は避け ら れな い 。
以上の よ う に 、 天然型 と全 く 周一の ポ リ ペプチ ドを遣 伝子 工学的手法で入手す る こ と は 、 従来非常に 困難で あ り 、 こ の天然型 と 全 く 同一の ポ リ ペプチ ド を宿主細胞か ら 直接製造で き る改良さ れ た方法の研究開発が 、 斯界で 要望さ れて い る現状 に あ る 。
本発明 は 、 上記斯界で 要望 さ れて い る天然型 と 全 く 周 一 の ポ リ ペプチ ド を宿主細胞か ら 直接製造でき る改良さ れた 方法を提供す る こ と を 目 的 と す る 。 ま た本発明 は 、 該方法の実施の た め の新 し い ベ ク タ ー 及び該べ ク タ 一 を 保有す る微生物 を提供す る こ と を も そ の 目 的 と し て い る 発 明 の 開 示
本発明 に よ れば、 シ グナルペ プ チ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配列 と を直接連結 さ せ て 目 的ポ リ ペプ チ ド を分泌発 現さ せ る た め の 、 シ グ ナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配列を含む こ と を特徴 と する ポ リ ペプチ ド分泌発現 用 ベ ク タ ー 、 シグナルペプチ ド を'コ ー ド す る D N A塩基 配列 と 目 的ポ リ ペプチ ドを:コ ー ド する D N A塩基配列 と が直接連結さ れ て な る融合ポ リ ペプチ ドを コ一 ド す る D N A塩基配列 を含む上記ベ ク タ ー 、 該ベ ク タ ーで形質 転換さ れた微生物及び該微生物 を培養 し て 分泌 さ れる ポ リ ペプチ ド を採取する ポ リ ペプチ ド の製造法が提供さ れ る 。
本明細書に おいて 、 ア ミ ノ 酸 、 核酸塩基、 その他 に 関 し て 略号で表示す る場合 は I U P A C、 I U Bの規定或 い は当該分野 に お け る慣用 記号 に従 う も の と し 、 そ の例 を次に 挙げる 。
S er： セ リ ン し eu； ロ イ シ ン
A rg ； アル ギ ニ ン C ys； シ ステ ィ ン
G in ; グルタ ミ ン I le ; イ ソ ロ イ シ ン
P ro； プ 口 リ ン V al ； バ リ ン
H is ; ヒ ス チ ジ ン et ; メ チ才ニ ン
A la； ァ ラ ニ ン P he； フ エ 二 ル ァ ラ ニ ン
G ly； グ リ シ ン A sp； ァスパ ラ ギ ン酸
A sn； ァ スパ ラ ギ ン
A ； ア デニ ン T '· チ ミ ン G ； グ ァ ニ ン C ； シ 卜 シ ン
シ グナルペプチ ド と は 、 細胞内で生産さ れた ポ リ ぺプ チ ド を細胞外 に分泌する働き を する ア ミ ノ 酸配列で ある 一般 に微生物 に 瑕 ら ず 全て の細胞の生産す る ポ リ ぺ プチ ド に は 、 細胞内 に 留 ま っ てそ の働き をな すも の と 、 細胞 外 に分泌 さ れる も の と が あ る の細胞外 に分泌さ れる ポ リ ペプチ ドで は 、 ま ず 、 そ の N 末端 に 十数個乃至数十 個 の ア ミ ノ 酸配列 か ら な る シ グナルペプチ ドが付加 さ れ た 前駆体 と し て細 胞内 に生産さ れ 、 次いで該前駆体 はそ の有 す る シグナルペ プ チ ド の作用 に よ り 該 シグ ナル ぺプ チ ド を介 し て 細胞膜を通過する と周 時 に シ グナルぺプチ ダー ゼ の作用 に よ り シ グナル ペプチ ド が 切 り 離 さ れ 、 そ の結果一切 の不要 ア ミ ノ 酸を 持た な い 目 的 ポ リ ペプチ ド の みが 細胞外 に 分泌 さ れる （ 以下 、 こ の よ う に細胞外 に 分泌 さ れる 目 的ポ リ ペプチ ド を 「 成熟ポ リ ペプチ ド 」 と い う ） 。 冽 えば 、 大腸菌の 3 ラ ク タ マ ー ゼ は 、 菌体内で β ラ ク タ マ — ゼ前駆体 、 即 ち 3 ラ ク タ マ ー ゼ と 2 3 個 の ア ミ ノ 酸か ら な る シ グ ナルペ プチ ド と の融合蛋 白 質 と し て 生産 さ れた 後 、 該シ グナルペプチ ド の作用 に よ り 細胞 膜を通過 し て ペ リ プ ラ ス ム 、 即 ち 細胞膜 と 外膜 と の 間 の 空 間 に 分泌 さ れ 、 そ の際 、 シ グ ナルペプチ ド は 、 シ グ ナ ルぺプチダーゼ に よ り 切断され、 ペ リ ブラズム内 に は成 熟'ポ リ ペ プチ ド 、 即 ち 活性型の /3 ラ ク タ マ ー ゼが蓄積さ れる こ と が知 ら れている 〔 J . G . S utc I i f f e, P roc. N atl . A cad. S ci . U S A , 7 5 , 3 7 3 7 - 3 7 4 1 ( 1 9 7 8 ) 〕 。
本発明者 ら は 、 上記シグナルペプチ ドの特性 に着目 し 該シグナルペ プチ ドを利用 し て 、 目 的 と する外来蛋白質 を シグナルペプチ ド と の融合ポ リ ペプチ ド と し て宿主賴 胞内で生産さ せるこ と に よ り 、 外来蛋 白質を細胞外に成 熟ポ リ ペプチ ド と して分泌させ 、 か く し て 目 的ポ リ ぺプ チ ド を容易 に 製造入手 し得る と の着想か ら鋭意研究を重 ね た 。 そ の結果 、 実際に宿主細胞内 に導入 する こ と に よ つ て 、 目 的ポ リ ペプチ ド を成熟ポ リ ペプチ ド と し て 細胞 外 に 分泌さ せ得る新 し い ベ ク タ ー （ プラ ス ミ ド ） 及ぴ該 ベ ク タ ー のた め の ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー の構 築に 成功 する と共 に 、 こ のベ ク タ ー の利用 に よ る 目 的ポ リ ペプチ ド の 製造 に成功 し た 。
本発明 の ポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー は 、 目 的ポ リ ペ プチ ドを コ ー ド す る D M A塩基配列を直接連結でき る よ う に設計さ れた シ グナルペプチ ド を コ ー ド す る
D N A塩基配列 を保有 し て い る 。 従っ て 該ベ ク タ ー に は 5 「 ¾ ¾ ¾ v Ν α ¾止 ） er 33 ½ ^ 籙 / ) \ύ 養 gf V N Cl ^ ^ — に W ^ ^ ^ ^ ¾
( し 〉
B I V ~9t) d - I B Λ - oj d - ηθ η —SA O -θ^ d
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目 ：? 1マ Π Χ ¼ §Ι腺 ： I C ：? 1驀 ¾ 0) 1(腺 ΐ雞 5
、 0) ^ ：2 §：& $ ¾ ¾葛 ^ : I つ Υ ¾ : ^ 翊腺 S ¾ W ：?
?1 - ^ ^ ¾ §- x n > ^ $ α ^？ ^ $ ¾虽 ^ ¾養 ¾ V N d d — に ¾ d 4厶 Γι Μ 目 ¾ 環 ：1 21 ¾翳 ¥ (] ー 1= ^、^ ： ^ ^ 0) 一 L
96900/S8df/l3d 6ムム£0/98 Ο 任意 に選択する こ と ができ る 。 尚 、 下記 D N Aは 、 メ チ ル化等の常法 に従い俊飾さ れた塩基を も含むも の と す る M et ; A T G '
S er : T C丁 、 T C C、 T C A、 T C G、 A G丁 、
A G C
I le : A T丁 、 A T C、 A T A
G in ; C A A、 C A G
H is ; C A T . C A C
P he ; T T T , T T C
A rg : A G A、 A G G、 C G丁 、 C G C、 C G A
C G G
V a G T丁 、 G T C G T A、 G T G
A I a G C 丁 、 G C C、 G C A、 G C G
L eu ; T T A , T T G、 C T丁 、 C T C 、 C T A
C T G
P ro : C C T、 C C C 、 C C A 、 C C G
C ys ; T G T , T G C
上記 D N A塩基配列の う ち で 、 特に 好 ま し く 選択さ れ た組合せ と し て は 、 下記式 （ 2 ) に 示すも の を例 示で き る 。
A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G T C G C C C T T A T T C C C T T T T T T G C G G C C T T T T G C C T T C C T G T C T T C G C G
( 2 ) ま た本発明 ベ ク タ ー に 保有さ れる シ グナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 は 、 上記の如き具体'的 D N A 塩基配列 を基本 と し て 、 そ の 3 ' 側付近 、 即 ち こ れ に 目 的ポ リ ぺプチ ド が連結さ れる側付近、 好 ま し く はそ の 0 塩基以内 に 、 又 は こ れ に 更に Ί 0 塩基以内 の D N A 配列 を付加 し て こ の付加部分 に 、 制 限酵素認識配列 を含 ま せ る も の と す る 。 こ れ は上記 シ グ ナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と 、 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配 列 と を 直接連結 さ せ る た め に 必須の も の で あ る 。 し か し て こ の 制 限酵素認識配列 を認識す る酵素 と し て は 、 公知 の制 限酵素の い ず れで も よ い が 、 好 ま し く は 5 塩基以上の塩基配列 を 認識す るも の が よ く 、 こ の 酵素に応 じ て 上記 3 ' 側付近の D N A塩基配列 は 、 任意 に 変化さ せ る こ と がで き る 。
例 え ば 、 上記具体的例示の 3 ラ ク タ マ ー ゼ の シ グ ナル ペプチ ド を 例 に と り 詳述すれば 、 そ の C端の ア ミ ノ 酸で あ る A laを コ ー ド す る 塩基配 列 と し て 、 G C C を選択 し た 場 合 、 更 に こ れ に G (3 G の 塩基配列 を連結さ せ れば 、 こ の G C C G G Cの 6塩基配列 は 、 制 眼酵素 N ael に よ り 認識さ れる 。 該シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A 塩基配.列 は 、 N ae I に よ り その 中央で切断さ れ 、 か く し て 3 ' 末端が G C C ( シグナルペプチ ド の C端 ア ミ ノ 酸 A laに対応する ） であ る D N Aが得ら れ、 該 D N Aに は そ の 直後に 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する任意の D N A 塩基配列を直接連結させる こ と ができ る 。
ま た 例 え ば、 上記シグナルペプチ ド C端の 2 つ の ア ミ ノ 酸配列を構成する P he— A I aを コ ー ドする塩基配列 と し て 、 T T C G C Gを選択 す る場合、 そ の 3 ' 側 に 更 に アデニ ン塩基 （ A ) を連結させ て得 ら れる 7塩基配列 ( T T C G C G A ) の う ち 、 T C G C G Aは制 限酵素 N rul に よ り 認識 さ れ 、 こ の中央で切断さ れ 、 こ れ に よ り 得 ら れる D N A塩基配列 は 、 その 3 ' 末端が T T C G と な る 。 シグナルペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 と し て 、 し の塩基配列を利用 す る と き に は 、 こ れ と 連結 すべ き 目 的 ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列の 5 ' 側 に 、 更 に C T、 C 〇 、 C A又 は C Gの 2塩基配列 を付加 する こ と に よ り 、 所望の融合ポ リ ペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 が得 ら れる 。
更 に例 え ば、 上記 シグナルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列の 3 ' 側 に 、 A A C T C A G C T G の 1 0 塩基配列 を連結さ せ れば、 こ の配列中の 6 塩基配列 ( C A G C T G ) は 、 P vu l に よ り 認識さ れ、 そ の 中央 で切 断さ れる 。 か く し て 得 ら れる D N A塩基配列 は 、 シ グナルペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 の 3 ' 側 に 更に A A C T C A Gの 7 塩基配列 が結合さ れた も ので あ り 、 こ の 7 塩基配列の う ち 、 最初の 3 塩基配列 A A C は A snを コ ー ド し て お り 、 次の 3 塩基配列 T 〇 A は S erを コ ー ド し て お り 、 最後の グ ァ ニ ン （ G 〉 は 、 A i a、 G ly V al、 A sp又 は G I nを コ ー ド す る コ ド ンの第 " 1 塩基で あ る 。 従っ て こ れを 、 シ グナルペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 と し て 用 い る と き に は 、 例 え ば 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン等の よ う に N 末端 ア ミ ノ 酸が A sn— S er— A sp で あ る ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 か ら そ の 5 ' 側 の 7 塩基配列 （ 例 え ば A A C T C A G ) を 除い た D N A塩基配列 を結合さ せる こ と に よ っ て 所望の融合 ポ リ ペプチ ド （ 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン と シ グナルペプチ ド と の 融合ポ リ ペプ チ ド ） を コ ー ド す る D N A塩基配列 を容 易 に 形成さ せ る こ と が で き る 。
従っ て 、 本発明 ベ ク タ ー の構成要素 と す る シ グ ナル ぺ プチ ド を コ ー ド す る D M A塩基配列 と し ては 、 前記 に 具 体的 に例示 し た D N A塩基配列 の他 に 、 例えばこ れに更 に 1 0個以内 の D N A塩基配列 を付加させ た も の をも 、 好 ま し いあの と し て利用 する こ と ができる 。 そ の一具体 例 は 、 上記 し た Ί 0塩基配列を付加 さ せた 下記式 （ 3 ) に 示す D M A塩基配列を有するも のである 。
A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G T C G C C C T T A T T C C C T T T T T T G C G G C C T T T T G C C T T C C T G T C T T C G C G A A C
T C A G C T G ( 3 ) 本発明 に お け る上記シグナルペ プチ ド を コ ー ド する
D N A塩基配列又 は こ れを含む塩基配列 は、 従来公知 の 各種の方法、 例 え ば こ れを含有す る微生物 、 そ れか ら 単 離 さ れたプラ ス ミ ド等、 好 ま し く は例 えば p B R 3 2 2 等か ら制 限酵素等を利用 し て 切 断単離す る方法 、 そ の D N A塩基配列 に従い化学合成する方法、 之等の方法の 組合せ等 に よ り 容易 に 製造する こ と がで き る 。 ま た 上記 シ グ ナルペプチ ド を コ ー ドする D N A塩基配列 と 、 目 的 ポ リ ペ プ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と の連結乃 至 結合手段も 、 従来公知の各種方法 、 例 え ば T 4 D N A リ ガ ー ゼ等を用 い る酵素反応等 に 従 う こ と がで き る 。
上記の ご と く し て得 ら れる シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を含む本発明ベ ク タ ー は 、 該 D N A 塩基配列 を 、 例 え ばプ ラ ス ミ ド 、 ウ ィ ルス D N A 、 コ ス ミ ド 〔 例え ば p J B 8 、 I sh- H orowicz, D and B urke, J . F . , N ucleic A cids R es. , 9 ,
2 9 8 9 ( 1 9 8 1 ) 〕 等の従来よ り 外来遣伝子の ク ロ 一 二 ングに用 い ら れて い る各種のベ ク タ ー に 耝込む こ と に よ り 得 ら れる 。 こ の D N A塩基配列 の耝込みの た め に 好適な起源ベ ク タ ー の具体例 と し て は 、 上記 し た プラス ミ ド P B R 3 2 2 の他、 例 え ば以下の も の を例示で き る o プ ラ ス ミ ド P T U B 4 〔 バ チルス * ズプチ リ ス 由 来の ひ — ア ミ ラ ー ゼ の シ グナルペ プチ ド 、 H . Y amazak i et a I . , J . B acter i o I . , 1 5 6 , 3 2 7 - 3 3 7
( 1 9 8 3 〉 〕 、
o プ ラス ミ ド P H C 5 〔 ェ シエ リ ヒ ア コ リ ー 由 来のマ ル 卜 ー ス結合蛋 白 の シ グナルペ プ チ ド 、 H . B edoue I I e et a I . , N ature , 2 8 5 , 7 8 - 8 1 ( 1 9 8 0 ) 〕 o プ ラス ミ ド P S N 5 1 8 〔 ェ シ エ リ ヒ ア コ リ ー 由 来 の リ ン 酸結合蛋 白 の シ グナルペ プ チ ド 、 K . agota et aに J . B acter i o I . , 1 5 7 , 9 0 9 - 9 1 7
( 1 9 8 4 〉 〕 、.
o プ ラ ス ミ ド p J P 1 2 〔 ェ シ エ リ ヒ ア コ リ ー 由 来の リ ン酸制限下に誘導さ れる外膜蛋 白 の シグナルペプチ ド N . 0 verbeeke et a I . , J . o I . B iol , , 1 6 3 , 5 1 3 — 5 3 2 ( 1 9 8 3 ) 〕 等 。
上記起源ベ ク タ ー へ の シグナルペプチ ドを コ ー ドする D N A塩基配列 の導入操作は 、 従来よ り こ の種外来遺伝 子をベ ク タ ー に耝込む際に 用 い ら れて いる こ れ ら 操作に 従 う こ と がで きる 。 そ の例 は 、 前述 し た通 り で あ る 。
ま た上記の ご と く し て得 ら れる本発明の シグナルぺプ チ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 を含むポ リ ペプチ ド分 泌発現用 ベ ク タ ー は 、 こ れを実際 に 宿主細胞 に導入 し て 目 的ポ リ ペプチ ド を分泌発現さ せ る た め に は、 こ れ に 目 旳ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 を さ ら に導 入 し なけ ればな ら ない こ と は勿論の こ と 、 他 に プロ モ ー タ ー 、 リ ボゾ ー ム結合部位 、 翻 訳停止シグナル 、 転写終 結因 子等の転写調節因子や翻 訳調節因子等を 含んで い な け ればな ら な い 。 こ れ ら の各因子 は 、 既に 起源ベ ク タ ー に 含 ま れて い る場合が あ り 、 こ の場合 に は該起源べ ク タ 一 、 例 えば P B R 3 2 2 由来の 3 ラ ク タ マ ーゼ の調節因 子等をそ の ま ま 用 い る こ と がで き る 。 こ れ に 限定 さ れる こ と な く 、 従来公知 の他の微生物又 は ウ ィ ルス 由 来の各 種 D N A も ま た 通常 こ れ ら の調節因子を含ん で お り 、 従 つ て こ れ ら を用 い る こ と もで きる 。 そ の例 と し て は 、 例 えば大腸菌 ラ ク 卜 ー ス 才 ペ ロ ン 、 卜 リ プ 卜 フ ァ ン オ ペ 口 ン 、 ス フ ァ ー ジの P L等のプ ロ モ ー タ ー 、 3 ガ ラ ク 卜 シ ダ ー ゼの S D配列等の リ ポゾ ー ム結合部位、 （ フ ァ ー ジ の t L 1 等の転写終結因子等を例示で き る 。 ま た 翻訳停 止シグナル と し て は 、 T A A、 T A G及び T G Aの 3通 り の塩基配列を利用 で きる 。 更 に 上記調節因子 は 、 し れ ら を含む D N Aよ り 常法 に従い 取 り 出 し た後、 必要な も の を適当 なベ ク タ ー に通常の方法 に 従い導入す る こ と も で き る 。
特 に 好 ま し い上記調節因子 と 、 シ グナルペプチ ド と を 保有す る本発明 ベ ク タ ー の一具体例 と し て は 、 P B R 3 2 2 を起源ベ ク タ ー と し て 構築さ れた p G H 5 4及び P G H 5 5 を例示で きる 。 こ れ ら のプ ラ ス ミ ドの 内 で p G H 5 4 は 、 （3 ラ ク タ マ ー ゼ のプ ロ モ ー タ ー 及び リ ボ ゾ ー ム結合部位 に 続い て 3 ラ ク タ マ 一 ゼ の シグナルぺプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を有 し 、 こ の塩基配列 の 3 ' 末端 に N ru l 及び P VII II の制 限酵素認識配列 を有 す る も ので あ る 。 そ の特性 は 、 その 製造概略操作 と共 に 第 1 図 に 示 し た 通 り で あ る
第 1 図 よ り 、 p G H 5 4 は図示さ れた 制 限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れる 。 ま た 該 P G H 5 4 の大き さ は 1 . 0 %ァガ ロ ー スゲル電気泳動 に よ る測定の結果、 約 3 . 9 K b で あ る 。 こ のブラス ミ ド p G H 5 4 を保有す る大腸菌 H B 1 0 株は 、 通商産業省工業技術院微生物 工業技術研究所に 「 H B 1 0 1 〔 P G H 5 4 〕 」 な る 表示で 、 寄託さ れ て お り 、 そ の寄託番号 は微ェ研条寄第 6 7 9号 （ F E R M B P— 6 7 9 ) で あ る 。
ま た P G H 5 5 は 、 3 ラ ク タ マ ーゼ のプ ロ モ ー タ ー 及 び リ ボゾー ム結合部位 に続い て /3 ラ ク タ マ ー ゼ の シダナ ルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 を有 し て い る点 に お いて P G H 5 4 と共通する が 、 該 p G H 5 4 に おけ る第 2 の Ρ νιιϋ制 限サイ 卜 を含む約 0 . 6 4 kbの D N A を欠 く も のであ り 、 第 1 の P vu II制 限サイ 卜 を シ グナル ペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 の 3 ' 末端付近に 有 し て い る 。 そ の特性は 、 そ の製造概略操作 と共 に 第 2 図 に 示 し た 通 り で あ る 。
第 2図 よ り 、 p G H 5 5 は図示さ れた 制 限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れ 、 そ の大き さ は 、 上記方法 に 従い 測定 し た結果、 約 3 . 3 k で あ る 。 こ のプラ ス ミ ド P G H 5 5 を保有 す る 大腸菌 株 は 、 通商産業 省工業技術院微生物 工業技術研究所 に 「 H B 1 0 . ( G H 5 5 ) 」 なる表示で寄託さ れて お り 、 その寄託 番号 は'微ェ研条寄第 6 8 0号 （ F E R M B P— 6 8 0 ) であ る 。
上記各種の調節因子を含み、 且つ シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と こ れ に 直接結合さ れた 目 的 ポ リ ペプチ ドを コ ー ドす る D N A塩基配列 と を有する本 発明 のポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー は 、 上記 し た本発 明ベ ク タ ー と同様に し て 構築さ れ、 本発明 はかかる成熟 ポ リ ペプ チ ド分泌発現ベ ク タ ー を も提供す る も ので あ る 本発明の こ の成熟ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー に 、 シグ ナルペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と連結さ れて 融合ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と し て保有さ れる ポ リ ペ プチ ド及びそ の D N A塩基配列 と し て は 、 任意の ポ リ ペプチ ド及びそ れを コ ー ド す る D N A 塩基配列 が いず れも利用 で きる 。 上記ポ リ ペ プチ ド の例 と し て は 、 例え ば表皮細胞増殖促進因子、 ソマ 卜 ス タ チ ン 、 イ ン シ ュ リ ン 、 G I P、 R — M S A 、 サイ モ シ ン β I 、 成長 ホルモ ン 、 成長ホルモ ン放出 因子等の ホルモ ン及び成長因子類 、 イ ン タ ー フ ェ ロ ン 、 イ ン タ ー ロ イ キ ン 2 、 腫瘍壊死因子等の リ ン フ 才 カ イ.ン免疫調節物質類 血清 アルブ ミ ン 、 プ ラ ス ミ ノ ー ゲ ン ァ ク テ ィ ベ ー タ 一、 アポ リ ポプ ロ テ イ ン等の血液構成物質、 B 型肝炎 ウ ィ ル ス表面抗原等の ワ ク チン用抗原蛋白質等を例示で き る 。 之等の各種ポ リ ペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 は そ れ ら の起源 と する細胞等か ら通常の方法に従い抽 出 単 離 し ても よ く 、 之等ポ リ ペプチ ド の ア ミ ノ 酸配列 に従い 化学合成す る こ と もできる 。
上記ポ リ ペプチ ド及び /又 はそ の D N A配列の具体例 を次に示す 。
◦ソマ卜スタチン
A la G ly Cys Lys Asn Phe Phe
5'
GTACGGACCAACATTCTTGAAGAAA
Trp Lys T r Phe The Ser Cys
Figure imgf000020_0001
oプロインシュリン
Phe Val Asn Gin His Leu Cys G ly Ser His Leu
Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg
G ly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gin Val Giy Gin Val Glu Leu
Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro
Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gin Lys Arg Gly l ie Val Glu Gin Cys Cys Thr Sep l ie Cys Sep
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
(Nature , Vol. 282, 29, November 1979)
oB型肝炎ウィルス表面抗原
TCC 2 〇
TCAATGTTAG
oB型肝炎ウィルス表面抗原
A
o表皮細胞増殖因子 （ Epidermal Growth Factor )
H - Asn-Ser-Tyr- Pro-G ly- Cys- Pro- Ser- Ser- Tyr-
Asp-Gly-Tyr-Cys- Leu- Asn-Gly-Gly- Val-Cys-Met- His— I le- Glu- Ser- Leu- Asp-Ser-Tyr-Thr-Cys-Asn- Cys- Val- I le- Gly-Tyr- Ser- Gly-Asp-Arg- Cys- G I n- T r- Arg-Asp- Leu- Arg-Trp-Trp-G lu- Leu-Arg-OH
( C. R. Savage , J r . ， T. I nagam i , S. Cohen, J. Biol . C em . ， 247, 7612 ( 1972) ； C. R. Savage , Jr . , J. H. Hash , S. Cohen, J. Biol . Chem . , 248, 7669 ( 1973) )
o G I P (Gastric I nhibitory Polypeptide) H-Tyr-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe- I le- Ser- Asp- Tyr- Ser- I le— Ala— Met— Asp— Lys- I le-Arg-G In-G In-Asp- Phe- Val - Asn- Trp- Leu- Leu- A la- G In-G In- Lys-Gly- Lys— Lys— Ser— Asp— Trp - Lys— His— Asn— I le-Thr-G ln- OH
〔 J . C. Brown, Can. J . B iochem. ， 4_9, 255 (1971 ) ； J C. Brown et al, 周上. ， 867 ( 1971〉 ； H. Yajima et al, J . Am . C em . Soc. , 7_, 5593 (1975) 〕 o成長ホルモン放出因子 （Growth Hormone- Releasing Factor )
H- Val- H is- Leu- Ser- A la- Glu- Glu - Lys- Glu- A la- OH
(A. V. Shally et al J. Biol . Chem . , 246, 6647 ( 1971 ) ； D. F. Veber et al, B iochem. B iophys. Res. Co画 n . , 45, 235 ( 1971 ) 〕 oソマ卜スタチン （Somatostatin )
H— A la— Gly— Cys— Lys-Asn- Phe- Phe-Trp- Lys-T r- Phe 一 Thr— Ser— Cys— OH
(A. V. Schally et al , Fed. Proc . Fed. Am . Soc. E p. Biol , . 34_, 584 ( 1975 ) 、 ' V. Schally et al, Biochemistry , V5_, 509 ( 1976) 〕 o R- S A (A Polypeptide with Multiplication -Stimulating Activity )
H- Ala-Tyr-Arg- Pro-Ser-Glu-T r- Leu-Cys— Gly- G ly-G lu- Leu- Val - Asp- Thr- Leu- G In- Phe- Val - Cys- Ser- Asp- Arg-G ly- Plie—Tyr—Phe—Ser—Arg—Pro—Ser— G I y- Arg- A la- Asn- Arg- Arg-Ser- Arg- G ly- I le- Val - G lu- G lu- Cys - Cys- Phe- Arg- Ser- Cys- Asp- Leu-Ala- Leu- Leu-G lu - Thr- Tyr— Cys- A la- Thr- Pro- A la- Lys— Ser-Glu-OH
〔H. Marquart ， G. J. Todaro , J . Biol . Chem . , 256, 6859 ( 1981 ) 〕 っソマ卜スタチン一 28 (Somatostatin -28)
H - Ser- A la- Asn- Ser- Asn- Pro- A I a- Met- A la- Pro- Arg-Glu-Arg- Lys— Ala— G I y— Cys— Lys— Asn— Phe- Phe- Trp- Lys-Thr- Phe- Thr-Ser- Cys- OH
(F. Esch et al, Proc . Natl . Acad . Sci. U. S. A. ,
77, 6827 ( 1980) ； N. Ling et al, B iochem. B iophys. Res. Commun . , 9_5, 945 ( 1980) 〕 oサイモシン JSA (Thymosin β& )
Ac -Ser- Asp- Lys- Pro- Asp- Met- A la- G I u- I le-Glu- Lys- Phe- Asp- Lys-Ser- Lys— Leu- Lys— Lys-Thr-Glu- T r-G In-G lu- Lys- Asn- Pro- Leu- Pro-Ser- Lys-G lu- Thr- I le- Glu- Gln-Glu- Lys- Gin- A la- Gly-Glu- Ser- OH
〔T. し K. Low et al , Proc . Natl . Acad . Sci.
U. S. A. , 78., 1 162 ( 1981 ) 〕 上記ポ リ ペプチ ドの D N A塩基配列 と 、 シグナルぺプ チ ド の D N A塩基配列 と の連結 は 、 例 えば シ グナルぺ プ チ ド の D N A塩基配列 を保有 する本発明 の ポ リ ペプチ ド 分泌発現用 ベ ク タ ー に 、 上記ポ リ ペ プチ ド の D N A塩基 配列 を 、 前述 し た方法 に 従い 、 例 え ば制 限酵素を用 い る 酵素反応及び T A D N A リ ガ ー ゼ を用 いる 酵素反応を利 用 し て 導入する こ と に よ り 実施できる 。 ま た 、 予め 上記 ポ リ ペプチ ド と シ グ ナ ルペプチ ド と の融合ポ リ ペプ チ ド の D N A塩基配列を化学合成 し た後、 こ の D N A塩基配 列 を 、 前記 シ グ ナルペ プチ ドの D N A塩基配列 の導入 と 同様 に し て 、 ベ ク タ ー に導入する こ と に よつ て も 行な う こ と ができ る 。
か く し て 融合ポ リ ペ プチ ドを コ ー ドする D M A塩基配 列を保有 する本発明 の ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー を 得る こ と ができ る 。 こ れ は 、 上記融合ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る D N A 塩基配列 の 前 に プ ロ モ ー タ ー及ぴ リ ポゾ ー ム結合部位を有 し 、 且つ 上記塩基配列 を構成する 目 的 ポ リ ペ プ チ ド の D N A 塩基配列 の直後 に 翻 訳停止 シグナ ルを有 し て お り 、 適当 な宿主細胞 に導入 す る こ と に よ り 該細胞を形質転換 し て ポ リ ペプ チ ド 分泌発現型 と す る こ と がで き る 。
上記ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー の好 ま し い一具体 例 と し て は p U G 2 0 1 を例示で き る 。 該 p U G 2 0 1 は 、 3 ラ ク タ マ ー ゼ のプ ロ モ ー タ ー 、 リ ポゾ ー ム結合部 位、 3 ラ ク タ マ ー ゼ の シ グナルペ プ チ ド の D N A塩基配 列 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン （ 目 的ポ リ ペプチ ド ） の D N A塩 基配列及びそ の 翻訳停止シ グ ナルが正確 に こ の顆序で 配 列 さ れた D N A塩基配列を有 し て いる 。 その配列 は 、 後 記実施例 に おい て 第 4 表 と し て示 し た通 り であ る 。 該べ ク タ一 （ プラス ミ ド ） P U G 2 0 1 を保有する大腸菌 H B 1 0 1 株 は 、 通商産業省工業技術院微生物工業技術 研究所に Γ Η Β 1 0 1 ( P U G 2 0 ) 」 なる表示で寄 託さ れて お り 、 そ の寄託番号 は微ェ研条寄第 6 8 1 号 ( F E R M B P — 6 8 1 ) であ る 。
本発明 の ポ リ ペプ チ ド分泌発現ベ ク タ ー の宿主細胞へ の導入 は 、 公知の各種方法に従っ て 行な う こ と がで き 、 用 い ら れる宿主細胞 と し て も特に 限定 はな く 、 公知 の各 種のも ので よ い し の宿主細胞 と し て利用 さ れるも の と し て は 、 例 えば大腸菌等のグラ ム 陰性細菌、 枯草菌等の グラ ム 陽性細菌、 放線菌、 酵母等を例示で き る し れ ら の 内で特 に H B 1 0 1 株を初 め と す る 大腸菌 K 1 2 株由 来の 菌株は好ま し い 。 之等の宿主細胞 はいず れも菌体外 分泌成分 、 外膜構成成分等の 、 細胞の正常な據能維持 に 必要なポ リ ペプチ ド の分泌の た めの機構 と し て シ グナル ぺ プチダ ー ゼ を有 し て お り 、 ま た各種微生物 由来の シ グ ナルぺプチダ ーゼ の基質特異性 に は殆ん ど差のない こ と が知 ら れて い る （ D . P er I man and H . 〇 . H a I vo rs on, J . M ol . B iol . , 1 6 7 ， 3 9 1 ( 1 9 8 3 ) 〕 上記宿主細胞へ の導入方法の具体例 と し て は 、 例えば 宿主細胞を低温で塩化カ ルシ ウ ム を含む水溶液中で処理 し 、 該溶液中 に ベ ク タ ー を添加 する方法 〔 E .
L ederberg , S . C ohen, J . B acter i o I . , 1 1 9 , 1 0 7 2 ( 1 9 7 4 〉 〕 を例示で き る 。
上記の よ う に し て 本発明ベ ク タ ー を導入 し て形質転換 し た細胞を培養す る と き に は 、 細胞内で融合ポ リ ぺ プチ ド が生産さ れ、 続い て細胞外又 はペ リ ブ ラズム に成熟ポ リ ペプチ ド が分泌蓄積さ れる 。 即 ち 、 ま ず 、 ベ ク タ 一 中 の融 合ポ リ ペプチ ドを コ ー ドす る遺伝子か ら 、 ベ ク タ ー 中 の転写調節因子並び に 宿主細胞中の諸因子の作用 で m R N A が生産さ れる 。 次いで 、 m R N A か ら 翻訳調節 因 子並び に 宿主細胞中'の 諸々 因子の作用 で融合ポ リ ぺ プ チ ド が生産 さ れる 。 更 に こ こ で生産さ れる融合ポ リ ぺプ チ ド は 、 シ グ ナルペプチ ド の作用 に よ り 、 細胞外又 は ぺ リ ブラズム に 分泌 さ れ 、 同 時に シグナルぺプチダーゼ の 作用 に よ り 、 融合ポ リ ペプ チ ド か ら シ グ ナルペプチ ド が 切 り 離さ れる ので あ る 。 そ の結果、 シグナルペ プチ ドも ま た 他の如 何な る不要な ア ミ ノ 酸配列 を も 含 ま な い成熟 ポ リ ペプチ ド が細 胞外又 はペ リ ブ ラズ ム に 分泌 、 蓄積さ れる 。 か く し て分泌、 蓄積さ れた成熟ポ リ ペプチ ド は 、 こ れ を常法に従い分離す る こ と がで き 、 ま た更に精製す る こ と ができる 。 こ の分離、 精製操作 と し て は例 えば培養上 澄又は浸透圧シ ョ ッ ク 法 に よ り 調整 し た ペ リ プラズム画 分か ら 、 ゲル泸過 、 吸着ク ロ マ ト グラ フ ィ ー 、 イ オ ン交 換ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 高速液体ク ロ マ ト グラ フ ィ ー 等 を適宜組合せた方法を採用 する こ と がで き る 。 特に本発 明 に従い得 ら れる 目 的ポ リ ペ プチ ド は 、 分泌さ れた も の であ る た め 、 そ の分離、 精製が比較的容易で ある利点が ある 。
発明を実施する た め の最良の形態
以下、 本発明 を更 に 詳 し く 説明 す る た め実施例 を挙げ る 。 尚 、 各例 に お いて 用 い ら れて い る各方法及び操作は 、 特に 明記 し な い 限 り 、 以下の通 り 行なわ れた も ので あ る 。 1 . 制 限酵素 に よ る D N A の切 断操作
D N A の水溶液 （ 又は緩衝液溶液 ） 或い は粉末 に 、 下 記第 1 表 に示 し た 各緩衝液の濃縮液及び水を混和 し 、 次 いで制 限酵素を加 え 、 3 7 °C の水浴中で 3 時間静 置 し て 反応さ せ る 。 制 限酵素の標準的使用 量 は、 D N A 1 g に対 し て 1 ユ ニッ ト で あ り 、 最終液量 は 1 0 ^ 2 と な る よ う に す る 。 第 Ί 表
耝 成 低塩濃度 中塩濂度 髙塩濃度
( ni ) 緩衝液 緩衝液 緩衝液 塩化ナ 卜 リ ウ ム 0 5 0 1 0 0 卜 リ ス塩酸
( H 7 . 5 ) 1 0 0 5 0 塩化マグネ シ ウ ム 0 〇 1 0 ジ チ 才 ス レ イ ト ール
2 . フ エ ノ ー ル抽 出法
酵素反応の終了後 、 酵素を失活さ せ反応を停止さ せる た め に こ の抽 出法を行な っ た 。 即 ち 、 反応液に 、 そ の 液 量の半量 と な る T E飽和 フ エ ノ ー ル （ 1 m D T A を含む 1 O m M 卜 リ ス塩酸 （ P H 8 . 0 ) 緩衝液を フ エ ノ ー ル に 飽和 さ せ た も の ） を加 え て充分混和 し た 後 、 周 じ く 半量の ク ロ 口 ホルム を加 え て 更 に 混和 し 、 次い で遠 心分離 し て D N Aの 含 ま れる緩衝液層を取る 。 更 に 0 . 1 倍量の 3 M酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ P H 5 . 0 ) と 2倍量の冷エ タ ノ ール と を加 え て 混和 し て 、 一 2 0 で 1 時間 以上放置 し て D N Aを 沈殺 と し て 回収す る こ と に よ り フ エ ノ ー ルを 完全 に 除去 す る 。 3 . D N Aポ リ メ ラ ーゼ I ( ク レ ノ ー 断片 ） に よ る D N Aのプラ ン 卜 エ ン ド化方法
4 0 m M リ ン酸カ リ ウム （ P H 7 . 4 ) 、 6 m M塩化 マ グネ シ ウ ム 、 1 m M 3 —メ ルカ プ 卜 エ タ ノ ー ル、 1 m A T P及び各 1 m Mの d A T P、 d C T P、 d G T P及び d T T Pを 含む水溶液中 に 、 D N Aを溶か し 、 D N A I ^ g に対 し て 1 ユニッ ト と な る量の D N A ポ リ メ ラ ー ゼ I ( ク レ ノ ー 断片、 宝酒造㈱製 ） を加 え 、 1 2でで 3 0分間反応さ せ る 。
4 . 丁 4 0 八 リ ガ ーゼ に ょ る 0 八 断片の結合 （ 環状 化 ） 操作
6 6 m M 卜 リ ス塩酸 （ P H 7 . 5 ) 、 6 . 6 m M塩化 マグネ シ ウ ム 、 1 0 m Mジ チ 才 ス レ イ 卜 ー ル及び 1 m A T Pに 0 . 0 1 % の牛血清アルブ ミ ン を添加 し た水溶 液中で 、 D N A断片 と 、 そ の Ί g 当 り 3 ユ ニ ッ ト と な る量の T 4 D N A リ ガ ーゼ （ 宝酒造㈱製 ） と を 、 1 2 °C で 5 時間以上反応さ せ る こ と に よ り D N Aを結合 （ 環状 化 ） さ せる 。
5 . 形質転換方法
宿主細胞 と し て は 、 大腸菌 K 1 2株由 来の H B 1 0 1 株を用 い る 。 H B 1 0 1 株を 、 L B培地 （ Ί %パ ク 卜 卜 リ プ ト ン 、 0 . 5 %パ ク 卜 ィ ー ス 卜 エ キ ス 、 0 . 5 %塩化ナ 卜 リ ウ ム ） で 、 3 7 °C下 、 6 1 0 nmの吸光度が 0 . 2 5 に なる ま で増殖さ せ 、 培養液 4 0 πιδを遠心分離 （ 6 0 0 0回 転 Ζ分 X 1 0分 ） し て 菌体を 回収 し 、 次いで氷冷 す る 。 れを 0 . 1 Μ塩化マ グネ シ ウ ム 2 0 mfiで洗净 し 、 続い て 氷冷 し た 0 . Ί iVI塩化カ ルシ ウ ム及び 0 . 0 5 M塩化マ グネ シ ゥ ム 溶液 2 0 πιβに懸濁 さ せ 、 1 時間氷冷す る 。 遠 心分離 （ 6 0 0 0回転 Ζ分 X Ί 0分 ） 後 、 菌体を氷冷 し た 0 . 1 Μ塩化 カ ル シ ウ ム及び 0 . 0 5 Μ塩化マグネ シ ゥ ム 溶液 2 ιπβに再懸濁 させ る <_ の 懸濁液 0 . 212 に 、
T i D N A リ ガ ー ゼ を用 い て 結合 さ せ た D N A断片の反 応組成液 0 . 0 1 mfiを加 え 、 Ί 時間 氷冷する 。 次いで 4 2 . 5 Cの 水浴で 9 0秒間加 温 し 、 L B培地 2 . 8 in3 を加 え 、 こ れを 3 7 'Όの水浴中で 1 時間 静置する 。
次 に 、 得 ら れる形質転換株 を以下の 抗生物質耐性で選 択 す る 。 即 ち 、 Ί . 5 %寒天 を含む L Β培地 に ア ン ピ シ リ ン 5 0 , g / ιπδ又 は テ 卜 ラ サイ ク リ ン 2 0 ^ g Z maを 添加 し て 調整 し た 平板培地 に 、 上記で得 た 反応耝成液の 溶液各 0 . 3 mSずつ を 拡げ 、 こ れを 3 7 で一晩培養 し 生 育す る大陽菌 コ ロ ニ ー を分離す る 6 . プラ ス ミ ドの単離
プラス ミ ドを保有する菌株を 、 ア ン ピ シ リ ン 5 0 〃 g Ζ ιπδ又 は テ 卜 ラ サイ ク リ ン 2 0 ^ g / πιδを添加 し た し B 培地 5 0 0 msで 、 6 1 0 nmで の吸光度が約 0 . 6 に な る ま で 3 7でで振盪培養す る 。 次いで ク ロ ラ ム フ エ ニ コ ー ル 8 0 mgを加 え 、 3 7 °Cで 1 2〜 1 6時間振盪培養する 。 こ れを遠心分離 （ 6 0 0 0回転 /分 X 1 0分 ） し て 菌体 を集め 、 0 . 8 5 %塩化ナ ト リ ウ ム水溶液で洗浄する 。 菌体を 2 096蔗糖及び 5 0 m M 卜 リ ス 塩酸 （ P H 8 . 0 ) 溶液 2 . 5 ιδに 懸濁させ 、 次 に 1 % リ ゾチー ム を 含む 0 . 2 5 Μ 卜 リ ス塩酸 （ Ρ Η 8 . 0 ) 溶液 0 . 5 13を加 え 、 分間水冷する 。 更 に 0 . 2 5 M E D T A
( Η 8 . 0 ) 1 ιπδを加 え 、 Ί 0分'間氷冷 す る 。 次に 6 m Μ 卜 リ ス塩酸 （ Ρ Η 8 . 0 ) 、 6 0 m M E D T A及 ぴ 0 . 1 % 卜 リ 卜 ン X— 1 0 0 の溶液 4 mfiを加 える 。 こ れを超遠心 （ 2 5 0 0 0回転 /分 X 9 0 分 ） し て上清を 採取す る 。 こ の上清 8 . 2 msに 塩化 セ シ ウ ム 9 . 0 g を 加 え て 溶か し 、 次いで Ί % ェチジ ゥ ムブ ロ マ イ ド 溶液 0 . 8 ι3を加 え る 。 こ れを遠心分離 （ 2 0 0 0回転 ./分 X 1 0 分 ） し て 浮遊物を 除き 、 溶液を超遠心
( 5 0 0 0 0回転 . Z分 X 1 5 時間 ） する 。 次いで紫外線 照射 に よ り 螢光を発するプラ ス ミ ド部分を分離す る 。 こ れを 5 M塩化 ナ ト リ ウ ム溶液で飽和 し た イ ソ プ ロ パ ノ ー ルで 5 〜 &回抽出 し て.こ れか ら ェ チジ ゥ ムプ ロ マ イ ド を 除去 す る 。 最後 に 1 0 m M 卜 リ ス塩酸 （ P H 8 . 0 ) 及 び Ί ϋΐ Μ E D T A に対 し て透析 し て 塩化セ シ ウ ム を 除 去す る 。
7 . 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ドの合成
才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド の合成 は 、 下記 に示す 固相合成法
( 固相 リ ン酸 卜 リ エ ス テル法 ） に よ り 行なっ た （ Η . I to e t a I , N ec I e i c A cids R esearch, 0 ,
1, 7 5 5 - 1 7 6 9 ( 1 9 8 2 ) 〕 。
即 ち 、 ま ず 1 %架橋ポ リ ス チ レ ン樹脂 S — X Ί
( 2 0 0 〜 4 0 0 メ ッ シ ュ 、 パ イ オ ラ ド ラ ボ ラ 卜 リ ー ズ 社製 ） を ァ ミ ノ メ チル化 し た も の と 、 5 ' — 0 — ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チルヌ ク レ オ シ ド の モ ノ コ ハ ク 酸エ ス テル と を 反応 さ せ て 、 ヌ ク レ オ シ ド担持樹脂を得る 。 次 に 、 バ ー チ ェ ム社製 D N A合成機を用 い て 以下の操作を行な う 。
上記樹脂 4 O mgを反応管 に 入れ 、 Ί Μ臭化亜鉛のジ ク 口 口 メ タ ン 一 イ ソ プ ロ パ ノ ー ル （ 8 5 ： 1 5 ) 溶液を 用 い て 5 ' 位の ジ メ 卜 キ シ 卜 リ チル基を脱離さ せ る 。 次 に 完全 に 保護 さ た ジ ヌ ク レ オ チ ド （ C . B roka et a I N ucleic A cids R esearch, 8 , 5 4 6 1 - 5 4 7 1 ( 9 8 0 ) の方法 に よ り 調製 し た 〕 の 卜 リ エ チルアン モ ニ ゥ ム塩 5 0 mgを加え 、 縮合剤 （ メ シ チ レ ン スルホ 二 ル ー 5 — 二 卜 口 卜 リ アゾー ル ） を用 い て縮合させる 。 以 上の操作を繰返 し て 、 頫次鎖長をのば し て 、 保護さ れた 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ドを担持 し た樹脂を得る 。 尚 、 最後の 縮合工程で は 、 必要に応 じ て ジヌ ク レ オチ ド の代 り に 、 前記文献に記載の方法に よ り 調製さ れる モ ノ ヌ ク レ オ チ ド の 卜 リ エ チル ア ン モ ニ ゥ ム塩 2 5 mgを使用 す る 。
次 に 0 . 5 M ピ リ ジ ン 力 ル ドキ シ メ 一 卜 の ピ リ ジ ン 一 水 （ 1 ： 1 ) 溶液を用 い て 、 保護さ れた オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド を樹脂か ら脱離させる 。 こ れを セ フ アデッ ク ス G— 5 0 カ ラ ム （ フ アルマ シ ア社製、 2 X 1 0 0 cm ) で 、 更 に 高速液体 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー （ ポ ンプ ： ウ ォ ー タ ー ズ 社製 6 0 0 0 A型、 検出 器 ； 4 4 0型ディ テ ク タ ー 、 力 ラ ム ； マ イ ク ロ ポ ンダ ーパ ッ ク C 1 8 、 溶出溶媒 ； （ 5 → 4 0 % ) ァセ 卜 二 卜 リ ル 一 0 . 酢酸 卜 リ エ チル ァ ンモ ニ ゥ ム水溶液 ） で精製 する 。 次に 8 0 %齚酸 に よ り 脱保護反応 を行な い 、 再度高速液体ク ロ マ 卜 グラ フ ィ ー に よ り 単一 ピ ー ク に なる ま で精製 する 。 こ の高速液体 ク ロ マ 卜 グ ラ フ ィ 一 の条件 は 、 溶出 溶媒 と し て （ 5 → 2 5 % ) ァ セ 卜 二 卜 リ ル — 0 . Ί Μ酢酸 卜 リ エチル ア ン モニ ゥ ム水溶液を用 い る以外は 、 上記 と同一 と す る 。 · 8 . D N A塩基配列の分析
D N A塩基配列 の分析は 、 メ シ ン グ （ M essi ng ) の方 法 〔 Μ Ί 3 法、 M ethods E nzymol . , 1 0 1 , 2 〇
( 1 9 8 3 ) 〕 に 従い 、 以下の よ う に行なっ た 。 即 ち 、 ま ず D N A 断片を制限酵素に よ り 切 り 出 し 、 1 % ァガ ロ ー スゲル電気泳動 に よ り 分離する 。 こ の D N A 断片を 1 3 tnp8 R F ( アマ 一 シ ャ ム社製 ） を ベ ク タ ー と し て ク ロ ー ニ ングする 。 得 ら れる耝換え フ ァ ー ジ D N A をマ ン デル （ M andei ) と ヒ ガ （ H iga ) の方法 〔 J . ol B iol . , 5 3 , 1 5 4 ( 1 9 7 0 ) 〕 に よ り 、 大腸菌 J M 1 0 7 株へ形質導入する 。 こ の 菌体懸濁液 0 . 2 mfi に 、 S S mgZ nifiの イ ソ プ ロ ピル 一 3 — D — チ才 ガ ラ ク 卜 シ ド 2 5 ^ S 及び 2 0 mgZ iii5の 5 — ブ ロ モ ー 4 — ク ロ 口 一 3 — イ ン ド リ ル 一 iS — D — ガ ラ ク 卜 シ ド 4 0 2 を加 え た 。 次いで こ の菌体懸濁 液を加熱溶解さ せ た 後 、 5 0 で保温 し た H — 卜 ッ プ アガ 一 液 （ Ί %パ ク 卜 卜 リ プ 卜 ン 、 0 . 8 %塩化ナ ト リ ウ ム及び 0 . 5 %寒天 ） 3 πιδを 加 え 、 1 . 5 %寒天を加 え て 固化さ せ た 2 Χ Τ Υ 培地 ( 1 . 6 %パ ク 卜 卜 リ ブ 卜 ン 、 1 %酵母エキス 及び 0 . 5 %塩化ナ ト リ ウ ム ） の平板 に重層 し 、 3 7 で一 晚培養する 。 D N A断片の挿入さ れた耝換え フ ァ ー ジ は 無色のプラ ー ク を生 じ るの に対 し 、 親株の M 1 3 mp8 は 青色のプラ ー ク を生 じ る ので 、 目 的の耝換え フ ァ ー ジ は 容易 に選別でき る 。
次に 単一の無色プラ ー ク をパ ス ツ ール ピ ぺッ 卜 に て取 り 出 し 、 こ れ と J M 1 0 3株の培養液 0 . 0 1 と を 、 2 Χ Τ Υ培地 1 in8に加 え 、 約 5 時間 、 3 7 Χίで振盪培養 し て 耝換え フ ァ ー ジ を増殖さ せ 、 培養後、 遠心 に て菌体 を 除き 、 上清に 2 0 %ポ リ エチ レ ング リ コ ール 6 0 0 0 の 0 . 2 πώを混合 し 、 室温で 1 5 分以上静置 し た後、 遠 心 に て沈濺する フ ァ ー ジ を集め 、 フ エ ノ ール抽 出 に よ つ て 、 フ ァ ー ジ か ら 一本鎖 D N Aを抽 出 し 、 こ れを铸型一 本鎖 D Ν Α と し て 用 いる 。
錶型一本鎖 D N Aプ ラ イ マ ー （ 宝 酒造㈱製 、 M 1 3 の 1 5塩基プライ マ ー ） と のそれぞれ 0 . 5 P mo I ずつ を 混合 し 、 6 0 °Cで 2 0分間熱処理後 、 徐冷す る 。 。 次 に こ の混合液に α 3 2 Ρ - d C T P ( アマ シ ャ ム社製、 4 0 0 C i / m mo I ) 2 ^ S と D N Aポ リ メ ラ ー ゼ I ( ク レ ノ ー 、 宝酒造㈱製 ） 2 ユ ニ ッ ト と を加 え 、 充分に 混合 し た後 、 そ の 3 . 2 , " 2 ずつ を 、 下記第 2 表 に示 し た 4種の（I N T P— ddN T P混合液のそれぞれ を 含む反応管 に加 える 。 室温で 2 0分間反応さ せ た後、 チ エ ー ス反応液 （ d A T P、 d C T P、 d G T P及び d T T Pの各 1 m ) の をそ れぞれ に加 え 、 更 に 2 0分間反応さ せる 。 ホルム ア ミ ド停止液 （ 9 5 % v / ホル ム ア ミ ド 、 0 . 1 % キ シ レ ン シ ァ ノ ー ル及び 0 . 1 %ブ ロ ム フ エ ノ ールブルー ） を ずつ加え 、 9 5 eCで 3分間加熱 し た 後、 急冷す る 。 次に サ ンプル 2 2 ずつ を 、 6 %又は 8 % ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル に よ り 電気泳動 （ 1 8 0 0 、 3 0 111 八 、 2〜 3 時間 ） さ せ る 。 泳動後 、 ゲルを 紙 （ ヮ ッ 卜 マ ン 3 M M ) に移 し 、 ゲル乾燥器 に て 乾燥 し 、 ォ ー 卜 ラ ジ オ グラ ム を と り 、
D N A塩基配列を解読する 。
第 2 表 d N TP— ddNTP混合液钽成 、 A )
Figure imgf000040_0001
但 し 第 2 表中 、 d d A は ジデ才 キ シ アデ ノ シ ン を 、 fl ( C は ジ デ 才 キ シ シ チ ジ ンを 、 d d G は ジデ 才 シ グ ア ノ シ ン を 、 ま た d d T は ジデ才キ シ チ ミ ジ ン をそれぞれ示す 。 9 . ァ ガ ロ ー ス ゲル電気泳動
シ ュ ラ イ フ （ S Ghlei f ) と ウ ェ ン シ ン ク （ W ensi nk ) の手引 書 （ " P ractical M ethods i n M olecu lar B iology" ( 1 9 8 ) , S pr i nger - V e r I a g 社 、 p p 1 1 4 - 1 2 5 〕 に 記載の方法に 従っ て 、 ァ ガ ロ ー スゲ ル電気泳動及び泳動後のゲルか ら の D M A断片の分離を 行な う 。 泳動用電源 と し て は 、 ァ 卜 一社製 コ ン ス タ ー パ ヮ ー S J 1 0 6 5型を 、 泳動槽 と し て は 1 2 x 1 5 cmの プラ ス チッ ク 製水槽 （ 白金電極付 ） を 、 ァ ガ ロ ー ス と し て は ァガ ロ ー ス I ( 周仁化学研究所製 ） を、 ま た泳動用 緩衝液 と し て は 4 0 m M 卜 リ ス塩酸 （ 5 m M酢酸 ナ 卜 リ ゥ ム及び 1 m D T A含有、 P H 7 . 9 ) をそ れぞ れ用 い る 。
1 0 . ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動
上記手引 書の第 7 8 — 8 7 頁及び第 1 1 4 一 1 2 5 頁 に 記載の方法 に 従い 、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 及び泳動後のゲルか ら の D N A断片の分離を行な う 。 泳 動用 電源 と し て は 、 ァ 卜 一 社製 コ ン ス タ ー パ ワ ー S J 1 0 6 5 型を 、 泳動槽 と し て は ァ 卜 一社製 S J 1 0 6 0 S D型を用 い る 。 ア ク リ ルア ミ ド溶液 と し て 、 ア ク リ ル ア ミ ド と N ， N ' ー メ チ レ ン ビ ス ア ク リ ル ア ミ ド （ 2 9 対 1 〉 と の水溶液を 、 重合促進剤 と し て N , N , N ' ,
N ' ー テ 卜 ラ メ チ レ ン エ チ レ ン ジ ァ ミ ン を 、 合触媒 と し て 過硫酸 ア ン モ ニ ゥ 厶 をそ れぞれ用 い る 。 ま た 泳動用 緩衝液 と し て 9 0 m M 卜 リ ス塩酸 〈 9 0 m M湖酸 、 2 . 5 m M D T A含有、 ！） H 8 . 3 ) を用 い る 実施例 1
成熟ポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H 5 4及び P G H 5 5の構築
( A ) 中 間体プラス ミ ド P G H 5 3 の構築
① 大腸菌の 3 — ラ ク タ マ ーゼ の シグナルペプチ ドの一 部を コ ー ド する D N A塩基配列を有する オ リ ゴヌ ク レオ チ ドの合成の た め に 、 以下の塩基配列を有する 4種の 才 リ ゴヌ ク レ オチ ドのそ れぞれを 、 前記 し た 固相 リ ン酸 卜 リ エ ス テル法 に よ り 合成 し た 。
< > 5' C G C C G G C C T T T T G C C T T C C
T G T C - 3'
Figure imgf000042_0001
T
上記 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 2 〉 及び 〈 4 〉 の 5 ' 端を それぞれ T i ポ リ ヌ ク レ オ チジル キ ナ ー ゼ （ B R L社製 ） を 用 い て リ ン酸化 し た 。 即 ち 、 各々 1 〇 g の オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド を 5 0 m M 卜 リ ス塩酸水溶液 （ Ί 0 m M塩化 マ グネ シ ウ ム 、 5 iii iV1ジ チ才ス レ イ 卜 ール 、 1 m M A T Pを含む、 p H 9 . 5 ) 5 0 〃 S に 溶か し 、 こ れ に T 4. ポ リ ヌ ク レ オ チジルキ ナ ー ゼ 5 ユニッ ト を加 え 、 3 7で で 3 0分間反応さ せ 、 フ エ ノ ー ル抽出 に よ り 反応 を停止 さ せ た 。
② ク ロ ー ニ ングベ ク タ ー と し て 、 プラ ス ミ ド P B R 3 2 2 ( B ol ivar et a I , G ene , 2 , 9 5 - 1 3 ( 1 9 7 7 ) 〕 を利用 し た 。
該プラス ミ ド P B R 3 2 2の Ί 0 g を 、 制 限酵素 P st l ( 宝酒造㈱製 ） と P vu l ( N E B社製 ） と を用 い て 髙塩濂度緩衝液中で切 断 し 、 Ί . 0 %ァ ガ ロ ー スゲル 電気泳動 を行ない 、 約 4 . 2 4 kbの D N A断片を分離 し た 。
③ 上記②で得た D N A断片を 、 上記①で調製さ れた リ ン 酸化 し た オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 2 〉 及び 〈 4 〉 並び に リ ン酸化 し て いない 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド < Ί 〉 及び 〈 3 〉 のそ れぞれ約 ずっ と 合せ て 、 D N A リ ガ ー ゼ で結合反応さ せ た 。 反応終了後 、 こ の反応組成液で大腸 菌 K 一 1 2株由 来の Η Β Ί 0 1 株を形質転換さ せ た 。 得 ら れた テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性を示す形質転換株の 中か ら 1 株を 選び 、 こ れか ら プ ラ ス ミ ド を 単離 し 、 目 的 と す る P G H 5 3 を得 た 。 一連の操作の概略 は第 1 図 に示す通 り で あ る 。
第 1 図 は起源ベ ク タ ー P B R 3 2 2 に合成オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 1〉 、 < 2 > , 〈 3 〉 及び 〈 4 〉 を ク ロ ー 二 ン グ し て プ ラ ス ミ ド P G H 5 3を得る 工程及びこ れ に よ り 得 ら れる p G H 3の特徴を示す図で あ り 、 図中 ロ は 合成 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド由来の塩基配列 を示 し て い る 。
得 ら れた P G H 5 3 は 、 1 . 0 %ァ ガ ロ ースゲル電気 泳動 の結果、 4 . 3 K b の大き さ を有 し て お り 、 そ の D N A塩基配列 を Μ Ί 3法 に よ り 分析 し た結果 、 P B R 3 2 2の P stl及び P vul の両制 限サイ 卜 間 が欠失 し 、 代 り に 次 に示す よ う に 、 才 リ ゴヌ ク レ オ チ ド 〈 1 〉 、 〈 2 〉 、 〈 3 〉 及び 〈 4 〉 が挿入さ れて い る こ と が確認 さ れた 。
Figure imgf000044_0001
< 2 >
GAACTCAGCTGCAlG
CTTGAGTCG CGTC
Pstl制限サイ卜 該 P G H 5 3 は 、 通商産業省工業技術院微生物 工業技 術研究所に Γ Η Β 1 0 1 ( G H 5 3 ) 」 なる表示で微 ェ研条寄第 6 7 8号 （ R B P— 6 7 8 ) と し て 寄託さ れて い る 。
( B ) 成熟ポ リ ペプチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H
5 4 の構築
① 上記 （ A ) で得た P G H 5 3 の 1 0 9 を制 眼酵素 N ael ( N E B社製 ） 及び A val ( 宝酒造㈱製 ） を用 い て 中塩濂度緩衝液中で切 断 し 、 次いで 1 . 0 %ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動 を行なっ て 、 約 2 . 2 2 kbの D N A断片 《 A》 を分離 し た 。
し の 断片 は 、 合成オ リ ゴヌ ク レ オ チ ド 由 来の D M A配 列 の大部分 と プ ラ ス ミ ド の 複製開始領域を含ん で い る 。
② P B R 3 2 2 を制 限酵素 A val 及び H ind ffl ( いず れ も宝酒造㈱製 ） で 、 中塩濃度緩衝液を用 い て 切 断 し 、
1 . 0 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳動を行なっ て 、 約 1 . 4 〇 kbの D N A断片 《 B 》 を得 た 。
こ の 断片 に は 、 テ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性遺伝子のプ ロ モ 一タ ー の一 部 と テ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性の 構造遺伝子 の 全 て が 含ま れて いる 。
③ P B R 3 2 2 の 2 0 g を制 限酵素 F nu4 H I ( N E B社製 ） で低塩濃度緩衝液を用 い て切断 し 、 次い で S 1 ヌ ク レ ア ーゼ に よ り D N A断片末端の突出塩基を 分解除去 し た 。 こ れ は フ エ ノ ール抽出後の D N Aを 、 6 m M酔酸ナ ト リ ウ ム 、 4 0 m M塩化ナ 卜 リ ウ ム及び 1 m M硫酸亜鉛緩衝液 （ P H 4 . 5 ) 1 mSに 溶か し 、 こ れ に 2 0 0 0 ユニッ ト の S 1 ヌ ク レ ア ー ゼ （ B R L社製 ） を加 え て 2 0 で 3 0分間反応させ る こ と に よ り 行なつ た 。 次いで 、 フ エ ノ ール抽出後の 、 D N Aを制 眼酵素 H ind IEで 中塩寢度緩衝液を用 い て 切 断 し 、 6 %ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 を行な い 、 約 0 . 2 8 kbの D N A断片 《 C》 を得た 。
こ の断片に は 、 3 — ラ ク タ マ ーゼ のプ ロ モ ー タ ー 、 リ ボゾ ー ム結合部位、 シグナルペプチ ド を コ ー ド する遺伝 子の一部の他 、 テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性遺伝子の プ ロ モ ー タ ー の一部が含 ま れて い る 。
④ 上記で得た 3 つ の 断片 《 八 》 、 《 B 》 及び 《 C》 を 、 T 4 D N A リ ガ ーゼを用 い て結合させた 。 反応後 、 こ の 反応組成液で H B 1 0 1 株を形質転換 し た 。 得 ら れ fcテ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性を示す形質転換株の 中 か ら 1 株を選 びプ ラ ス ミ ド を 単錐 し た 。 かく し て p G H 5 4 を得た 。
P G H 5 4 は 、 Μ Ί 3 法 に よ る塩基配列分析の結果、 β ラ ク タ マ ー ゼ の プ ロ モ ー タ ー及び リ ボゾー ム結合部位 に続いて シグ ナルペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を有 し 、 こ の塩基配列 の 3 ' 末端の上流側 に N rul及び 下流側 に P vu の そ れぞれの制 限酵素認識配列 を有 し て い る こ と が確認さ れた 。
—連の操作の概略 は 、 第 2図 に示さ れる通 り で あ る 。 第 2図 は！） G H 5 3 と P B R 3 2 2 と か ら本発明 ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H 5 4を得る 工程及び 得 ら れた ベ ク タ ー P G H 5 4の特性を示す 図で あ り 、 図 中 顬 は シ グ ナ ル ペ プ チ ド を コ ー ド す る塩基配列を示す 。
P G H 5 4 は 、 前記 し た 通 り 約 3 . 9 K b の大き さ 及 び第 2 図 に示す制 限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れ 、 ま た VI 1 3法 に よ る塩基配列分析の結果 、 前記式 （ 3 ) に 示 し た 塩基配列 に よ り コ ー ド さ れる 3 ラ ク タ マ ー ゼ シ グ ナ ^ペプチ ド の遺伝子を有 す る こ と が確認 さ れた 。 ( C ) 成熟ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー P G H
5 5 の構築
ΐ P B R 3 2 2の A V a I 及び Ρ V u I制 限サ イ 卜 間 の塩 基配列 を欠失 さ せ た プラ ス ミ ドで あ る P B R H 0 2 を次 の操作 に よ り 作成 し た 。 即 ち P B R 3 2 2の 5 x g を 、 中 塩濃度緩衝液中で 、 制 限酵素 A va I 及び P vu I ( いず れも宝酒造㈱製 ） で切 断 し 、 フ エ ノ ール抽出後 、 D N A ポ リ メ ラ ーゼ I ( ク レ ノ ー 断片、 宝酒造㈱製 ） で切断断 片をブラ ン 卜 エ ン ド化 し た 。 次 に 1 . 096ァ ガ ロ ー スゲ ル電気泳動で約 3 . 7 2 の 0 八 断片を分離 し 、 し の 断片を T 4 D N Aリ ガ ーゼで環状化さ せ た 。 反応終了後 こ の反応組成液で H B 1 0 1 株を形質転換 し 、 得 ら れる ア ン ピ シ リ ン耐性及びテ 卜 ラサイ ク リ ン耐性を示す形質 転換株の 中 か ら 一株を選択 し て プラ ス ミ ドを単離 し p B R H 0 2を得た 。 得 ら れた P B R H 0 2 は 、 P B R 3 2 2 と は異なっ て 、 A valで も Ρ νιιϋでも切 断さ れな かっ た 。
② 上記①で得た P B R H 0 2の 5 xz g を制 限酵素 P st •I及び B amH I ( いず れも宝酒造㈱製 ） を用 い て 中塩濂 度緩衝液中で切 断 し 、 次いで 1 . 0 %ァガ ロ ー スゲル電 気泳動 を行なっ て 、 約 2 . 6 0 kbの D N A断片 《 D》 を 分離 し た 。
こ の 断片 は 、 テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性遺伝子の一部及び プラ ス ミ ド の複製開始頜域を含んでい る 。
③ P G H 5 4の 1 0 ^ g を制 眼酵素 P stl 及び B am H I で、 中塩濃度緩衝液を用 い て 切 断 し 、 次いで 1 . 0
°/0 ァ ガ ロ ースゲル電気泳動 を行な い 、 約 0 . 6 6 k bの D N A断片 《 E 》 を得た
こ の 断片に は 、 /3 — ラ ク タ マ ー ゼのプ ロ モ ー タ ー 、 リ ポゾー ム結合部位、 シ グナルペプチ ドを コ ー ドする D N A配列及ぴテ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性遺伝子の一部が含 ま れて いる 。
④ 上記で得た 2つ の 断片 《 D 》 及び 《 E 》 を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼ を用 い て 結合さ せ た 。 反応後、 こ の反応 組成液で H B 1 0 1 株を形質転換 し た 。 得 ら れた テ 卜 ラ サイ ク リ ン耐性を示す形質転換株の中か ら 1 株を選びプ ラ ス ミ ドを単離 し た 。 か く し て P G H 5 5 を得た 。
—連の操作の概略 は 、 第 3 図 に示さ れる通 り で あ る 。 第 3 図 は P B R 3 2 2か ら P B R H 0 2 を得、 の
P B R H 0 2 と P G H 5 4 と か ら 本発明ポ リ ペプ チ ド分 泌発現用 ベ ク タ ー P G H 5 5 を得る 工程及び得 ら れる P G H 5 5 の特性を示す 図で あ る 。
P G H 5 5 は 、 上記第 3 図 に 示さ れる制限酵素開裂地 図 に よ り 特徴付け ら れ 、 1 . 0 % ァ ガ ロ ー スゲル電気泳 動 の結果、 約 3 . 3 K b の大き さ を有 し て い た 。 ま た 該 P G H 5 5 は 、 3 法 に よ る塩基配列分析の結果、 P G H 5 4 に お け る第 2 の P vul制 限サイ 卜 を含む約 0 . 6 4 kbの D N Aを欠 く 以外 は 、 該 P G H 5 4 と周様 で あ り 、 その第 1 の Ρ νυ II制限サイ 卜 は 、 シ グナルぺプ チ ド を コ ー ド する. D N A塩基配列の 3 ' 末端の近傍に存 在 し て いる こ と が確認された 。
実施例 2
シ グナルペプチ ド — 3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ン融合ポ リ ぺプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 を有する分泌発現べ ク タ ー の構築
{ A ) ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを コ ー ドする D N A塩基配列 の合成
こ の塩基配列 は 、 グ レ ゴ リ ー （ H . G regory) に よ り 報告さ れた ア ミ ノ 酸配列 〔 N ature, 2 5 7 , 3 2 5 — 3 2 7 ( 1 9 7 5 ) 〕 を参考に し て 、 ま ず /3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを コ ー ド する D N A塩基配列の前後に 開始コ ド ン 、 終止 コ ド ン及び制 限酵素認識部位を付加 し て な る下記第 3表 に示す D N A塩基配列を構築する こ と よ り 行なっ た c こ の D N A塩基配列 は 、 本発明者 ら に よ り 既に特顥昭 5 9 — 1 3 7 6 9 1 号 と し て特許出顥さ れて い る 。 第 3 表
5' AAT TCG AAG ATC TGC ATG AAT AGC
3' GC TTC TAG ACG TAC TTA TGG
GAT TCT GAG TGC CCA CTG TCT CAC
CTA AGA CTC ACG GGT GAC AGA GTG
GAT GGC TAT TGT CTG CAG GAC GGT
CTA CCG ATA ACA GAC GTG CTG CCA
GTT TGC ATG TAC ATC GAA GCT TTG
CAA ACG TAC ATG TAG CTT CGA AAC
GAT AAA TAC GCG TGT AAC TGT GTA
CTA TTT ATG CGC ACA TTG ACA CAT
GTG GGT TAT ATC GGT GAA CGC TGT
CAC CCA ATA TAG CCA CTT GCG ACA
CAA TAC CGT GAT CTG AAA TGG TGG
GTT ATG GCA CTA GAC TTT ACC ACC
GAA TTG CGT TAA TAG TGA AGA TCT
CTT AAC GCA ATT ATC ACT TCT AGA
G 3'
CCT AG 5'
( B ) iS ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン を コ ー ド する D N A塩基配列 を保有 す るプ ラ ス ミ ド の 構築 P B R 3 2 2 の 1 0 g を 、 ま ず高塩濃度緩衝液中 で E coR I ( 宝酒造㈱製 ） と B amH I とで切断 し 、 次い で 1 . 0 %ァガ ロ ー スゲル電気泳動を行なっ て 、 約 3 . 9 9 の D N A断片を単離 し た 。
② 上記①で得た D N A断片 と 、 上記 （ A ) で得た 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ンを コ ー ドす る D N A塩基配列 と を 、 T 4 D N A リ ガ ー ゼで結合さ せた 。 反応後、 反応組成物で Η Β 1 0 1 株を形質転換 し 、 得 ら れた ア ン ピ シ リ ン耐性 を示す形質転換株の中 か ら一株を選びプラ ス ミ ドを単離 した 。 か く し て 3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを コ ー ドする D N A塩 基配列 を P B R 3 2 2 の E coR I 及び B amH I 制 眼サイ 卜 間 に 挿入さ れた プラ ス ミ ド P U G 3 を得た 。
のプラ ス ミ ド P U G 3 を保有する H B 1 0 1 株 は 、
Γ Η Β 1 0 1 ( U G 3 ) 」 な る表示で 、 微 ェ研菌条第 5 4 3号 （ F E R M B P — 5 4 3 ) と し て 寄託さ れて い る 。
( C ) P U G 2 0 1 の構築
上記 （ B ) で得 た p U G 3 を制 限酵素 H ί n f I で切 断 し て 得 ら れる D N A断片を 、 P G H 5 5 の P vul制 限サ ィ 卜 に 挿入 し て 、 シ グナルペプチ ド 一 /3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン 融合 ポ リ ペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列を含む分 泌発現べ ク タ 一 で あ る P U G 2 0 1 を 、 以下の方法 に よ り 構築 し た 。
① P U G 3 の 1 5 g を 、 髙塭 S度緩衝液中で H inf
I ( 宝酒造㈱製 ） で切断 し 、 フ エ ノ ー ル油出後 、 D N A ' ポ リ メ ラ ーゼ I ( ク レ ノ ー 断片 ） で 切断断片を ブラ ン 卜 エ ン ド 化 し た 。 次いで 6 % ポ リ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気 泳動 を行ない 、 約 0 . 4 3 kbの D N A靳片 《 F 》 を単離 し た 。
こ の 断片 に は 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン を コ ー ド す る D N A 塩基配列 〈 翻訳停止 コ ド ン を含む ） の う ち 5 ' 端の 7塭 基を 除 く 塩基配列 が含 ま れ て い た 。
② P G H 5 5 は 、 3 ラ ク タ マ ー ゼ の シグ ナルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 の後 に 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の N端領域を コ ー ド す る最初 の 7個 の D N A塩基配列 が 直結 し 、 且つ そ の直後で制 限酵素 P VII E に よ り'切 新さ れ る よ う に 構成さ れた D N A塩基配列 を有す る も の で あ り . 該 P G H 5 5 の 5 / g を 中塩濃度緩衝液中で 、 P vulで 切 断 し て 、 約 3 . 2 6 kbの D N A断片 《 G》 を得 た 。
こ の 断片は 、 p G H 5 5 の全て の遛伝情報を 有 し て い る 。
③ 上記①で 得 た 断片 《 F 》 の約 1 g と 上記②で得た 断片 《 G》 の約 0 . 5 ^ g と を 丁 4 D N A リ ガ ー ゼ で結 合さ せた 。 反応後、 こ の反応組成液で H B 1 0 1 株を形 質転換 し 、 得 ら れる テ 卜 ラサイ ク リ ン耐性の形質転換株 の中か ら一株を選び、 プラ ス ミ ド p U G 2 0 1 を単離 し た 。
—連の操作の概略 は 、 第 4 図 に示さ れる通 り である 。 第 4 図 は 、 P G H 5 5 と P U G 3 と か ら シグナルぺプ チ ド と 目 的ポ リ ペプチ ド （ jS ゥ ロ ガス 卜 ロ ン ） と の融合 ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列を含む本発明 ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー P U G 2 0 1 を得る工程 及び得 ら れる P U G 2 0 1 の特性を示す図で あ り 、 図中 白 ヌ キ の矢印 は- jS ゥ ロ ガス 卜 ロ ンの遣伝子を示す 。
P U G 2 0 1 は 、 1 . 0 % ァガ ロ ー スゲル電気泳動の 結果、 約 3 . 7 K b の大き さ を有 し て い た 。 こ れを B am H I 又 は H ind Iで切断する と 、 そ れぞれ 2種類の D N A断片が得 ら れる こ と か ら 、 該 P U G 2 0 1 に は 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン遺伝子が含 ま れて い る こ と が判 り 、 ま た 該断片の大き さ を調べた結果よ り 、 目 的のプラ ス ミ ドで あ る こ と が判っ た 。 更 に 、 p U G 2 0 1 に つ い て 、 3 ラ ク タ マ ーゼ のプ ロ モ ー タ ー 部分か ら 3 ゥ ロ ガス 卜 ロ ン遛 伝子 ま で を含む D N A断片の 塩基配列 を 、 M 1 3 法 に よ る塩基配列分析 に よ り 調 べ た 。 そ の結果 、 該 D N A塩基 配列 は下記第 4窣の通 り であ り 、 p U G 2 0 1 がプ ロ モ 一タ ー 、 リ ボゾ ー ム結合部位並び に /3 ラ ク タ マ ー ゼ の シ グ ナルペプチ ド を コ ー ド する塩基配列及び 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン を コ ー ド す る 塩基配列 （ 融合ポ リ ペ プチ ド を コ ー ド する塩基配列 ） が 、 正確 に こ の順序で配列 さ れて い る し と が確認 さ れた 。 ま た第 4表 に は D N A塩基配列 に 対応 す る ア ミ ノ 酸配列も併記す る 。
上記 P U G 2 0 1 は 、 こ れを大腸菌 H B 1 0 1 に 保有 さ せ 、 こ の保有株を Γ Η Β 1 0 Ί 〔 P G H 2 0 1 〕 」 な る 表示で 、 通商産業省工業技術院微生物 工 業研究所 に 寄 託さ れて い る 。 その寄託番号 は 、 微ェ研条寄第 6 8 1 号 ( F E M B P — 6 8 1 〉 で あ る 。
第 4 表
プ □ タ
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000056_0002
Jポゾー厶結合部位
AAGGAAGAGT ATG AGT ATT CAA CAT TTCCTTCTCA
Figure imgf000056_0003
TTC CGT GTC GCC CTT ATT CCC TTT
AAG GCA CAG CGG GAA TAA GGG AAA
Phe Arg Val Ala Leu I le Pro Phe シ グ ナ ル ぺ プ チ 丁 ττ GCG GCC TTT TGC CTT CCT GTC
AAA CGC CGG AAA ACG GAA GGA CAG
Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val
TTC GCG AAC TCA GAT TCT GAG TGC
AAG CGC TTG AGT CTA AGA CTC ACG
Phe Ala Asn Ser Asp Ser Glu Cys
CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT
GGT GAC AGA GTG CTA CCG ATA ACA
Pro し en Ser His Asp Gly Tvr Cys
.Sゥ口ガス卜ロンのポリぺプチド
CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC
GAC GTG CTG CCA CAA ACG 丁 AC ATG
Leu His Asp Gly Val Cys et Tyr β 0 ' 0 し マ 4 S 通 /: Γι ^ ¾ β 0 ' s ¾ ¾ し ♦ 遝 エ ^ β S ' 0 ¾ ^ Ζ ♦ 7 ^ ^ ^ ^ ^ ¾S
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〇 丄0〇¥〇 丄0丄丄〇 〇丄
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丄丄 V VOO OVV 丄丄 0 00V 00V 丄丄丄 OVO
VV丄 100 9丄丄 VVO 03丄 ΘΘ丄 VVV 0丄 0 dsy 6J V 」Λ丄 U|〇 6J V n|〇 Λ|〇
V丄〇 VOO 。丄 V 丄丄〇 VOV ΘΟΘ 丄丄 0 VOO
丄 VE) 丄 E)0 QV丄 VVO 101 000 VVO 丄 90
8| I JA丄 Λ|〇 ΙΒΛ SAQ usv SAO
ΘΥ1 V丄 V VOO OVO IVO VOV 。丄丄 VOV
0丄 V 丄 V丄 100 〇丄〇 V丄 Θ 101 OVV 101
BIV 」Λ丄 SA1 dsv B|V ΠΙΘ θ| I
000 ε>丄 V 丄丄丄 V丄 Q OVV VOO 丄丄 0 OVl
ΘΟΘ VVV 丄 ve» 0丄丄 丄 09 VVO 0丄 V
9 9
96900/S8df/lDd 6LL£Q/9S O リ ン酸水素 ア ン モニ ゥ ム ♦ ナ 卜 リ ウ ム
4 水塩 3 . 5 g プ ド ウ糖 2 . 0 g カ ザ ミ ノ 酸 0 g
L 一 プ ロ リ ン 0 . 2 3 g し 一 口 イ シ ン 3 9 . 5 mg 塩酸チ ア ミ ン 1 6 . 8 5 mg テ 卜 ラ サイ ク リ ン ♦ 塩酸塩 2 0 . 0 mg
P U G 2 0 1 株の前培養液 Ί υιΰを 、 修正 Ε 培地 2 0 0 mQを含む フ ラ ス コ に 加 え 、 3 7 °Cで 2 4 時間振盪培養 し た 。
( B ) 菌体か ら の ペ リ プラズム画分 と 細胞内画分 と の 抽 出
上記 （ A ) で 得た培養液か ら 遠心分離 （ 6 0 0 0 回 転 Z分 X 1 0分 ） で菌体を集め 、 培養液の 0 . 5 倍量の洗 淨緩衝液 〈 Ί 0 m M 卜 リ ス塩酸及び 3 ◦ m M塩化ナ 卜 リ ゥ ム 、 p H 8 . 0 ) で菌体を 洗浄 し た後 、 浸透圧 シ ョ ッ ク 法 〔 H . C . N euと し . A . H eppel , J . B . C .， 2 4 0 ， 3 6 8 5 - 3 6 9 2 ( 1 9 6 5 ) 〕 に 従い 、 ぺ リ ブ ラズ 厶 画分を 油 出 し た の抽 出 操作は 、 ま ず湿
1 9 の菌体を 2 0 %蔗糖を含む 3 0 m M 卜 リ ス塩酸緩 衝液 （ P H 8 . 0 ) 8 0 ιηδに懸濁 さ せ 、 0 . 2 5 Μ E D T A水溶液 （ Ρ Η 8 . 0 ) の Q . 3 2 m2を加 え 、 ロ ー タ リ ー シ ェ ー カ ー で 2 4で に て 1 8 0回転 /分で 1 0分間攬拌 し た 後 、 遠心分離 （ 9 0 0 0回転 /分 X 1 0分 ） し て菌体を集め 、 次いで こ の菌体を氷冷 し た水 8 012に 再懸濁 さ せ 、 氷中 に 1 0分間 静置 し て 時々 攬拌 し 、 遠心分離 （ 9 0 0 0回転 /分 X 1 0分 ） に よ り 菌体 と 上澄 と を分離 す る こ と に よ り 行なっ た も ので あ り 、 得 ら れ た 上澄が ペ リ ブラ ズム画分で あ る
次い で 、 上記ペ リ プ ラ ズ ム 画分を抽 出 し た後の 菌体を 前記 と 同一 の洗净緩衝液で洗净後 、 P B S ( 1 5 0 m M 塩化 ナ ト リ ウ ム を 含む 2 0 m M リ ン酸ナ ト リ ウ ム 、 p H 7 . 0 ) 6 に 懸濁 さ せ 、 迢音波破砕機 （ 大岳製作所製 5 2 0 2 型 ） を用 い て 出力 1 0 0 Wに て 3 0秒ず つ 3 回 超音波破砕処理 し 心分離 （ 1 8 0 0 0回転 Ζ分 X
2 〇 分 ） し て 上澄 を得た れを細胞内 画分 と し た
( C ) ラ ジ オ ィ ム ノ ア ッ セ ィ に よ る 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の 測定
上記 （ Β ) で 得た そ れぞれの 分 につ き 、 以下の通 り 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の 存在 を 、 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン特異 ラ ジ オ イ ム ノ ア ツ.セ ィ に よ り 検討 し た 。 ラ ジ オ ィ ム ノ ア ッ セ ィ の方法は次の通 り である 。 即 ち 、 精製 ヒ 卜 iS ゥ ロ ガス 卜 ロ ンを抗原 と し て 、 家兎を免疫 し 抗血清を作成 し た 。 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン を蒸留水 0. 2 in2に 溶解後 5 0 % ポ リ ビ ニル ピ ロ リ ド ン液 1 . 5 ιπδを加 え室温で 2 時間撹拌 し た 。 コ ンプ リ ー ト · フ ロ イ ン ド ♦ ア ジ ュバ ン 卜 2 . Ο πιδを加 え て 乳化 し 、 家兎 3 匹の胸部に 皮下注射 し た 。 2週間毎に免疫を 4 回 く り 返 し た後、 さ ら に 5 0 g の抗原を静注 し 、 3 日 後 に全採血を行ない 、 血清を 分離 し た 。
次 に ア ツ セ ィ に 用 いる抗血清の希釈倍率を求める タ イ 卜 レ ー シ ヨ ン カ ー プ 、 ア ツ セ ィ 条件を最適化す る た め ィ ンキ ュ ベ ー シ ヨ ン 時間 、 抗体結合標識抗原 （ バ ウ ン ド ） と 遊離標識抗原 （ フ リ ー ） の分離方法等の検討を加 え 、 下記測定条件を設定 し た 。
即 ち 、 0 . 5 % ゥ シ血清 アルブ ミ ン （ B S A ) 、
1 4 0 m M塭化ナ ト リ ウ ム 、 2 5 m M D T Aニ ナ 卜 リ ウ 厶 を含む 1 0 m M リ ン酸緩衝液 （ P H 7 . 4 ) を希 釈液 と し て用 い 、 該希积液 4 0 0 ^ 2 、 測定試料又 は標 準 ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン 1 0 0 S 及び抗 ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン血清 1 0 0 ^ 2 を加 え て 4 °Cに て 2 4 時間 イ ン キ ュ ベ 一 卜 し た 後 、 1 2 5 I 標識 ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン 1 0 0 X 2 ( 約 5 〇 0 〇 cpm ) 加 え た 。 更 に 4 °C に て 4 8 時間 イ ン キ ュ ベ ー 卜 し fc後 、 第 2 抗体 （ 抗家兎 ァ ー グ ロ プ リ ン ャ ギ血清 ） （ 1 ： 2 0 ) 1 0 0 ^ 2 、 正常家 兎血清 （ 1 : 2 0 0 ) 1 0 0 δ 及び 5 % ポ リ エ チ レ ン グ リ コ ールを含む 1 0 m M P B S 液 9 0 0 〃 2 を加 え て 4 °C に て 3 時間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 次 に 3 0 0 0 rpm で 3 0 分間遠心分離 し 、 上清を除き沈瀕物を カ ウ ン 卜 し た 。 標準 ヒ 卜 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン よ り 得 ら れた 標準曲 線 よ り 試料中の ヒ 卜 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン免疫活性物の含量 を 求め た 。
上記結果を下記第 5 表 に 示す 。 ま た 第 5 表に は 、 P U G 2 0 1 を保有す る H B 1 0 1 株に 代え て 、 周様 に し て 作成さ れた P G H 5 5 及び p U G 3 のそれぞれで形 質転換 さ れた H B 1 0 1 株を用 い て 同様 に し た結果を併 記 す る 。
第 5 表
3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン免疫活性 株 ( g / s 培養液 ）
ペ リ ブラズ ム画分—細胞内画分
Η Β 1 0 1
C P G Η 5 5 ) < 0 . 0 3 < 0 . 0 3
Η Β 1 0 1
〔 P U G 3 ) < 0 . 0 3 < 0 . 0 3
Η Β 1 0 1
( U G 2 0 ) 2 6 3 0 ._6 2一 上記第 5表 よ り 、 シ グナルペプチ ドの みを コ ー ド す る D N A塩基配列 を含むベ ク タ ー を保有する大腸菌 （ Η Β 1 0 1 ( G Η 5 5 ) ) 及び ゥ ロ ガ ス ト ロ ン の みを コ - ド す る D M A塩基配列 を含むプラ ス ミ ド を保有す る大 腸菌 （ H B 1 0 1 ( U G 3 ) で は 、 そ れ ら の培養抽 出液中 に 3 ゥ ロ ガ ス 卜 口 ン の免疫活性物質は実質的 に 検 出 さ れない が 、 シ グナルペプチ ド と 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン の 融合ポ リ ペ プチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 を含み 、 そ の前に プ ロ モ ー タ ー 及び リ ボゾー ム結 合部位が連結さ れた 本発明 の成熟 ポ リ ペプチ ド分泌発現ベ ク タ ー を 保有 す る大腸菌 （ H B 1 0 1 ( U G 2 0 1 ：) で は 、 そ の 培養抽出液中 に 顕著な 5 ゥ ロ ガ ス 卜 口 ンの免疫活性が検 出 さ れる こ と が 明 ら かで あ る 。
ま た 本発明ベ ク タ ー で形質転換 し た上記微生物の培養 で は 、 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ンの免疫活性物質の殆ん ど す ベ て ( 9 9 . 8 % ) が 、 ペ リ ブラズ ム に 分布 し て い る こ と も 確認さ れる 。 こ の こ と か ら 、 シグ ナルペプチ ド と 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン と の融合ポ リ ペプ チ ドの D N A 塩基配列 を利 用 し た 本発明 に よ れば、 /3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ン は細胞膜を通 過 し て ペ リ プラ ズム に分泌さ れる こ と が判る 。
( D ) ポ リ ペプチ ド の精製
上記ペ リ ブラ ズム抽 出液中 の 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン の免疫 活性物質を 、 プチル 卜 ョ パ ー ル （ 東洋曹達㈱製 ） を用 い た 吸着 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 、 C M — 卜 ョ パ ー ル （ 東洋曹 達株式会社製 ） を用 い た イ オ ン交換 ク ロ マ ト グラ フ ィ ー P e p R P C カ ラ ム （ フ ア ルマ シ ア社製 ） を用 い た 髙速液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー 操作 に よ り 、 そ れぞれ単一 の ポ リ ペプチ ド に なる ま で精製 し た 。
そ の結果、 精製さ れた ポ リ ペ プチ ド は 、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動 、 S D S — ポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲル 電気泳動 、 ア ミ ノ 酸分析 、 N 末端分析の す べ て に お い て ヒ 卜 尿 よ り 単離精製さ れた 3 ゥ 口 ガ ス 卜 ロ ン と 周一物質 であ る こ とが確認 された
ffiJIS様式 INTERNATIONAL FORM
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
特許手垸上の微生物の寄託の国際的承 12 OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES
OF PATENT PROCEDURE
、に関するブダべスト条約
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
下記国際寄託当局によって規則 7. 1に従い
DEPOSIT
発行される
issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page. 氏名 （名称） アース製薬铣式会社
あ て 名兵庫県赤穂市坂越 3 2 1 8の 1 2
I . 微生物の表示
(寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
微ェ研条寄第 6 7 8 号
HB101 pGH53
(FERM BP -6 7 8 )
Π . 科学的性質及び分類学上の位置
I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた
Ξ 科学的性質
分頷学上の位置
πι. 受頡及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 13 曰 （原寄託日）に受領した I櫧の微生物を 受託する。
IV. 国際寄託当局
通商苣業省工業技術院微生物工業技術研究所 名 "Γ小-
あて名：
Figure imgf000065_0001
305, JAPAN
昭和 59 年 （1984 ) 12 月 13 日 国際様式 INTERNATIONAL FORM
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES
特許手铳上の微生物の寄託の国際的承認
OF PATENT PROCEDURE
、に関するブダぺス卜条約
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
下記国際寄託当局によつて規則 7.〗に従い
DEPOSIT
発行される
issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page.
氏名 （名称） アース製薬株式会社
- あ て 名兵庫県赤穂巿坂越 3 2 1 8の Ί 2
I . 微生物の表示
(寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
HB10l fpGH54 微ェ研条寄第 6 7 9 号
(FERM BP - 6 7 9 )
I. 科学的性質及び分類学上の位置
I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた c
□ 科学的性質
Q 分類学上の位置
I. 受領及び受託
" 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 13 曰 （原寄託ョ）に受領した 1搠の微生物を 受託する。
IV. 国際寄託当局
通商苣業省工業技術院微生物工業技術研究所 名 称
あて名
Figure imgf000066_0001
305, JAPAN
昭和 59 年 （1 984 ) 1 2月 13 曰 国際様式 INTERNATIONAL FORM
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
f OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES 特許手垸上の ¾主物の寄託の国際的承認
OF PATENT PROCEDURE
、に関するブダへフ、ト 約 )
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
下記国際？ ί託当局によって規 7. 1に従い
DEPOSIT
発行される issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page. 氏名 （名称） アース製薬株式会社
寄託者
あ て 名 兵庫県赤穂巿坂越 3 2 1 8の 1 2
I . 微生物の ¾不
(寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
HB1 01 (pGH55 微ェ研条寄 ·6 8 0 号'
(FERM BP - 6 8 0 )
Π . 科学的性質及び分類学上の位置
I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた
0 科学的性質 ，
分類学上の位置
I . 受領及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 1 2 月 Ί 3 日 （原寄託曰）に受領した I搠の微生物を 受託する。
IV. 国際寄託当局
通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
Fennentatiofl— Receaich-Iastitute
名 称： Agency of Industrial acienccand. [Technology
. , , !リ. ! 千 ！ ！
所 長 大 山 次 郎 ^ミ^ i
Jiro Ooyama, r. : "TiDTRECTOR GENERAL.
あて名：曰本国茨城県筑波郡谷田部 BJ東 Γ,目 ； (郵便番号 305 )
1-3 , Higashi 1 chome Vatabe-macfti isukuba-gun Ibaraki-ken
305, JAPAN .
昭和 59 年 （1 984 ) 12月 13 曰 国際様式 INTERNATIONAL FORM
BUDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNITION OF THE DEPOSIT
f OF MICROORGANISMS FOR THE PURPOSES 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認
OF PATENT PROCEDURE
^こ関するブダぺス ト条約
RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINAL
下記国際寄託当局によって規則 7.〗に従い
DEPOSIT
発行される
issued pursuant to Rule 7. 1 by the INTERNA¬
- 原寄託についての受託証 TIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified at the bottom of this page. 氏名 （名称） アース製薬珠式会社
あ て 名兵庫県赤穂市坂越 3 2 1 8の 1 2
I . 微生物の表示
(寄託者が付した識別のための表示） (受託番号）
HB101 fpUG20l) 微ェ研条寄第 6 8 1 号
(FERM BP - 6 8 1 )
I . 科学的性質及び分類学上の位置
I欄の微生物には， 次の事項を記載した文書が添付されていた <：
Q 科学的性質
Q 分類学上の位置
1. 受領及び受託 本国際寄託当局は， 昭和 59 年 12 月 13 曰 （原寄託日）に受領した I欄の微生物を 受託する。
IV. 国際寄託当局
通商苣業省工業技術院微生物工業技術研究所 名 称：
あて名：
Figure imgf000068_0001
305, JAPAN
昭和 59年 （ 1984 ) 12月 13 曰

Claims

請 求 の 範 囲
① シグナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ドを コ ー ドす る D N A塩基配列 と を直接 連結さ せ て 目 的ポ リ ペプチ ド を分泌発現さ せる た め の シグナルペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列を含む こ と を特徴 と す る ポ リ ペ プチ ド分泌発現用 ベ ク タ ー 。
② シグナルペプチ ド を コ ー ド する D N A塩基配列 と共 に 該塩基配列 の前 に プ ロ モ ー タ ー 及び リ ポゾ ー ム結合 部位を有する特許請求の範囲第 1 項 に記載のベ ク タ ー ③ シ グ ナルペプ チ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 に 連 結さ れる べ き 目 的 ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩 基配列 の 直後 に 翻訳停止シ グナルを直接連結さ れ る べ く し た 特許請求の範囲第 1 項又 は第 2 項に 記載の べ ク タ 一 。
④ 翻 訳停止シ グナルの後 に更 に転写終結因子が連結さ れて な る特許請求の範囲第 3 項 に 記載の ベ ク タ ー 。 ⑤ シ グ ナ ルペプチ ド が大腸菌 3 ラ ク タ マ 一 ゼ の も ので あ る特許請求の範囲第 1 〜 4 項の い ず れか に 記載の ベ ク タ 一 。
⑥ プ ロ モ ー タ ー 、 リ ボゾー ム結合部位及び転写終結因 子が大腸菌 3 ラ ク タ マ ー ゼ の も の で あ る特許請求の範 囲第 1 〜 5 項の いずれか に 記載のベ ク タ ー 。
⑦ P G H 5 4 である特許請求の範囲第 1 項に 記載の ベ ク タ一。
⑧ P G H 5 5 で ある特許請求の範囲第 1 項 に 記載の ベ ク タ一。
⑨ シグナルペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る D N A塩基配列 と が直接 連結さ れてなる融合ポ リ ペプチ ドを コ ー ドする D N A 塩基配列 を含むこ と を特徴と する特許請求の範囲第 1 〜 9 項の いずれか に 記載のベ ク タ ー 。
⑩ 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 が 3 ゥ ロ ガ ス 卜 ロ ンを コ ー ドする ものであ る特許請求の範 囲第 9 項 に 記載の ベ ク タ ー 。
© P U G 2 0 1 で あ る特許請求の範囲第 9 項 に 記載の ベ ク タ ー 。
@ シグナルペプチ ドを コ ー ド する D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ドを コ ー ド す る D N A塩基配列 と が 直接 連結さ れて なる融合ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る D N A 塩基配列 を含むベ ク タ 一で形質転換さ れた微生物 。 ⑩ 大腸菌であ る特許請求の範囲第 1 2 項 に記載の微生 物 。 ® シ グナルペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と 目 的ポ リ ペプチ ド を コ ー ド す る D N A塩基配列 と が直接 連結さ れて なる融合ポ リ ペプチ ド を コ ー ドす る D N A 塩基配列を含むベ ク タ ー で形質転換さ れた微生物 を培 養 し て分泌さ れる ポ リ ペプチ ドを採取す る こ と を特徴 と す る ポ リ ペ プチ ドの 製造法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004686A (en) * 1986-02-24 1991-04-02 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US5770192A (en) * 1991-03-22 1998-06-23 Roussel-Uclaf Biological control agents

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH069516B2 (ja) * 1986-01-31 1994-02-09 ア−ス製薬株式会社 β−ウロガストロンの製造方法
CA1297435C (en) * 1986-09-12 1992-03-17 Stephen D. Gillies Messenger rna stabilization in animal cells
US5011772A (en) * 1988-02-05 1991-04-30 Public Health Research Institute Of The City Of N.Y. High yield protein production system
EP0689551B1 (en) * 1993-03-17 2008-02-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Immunogenic chimeras comprising nucleic acid sequences encoding endoplasmic reticulum signal sequence peptides and at least one other peptide, and their uses in vaccines and disease treatments
KR100473443B1 (ko) * 1994-09-07 2005-06-23 다이이찌 산토리 파마 가부시키가이샤 단백질의 생산방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59196093A (ja) * 1983-04-07 1984-11-07 カイロン　コーポレイション インスリンの発現方法
JPS59198980A (ja) * 1983-04-26 1984-11-10 チロン・コ−ポレイシヨン ａ因子およびそのプロセツシングシグナルを含むＤＮＡ構成物
JPS59205997A (ja) * 1983-04-25 1984-11-21 チロン・コ−ポレイシヨン ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法
JPH0630687A (ja) * 1992-07-17 1994-02-08 Kao Corp 小麦粉組成物
JPH0641488A (ja) * 1991-01-23 1994-02-15 Arakawa Chem Ind Co Ltd 印刷インキ用バインダーおよび印刷インキ組成物
JPH06115691A (ja) * 1991-07-16 1994-04-26 Daiyamondo Eng Kk 粉体流量分配制御方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
US4624926A (en) * 1981-01-02 1986-11-25 The Research Foundation Of State University Of New York Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
EP0108132A1 (en) * 1982-05-06 1984-05-16 Applied Molecular Genetics Inc. The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof
JPS6030687A (ja) * 1983-08-01 1985-02-16 Wakunaga Seiyaku Kk Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド
EP0170266B1 (en) * 1984-07-30 1993-03-24 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing protein, and vector, recombinant dna and transformant used therefor

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59196093A (ja) * 1983-04-07 1984-11-07 カイロン　コーポレイション インスリンの発現方法
JPS59205997A (ja) * 1983-04-25 1984-11-21 チロン・コ−ポレイシヨン ヒト−インシユリン様成長因子の製造方法
JPS59198980A (ja) * 1983-04-26 1984-11-10 チロン・コ−ポレイシヨン ａ因子およびそのプロセツシングシグナルを含むＤＮＡ構成物
JPH0641488A (ja) * 1991-01-23 1994-02-15 Arakawa Chem Ind Co Ltd 印刷インキ用バインダーおよび印刷インキ組成物
JPH06115691A (ja) * 1991-07-16 1994-04-26 Daiyamondo Eng Kk 粉体流量分配制御方法
JPH0630687A (ja) * 1992-07-17 1994-02-08 Kao Corp 小麦粉組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP0207165A4 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5004686A (en) * 1986-02-24 1991-04-02 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US5770192A (en) * 1991-03-22 1998-06-23 Roussel-Uclaf Biological control agents

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