CN112695023A

CN112695023A - 一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用

Info

Publication number: CN112695023A
Application number: CN202011386939.8A
Authority: CN
Inventors: 李艳; 贾红华; 齐雪莲; 邵俊澜; 余杰; 严明
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112695023B

Abstract

本发明公开了一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用，所述糖苷酶是经过分析对比整合得到的如SEQ No.1所示氨基酸序列的α‑葡萄糖苷酶，其核苷酸序列如SEQ No.2所示，该酶能够将L‑AA转化为单一的AA‑2G，无副产物生成。本发明所述的α‑糖苷酶可工业应用，反应条件简单且时间短，并且产物单一易于纯化。本发明的α‑糖苷酶和使用该酶生产AA‑2G的方法可以为酶法生成AA‑2G提供新思路。

Description

一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种枸杞来源的α-糖苷酶及其在生产2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用。

背景技术

α-糖苷酶即α-葡萄糖苷酶(α-glycosidase)为淀粉水解酶类中的一种，它可从多糖的非还原末端水解底物的α-葡萄糖苷键，产生α-D-葡萄糖，该酶还具备转糖苷酶活性，能够以麦芽糖等糖基供体，催化糖基化反应，修饰多种含羟基的受体化合物。目前，α-葡萄糖苷酶已广泛应用于包括淀粉水解、酒精发酵和化学合成等技术领域。但是目前开发出的工业应用类α-葡萄糖苷酶，尤其是具备较高的转糖苷活性的酶类，还十分有限，人们迫切的需要开发出更多，具备工业所需酶学性质的α-葡萄糖苷酶新酶。

维生素C（缩写为VC）又名L-抗坏血酸，具有抑制黑色素合成，促进胶原蛋白合成以及抗氧化等多种生理功能，人体不能自身合成，只能靠食物或药物提供。但是VC本身稳定性很差，其在水溶液中极不稳定；易被空气中的氧和其他氧化剂氧化；暴露于中性pH、热、光和重金属下会快速降解等,从而限制了它在某些领域中的应用。

L-抗坏血酸葡萄糖苷（AA-2G）是维生素C的一种衍生物，是公认的最为稳定的VC衍生物，VC分子上2位C上的羟基被吡喃型葡萄糖苷取代，经过皮肤上α-葡萄糖苷酶的作用，L-抗坏血酸葡萄糖苷所含的VC可慢慢被水解出来，逐渐发挥VC的生理活性功能，水解后的VC与天然VC有完全相同的结构和生理活性。

利用糖基转移酶的特异性转糖基作用进行生物转化合成是目前维生素C葡萄糖苷的唯一生产途径。目前所报道的AA-2G生物催化用酶主要有α-葡萄糖苷酶（EC 3 .2 .1.20，α-Glucosidase）、环麦芽糊精葡聚糖转移酶（EC 2 .4 .1 .19，CyclomaltodextrinGlucanotransferase，简称CGTase）、α-淀粉酶（EC 3 .2 .1 .1，α-Amylase）、蔗糖磷酸化酶（EC 2 .4 .1 .7，Sucrose phosphorylas）、葡聚糖蔗糖酶（EC 2 .4 .1 .5，Dextransucrase）、α-异麦芽糖基葡糖基形成酶等六类酶。

CGTas是目前最常用于合成AA-2G的酶，该酶能够以的α-环糊精为底物合成AA-2G。但与麦芽糖、可溶性淀粉等来源广泛的底物相比，α-环糊精的价格相对较高。有研究者利用可溶性淀粉和麦芽糊精等较为廉价的底物，通过CGTase合成AA-2G，但产量较低，普遍在2－3 g/L左右。并且，用CGTase催化首先得到的是AA系列衍生物，还需要经酶解等后处理过程才能获得AA-2G。1990年，NorioMuto等首次发现大米来源的α-糖苷酶能够以成本较低的麦芽糖为糖基供体，特异性催化L-AA合成AA-2G。但相关研究较少。

利用α-糖苷酶催化合成AA-2G具有反应简单，底物价廉易得，且产物单一易于分离纯化的特点。本专利旨在发掘新的生物催化剂α-糖苷酶，且用于催化合成AA-2G，为AA-2G生产工艺的多样性及可能性奠定基础。

发明内容

本发明提供一种新的来源于枸杞的α-葡萄糖苷酶，所述α-葡萄糖苷酶包含SEQNo.1所示的氨基酸序列。

所述来源于枸杞的α-葡萄糖苷酶能够将L-AA转化为AA-2G。

本发明提供编码该酶的多核苷酸，所述核苷酸序列如SEQ No.2所示。

一种携带该多核苷酸的重组载体。

含有该重组载体的重组细胞。

用于生产AA-2G的组合物，所述组合物包含选自由以下组成的组中的一种及以上：酶、编码所述酶的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体和含有所述重组载体的重组细胞。

使用选自由以下组成的组中的一种及以上生产AA-2G的方法；酶、编码所述酶的多核苷酸、携带所述多核苷酸的重组载体和含有所述重组载体的重组细胞。

对枸杞果实进行转录组测序分析，将序列结果与NR、NT、SwissProt、KOG、KEGG、GO、InterPro功能数据库进行比对注释，确定出一条功能注释为α-糖苷酶的多核苷酸序列。

另外，将该多核苷酸插入重组载体中，并使其表达以提供具有由L-AA生产AA-2G的活性的酶，从而完成了本发明。

在本发明中，鉴定功能未知的蛋白的氨基酸序列和编码该蛋白的基因的核苷酸序列，该蛋白被认为是能够对多种糖基供体经转糖基作用催化L-AA生成AA-2G的α-糖苷酶。因此，本发明的一个方面涉及该基因和该蛋白在生产AA-2G中的用途以及该蛋白作为α-糖苷酶的用途。

本发明所获得的α-糖苷酶的最适反应温度范围为30℃-45℃，最适pH条件为pH5.5或pH 8.0，比酶活力最高可达8.3 U/mg。该酶在酸性或碱性条件下均能保持较高的活性，pH耐受范围广。

一种实施方式提供了一种蛋白，该蛋白包含SEQ NO.1所示的氨基酸序列，或基本由该氨基酸序列组成。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的α-葡萄糖苷酶还包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No.1所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如通过在末端添加标签序列，如His-tag 或Strep-tag 而衍生的蛋白质。

α-糖苷酶包含SEQIDNO.1所示的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成，并且具有将L-AA转化为AA-2G的活性。该酶可能具有α-糖苷酶活性。例如，该蛋白或该酶可以得自（源自）枸杞果实，但是不限于此。

该蛋白或该酶可以具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，但是只要该氨基酸序列保留将L-AA转化为AA-2G的活性（例如，α-糖苷酶的转糖基活性），就可通过置换、插入和/或缺失使其突变。例如，该蛋白或该酶可以再保留将L-AA转化为AA-2G的活性的情况下包含与SEQIDNO.1的氨基酸序列具有80%或更高、90%或更高、95%或更高、98%或更高或99%或更高的同源性的氨基酸序列。

本发明提供编码包含SEQIDNO.1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白的多核苷酸。此外，本发明的又一方面提出包含（携带）编码该蛋白的多核苷酸的重组载体。本发明的又一方面提出含有（包含）该重组载体的重组细胞，即用该重组载体转化的细胞。因此，该重组细胞可以表达所述蛋白。

编码该蛋白的多核苷酸可以包含以下，或基本由以下组成：SEQID NO.2所示的核苷酸序列或与SEQ NO.2具有基本同一性的核苷酸序列。如本文所使用的，术语“基本同一性”是指，如通过比对程序所分析的，多核苷酸包含与参考序列相比具有至少80%序列同一性、至少90%序列同一性、至少95%序列同一性、至少98%序列同一性、至少99%序列同一性或100%序列同一性的序列，并且通过该多核苷酸序列编码的蛋白保留将L-AA转化为AA-2G的活性。本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。

多核苷酸可以自身单独使用，或者可以以被重组载体携带的方式使用。术语“重组载体”是指能够递送可操作地连接感兴趣的多核苷酸的重组核酸分子。可以使用本领域公知的方法将重组载体构建为克隆或表达用载体。任何适合在基因重组中使用的载体都可以用作重组载体。详细地，重组载体可以适于在毕赤酵母中表达，并且可以基于选自由pAO、pGAP、pPIC和pPINK组成的组中的一种进行构建。

只要具有允许蛋白表达（过量表达）的表达系统，任何微生物都可以用作重组载体转化为的宿主细胞。例如，毕赤酵母。毕赤酵母的实例包括但不限于：GS115、X-33、KM71、KM71H、SMD1168和SMD1168H。此外，宿主细胞还可以是大肠杆菌，如BL21、JM109等。

如上所述，包含SEQ NO.1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白具有将L-AA转化为AA-2G的活性的酶蛋白。因此，该包含SEQIDNO.1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白或表达该蛋白的重组细胞可以有用地用于AA-2G的生产。

本发明的再一方面，提出一种用于生产AA-2G的组合物，包含选自由以下组成的组中的一种及以上：包含SEQ NO.1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白、编码该蛋白的多核苷酸、携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、该重组细胞的培养物、该重组细胞的培养物上清液和该重组细胞的裂解物。用于生产AA-2G的组合物可以用于由用作底物的L-AA生产AA-2G。含有由重组细胞生产的酶蛋白的该培养物可以包含有该重组细胞、或者可以另外为不含细胞的形式。所述裂解物可以来源于重组细胞的裂解或可以包含通过使裂解物离心得到的上清液，以使其在任何一种情况下都含有由重组细胞产生的酶蛋白。除非本文另作说明，重组细胞是指选自由菌株的细胞群、菌株的培养物和菌株的裂解物组成的组中的至少一种。

根据本发明的又一方面，本发明提供一种使用选自以下中的至少一种生产AA-2G的方法：包含SEQ NO.1的氨基酸序列或基本由该氨基酸序列组成的蛋白、编码该蛋白的多核苷酸、携带该多核苷酸的重组载体、含有该重组载体的重组细胞、该重组细胞的培养物、该重组细胞的培养物上清液和该重组细胞的裂解物（下文统称为“酶蛋白”）。该生产AA-2G的方法包括酶蛋白与L-AA及糖供体的反应。在一种实施方式中，酶蛋白与L-AA及糖供体的反应可以通过使酶蛋白与L-AA及糖供体接触来进行。

在本发明的一种实施方式中，将原始载体pPIC9K上的AOX1启动子替换成GAP启动子，成功构建表达载体pGAP9K；并将如SEQ ID NO.2所示的多核苷酸序列克隆至表达载体pGAP9k上，并以Pichia pastoris GS115为表达宿主，成功将来源于枸杞的α-糖苷酶分泌表达。将重组α-糖苷酶用于制备AA-2G，在酶反应条件（37℃、pH 5.5、加酶量10 U/mL、麦芽糖浓度100g/L、L-AA浓度35g/L、反应时间8h）下，重组α-糖苷酶催化L-AA生成AA-2G的产量达到8.9g/L，转化率为25.5%。

有益效果：本发明所述的α-糖苷酶是具有生产AA-2G的活性的酶，在工业可应用的条件下成本低廉，反应条件简单且时间短，并且产物单一易于纯化。因此，本发明的α-糖苷酶和使用该酶生产AA-2G的方法可以为酶法生成AA-2G提供新思路。

附图说明

图1表达载体pPIC9k的部分图谱；其中a)是原始表达载体pPIC9k的部分图谱；b)是本发明用于表达α-糖苷酶蛋白的重组载体的部分图谱；

图2是根据本发明的一种实施方式的pGAP9K-AGL摇瓶发酵SDS-PAGE电泳图，M，Takara SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中分子量标准蛋白；1：摇瓶发酵后分泌表达的重组α-糖苷酶。红色箭头标注为目的蛋白；

图3是根据本发明的一种实施方式的利用α-糖苷酶催化生成AA-2G的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面的实例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：对枸杞发育过程中的果实进行转录组测序分析

以枸杞发育过程中的绿果和红果作为组织样本，并从中提取总RNA样品。对所获得的样品总RNA进行mRNA的分离及富集后，反转录成cDNA后构建cDNA文库，并对所有的单链DNA分子进行测序，获得测序结果，并对其整理分析，挖掘出枸杞中新的α-糖苷酶基因。

对获得的转录组原始数据进行质量评价前，需将含有低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads去除得到cleanreads以保证结果的可靠性。

使用软件Trinity对clean reads(去除 PCR 重复以提高组装效率)进行de novo组装, 然后使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余，得到Unigene，并将其与公共数据库进行比较。

枸杞发育过程中基因差异表达，通过筛选指标FDR小于0.01，Log2FC大于1作为差异基因的筛选条件，得到一定数目的上调差异表达基因或者下调差异表达基因。

对总的差异表达基因的KEGG和GO功能分析，对上调表达的差异基因的KEGG和GO注释分析。根据KEGG和GO功能分析，设定筛选标准，筛选出满足P值小于0.05，Log2FC大于2，基因长度大于600bp，覆盖度大于85％，同源度大于80％的多个unigene，并对其基本功能和参与调节的信号通路进行分类。在进行筛选时可结合目前已有文献报道的序列进行综合对比筛选，验证筛选出的差异表达基因以确保筛选准确性。

实施例2 α-糖苷酶的基因分离

2-1. 用于扩增感兴趣的基因的合成引物的设计

为了设计在扩增编码具有α-糖苷酶活性的蛋白的基因中使用的DNA引物，进行了以下试验。在蛋白BLAST搜索（UniProt）的基础上，选择已表征确定为α-糖苷酶的序列（登记号：O43451、P10253、Q9BE70、Q653V7、Q12558和Q43763）及基于实施例1筛选出的枸杞转录组中差异表达基因，鉴定出这些酶在邻近5’和3’端的区域中共同具有部分保守核苷酸序列。

使用覆盖α-糖苷酶基因的5’和3’端的保守区域的基因的DNA片段来建立编码全部α-糖苷酶的基因的完整DNA序列。

基于上述基因，合成了下面的SEQIDNO.3、4、5和6的兼并引物，用于在扩增编码具有α-糖苷酶活性的蛋白的DNA中使用。

SEQ IDNO.3：5’ CCCTCTGGAGGTGATGTGGACCGACATHGAYTAYAT 3’

SEQ IDNO.4：5’ CCAAGGTGAAGTCCCTGTAGCCGTCCATRTARTCDAT 3’

SEQ IDNO.5：5’ GGTGCCCTTCGACGGCCTGTGGATCGAYATGAAYGA 3’

SEQ IDNO.6：5’ GGCTGGGTCGATGAAGTTGGAGAGYTCRTTCATRTC 3’

2-2. 通过提取枸杞果实的总RNA后构建cDNA文库，并进行PCR来获取编码α-糖苷酶的DNA片段

在含有液氮的研钵中把枸杞果实充分研磨成组织粉末，并于每100 mg组织样品中加入1mL Trizol，混匀后离心并转移上层水相于EP管中。每1mL Trizol中加入200 μl氯仿后，上下翻转混匀后离心，混合物分为三层，其中，总RNA主要集中在上层水相中。转移上层水相并依次使用异丙醇和75%乙醇混匀后离心，最后得到RNA沉淀，并用Nulease-freewater溶解。对获得的总RNA用1%琼脂糖凝胶确定RNA状态，并利用紫外分光光度计测定其在260nm和280 nm处的吸收值，用比值来确定RNA的质量。

利用1st Strand cDNA合成试剂盒（Takara Biomedical Technology Co.）以上述所获总RNA为模板，构建cDNA文库。并用所获得的cDNA用作模板，使用合成的DNA引物对SEQID NO.3和4或SEQ ID NO.5和6通过PCR扩增感兴趣的基因。在热循环仪（Biometra.Co.）中进行PCR，以95℃持续30秒、65℃持续45秒和72℃持续4分钟进行30次循环。在将2μl的PCR产物加样到1%琼脂糖凝胶上后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，在约3kb处检测到PCR产物。

对DNA片段进行碱基序列测定鉴定出编码α-糖苷酶的多核苷酸序列，其序列结果如SEQ NO.2所示。

实施例3 α-糖苷酶基因的克隆

以pPIC9K（参见图1-a）作为原始表达载体，将GAP启动子插入到限制性酶切位点SacI和BamHI中间替换原AOX1启动子，并将获得的表达载体命为pGAP9K。将通过PCR得到的多核苷酸（SEQ ID NO.2）利用同源重组的方法插入到载体pGAP9k的限制性酶切位点EcoRI，并在序列N端加上6-His标签（参见图1-b）。

通过化学转化的方法将经上述获得的重组载体转化到大肠杆菌DH5α中进行质粒的复制与扩增；在通过质粒抽提试剂盒（VazymeCo.）获得质粒后，经限制性内切酶PshAI（New England Biolabs）酶切消化后得到线性化重组载体，并通过电转化法重组到毕赤酵母GS115的基因组中。

将由此获得的转化体经G418筛选及菌落PCR鉴定后得到的重组毕赤酵母单菌落接种到YPD培养基中，30℃、200rpm，培养24h；将培养液按10%的接种量接种到BMGY培养基中，先于30℃、200rpm，培养18h，离心，弃上清，收集菌体，用新鲜BMGY培养基重悬菌体，中间补充终浓度为1%葡萄糖作为碳源，30℃、200rpm，培养72-90h，发酵液经离心后，上清液即为重组α-糖苷酶粗酶液（参见图2）。

实施例4：温度对α-糖苷酶的影响

α-糖苷酶酶活测定：在100 μl反应体系中（25 mM麦芽糖，100 mM乙酸缓冲，pH5.0）加入20 μg粗酶液启动反应，反应在37℃水浴锅条件下进行，10 min后反应液经95℃水浴加热7 min后终止反应。后利用葡萄糖氧化酶法检测样品中生成的葡萄糖的量。

α-糖苷酶的酶活定义为：在上述条件下，每分钟水解1 μmol底物所需的酶量称为一个酶活力单位（U）。

将20 μg经实施例3得到的重组α-糖苷酶加至100 μl反应体系中（25 mM麦芽糖，100 mM磷酸钠缓冲，pH 5.0），在不同的温度（37℃、50℃、60℃、70℃）条件下反应10 min，反应液经95℃水浴加热7 min终止反应，利用葡萄糖氧化酶法检测样品中生成的葡萄糖的量，每个反应做三组平行样。取酶活最高的一组作为相对酶活100%。

将20 μg经实施例3得到的重组α-糖苷酶，在不同的温度（37℃、50℃、60℃、70℃）条件下孵育一段时间（15、30和60 min）后，加至100 μl反应体系中（25 mM麦芽糖，100 mM磷酸钠缓冲，pH 5.0）于37℃反应10 min，反应液经95℃水浴加热7 min终止反应，利用葡萄糖氧化酶法检测样品中生成的葡萄糖的量，每个反应做三组平行样。取酶活最高的一组作为相对酶活100%。

该酶在60℃条件下，比酶活力最高且达7.6 U/mg，但在60℃温育30 min和60 min后，分别保持其初始活性的49.5%和34.3%；在37℃温育60 min后，其活性仍保持在80%以上。因此，该酶的最适反应温度为30℃-45℃。

实施例5 pH对α-糖苷酶的影响

将20 μg经实施例3得到的重组α-糖苷酶加至不同pH（4.0-9.0）的100 μl反应体系中（25 mM麦芽糖，100 mM磷酸钠缓冲）37℃反应10 min，反应液经95℃水浴加热7 min终止反应，利用葡萄糖氧化酶法检测样品中生成的葡萄糖的量，每个反应做三组平行样。取酶活最高的一组作为相对酶活100%。

该酶在酸性或碱性条件下均能保持较高的活性，且在pH为8.0或pH 5.5条件下酶活力较高，为8.3 U/mg；并在pH 7.0条件下无明显催化活性。

实施例6 α-糖苷酶催化合成AA-2G

AA-2G的高效液相色谱（HPLC）检测：色谱柱为Agilent 5 TC-C18柱，5 μm（φ250×4 .6 mm）。紫外检测波长为 238 nm。流动相为 1 %的甲醇，用磷酸调pH至 2 .0，流速 0 .8mL/min，时间为10 min，进样量10 μL，柱温为 25 ℃。HPLC图谱中AA-2G的峰面积和浓度成正比，以此绘制AA-2G标准曲线。利用标准曲线及样品中的AA-2G的峰面积，得出样品中AA-2G的浓度。

利用经实施3获得的α-糖苷酶粗酶液进行催化反应。200 μl反应体系中包含267mM麦芽糖，178 mM L-AA，13 mM硫脲，pH 5.5的100 mM 乙酸缓冲，加入10 U/mL粗酶液，在37℃避光条件下反应12h，每4小时取样，加入800 μl 1.06%偏磷酸终止反应。产物用HPLC进行检测（图3），反应产物单一，易于纯化。

本研究确定了不同反应时间、pH 5.5、37℃反应条件下AA-2G的产量，得出反应8h后，AA-2G的产量达到最高8.9 g/L，转化率为25.5%。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种来源于枸杞的糖苷酶及其应用

<141> 2020-12-02

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 890

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Met Lys Pro Thr Gln Phe Ser Ser Leu Leu Thr His Thr Phe Phe Phe

1 5 10 15

Ile Phe Leu Ser Ile Leu Ser Pro His Ser Asp Ala Ile Ser Ile Lys

20 25 30

Asp Gln Glu Pro Gln Gln Gln Val Ile Gly Tyr Gly Tyr Ser Val Thr

35 40 45

Ser Val Ala Ile Asp Ser Thr Gly Asn Ser Leu Phe Ala Asn Leu Gln

50 55 60

Leu Ile Asn Asn Ser Ser Val Phe Gly Pro Asp Ile Gln Asn Leu Ile

65 70 75 80

Leu Ile Ala Ser Leu Glu Thr Asn Asp Arg Leu Arg Ile Arg Ile Thr

85 90 95

Asp Thr Asn Arg Gln Arg Trp Glu Val Pro Gln Asp Ile Leu His Arg

100 105 110

Pro Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ser Thr Thr Thr His Ser His His Asn

115 120 125

Thr Thr Leu Ser Asn Thr Asn Ser Asp Leu His Phe Thr Leu His Asn

130 135 140

Thr Thr Pro Phe Thr Phe Thr Val Gln Arg Arg Ser Thr Asn Asp Thr

145 150 155 160

Leu Phe Asn Asn Thr Leu Leu Ile Phe Lys Asp Gln Tyr Ile His Ile

165 170 175

Ser Ser Ser Leu Pro Ala Thr Arg Ala Asn Leu Tyr Gly Leu Gly Glu

180 185 190

His Thr Lys Ala Thr Phe Lys Leu Lys His Asn Gln Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Trp Asn Ala Asp Val Gly Ser Ser Asn Val Asp Val Asn Leu Tyr Gly

210 215 220

Ser His Pro Phe Tyr Met Asp Val Arg Glu Gly Gly Val Ser His Gly

225 230 235 240

Val Leu Phe Met Ser Ser Asn Gly Met Asp Val Val Tyr Thr Gly Asp

245 250 255

Arg Ile Ser Tyr Lys Val Ile Gly Gly Leu Ile Asp Leu Tyr Phe Phe

260 265 270

Ala Gly Pro Leu Pro Asp Met Val Val Asp Gln Tyr Thr Gln Leu Ile

275 280 285

Gly Arg Pro Ala Pro Met Pro Tyr Trp Ser Phe Gly Phe His Gln Cys

290 295 300

Arg Trp Gly Tyr Lys Asn Ile Asp Asp Ile Glu Leu Val Val Asp Ser

305 310 315 320

Tyr Ala Lys Ala Gly Ile Pro Leu Glu Val Met Trp Ser Asp Ile Asp

325 330 335

Tyr Met Asp Gly Phe Lys Asp Phe Thr Leu Asp Pro Val Asn Phe Pro

340 345 350

Leu Glu Arg Val Lys Ser Phe Leu Arg Lys Leu His Gln Asn Asp Lys

355 360 365

Lys Tyr Val Leu Ile Val Asp Pro Gly Ile Ser Ile Asn Asn Thr Tyr

370 375 380

Asp Thr Tyr Arg Arg Gly Met Glu Ala Asp Val Phe Ile Lys Arg Asp

385 390 395 400

Asn Met Pro Tyr Gln Gly Val Val Trp Pro Gly Asn Val Tyr Tyr Pro

405 410 415

Asp Phe Leu Asn Pro Ala Thr Gly Ile Phe Trp Arg Tyr Glu Ile Glu

420 425 430

Lys Phe Gln Asp Leu Val Pro Phe Asp Gly Leu Trp Leu Asp Met Asn

435 440 445

Glu Leu Ser Asn Phe Ile Thr Ser Pro Pro Thr Pro Ser Thr Thr Phe

450 455 460

Asp Asp Pro Pro Tyr Lys Ile Asn Asn Ser Gly Asp His Leu Pro Ile

465 470 475 480

Asn Tyr Arg Thr Val Pro Ala Thr Ser Thr His Phe Gly Asn Lys Met

485 490 495

Glu Tyr Asn Val His Asn Leu Tyr Gly Leu Leu Glu Ser Arg Ala Thr

500 505 510

Tyr Asn Val Leu Val Asn Val Thr Gly Lys Arg Pro Phe Ile Leu Ser

515 520 525

Arg Ser Thr Phe Leu Gly Ala Gly Arg Tyr Thr Ser His Trp Thr Gly

530 535 540

Asp Asn Ala Ala Thr Trp Asn Asp Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Thr Ile

545 550 555 560

Leu Asn Phe Gly Leu Phe Gly Ile Pro Met Ile Gly Ala Asp Ile Cys

565 570 575

Val Phe Ser Arg Asn Thr Thr Glu Glu Leu Cys Arg Arg Trp Ile Gln

580 585 590

Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Ala Arg Asp His Ser Ala Lys Asp Thr

595 600 605

Thr Ser Gln Glu Leu Tyr Leu Trp Glu Ser Val Ala Ala Ala Ala Lys

610 615 620

Lys Val Leu Gly Leu Arg Tyr Gln Leu Leu Pro Tyr Phe Tyr Met Leu

625 630 635 640

Met Tyr Glu Ala His Thr Lys Gly Thr Pro Ile Ala Arg Pro Leu Phe

645 650 655

Phe Ser Phe Pro Gln Asp Thr Asn Thr Tyr Asp Ile Ser Thr Gln Phe

660 665 670

Leu Leu Gly Lys Gly Val Met Ile Ser Pro Val Leu Lys Gln Gly Ala

675 680 685

Thr Ser Val Asp Ala Tyr Phe Pro Ala Gly Asn Trp Phe Asp Leu Phe

690 695 700

Asn Tyr Ser Arg Phe Val Ser Leu Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Thr Leu

705 710 715 720

Asp Ala Pro Ala Asp Tyr Ile Asn Val His Val Arg Glu Gly Asn Ile

725 730 735

Leu Ala Met Gln Gly Glu Ala Met Thr Thr Gln Ala Ala Arg Arg Thr

740 745 750

Ala Phe Lys Leu Leu Val Val Leu Ser Ser Ser Gly Asn Ser Thr Gly

755 760 765

Gly Leu Phe Val Asp Asp Asp Asp Glu Val Gln Met Gly Arg Glu Gly

770 775 780

Gly Arg Trp Thr Leu Val Arg Phe Ser Gly Asn Ile Ile Gly Asn Lys

785 790 795 800

Ile Val Val Lys Ser Glu Val Val Asn Gly Gln Tyr Ala Leu Asp Gln

805 810 815

Gly Leu Val Leu Glu Lys Val Thr Leu Leu Gly Leu Lys Asn Val Arg

820 825 830

Gly Leu Lys Gly Tyr Glu Leu Val Cys Cys Met Glu Ser Asp Gln Gln

835 840 845

Gly Asn Thr Thr Met Lys Glu Asn Ile Glu Gln Ser Ala Gln Phe Ala

850 855 860

Thr Val Glu Ile Ser Gly Met Ser Ile Leu Val Gly Lys Glu Phe Lys

865 870 875 880

Leu Glu Ile Leu Ser Pro Ile Asn Val Ile

885 890

<210> 2

<211> 2676

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

atgaaaccaa cacaattttc atctttacta acacacacct tcttttttat cttcttatca 60

attctttcac cccattctga tgccatttct attaaggatc aagaaccaca acaacaagtt 120

attggttacg gttattctgt tacttctgtt gctattgatt ctactggtaa ctctttgttc 180

gctaatttgc aattgattaa caattcttct gttttcggtc ctgatatcca aaacttgatc 240

ttgatcgctt ctttggaaac taacgataga ttgagaatta gaatcactga tactaacaga 300

caaagatggg aggttccaca agatattttg catagaccac ctccaccttc tccaccttct 360

actactactc actctcatca caacactact ttgtctaaca ctaattctga tttgcatttc 420

actttgcata acactactcc ttttactttc actgttcaaa gaagatctac taacgatact 480

ttgtttaaca acactttgtt gattttcaag gatcaatata ttcatatttc ttcttctttg 540

ccagctacta gagctaactt gtacggtttg ggtgaacata ctaaagctac tttcaagttg 600

aaacacaacc aaactttgac tatttggaat gctgatgttg gttcttctaa cgttgatgtt 660

aatttgtacg gttctcatcc attctacatg gatgttagag agggtggtgt ttctcacggt 720

gttttgttca tgtcttctaa tggtatggat gttgtttaca ctggagatag aatctcttac 780

aaggttattg gtggtttgat cgatttgtac tttttcgctg gtccattgcc tgatatggtt 840

gttgatcaat acactcaatt gattggtaga ccagctccta tgccatattg gtcttttggt 900

ttccatcaat gtagatgggg ttacaagaac atcgatgata tcgaattggt tgttgattct 960

tacgctaaag ctggtattcc tttggaggtt atgtggtctg atatcgatta catggatggt 1020

tttaaagatt tcactttgga tcctgttaac tttccattgg aacgtgttaa gtctttcttg 1080

agaaagttgc accaaaacga taagaaatac gttttgatcg ttgatccagg tatctctatt 1140

aacaacactt acgatactta tagacgtggt atggaggctg atgtttttat taagagagat 1200

aacatgcctt atcaaggtgt tgtttggcct ggtaacgttt actatcctga tttcttgaat 1260

ccagctactg gtattttctg gagatacgaa atcgagaagt tccaagattt ggttcctttc 1320

gatggtttgt ggttggatat gaacgaattg tctaacttca tcacttctcc acctactcca 1380

tctactactt tcgatgatcc accttacaag attaacaact ctggagatca tttgcctatt 1440

aactacagaa ctgttccagc tacttctact cattttggta acaagatgga atacaacgtt 1500

cacaatttgt atggtttgtt ggagtctaga gctacttaca acgttttggt taacgttact 1560

ggtaaaagac cttttatttt gtctagatct actttcttgg gtgctggtag atatacttct 1620

cactggactg gagataacgc tgctacttgg aatgatttgg cttactctat ccctactatc 1680

ttgaacttcg gtttgttcgg tattccaatg attggtgctg atatctgtgt tttctctaga 1740

aacactactg aagagttgtg tagaagatgg attcaattgg gtgcttttta tccattcgct 1800

agagatcatt ctgctaagga tactacttct caagaattgt acttgtggga gtctgttgct 1860

gctgctgcta agaaagtttt gggtttgaga taccaattgt tgccttactt ctatatgttg 1920

atgtatgaag ctcacactaa aggtactcct attgctagac cattgttttt ctctttccca 1980

caagatacta acacttacga tatctctact caattcttgt tgggtaaagg tgttatgatt 2040

tctcctgttt tgaaacaagg tgctacttct gttgatgctt attttccagc tggtaactgg 2100

ttcgatttgt tcaattactc tagattcgtt tctttgaacc agggtaatta caagactttg 2160

gatgctcctg ctgattacat caacgttcat gttagagaag gtaatatttt ggctatgcaa 2220

ggagaggcta tgactactca agctgctaga agaactgctt ttaaattgtt ggttgtcttg 2280

tcttcttctg gtaattctac tggtggtttg ttcgttgatg atgatgatga agttcaaatg 2340

ggtagagagg gtggtagatg gactttggtt agattttctg gtaacatcat cggtaataag 2400

atcgttgtta aatctgaagt tgttaacggt caatatgctt tggatcaagg tttggttttg 2460

gagaaggtta ctttgttggg tttgaagaat gttagaggtt tgaaaggtta cgaattggtt 2520

tgttgtatgg agtctgatca acagggtaac actactatga aggaaaacat cgagcaatct 2580

gctcaattcg ctactgttga aatctctgga atgtctatct tggttggtaa agagtttaag 2640

ttggagattt tgtctccaat taacgttatt taatga 2676

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

ccctctggag gtgatgtgga ccgacathga ytayat 36

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ccaaggtgaa gtccctgtag ccgtccatrt artcdat 37

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 5

ggtgcccttc gacggcctgt ggatcgayat gaayga 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

ggctgggtcg atgaagttgg agagytcrtt catrtc 36

Claims

1.一种来源于枸杞的α-葡萄糖苷酶，其特征在于，所述α-葡萄糖苷酶包含SEQ No.1所示的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述α-葡萄糖苷酶。

3.一种重组载体，其携带权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种重组细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的重组载体或含有权利要求2所述多核苷酸序列，可表达得到权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶。

5.一种生产α-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于，采用权利要求4所述重组细胞发酵产酶。

6.一种用于生产2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的方法，其特征在于，以麦芽糖作为糖基供体，L-AA作为糖基受体，在含有权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶转糖基作用下，生成2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应在pH 5.5条件下进行。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应在37℃的温度下进行。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应中以150-300 mM麦芽糖和L-AA为底物与5-10 U/mL酶进行转化反应，温育反应1-12小时，转化生成AA-2G。