CN105267231A

CN105267231A - L-抗坏血酸基糖苷类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN105267231A
Application number: CN201510699082.8A
Authority: CN
Inventors: 马济美; 江洪; 谢凌云; 贾蕊祯; 董洁; 曾贞; 李子龙; 孙林皓
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-10-22
Filing date: 2015-10-22
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2035-10-22
Also published as: CN105267231B

Abstract

本发明涉及L-抗坏血酸基糖苷类化合物，如2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸、3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸等，在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。此类化合物对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制活性，效果接近伏格列波糖，因此可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂开发应用。

Description

L-抗坏血酸基糖苷类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及L-抗坏血酸基糖苷类化合物的新用途，尤其是在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的新用途。

背景技术

糖尿病是目前危害人类身体健康甚至生命的最严重的慢性疾病之一，据国际糖尿病联合会统计，2010年全世界有2.85亿人患有糖尿病，到2030年预计患者数量可能达到4.38亿(Cytotechnology2015,67,653)。糖尿病分为I型糖尿病(胰岛素依耐型型)和II型糖尿病(非胰岛素依耐型)，90％以上的患者属于II型糖尿病，目前主要的治疗方式是通过抑制糖苷水解酶来控制血糖。糖苷酶抑制剂能延缓糖分消化吸收，控制餐后血糖急剧升高，以达到平衡血糖浓度的目的，目前临床上葡萄糖苷酶抑制剂药物有阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，但是这几种药物也存在一定的副作用，会引起腹胀腹泻、腹痛和肝脏损害(FoodChem.2016,190,207)，因此有必要继续开发新的高效无副作用的抗糖尿病药物，而从天然产物中发现有效成分是当前医药开发的选择之一。

2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸是一种从我国传统中药枸杞干果中提取出来的糖苷类化合物，是天然的维生素C前体类物质，安全性高。研究表明，2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸表现出比维生素C更好的抗氧化性，(Biosci.Biotechnol.Biochem.2008,72,1558；实用医学杂志2011,27,11)，但目前尚未见此类物质具有糖苷酶抑制活性的研究报道。含L-抗坏血酸基的β-糖苷类化合物在体内只能被β-葡萄糖苷酶水解(J.Agric.FoodChem.2004,52,2092)，不同于α-葡萄糖苷酶广泛存在于人体各消化器官中，β-葡萄糖苷酶主要只存在于小肠组织和肝肾的胞浆中(FEBSLett.1998,436,71)，所以含L-抗坏血酸基的β-糖苷类化合物在人体内水解缓慢，本身对血糖影响较小，而自身糖苷的结构特点决定其可能具有糖苷酶抑制活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一类L-抗坏血酸基糖苷类化合物，如2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2βG)，3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-3βG)和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸(AA-2βGal)等，作为α-葡萄糖苷酶抑制剂的新用途。

本发明的2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸可根据文献方法(中国新药杂志，2007，16，689)从枸杞干果中提取，或通过以下方法合成：3-O-苄基-5,6-O-异丙叉基抗坏血酸与四乙酰基溴代葡萄糖发生糖苷化反应得到2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-3-O-苄基-L-抗坏血酸，然后依次在醋酸水溶液中脱除异丙叉基、催化氢化脱除苄基、甲醇钠脱除乙酰基，最后用酸性阳离子交换树脂酸化得到2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸。3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸通过类似方法制得。三种化合物的结构式如下：

我们测试了2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，实验结果表明，三种化合物对α-葡萄糖苷酶均有显著的抑制作用，极有可能进一步发展为有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

具体实施方式

实施例1

2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的制备

将3-O-苄基-5,6-O-异丙叉基抗坏血酸(3.06g,10mmol)和四乙酰基溴代葡萄糖(4.94g,12mmol)加入到60mL二氯甲烷和水混合溶剂中，随后加入K₂CO₃(1.66g,12mmol)和TBABr(12mmol)，室温下搅拌反应5小时。分液，水相用二氯甲烷萃取1次，合并有机相，用柠檬酸溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤1次，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，柱层析分离得到2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-3-O-苄基-L-抗坏血酸(5.09g,80％)。

2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-3-O-苄基-L-抗坏血酸(2g,3.14mmol)溶于50mL乙酸水溶液，80℃反应1小时。冷却后，在反应体系中加入50mL乙酸乙酯，依次用水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，溶于乙酸乙酯，加入到盛有0.20g10％Pd/C湿剂的圆底烧瓶中，氢气氛围下室温反应2.5小时后，减压过滤，滤液旋干，过柱，得到2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-抗坏血酸(1.43g，90％)。

将2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-抗坏血酸(0.51g,1mmol)溶于30mL的甲醇中，加入甲醇钠(21.6mg，0.4mmol)，在室温下反应4小时。反应结束加入732阳离子交换树脂室温搅拌40分钟。减压过滤，滤液浓缩旋干得到2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(0.32g，95％)。¹HNMR(400MHz,D₂O)δ4.72(d,J＝7.8Hz,1H),4.56(d,J＝1.6Hz,1H),4.04(dt,J＝6.6,1.6Hz,1H),3.85(dd,J＝12.8,1.6Hz,1H),3.74-3.70(m,3H),3.55-3.48(m,1H),3.46-3.40(m,3H)。

实施例2

3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的制备

将5,6-O-异丙叉基抗坏血酸(2.00g,9.26mmol)加入到60mLDMF中，随后加入K₂CO₃(1.92g,14mmol)和四乙酰基溴代葡萄糖(5.71g,14mmol)，室温下搅拌反应10小时。停止反应，反应体系用乙酸乙酯萃取，有机相依次用柠檬酸溶液、饱和食盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，柱层析分离得到3-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-5,6-O-异丙叉基抗坏血酸(3.31g,65％)。

在3-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-5,6-O-异丙叉基抗坏血酸(1.05g)中加入乙酸溶液65mL，80℃下反应2.5h。反应停止，向反应体系中加入50mL乙酸乙酯萃取产物，分液，有机相依次用水、饱和NaHCO₃溶液洗涤至有机相为中性，加入MgSO₄干燥，过滤，旋干，柱层析分离得到化合物3-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-抗坏血酸(0.79g，80％)。

将3-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-抗坏血酸(0.15g，0.291mmol)溶于15mL甲醇，随后加入甲醇钠(6.28mg，0.116mmol)室温下搅拌反应6小时。然后加入阳离子交换树脂，搅拌约1小时。过滤，收集溶液，旋干，得到3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，产率98％。¹HNMR(400MHz,D₂O)δ5.43(d,J＝7.7Hz,1H),5.01(d,J＝1.6Hz,1H),4.08(dt,J＝6.8,1.6Hz,1H),3.88(dd,J＝12.6,2.2Hz,1H),3.76-3.68(m,3H),3.55-3.41(m,4H)。

实施例3

2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸的制备

将3-O-苄基-5,6-O-异丙叉基抗坏血酸(2.45g,8mmol)和四乙酰基溴代半乳糖(3.95g,9.6mmol)加入到50mL60mL二氯甲烷和水混合溶剂中，室温均匀搅拌下，加入K₂CO₃(1.33g,9.6mmol)和TBABr(12mmol)，继续搅拌反应5小时。分液，水相用二氯甲烷萃取1次，合并有机相，用柠檬酸溶液洗涤两次，再用饱和食盐水洗涤1次，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，柱层析分离得到2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-3-O-苄基-L-抗坏血酸(3.87g,76％)。

2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-3-O-苄基-L-抗坏血酸(1.91g,3mmol)溶于50mL乙酸水溶液，80℃反应1小时。冷却后，在反应体系中加入50mL乙酸乙酯，依次用水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，有机相用硫酸镁干燥，过滤，滤液旋干，溶于乙酸乙酯，加入到盛有0.20g10％Pd/C湿剂的圆底烧瓶中，氢气氛围下室温反应2.5小时后，减压过滤，滤液旋干，过柱，得到2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-抗坏血酸(1.34g，88％)。

将2-O-β-D-四乙酰葡萄糖基-L-抗坏血酸(0.51g,1mmol)溶于30mL的甲醇中，加入甲醇钠(21.6mg，0.4mmol)，在室温下反应4小时。反应结束加入732阳离子交换树脂室温搅拌40分钟。减压过滤，滤液浓缩旋干得到2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(0.32g，95％)。¹HNMR(400MHz,D₂O)δ4.68(d,J＝7.1Hz,1H),4.60(d,J＝1.7Hz,1H),4.06-4.02(m,1H),3.92-3.91(m,1H),3.81-3.71(m,4H),3.70-3.63(m,3H)。

实施例4

2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸对α-葡萄糖苷酶的抑制活性测定

1.实验仪器

酶标仪：BioTekElx808

2.试剂

α-葡萄糖苷酶(百灵威，50U)，对硝基酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG，阿拉丁)，伏格列波糖(上海永叶生物科技有限公司)

3.药品与试剂的配制

缓冲溶液：称取9.2897g磷酸氢二钾和13.8500g磷酸氢二钠溶于1L去离子水中中配成0.1M，pH＝6.5缓冲溶液。

对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷(pNPG)底物溶液：称取0.0350g对硝基苯-α-D-葡萄糖吡喃苷，用缓冲溶液定容至50mL，充分溶解摇匀，配制浓度为0.7mg/mL的pNPG溶液备用。

待测样品溶液：称取25mg的待测化合物，用缓冲溶液配制成25mL的溶液(浓度为1mg/mL)，分别取5mL、1mL、0.5mL、0.1mL的上述溶液，采用缓冲溶液配制成10mL的样品溶液备用，浓度分别为0.5mg/ml、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL。

阳性对照溶液：称取25mg的伏格列波糖，用缓冲溶液配制成25mL的溶液(浓度为1mg/ml)，分别取5mL、1mL、0.5mL、0.1mL的上述溶液，采用缓冲溶液配制成10mL的样品溶液备用，浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL。

4.测定方法

采用比色法，通过96孔板在405nm处检测吸光度值。每孔中加入50μL的待测化合物溶液，然后加入缓冲溶液50μL及10μl的酶液(3u/mL)，在37℃恒温条件下保温20min，加入50μL的pNPG溶液，在37℃恒温条件下继续反应15min。加入100μL1M的碳酸钠终止反应。然后用酶标仪在405nm测定吸光度A值。

实验以不加抑制剂为空白对照组，将伏格列波糖作为阳性对照组。

阴性对照组：不加对硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(pNPG)和α-葡萄糖苷酶对照组，在405nm处无明显吸收(排除样品的干扰)。

样品对α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式为：

抑制率(％)＝(A_空白-A_样品)/A_空白×100％

A_样品表示样品的吸光度值，A_空白表示空白的吸光度值。测试样品化合物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC₅₀)由剂量效应曲线得到。

结果显示，2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值分别为0.026mg/mL，0.09mg/mL，1mg/mL(表1)。伏格列波糖是目前临床最有效的α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物，实验得出其IC₅₀值为0.005mg/mL，2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的效果与之接近。

表1四种化合物对α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值

样品	半数抑制浓度(IC₅₀)
		伏格列波糖	0.005mg/mL
AA-2βG	0.026mg/mL
		AA-3βG	0.09mg/mL
AA-2βGal	1mg/mL

实验结论：2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制活性，效果接近伏格列波糖，此类L-抗坏血酸基糖苷类化合物可作为α-葡萄糖苷酶抑制剂开发应用。另外，2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸和3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸是作为食品的枸杞中的成分，安全性高，此类化合物还具有良好的抗氧化作用，应用前景十分广阔。

Claims

1.L-抗坏血酸基糖苷类化合物在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述L-抗坏血酸基糖苷类化合物为2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸或3-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸或2-O-β-D-半乳糖基-L-抗坏血酸。