CN104173412B

CN104173412B - 太子参萃取物的用途

Info

Publication number: CN104173412B
Application number: CN201410215971.8A
Authority: CN
Inventors: 王雅英; 陈芳芳; 王贵弘
Original assignee: Xiamen Medical College
Current assignee: Xiamen Medical College
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2017-10-03
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: CN104173412A

Abstract

本发明公开了一种太子参萃取物的用途，萃取物制备方法为以下萃取方法中的至少一种：1)太子参超临界萃取；2)太子参水萃取；3)太子参95％乙醇萃取。萃取物用于制备皮肤保湿、DNA保护和/或抗炎的制剂或药物或保健品或化妆品。

Description

太子参萃取物的用途

技术领域

本发明涉及太子参Pseudostellaria heterophylla适用于皮肤保湿、DNA保护、抗炎等多种功效用途的萃取物及其用途。

背景技术

太子参为石竹科Caryophyllaceae植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.之干燥块根，以块根入药。又名孩儿参、童参、双批七、四叶参、米参。有补气益血、生津、补脾胃的作用。适于小儿夏季久热不退、饮食不振、肺虚、咳嗽、心悸等虚弱之症以及小儿病后体弱无力、自汗、盗汗、口平等症。分布于贵州、辽宁、河北、山东、安徽、江苏等省，目前以福建省柘荣县产的太子参最为出名。

太子参性平、味甘、微苦，有补气生津的作用，在中医临床上使用非常广泛。一般素有口干、烦躁、心悸、失眠、乏力、食少、手足心热等气阴两虚症状的病人均可使用，它既可与其他药物配伍，又能单味煎水温服。”中华药典”纪载太子参为常用之中药材，具益气健脾、生津润肺之效，临床用于脾虚体倦、食欲不振、气血不足、自汗口渴、肺燥干咳等症，尤其治疗小儿脾虚且食欲不佳的良药。已往药理文献报告显示太子参多醣体具有增强免疫的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在太子参萃取物的用途。

太子参萃取物的用途，其用于制备皮肤保湿、DNA保护和/或抗炎的制剂或药物或保健品或化妆品。

其中，该太子参萃取物为以下萃取物中的至少一种：

1)太子参超临界萃取物；

2)太子参水萃取物；

3)太子参95％乙醇萃取物。

其中，1)太子参超临界萃取物的制备方法为：太子参干品先作破碎前处理，使其为粉末状，置于超临界萃取压力槽中，以纯CO₂萃取，萃取槽压力300-400bar、萃取槽溫度30-70℃、气体流速2-4ml/L，喷嘴温度：40-60℃、连续萃取30-60分钟。

其中，2)太子参水萃取物的制备方法为：太子参水萃取物的制备方法为：太子参干品粉碎后，以重量比1比3-5的太子参与水混合，经加热回流萃取后过滤，滤液以高速离心方式得太子参澄清液，之后加入3-5倍太子参澄清液体积的95％乙醇，此时会有沉淀析出，静置约24小時后抽气过滤，滤液与沉淀物分別收集，经浓缩与冷冻干燥后，滤液干燥物即为水萃取物，沉淀物干燥后即为太子参多糖体。

其中，所述的高速离心可以为4000rpm-10000rpm。优选5000rpm-8000rpm。

其中，太子参95％乙醇萃取物的制备方法为：太子参干品粉碎后，以重量比1比5-8的太子参与95％乙醇量混合浸泡，浸泡两天，每天均以超声波破碎机振动20-40分钟，过滤后，残渣再加入回收95％乙醇浸泡三天，浸泡为重量比1比5-8的太子参残渣与95％乙醇量混合，每天均以超声波破碎机振动20-40分钟，过滤后合并前后两次滤液，经浓缩与冷冻干燥后，滤液干燥物即是所述的太子参95％乙醇萃取物。

其中，超声波功率可以为200W-600W，优选采用300W。

本发明提供了太子参不同于现有技术中的新用途。本发明方法萃取物无细胞毒性，使用安全。太子参粗多醣体的吸湿能力在65％与85％的环境湿度下均比玻尿酸略为优异。太子参95％乙醇萃取物具有DNA保护的能力，而且是在50μg/mL就显现出保护效果。

附图说明

图1为MTT反应机制；

图2为太子参粗多醣体在正常皮肤于27℃、50-55％RH下皮肤水分散失率评估；

图3为太子参水萃取物DNA保护评估结果；

图4为太子参95％乙醇萃取物DNA保护评估结果；

具体实施方式

原料的制备：

1)太子参超临界萃取物

制备方法为：太子参干品先作破碎前处理，使其为粉末状，置于超临界萃取压力槽中，以纯CO₂萃取，萃取槽压力300-400bar、萃取槽溫度30-70℃、气体流速2-4ml/L，喷嘴温度：40-60℃、连续萃取30-60分钟。

2)太子参水萃取物

制备方法为：太子参干品粉碎后，以重量比1比3-5的太子参与水混合，经加热回流萃取后过滤，滤液以高速离心(5000rpm)方式得太子参澄清液，之后加入3-5倍太子参澄清液体积的95％乙醇，此时会有沉淀析出，静置约24小時后抽气过滤，滤液与沉淀物分別收集，经浓缩与冷冻干燥后，滤液干燥物即为水萃取物，沉淀物干燥后即为太子参多糖体。

3)太子参95％乙醇萃取物

制备方法为：太子参干品粉碎后，以重量比1比5-8的太子参与95％乙醇量混合浸泡，浸泡两天，每天均以超声波破碎机振动20-40分钟(功率为200-600W)，过滤后，残渣再加入回收95％乙醇浸泡三天，浸泡为重量比1比5-8的太子参残渣与95％乙醇量混合，每天均以超声波破碎机振动20-40分钟(功率为200-600W)，过滤后合并前后两次滤液，经浓缩与冷冻干燥后，滤液干燥物即是所述的太子参95％乙醇萃取物。

以上的三种萃取物作为下面所有实施例的原料。

实施例1

太子参以乙醇、水为溶剂所获得之萃取物之毒性检测，发现太子参萃取物无毒性

细胞毒杀(Colormetric MTT assay)活性评估：评毒性采用Colormetric MTTassay之活性测试法。其原理为利用细胞株活细胞粒腺体内脱氢酵素(dehydrogenase)将MTT(3-4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)之四唑(tetrazolium)环切断，蓝色沉淀甲臜(formazan)形成，颜色由淡黄转为深蓝色，而死细胞粒腺体不含脱氢酵素，所以MTT颜色并不会产生变化，仍为淡黄色。其反应如图1所示。

细胞毒杀测试之实验流程

(1)检测采用人类纤维母细胞(Hs68cells:human foreskin fibroblast)进行评估。

(2)以每孔种100μL癌细胞株于96孔上，并在37℃及5％CO₂、95％空气的条件下进行培养。

(3)使细胞贴附时间大于20小时，抽除培养基后，每孔各加入100μL不同浓度的萃取物。

(4)于37℃及5％CO₂的条件下培养72小时，再抽去培养基，每孔各加入5mg/mL的MTT10μL。

(5)在37℃及5％CO₂的条件下培养4小时，再抽去培养基，每孔各加100μL100％DMSO。

(6)将9孔盖上铝箔避光，于室温下搅10-20分钟，去除气泡，以拭净纸擦拭干净孔盘底部，再以波长570nm测其吸光值。

表1、太子参萃取物对Hs68cells作用48小时之细胞毒性

评估结果显示太子参以超临界萃取、水萃或以95％以纯进行萃取所获得之萃取物均无显著之细胞毒性，是相当安全之萃取物。

实施例2

太子参以水为溶剂所获得之萃取液，加入95％乙醇沉淀后后，所获得的太子参粗多醣体具有保湿的效果

以三种不同实验评估太子参粗多醣体的保湿能力，分别是吸湿率的评估、保湿率的评估与经表皮失水率(Trasepidermal Water Loss,TEWL)测定。

不同保湿剂对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同，作用力大的对水分子结合力强，吸收和保持水分的量也较大。因此，根据保湿剂吸湿、保湿性能的差异，在控制试验条件的前提下，可以用称重的方法来评价保湿剂的保湿功效。

测定化保湿剂的保湿效能需要选定恒温恒湿的环境下进行，一般采用密闭小容器，放置某一化学试剂的饱和水溶液，在规定的温度下使之保持一定的相对湿度。

(1)吸湿率的评估

吸湿率的测定将干燥至恒重的样品称重，分别在相同室温下，湿度为80％、65％、44％恒定的干燥器中，放置4、8、24、48小时后称其质量。在相同条件下测量三次，取平均值。

计算公式如下：吸湿率％＝(M0-M)/M0x100％

(M0：放置前样品质量；M：放置后样品质量)

(2)保湿率的评估

称取一定量含水分的样品，放置在干燥器中干燥，2、4、8、24、48、72小时后称量样品质量的减少，计算出样品的保湿率，经对比分析，比较出不同样品保湿性的大小。

计算公式如下：保湿率％＝Mt/M0x100％

(M0：放置前样品质量；Mt：放置t小时后样品质量)

(3)经表皮失水率(Trasepidermal Water Loss,TEWL)测定

目前世界上许多研究机构通过测定经表皮失水率(Trasepidermal Water Loss,TEWL)来评价皮肤屏障功能，因此本计划的皮肤保养品研究方法将采用经表皮失水率(TEWL)测定。

TEWL是反应角质层对于水的屏障功能，是评价角质层状态的重要因子。TEWL通过评价角质层屏障功能达到预测护肤品通过保湿作用对表皮屏障功能的维护、修复和加强作用；也可以应用于不同皮肤疾病状态下对皮肤屏障功能的评价。

简述实验流程：

(a)手部先以使用肥皂清洁，自然干燥后将多醣体系列产品均匀涂抹于左手臂前屈侧表皮；

(b)于冷气房中控制温度约25℃、湿度约60﹪下进行测量，同时记錄当时周遭的温度和湿度；

(c)经皮水分散失可以贴切地反应角质层的水分流动速率，以经皮水份散失测定仪(TM300)的探针测量认取4点，依不同之时间点侦测六次；

(d)六侦测时间点分别为(1)涂抹前、(2)涂抹后10分钟、(3)涂抹后30分钟、(4)涂抹后60分钟、(5)涂抹后90分钟、(6)涂抹后120分钟；(检测三重复，取平均值)

(e)纪录手臂皮肤电容量值，将每时段每一检测点平均数值减去每一检测点空白数值，

即为该时段该检测点的测定值(g/m²h)，亦可计算每时段每一检测点平均数值与每一检测点空白数值的比值；

(f)测定值与比值越低，表示保湿产品通过其保湿功能对皮肤皮肤屏障功能的影响作用越好。

表2、太子参粗多醣体之吸湿率评估

由上表2之实验结果显示在环境湿度44％、65％、85％下，纯水均逐渐蒸发干燥，而太子参粗多醣体与玻尿酸两者显示随着时间增加其吸收水分的能力也逐渐增加，且随着环境中相对湿度的降低而降低其吸湿能力。但是可发现太子参粗多醣体的吸湿能力除在低湿度环境(44％)下略比玻尿酸差外，在65％与85％的环境湿度下均比玻尿酸略为优异，显示太子参粗多醣体是具备吸湿效能的。

表3、太子参粗多醣体之保湿率评估

由上表3的结果得知太子参粗多醣体的保湿能力与标准品玻尿酸相近。

表4、太子参粗多醣体在正常皮肤于27℃、50-55％RH下皮肤水分散失率评估

单位：g/hm²

比较表4与图2可知，5％与10％的太子参粗多醣体水溶液均能使皮肤表水的散失能力下降，显示具有防止皮水表水的蒸散作用，10％的太子参粗多醣水溶液于涂抹90分钟后显现更低的皮肤表水的散失效果。

综合上述三项保湿实验均证实太子参粗多醣体是具备保湿能力的。

实施例3太子参以乙醇为溶剂所获得之萃取物发现具有DNA保护的效果

以DNA保护试验来验证

pUC119DNA质体原是一个超螺旋的结构(S-form)，经过UV或是氧化伤害后，超螺旋结构会被打开行程(L-form)，因此藉由此试验评估太子参以乙醇、水为溶剂所获得之萃取物是否具有保护质粒DNA的能力。利用芬顿反应产生自由基攻击DNA，若太子参以乙醇、水萃取物具有保护DNA不会断裂，经过电泳分析即可验证其保护功效。

试验方法如下：

(1)将定量之pUC119DNA取2μl于1.5ml离心管中，其次每管各加入3μl之1X PBS以及已配制成不同浓度之待测样品，最后分别各加入5μl之0.3％H2O2待测。

(2)从每一离心管将已配制好之样品浓度分别取出置于石英玻片上。

(3)将石英玻片置于紫外箱上，照射UV30mJ/cm2。

(4)照射完，再分别各加入3μl之6X上样缓冲液，混合均匀，再取出已制好的电泳胶片，分别把不同样品浓度注入到电泳胶片以进行电泳。

(5)待电泳跑完后，戴上手套取出胶片移置已加入适量溴化乙锭的去离子水槽中，进行染色约30min。

(6)待染色完成，戴上手套取出胶片，以电泳胶片影像撷取分析系统拍照存盘。

根据图3与图4的结果可判定太子参95％乙醇萃取物具有DNA保护的能力，而且是在50μg/mL就显现出保护效果。

实施例4太子参以乙醇、水为溶剂所获得之萃取物发现具有抗发炎的效果

具体实施方式以抑制LOX-1与一氧化氮的的生成来验证抗发炎效果

(1)抑制脂氧合酶(LOX-1)的评估

LOX-1是发炎反应中重要的一个酵素，因此藉由此试验来评估抑制发炎能力，萃取物取1μL加入2μL之LOX-1(135单位)，接着以1.5μL10mM之亚麻油酸(linoleic acid)作为引起反应之基质，并加入95.5μL之Tris-HCl缓冲液(pH9.0)。控制组以等药量之DMSO为基准，完全均匀混合后，在234nm下测定其吸光值。

表5、抑制脂氧合酶(LOX-1)的评估

除太子参超临界萃取物没有抑制LOX-1的能力外，太子参水萃取物与95％乙醇萃取物均有不错的抑制LOX-1的效能。

(1)清除一氧化氮含量的评估

一氧化氮在人体内极易代谢形成亚硝酸盐/硝酸盐的稳定代谢产物，因此以细胞培养液中亚硝酸盐/硝酸盐的浓度来评估NO的释放量及NOS的活性。本实验使用之格里斯试剂可与亚硝酸盐反应产生呈色反应，先利用硝普酸钠(SNP)本身是一种一氧化氮供体，在正常生理条件下可以产生NO，本实验评估利用一氧化氮供体來探讨一氧化氮清除能力。

取98μL硝普酸钠(5mM)加入2μL样品在25℃下150分钟培养，加入100μL格里斯试剂(0.1％naphthylenediamine dihydrochloride,5％磷酸和1％sulfanilamine)，在560nm下测吸光值。

表6、清除一氧化氮含量的评估

三种太子参萃取物均显示出清除一氧化氮含量的能力，尤其以太子参水萃取物的效果最优异。

Claims

1.太子参萃取物的用途，其用于制备DNA保护的制剂或药物或保健品或化妆品，所述的DNA保护为：防止DNA经过UV或是氧化伤害后，超螺旋结构被打开，所述太子参萃取物为太子参95％乙醇萃取物。

2.如权利要求1所述的一种太子参萃取物的用途，其特征在于：所述太子参95％乙醇萃取物的制备方法为：太子参干品粉碎后，以重量比1比5-8的太子参与95％乙醇量混合浸泡，浸泡两天，每天均以超声波破碎机振动20-40分钟，过滤后，残渣再加入回收95％乙醇浸泡三天，浸泡为重量比1比5-8的太子参残渣与95％乙醇量混合，每天均以超声波破碎机振动20-40分钟，过滤后合并前后两次滤液，经浓缩与冷冻干燥后，滤液干燥物即是所述的太子参95％乙醇萃取物。

3.如权利要求2所述的一种太子参萃取物的用途，其特征在于：超声波功率为200W-600W。