JPWO2019009257A1 - マロニル基転移酵素遺伝子の使用 - Google Patents
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Abstract
本発明により解決される課題は、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法を提供すること、及び、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンをコピグメントとして含み、これにより、改変された花色、好ましくは、既存の品種よりも青い花色を有する植物品種を作出することである。（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；等からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを用いる。
Description
本発明は、フラボン７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いた、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンをコピグメントとして含み、これにより、改変された花色、好ましくは、既存の品種よりも青い花色を有する植物品種の作出方法、及び、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法に関する。
花の色は、フラボノイド、カロテノイド、クロロフィル、ベタレインの４種類の色素に起因する。この中で、フラボノイドは黄、赤、紫、青といった多様な色を呈する。フラボノイドの中で、赤、紫、青色を呈する１グループはアントシアニンと総称され、アグリコンの構造に依り、ペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジンの３つのグループに分類することができる。
花色が青くなるためにはデルフィニジンが蓄積することに加え、（ｉ）アントシアニンが１つ又は複数の芳香族アシル基により修飾されること、（ｉｉ）アントシアニンがフラボンやフラボノールなどのコピグメントと共存すること、（ｉｉｉ）鉄イオンやアルミニウムイオンがアントシアニンと共存すること、（ｉｖ）アントシアニンが局在する液胞のｐＨが中性から弱アルカリ性に上昇すること、又は（ｖ）アントシアニン、コピグメント、金属イオンが錯体を形成すること（このようなアントシアニンはメタロアントシアニンと呼ばれる）のいずれかが必要であると考えられている（非特許文献１）。
フラボノイドやアントシアニンの生合成経路はよく研究され、関連する生合成酵素やそれをコードする遺伝子が同定されている（非特許文献２）。また、フラボノイドの1つであるフラボンは、アントシアニンと共存すると花色を青く濃くする効果がしられており、フラボンの生合成酵素をコードする遺伝子が多くの植物から同定されている。
アントシアニンやフラボンを修飾する酵素遺伝子も多くの植物から得られており、例えば糖転移酵素遺伝子、アシル基転移酵素遺伝子、メチル基転移酵素遺伝子などがある。アントシアニンやフラボンは、これらの酵素によって、種および品種特異的に多様な修飾を受け、この多様性が花色の多様さの一因となっている。例えば、アントシアニン ３−グルコシドの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、キク、ダリア、シネラリアから単離されている（非特許文献３、特許文献１）。アントシアニン ５−グルコシドの５位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、サルビア、シロイヌナズナから単離されている（非特許文献４、特許文献１）。イソフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ダイズ、メディカゴなどから単離されている（非特許文献５、６）。フラボノール ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、タバコから単離されている（非特許文献７）。
アントシアニンやフラボンを修飾する酵素遺伝子も多くの植物から得られており、例えば糖転移酵素遺伝子、アシル基転移酵素遺伝子、メチル基転移酵素遺伝子などがある。アントシアニンやフラボンは、これらの酵素によって、種および品種特異的に多様な修飾を受け、この多様性が花色の多様さの一因となっている。例えば、アントシアニン ３−グルコシドの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、キク、ダリア、シネラリアから単離されている（非特許文献３、特許文献１）。アントシアニン ５−グルコシドの５位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、サルビア、シロイヌナズナから単離されている（非特許文献４、特許文献１）。イソフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、ダイズ、メディカゴなどから単離されている（非特許文献５、６）。フラボノール ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、タバコから単離されている（非特許文献７）。
Natural Product Reports (2009), 26, 884-915
Biosci. Biotechnol. Biochem (2010), 74(9), 1760-1769
Plant Biotechnology, 20(3), 229-234 (2003)
The Plant Journal (2007) 50, 678-695
Phytochemistry 68 (2007), 2035-2042
The Plant Journal (2008) 55, 382-396
The Plant Journal (2005) 42, 481-491
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.282, NO.21, 15812-15822
遺伝子組換えにより、青色色素デルフィニジンの誘導体を生成する青色キクが作出されている（特許文献２）。この花弁青色化の要因は、デルフィニジンの生成に加えて、共存するフラボンの一種、ルテオリン ７−マロニルグルコシドのコピグメント効果によるものと考えられる。しかし、ルテオリン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードするキク由来の遺伝子は未同定であった。
かかる状況の下、本発明が解決しようとする課題は、キクにおいてフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定し、これを用いて、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法を提供することである。さらに、このようなポリヌクレオチドを用いて７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンを生成し、当該フラボンのコピグメント効果により、改変された花色、好ましくは、既存の品種よりも青い花色を有する植物品種を作出することである。
かかる状況の下、本発明が解決しようとする課題は、キクにおいてフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定し、これを用いて、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法を提供することである。さらに、このようなポリヌクレオチドを用いて７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンを生成し、当該フラボンのコピグメント効果により、改変された花色、好ましくは、既存の品種よりも青い花色を有する植物品種を作出することである。
上記課題を解決すべく、本願発明者は鋭意検討し、実験を重ねた結果、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質としてキク由来のアントシアニンマロニル基転移酵素ホモログ（Ｄｍ３ＭａＴ３）を同定し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］ 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを宿主植物に導入することを含む、７位のグルコースにマロニル基が付与されたフラボンを生成する遺伝子組換え植物又はその子孫を生産する方法。
［２］ 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、１に記載の方法。
［３］ 前記遺伝子組換え植物が改変された花色を有する、１又は２に記載の方法。
［４］ 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、７位のグルコースにマロニル基が付与されたフラボンを生成する遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［５］ 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、４に記載の遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［６］ 前記遺伝子組換え植物が改変された花色を有する、４又は５に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［７］ 切花である、４〜６のいずれかに記載の植物の部分。
［８］ ７に記載の切花を用いた切花加工品。
［９］ 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを非ヒト宿主に導入し、
該非ヒト宿主を培養し又は生育させること、
を含む、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法。
［１０］ 前記非ヒト宿主が植物細胞である、９に記載の方法。
［１１］ 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、９又は１０に記載の方法。
すなわち、本発明は以下の通りのものである。
［１］ 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを宿主植物に導入することを含む、７位のグルコースにマロニル基が付与されたフラボンを生成する遺伝子組換え植物又はその子孫を生産する方法。
［２］ 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、１に記載の方法。
［３］ 前記遺伝子組換え植物が改変された花色を有する、１又は２に記載の方法。
［４］ 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、７位のグルコースにマロニル基が付与されたフラボンを生成する遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［５］ 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、４に記載の遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［６］ 前記遺伝子組換え植物が改変された花色を有する、４又は５に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
［７］ 切花である、４〜６のいずれかに記載の植物の部分。
［８］ ７に記載の切花を用いた切花加工品。
［９］ 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを非ヒト宿主に導入し、
該非ヒト宿主を培養し又は生育させること、
を含む、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法。
［１０］ 前記非ヒト宿主が植物細胞である、９に記載の方法。
［１１］ 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、９又は１０に記載の方法。
本発明により、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンをコピグメントして含み、これにより、改変された花色、好ましくは、既存の品種よりも青い花色を有する植物品種を作出することができる。また、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法が提供される。
本発明で用いられるポリヌクレオチド（配列番号１）はＤｍ３ＭａＴ３をコードするものである。本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」はＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。本発明で用いられるポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列、又はその相当のアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなるものに限定されず、当該塩基配列又はその相補配列からなるポリヌクレオチド、あるいは当該アミノ酸配列と特定の配列相同性、好ましくは配列同一性を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書では、キク由来のフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子について述べているが、本発明で用いられるポリヌクレオチドは、キク由来の遺伝子に限定されるものではなく、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の起源としては植物でも動物でも微生物であってもよく、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有している限り、起源を問わず、植物における花色の変更に利用可能である。
本明細書では、キク由来のフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子について述べているが、本発明で用いられるポリヌクレオチドは、キク由来の遺伝子に限定されるものではなく、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の起源としては植物でも動物でも微生物であってもよく、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有している限り、起源を問わず、植物における花色の変更に利用可能である。
本発明で用いられるポリペプチドには、配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。本明細書中、用語「ストリジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」又は「相同性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。
本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
本発明に係るＤＮＡは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。
本発明で用いられるポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
本発明で用いられるポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。このようなポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して、好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本明細書中、用語「同一性」は、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。
また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン１４．５．２（２４）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて算出される数値である。
本発明で用いられるポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。
生来の塩基配列を有する遺伝子は、以下の実施例に記載するように、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドがフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。さらに、当該ポリヌクレオチドを発現させることにより、ポリヌクレオチド産物であるフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質を得ることができる。あるいは配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドに対する抗体を用いてもフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質を取得することができ、かかる抗体を用いて他の生物由来のフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローン化することもできる。
このようにして得られた、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを、例えば、（組換え）ベクター、特に発現ベクターを用いて植物に導入し、これを該植物の細胞内に含有させることにより、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンをコピグメントして含み、これにより、改変された花色、好ましくは、既存の品種よりも青い花色を有する遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はこれらの部分若しくは組織（細胞を含む）を生産することができる。該部分若しくは組織の形態としては切花であることができる。
形質転換可能な植物の例としては、バラ、カーネーション、キク、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコキキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリプ、アンセリウム、コチョウラン、イネ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、ダイズ、アルファルサ、ルービン、トウモロコシ、カリフラワー、ダリアなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
また、本発明により、上記にしたがい得られた遺伝子組換え植物若しくはその子孫の切花を用いた加工品（切花加工品）が提供される。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。
さらに、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、フラボン ７−グルコシド及び／又はマロニルＣｏＡなどのマロニル基供与体を含有する非ヒト宿主に導入し、該非ヒト宿主を培養し又は生育させ、そして、該非ヒト宿主から、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンを採取することにより、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンを容易に製造することができる。
形質転換された非ヒト宿主を培養、栽培又は生育させることによって得られた培養物又は培地から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどにより回収・精製して、目的とするタンパク質を得ることができる。また、本発明の製造方法により製造された７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンは、食品、医薬品、化粧品の製造などの用途に使用することができる。
非ヒト宿主としては、原核生物又は真核生物を用いることがきる。原核生物としては細菌、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、バシルス・スブシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核生物としては、下等真核生物、例えば、真核微生物、例えば、真菌である酵母又は糸状菌が使用できる。酵母としては、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが挙げられ、また糸状菌としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。宿主としては、さらに動物細胞又は植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒトなどの細胞系が使用され、さらに、昆虫細胞、例えば、カイコ細胞、カイコの成虫それ自体も宿主として使用される。本発明の方法においては、好ましくは植物細胞が用いられる。
現在の技術水準の下では、前記のポリヌクレオチドを含む（組換え）ベクター、特に発現ベクターによって非ヒト宿主にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。非ヒト宿主へのポリヌクレオチドの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。
本発明で用いられる発現ベクターは、それらを導入する非ヒト宿主の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーターなどが使用され、そして糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーターなどが使用される。また、動物細胞宿主用のプロモーターとしては、ウイルス性プロモーター、例えば、ＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーターなどが使用される。
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。
植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。
発現ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。
以下、実施例に従って発明を具体的に説明する。
［実施例１：フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いる場合）］
＜大腸菌発現用ベクターの作製＞
非特許文献８に記載された機能未同定のＤｍ３ＭａＴ３をフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質候補とし、ｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｄｍ３ＭａＴ３の完全長を含む大腸菌発現用ベクター（ｐＥＴ３２ａ−Ｄｍ３ＭａＴ３）を作製した。
＜マロニル転移酵素の大腸菌での発現＞
ｐＥＴ３２ａ−Ｄｍ３ＭａＴ３を、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２１へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体を５ｍｌのソニックバッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．０）：２．５ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を、Ｄｍ３ＭａＴ３を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
［実施例１：フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質候補の酵素活性測定実験（大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いる場合）］
＜大腸菌発現用ベクターの作製＞
非特許文献８に記載された機能未同定のＤｍ３ＭａＴ３をフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質候補とし、ｐＥＴ３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｄｍ３ＭａＴ３の完全長を含む大腸菌発現用ベクター（ｐＥＴ３２ａ−Ｄｍ３ＭａＴ３）を作製した。
＜マロニル転移酵素の大腸菌での発現＞
ｐＥＴ３２ａ−Ｄｍ３ＭａＴ３を、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、大腸菌株ＢＬ２１へ導入し、形質転換大腸菌を取得した。この大腸菌をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液２ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、５０ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、４℃、１５分間）し、集菌した菌体を５ｍｌのソニックバッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．０）：２．５ｍＭ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して、上清を回収した。その上清を、Ｄｍ３ＭａＴ３を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
５０μｌのＤｍ３ＭａＴ３を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのマロニル−ＣｏＡ、５μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、５μｌの５００μｇ／ｍｌのルテオリン ７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１６分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴ３２ａベクターを導入した大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いて同様の実験を行った。
キクは、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性以外に、アントシアニンの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有する（非特許文献８参照）。Ｄｍ３ＭａＴ３を、アントシアニンの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び３位のグルコースの６位がマロニル化されたアントシアニンの３位のグルコースの３位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてすでに報告されているキク由来アントシアニジン３−Ｏ−グルコシド−６”−Ｏ−マロニル基転移酵素（Ｄｍ３ＭａＴ１）、及びキク由来アントシアニジン３−Ｏ−グルコシド−３”，６”−Ｏ−ジマロニル基転移酵素（Ｄｍ３ＭａＴ２）と差別化するため、Ｄｍ３ＭａＴ１、２についても同様に大腸菌発現用ベクターを作製し、大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いて酵素活性測定実験を行った。さらに、シアニジン ３−グルコシドを基質とした酵素反応も行い、Ｄｍ３ＭａＴ３の結果と比較した。その場合、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析をするときには、検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い５２０ｎｍでアントシアニンを検出した。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＤＥ−４１３Ｌ（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１５分間の直線濃度勾配とそれにつづく５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
その結果、Ｄｍ３ＭａＴ３とルテオリン ７−グルコシドを酵素反応させると、基質として加えたルテオリン ７−グルコシド以外に、ルテオリン ７−マロニルグルコシドのピークが検出された。Ｄｍ３ＭａＴ１、２とルテオリン ７−グルコシドを酵素反応させた場合には、ルテオリン ７−マロニルグルコシドのピークは検出されなかった（図１参照）。
また、Ｄｍ３ＭａＴ３とシアニジン３−グルコシドを酵素反応させると、基質として加えたシアニジン ３−グルコシド以外に、シアニジン ３−マロニルグルコシドのピークが検出された。しかし、Ｄｍ３ＭａＴ１とシアニジン ３−グルコシドを反応させた場合と比較して、Ｄｍ３ＭａＴ３の場合では、シアニジン ３−グルコシドの消費量は明らかに少なかった（図２参照）。
これらの結果より、Ｄｍ３ＭａＴ３は、Ｄｍ３ＭａＴ１、２と異なり、アントシアニン３−グルコシドの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、３位のグルコースの６位がマロニル化されたアントシアニンの３位のグルコースの３位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ではなく、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が示された。
５０μｌのＤｍ３ＭａＴ３を発現させた大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのマロニル−ＣｏＡ、５μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、５μｌの５００μｇ／ｍｌのルテオリン ７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１６分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。コントロールとして、インサートを挿入しないｐＥＴ３２ａベクターを導入した大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いて同様の実験を行った。
キクは、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性以外に、アントシアニンの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有する（非特許文献８参照）。Ｄｍ３ＭａＴ３を、アントシアニンの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、及び３位のグルコースの６位がマロニル化されたアントシアニンの３位のグルコースの３位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子としてすでに報告されているキク由来アントシアニジン３−Ｏ−グルコシド−６”−Ｏ−マロニル基転移酵素（Ｄｍ３ＭａＴ１）、及びキク由来アントシアニジン３−Ｏ−グルコシド−３”，６”−Ｏ−ジマロニル基転移酵素（Ｄｍ３ＭａＴ２）と差別化するため、Ｄｍ３ＭａＴ１、２についても同様に大腸菌発現用ベクターを作製し、大腸菌から粗抽出したタンパク質溶液を用いて酵素活性測定実験を行った。さらに、シアニジン ３−グルコシドを基質とした酵素反応も行い、Ｄｍ３ＭａＴ３の結果と比較した。その場合、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析をするときには、検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い５２０ｎｍでアントシアニンを検出した。カラムはＳｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＤＥ−４１３Ｌ（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１５分間の直線濃度勾配とそれにつづく５分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
その結果、Ｄｍ３ＭａＴ３とルテオリン ７−グルコシドを酵素反応させると、基質として加えたルテオリン ７−グルコシド以外に、ルテオリン ７−マロニルグルコシドのピークが検出された。Ｄｍ３ＭａＴ１、２とルテオリン ７−グルコシドを酵素反応させた場合には、ルテオリン ７−マロニルグルコシドのピークは検出されなかった（図１参照）。
また、Ｄｍ３ＭａＴ３とシアニジン３−グルコシドを酵素反応させると、基質として加えたシアニジン ３−グルコシド以外に、シアニジン ３−マロニルグルコシドのピークが検出された。しかし、Ｄｍ３ＭａＴ１とシアニジン ３−グルコシドを反応させた場合と比較して、Ｄｍ３ＭａＴ３の場合では、シアニジン ３−グルコシドの消費量は明らかに少なかった（図２参照）。
これらの結果より、Ｄｍ３ＭａＴ３は、Ｄｍ３ＭａＴ１、２と異なり、アントシアニン３−グルコシドの３位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、３位のグルコースの６位がマロニル化されたアントシアニンの３位のグルコースの３位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子ではなく、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である可能性が示された。
［実施例２：フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質の酵素活性測定実験（大腸菌からＨｉｓ−Ｔａｇを付加したタンパク質を精製したタンパク質溶液を用いる場合）］
＜マロニル基転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
実施例１で記載したｐＥＴ３２ａ−Ｄｍ３ＭａＴ３を導入した大腸菌株ＢＬ２１をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液８ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、２００ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１０分間）し、集菌した菌体を２０ｍｌの抽出液（組成；緩衝液（ＫＣl：３００ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4：５０ｍＭ、イミダゾール：５ｍＭ）（ｐＨ８．０）、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１４００×ｇ、４℃、２０分）して、上清を回収した。その上清を０．４５μｍフィルターに通し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製した。得られた精製タンパク質溶液を、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ）（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ社）を用いて、遠心分離（７５００×ｇ、４℃、１５分間）し、その濃縮されたタンパク質溶液を「Ｄｍ３ＭａＴ３タンパク質溶液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜マロニル基転移酵素の大腸菌での発現とタンパク質精製＞
実施例１で記載したｐＥＴ３２ａ−Ｄｍ３ＭａＴ３を導入した大腸菌株ＢＬ２１をＯｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ１（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、培養した。調製した培養液８ｍｌで、形質転換大腸菌をＯＤ６００値が０．５になるまで３７℃で培養した（約４時間）。この大腸菌液を前培養液として、２００ｍｌの培養液に加え、２５℃で一晩本培養した。
一晩本培養した大腸菌液を遠心分離（１０００×ｇ、４℃、１０分間）し、集菌した菌体を２０ｍｌの抽出液（組成；緩衝液（ＫＣl：３００ｍＭ、ＫＨ2ＰＯ4：５０ｍＭ、イミダゾール：５ｍＭ）（ｐＨ８．０）、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に懸濁し、超音波処理により大腸菌を粉砕した後、遠心分離（１４００×ｇ、４℃、２０分）して、上清を回収した。その上清を０．４５μｍフィルターに通し、Ｐｒｏｆｉｎｉａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って、Ｈｉｓ−Ｔａｇ精製した。得られた精製タンパク質溶液を、ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０Ｋ）（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ社）を用いて、遠心分離（７５００×ｇ、４℃、１５分間）し、その濃縮されたタンパク質溶液を「Ｄｍ３ＭａＴ３タンパク質溶液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
＜酵素活性測定＞
３０μｌのＤｍ３ＭａＴ３タンパク質溶液（１０μｇ）、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのマロニル−ＣｏＡ、５μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、５μｌの５００μｇ／ｍｌのルテオリン ７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１６分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
３０μｌのＤｍ３ＭａＴ３タンパク質溶液（１０μｇ）、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのマロニル−ＣｏＡ、５μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、５μｌの５００μｇ／ｍｌのルテオリン ７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％メタノール水溶液）を用いた。両者の８：２の混合液から０：１０の混合液までの１６分間の直線濃度勾配とそれにつづく６分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。
その結果、酵素反応液中で、ルテオリン ７−マロニルグルコシドが合成されていた。反応率（基質が変換された割合）は８１．１３％であった（図３、図５参照）。同じ反応条件下で基質を５００μｇ／ｍｌのアピゲニン ７−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）として、酵素反応を行った場合には、アピゲニン ７−マロニルグルコシドが合成された。反応率は８５．８０％であった（図５）。一方、同じ反応条件下で同じ反応条件下で基質を５００μｇ／ｍｌのルテオリン ４’−グルコシド（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）として、酵素反応を行った場合には、ルテオリン ４’−マロニルグルコシドと予測される物質が合成されていたが、その反応率は３４．８１％にとどまった（図４、図５参照）。さらに、図５に記載の各種フラボノイド化合物（アピゲニン、ルテオリン、トリセチン、ケンフェロール、ケンフェロール ３−グルコシド、ケルセチン、ケルセチン ３−グルコシド、ミリセチン、ペラルゴニジン、ペラルゴニジン ３−グルコシド、ペラルゴニジン ３，５−ジグルコシド、シアニジン、シアニジン ３−グルコシド、シアニジン ３，５−ジグルコシド、デルフィニジン、デルフィニジン ３−グルコシド、デルフィニジン ３，５−ジグルコシド）に対する反応性を調べたところ、Ｄｍ３ＭａＴ３タンパク質は、アピゲニン ７−グルコシド、ルテオリン ７−グルコシドのようなフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースを選択的にマロニル化しており、基質特異性が高いマロニル基転移酵素であることが明らかとなった（図５参照）。
また、Ｄｍ３ＭａＴ３と既知の糖転移酵素における塩基配列及びアミノ酸配列の同一性を解析した。Ｄｍ３ＭａＴ３と同じキク由来のマロニル基転移酵素を比較すると、Ｄｍ３ＭａＴ３とＤｍ３ＭａＴ１の間の、及びＤｍ３ＭａＴ３とＤｍ３ＭａＴ２の間のアミノ酸配列の同一性は、それぞれ、５５％、及び５３％であった（図６参照）。既に同定されているマロニル基転移酵素の中で、Ｄｍ３ＭａＴ３と最も同一性が高いアミノ酸配列は、Ｄｍ３ＭａＴ１である（図７参照）。この解析には、ＭａｃＶｅｃｔｏｒアプリケーション（バージョン１４．５．２（２４）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いた。しかし、Ｄｍ３ＭａＴ１とＤｍ３ＭａＴ２は、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有しておらず、本願のＤｍ３ＭａＴ３は、Ｄｍ３ＭａＴ１とＤｍ３ＭａＴ２とは機能の異なるマロニル基転移酵素である。
［実施例３：Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子のバラにおける発現］
本発明のＤｍ３ＭａＴ３遺伝子が、植物内でフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確かめるため、Ｄｍ３ＭａＴ３を植物で発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ７１３６を構築し（図８参照）、バラ（オーシャンソング）へ導入した。ｐＳＰＢ７１３６では、基本骨格としてｐＢＩＮＰＬＵＳ（Van Engel et al., Transgenic Research 4, 288）を、Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子を発現させるプロモーターとしてＥｌ２３５Ｓプロモーター（Mitsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37, p49）を、ターミネーターとしてＨＳＰターミネーター（Plant Cell Physiol (2010) 51, 328-332）を使用した。
ｐＳＰＢ７１３６を導入した遺伝子組換えバラの若い葉を用いて、Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子の発現解析を行った。トータルＲＮＡ単離はＰｌａｎｔ ＲＮＡｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って取得し、ｃＤＮＡ合成はＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って行った。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、２０μｌで行った（９４℃で５分間保持し、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒間保持のサイクルを３０サイクル繰り返した後、７２℃７分、４℃で保持した）。その際、Ｄｍ３ＭａＴ３の完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマー（フォワードプライマー：ATGGCTTCTCTTCCCATCTTG、リバースプライマー：TTAAAGGTATGCTTTTAGTCC）を設計し、利用した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、完全長ｃＤＮＡに相当する１３６５ｂｐのバンドが検出されたことから、バラにおいてＤｍ３ＭａＴ３遺伝子が転写されていることが確認された。
本発明のＤｍ３ＭａＴ３遺伝子が、植物内でフラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性を有するタンパク質をコードすることを確かめるため、Ｄｍ３ＭａＴ３を植物で発現させるためのバイナリーベクターｐＳＰＢ７１３６を構築し（図８参照）、バラ（オーシャンソング）へ導入した。ｐＳＰＢ７１３６では、基本骨格としてｐＢＩＮＰＬＵＳ（Van Engel et al., Transgenic Research 4, 288）を、Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子を発現させるプロモーターとしてＥｌ２３５Ｓプロモーター（Mitsuhara et al., (1996) Plant Cell Physiol. 37, p49）を、ターミネーターとしてＨＳＰターミネーター（Plant Cell Physiol (2010) 51, 328-332）を使用した。
ｐＳＰＢ７１３６を導入した遺伝子組換えバラの若い葉を用いて、Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子の発現解析を行った。トータルＲＮＡ単離はＰｌａｎｔ ＲＮＡｅａｓｙ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って取得し、ｃＤＮＡ合成はＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従って行った。逆転写ＰＣＲ反応は、ｃＤＮＡを鋳型として、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、製造者に推奨されているプロトコールに従い、２０μｌで行った（９４℃で５分間保持し、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒間保持のサイクルを３０サイクル繰り返した後、７２℃７分、４℃で保持した）。その際、Ｄｍ３ＭａＴ３の完全長ｃＤＮＡが特異的に増幅するようなプライマー（フォワードプライマー：ATGGCTTCTCTTCCCATCTTG、リバースプライマー：TTAAAGGTATGCTTTTAGTCC）を設計し、利用した。反応産物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、完全長ｃＤＮＡに相当する１３６５ｂｐのバンドが検出されたことから、バラにおいてＤｍ３ＭａＴ３遺伝子が転写されていることが確認された。
［実施例４：バラにおけるＤｍ３ＭａＴ３の機能解析］
完全長ｃＤＮＡＤｍ３ＭａＴ３の転写産物が合成されたバラ系統の花弁から粗酵素液を調製し、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性の有無を評価した。２．５ｇの花弁サンプルを液体窒素で冷やしながら乳鉢ですりつぶし、３０ｍｌの抽出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ、ポリビニルピロリドン Ｋ−３０：１０ｍｇ／ｍｌ、１−チオグリセロール：１ｍｇ／ｍｌ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かした。得られたタンパク質溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、回収した上清に３５％の飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度７０％となるように添加し、４℃で３時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈澱を得た。この沈澱を１ｍｌの溶出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：２０ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かし、ＮＡＰ−５Ｃｏｌｕｍｓ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてカラム精製を行って、硫酸アンモニウムを取り除いた。この液を「花弁粗酵素液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
２０μｌの花弁粗酵素液、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのマロニル−ＣｏＡ、５μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、２．５μｌの１ｍＭのアピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の９：１の混合液から８：２の混合液までの２０分間の直線濃度勾配、８：２の混合液から２：８の混合液までの１５分間の直線濃度勾配、２：８の混合液から０：１０の混合液までの５分間の直線濃度勾配とそれにつづく１分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。対照として、非遺伝子組換えバラについても同様にして、花弁から粗酵素液を調製し、酵素活性測定実験を行った。
非遺伝子組換えバラの花弁粗酵素液を用いた酵素反応液中においては、アピゲニン化合物のうちアピゲニンが７１．２４％、アピゲニン ７−グルコシドが２８．７６％を占めており、アピゲニン ７−マロニルグルコシドは検出されなかった。Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子を導入した遺伝子組換えバラの花弁粗酵素液を用いた酵素反応液中においては、アピゲニン ７−マロニルグルコシドのピークが２．０４％を占め、残りの９７．９６％は、対照の非遺伝子組換えバラの花弁粗酵素液を用いた酵素反応液にも含まれるアピゲニン、アピゲニン ７−グルコシドであった。このことから、遺伝子組換えバラの花弁において、フラボン７−グルコシドの７位のグルコースにマロニル基を転移する活性を有するＤｍ３ＭａＴ３が発現していることが確認された。
完全長ｃＤＮＡＤｍ３ＭａＴ３の転写産物が合成されたバラ系統の花弁から粗酵素液を調製し、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を転移する活性の有無を評価した。２．５ｇの花弁サンプルを液体窒素で冷やしながら乳鉢ですりつぶし、３０ｍｌの抽出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：１００ｍＭ、ポリビニルピロリドン Ｋ−３０：１０ｍｇ／ｍｌ、１−チオグリセロール：１ｍｇ／ｍｌ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かした。得られたタンパク質溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）し、回収した上清に３５％の飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。４℃で１時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニウムを飽和濃度７０％となるように添加し、４℃で３時間撹拌した後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分間）して沈澱を得た。この沈澱を１ｍｌの溶出バッファー（組成；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）：２０ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、アミジノファニルメタンスルフォニルフルオライド塩酸（ＡＰＭＳＦ）：１０μＭ）に溶かし、ＮＡＰ−５Ｃｏｌｕｍｓ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ＤＮＡ Ｇｒａｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてカラム精製を行って、硫酸アンモニウムを取り除いた。この液を「花弁粗酵素液」とした。遠心分離には、Ａｖａｎｔｉ ＨＰ−２６ＸＰ（ローター：ＪＡ−２）を使用した（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社）。
２０μｌの花弁粗酵素液、５μｌの１ｍｇ／ｍｌのマロニル−ＣｏＡ、５μｌの１Ｍ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、２．５μｌの１ｍＭのアピゲニン（０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル水溶液に溶解）を混合し、水で１００μｌになるように氷上で調整した反応液を３０℃で２０分間保持した。その後、１００μｌの停止バッファー（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を加えて反応を停止させ、反応液を高速液体クロマトグラフィー（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ（島津製作所））にて分析した。検出器は島津ＰＤＡ ＳＰＤ−Ｍ２０Ａを用い３３０ｎｍでフラボンを検出した。カラムはＳｈｉｍ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ １５０ｍｍ＊４．６ｍｍ（島津製作所）を用いた。溶出には、Ａ液（０．１％ＴＦＡ水溶液）とＢ液（０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリル水溶液）を用いた。両者の９：１の混合液から８：２の混合液までの２０分間の直線濃度勾配、８：２の混合液から２：８の混合液までの１５分間の直線濃度勾配、２：８の混合液から０：１０の混合液までの５分間の直線濃度勾配とそれにつづく１分間０：１０の混合液による溶出を行なった。流速は０．６ｍｌ／分とした。対照として、非遺伝子組換えバラについても同様にして、花弁から粗酵素液を調製し、酵素活性測定実験を行った。
非遺伝子組換えバラの花弁粗酵素液を用いた酵素反応液中においては、アピゲニン化合物のうちアピゲニンが７１．２４％、アピゲニン ７−グルコシドが２８．７６％を占めており、アピゲニン ７−マロニルグルコシドは検出されなかった。Ｄｍ３ＭａＴ３遺伝子を導入した遺伝子組換えバラの花弁粗酵素液を用いた酵素反応液中においては、アピゲニン ７−マロニルグルコシドのピークが２．０４％を占め、残りの９７．９６％は、対照の非遺伝子組換えバラの花弁粗酵素液を用いた酵素反応液にも含まれるアピゲニン、アピゲニン ７−グルコシドであった。このことから、遺伝子組換えバラの花弁において、フラボン７−グルコシドの７位のグルコースにマロニル基を転移する活性を有するＤｍ３ＭａＴ３が発現していることが確認された。
Claims (11)
- 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを宿主植物に導入することを含む、７位のグルコースにマロニル基が付与されたフラボンを生成する遺伝子組換え植物又はその子孫を生産する方法。 - 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、請求項１に記載の方法。
- 前記遺伝子組換え植物が改変された花色を有する、請求項１又は２に記載の方法。
- 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、７位のグルコースにマロニル基が付与されたフラボンを生成する遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。 - 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、請求項４に記載の遺伝子組換え植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
- 前記遺伝子組換え植物が改変された花色を有する、請求項４又は５に記載の植物若しくはその子孫又はそれらの部分若しくは組織。
- 切花である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の植物の部分。
- 請求項７に記載の切花を用いた切花加工品。
- 以下の（ａ）〜（ｅ）：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
（ｅ）配列番号２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、フラボン ７−グルコシドの７位のグルコースの６位にマロニル基を特異的に転移する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
からなる群から選ばれるポリヌクレオチドを非ヒト宿主に導入し、
該非ヒト宿主を培養し又は生育させること、
を含む、７位のグルコースにマロニル基が付加されたフラボンの製造方法。 - 前記非ヒト宿主が植物細胞である、請求項９に記載の方法。
- 前記フラボンがルテオリン又はアピゲニンである、請求項９又は１０に記載の方法。
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Non-Patent Citations (5)
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| LIN, L.C. ET AL.: "Isolation of Luteolin and Luteolin-7-O-glucoside from Dendranthema morifolium Ramat Tzvel and Their", J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 63, JPN6018036128, 2015, pages 7700 - 7706, XP009510027, ISSN: 0004608427, DOI: 10.1021/jf505848z * |
| MANJASETTY, B.A. ET AL.: "Structural basis for modification of flavonol and naphthol glucoconjugates by Nicotiana tabacum malo", PLANTA., vol. 236, JPN6018036130, 2012, pages 781 - 793, XP035103033, ISSN: 0004608430, DOI: 10.1007/s00425-012-1660-8 * |
| UNNO, H. ET AL.: "Structural and Mutational Studies of Anthocyanin Malonyltransferases Establish the features of BAHD", J. BIOL. CHEM., vol. 282, no. 21, JPN6018036129, 2007, pages 15812 - 15822, XP055565321, ISSN: 0004608428, DOI: 10.1074/jbc.M700638200 * |
| 中山亨 ほか: "キク花弁由来アントシアニンマロニル基転移酵素ホモログDm3MaT3のX線結晶構造解析", 日本植物細胞分子生物学会大会・シンポジウム講演要旨集, vol. 25, JPN7018003191, 2007, pages 122, ISSN: 0004608429 * |
| 野田尚信 ほか: "バイオテクノロジーによる花色の青色化と青いキクの創出", 園芸学研究（HORITICULTURAL RESEARCH）, vol. 17, no. 1, JPN6018036131, 24 March 2018 (2018-03-24), JP, pages 234, ISSN: 0004608431 * |
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