CN102174567A - 一种通过转DdICE1基因提高切花菊抗逆性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，包括以下步骤：构建DdICE1基因植物表达载体；采用农杆菌介导法将其转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。对转化植株进行PCR、半定量及定量RT-PCR检测证实外源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行抗性检测，发现与未转基因植株相比，转基因植株抗寒、抗旱和抗盐性有很大提高。本发明通过转化外源DdICE1转录因子并正常转录表达，及在逆境下诱导下游一系列抗逆基因的表达从而提高切花菊的抗逆性，为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

一种通过转DdICE1基因提高切花菊抗逆性的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转DdICE1基因提高切花菊抗逆性的方法。

背景技术

菊花〔Dendranthema morifolium Tzvel.(Chrysanthemum morifolium Ramat.)〕是菊科菊花属的多年生宿根草本植物。是世界四大切花之一，其中，切花菊约占世界切花总量的30％，在花卉产业中占据重要的地位。是我国传统名花和世界最主要的观赏花卉之一。ICE1是DREB1冷响应通道的上游转录调控因子，通过与DREB1启动子中MYC顺式作用元件的结合激活下游DREB1基因表达。2003年亚里桑那大学研究人员通过拟南芥突变体筛选获得的ICE1基因，转ICE1基因的拟南芥(Chinnusamy等，2003)的抗寒性获得显著提高。目前，除拟南芥外，其他物种ICE1转录因子的报道很少，通过EST拼接克隆到杨树ICE1(林元震等，2007)；同源克隆出芥菜ICE1(Wang等，2005)；从小麦cDNA文库中筛选得到ICE41和ICE87，并转化烟草提高了抗寒性，转化的拟南芥在低温诱导下DREBs表达增强(Badawi等，2008)；此外，向殿军等(2007)报道通过农杆菌介导的转拟南芥ICE1基因提高了水稻的耐寒性，而转拟南芥ICE1基因也增强了烟草抗寒性(郑银英等，2009)。

随着生物技术的发展，导入外源基因提高植物抗逆性已成为现代植物育种的主要手段。自Lemieux1989第一次成功利用农杆菌介导法诞生第1株转基因菊花以来，为利用新基因资源改良菊花品种提供了新的手段和途径，如通过转基因改变菊花花色、形状、高度、株型，花期寿命等园艺特征，以及提高对非生物胁迫和病虫害的抗性，构建具有重要经济意义的各种切花，盆栽和绿化用菊花品种。而利用农杆菌介导转化提高植株抗性的研究报道也有很多，拟南芥AtDREB1A基因导入烟草(Kasuga等，2004)、水稻(Dubouzet等，2003)、小麦(Pellegrineschi等，2004)、番茄(Hsieh等，2002)等作物中进行异源表达，转化植株在综合耐性方面得到了提高。利用35S：CBF1/DREB1B转化拟南芥，可以明显提高植物对冷胁迫的耐受性，同时也增强了对干旱和高盐胁迫的耐受性(Jaglo-Ottosen等，1998；洪波等，2006)，但是关于35S启动子驱动的ICE1基因提高了植株对干早、高盐和冷冻胁迫耐性方面还没有报导。通过将外源DdICE1转录因子导入切花菊‘神马’提高其抗逆性是一种新的探索，为利用基因工程技术选育菊花抗逆品种提供新颖而实用的方法。

参考文献：

Chinnusamy V，Ohta M，Kanrar S，et al.ICE1：a regulatory of cold2induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis.Genes Dev，2003，17：1043-54；

林元震，张志毅，刘纯鑫，等。2007。甜杨抗冻转录因子ICE1基因的in silico克隆及其分析.

分子植物育种，5(3)：424-430；

洪波，仝征。AtDREB1A基因在菊花中的异源表达提高了植株对干旱和盐渍胁迫的耐性[J]。

中国科学C辑生命科学，2006，36(3)：223-231；

向殿军，张瑜，殷奎德。2007。农杆菌介导的转ICE1基因提高水稻的耐寒性.中国水稻科学，21(5)：482～486；

郑银英，崔百明，常明进，等。2009。转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究。西北植物 学报，29(1)：75-79；

许瑛，陈发棣^＊。2008。菊花8个品种的低温半致死温度及其抗寒适应性.园艺学报，35(4)：559-564；

Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，et al.OsDREB genes in rice，Oryza sativaL，encode transcription activators that function in drought，high salt and coldresponsive gene expression[J]Plant Journal，2003，33：751-763；

Hsieh T H，Lee J T，Yang P T，et al.Heterology expression of the Arabidopsis C-repeat/dehydration response element binding factor 1 gene confers elevated tolerance to chilling and oxidative stresses in transgenic tomato[J].Plant Physiology，2002，129(3)：1086-1094；

Kasuga M，Miura S，Shinozaki K，et al.A combination of the Arabidopsis DREB 1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought-and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer[J].Plant Cell Physiol，2004，45：346-350；

M.Badawi，Y.V.Reddy，Z，Agharbaoui，Y.Tominaga，et al，2008。Structure and Functional Analysis of Wheat ICE(Inducer of CBF Expression)Genes.Plant Cell Physiol，49：1237-124。

发明内容

本发明的目的在于解决现实生产中切花菊对干旱、高盐及低温胁迫抗性低的问题，提供一种通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法。本发明涉及的农杆菌介导遗传转化，转基因植物的分子检测及转基因植株后代对低温、干旱及高盐的抗性分析用于本发明，为利用基因工程技术开展抗逆性菊花分子育种提供方法和实例。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

利用根癌农杆菌介导法，将DdICE1基因导入切花菊，并经过草胺磷筛选抗性植株；经过草胺磷抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、半定量及定量RT-PCR检测验证外源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株后代进行抗干旱、高盐及低温分析，最终获得抗逆性提高的转基因菊花植株。DdICE1基因为从菊属异色菊中克隆的耐寒基因，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

一种通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1的构建

设计引物以菊属异色菊cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在DdICE1基因的上游和下游分别引入SalI和NotI酶切位点，

(上游引物)DdICE1-gateway-F(5′-GCGTCGACATGCTACCGGAAAACGACA-3′)

(下游引物)DdICE1-gateway-R(5′-TTGCGGCCGCGAAATGGCACCATGATAACCT-3′)

PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Sal I和Not I双酶切得到的DdICE1片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1构建成功，所述的DdICE1基因序列为SEQ ID NO.1。

(2)采用农杆菌介导法将步骤(1)构建的DdICE1基因植物表达载体转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。

上述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其在于步骤(2)中所述的采用农杆菌介导将DdICE1基因转入菊花的过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的DdICE1基因植物表达载体转入感受态的农杆菌中，挑选阳性克隆，摇菌至OD 0.5，离心后，弃上清，用MS(pH5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养基中培养3d，然后浸入上述备好的转入了DdICE1的植物表达载体的农杆菌菌液中侵染8～10min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再将其接种到共培养基上，暗培养3～5d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。所用的农杆菌菌株为EHA105。

上述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其在于菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；筛选培养基：MS+草胺磷(GFP)20mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+草胺磷(GFP)8mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L。

详细操作过程为：

从YEB(50ug/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。

取10uL pEarleyGate103-DdICE1载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800uL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。

以切花菊‘神马’叶片为外植体，取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cm*0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染8～10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3～5d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。

上述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其在于将转DdICE1基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR及半定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系：

(1)PCR检测

取生根筛选得到的草胺磷抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将GFP基因作为检测目标，根据GFP基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为434bp，引物序列为：

上游引物G1：ATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGA

下游引物G2：TGTTGTGGCGGGTCTTGAAGT

分别以草胺磷抗性植株和未转化植株DNA为模板，以G1和G2为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

(2)荧光定量RT-PCR检测

提取抗草胺磷植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为323bp，引物序列为：

上游引物I1：TTCACCTTCACAATCACACTCA，

下游引物I2：TGTTGGAAATGAAGCTAGGGTC；

以psaA扩增的基因片段为内标，片段长度为127bp，引物序列：

上游引物P1：CCAATAACCACGACCGCTAA，

下游引物P2：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

(3)半定量RT-PCR检测

用半定量RT-PCR对DdICE1基因的表达量进行检测，用特异性引物扩增，特异引物扩增出的片段长为323bp，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，引物序列为：

上游引物I1：TTCACCTTCACAATCACACTCA，

下游引物I2；TGTTGGAAATGAAGCTAGGGTC；

以psaA扩增的基因片段为内标，片段长度为127bp，引物序列：

上游引物P1：CCAATAACCACGACCGCTAA，

下游引物P2：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

上述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其在于对通过PCR、半定量RT-PCR及荧光定量RT-PCR分子检测所获得转基因植株后代进行抗性分析：

(1)采集转基因株系和未转化植株生长一致的脚芽叶片，进行不同低温胁迫处理，温度梯度为-3，-6，-9，-12，-15℃，并测定相对电导率，拟合Logistic回归方程，得到半致死温度(LT₅₀)，根据半致死温度进行脚芽恢复生长试验，处理温度为-6，-9℃，对照温度为23℃，低温处理后，将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况；

(2)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行干旱胁迫处理，处理后，将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况；

(3)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行盐胁迫处理，处理后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长两周，统计植株存活率并观察生长情况。

本发明所提供的通过转DdICE1基因提高切花菊抗逆性的方法具有如下优点：

本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，采用转基因技术，将DdICE1基因整合到菊花基因组中，通过低温、干旱及高盐试验分析获得抗低温、干旱及高盐的转基因菊花株系。结果发现，与未转基因植株相比，转入DdICE1基因的植株抗低温、干旱及高盐能力得到很大提高，利用本方法向菊花基因组中转入的DdICE1基因可以显著提高菊花的抗逆性。

附图说明

图1为植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1图谱。

图2为DdICE1琼脂糖凝胶电泳分析。

M：DNA Marker；1：DdICE1；2：pMD 19-T Simple-DdICE1质粒Sal I和Not I双酶切；

3：pEarleyGate103-DdICE1表达载体电泳检测图。

图3为转DdICE1基因切花菊的转化和再生过程。

A：转化叶盘分化出愈伤；B：转化叶盘分化出抗性芽；C：抗性芽生根；

D：抗性芽生根筛选长成完整植株；E：组培苗移栽至基质长成45d苗龄植株。

图4为转DdICE1基因植株的定量PCR检测结果。

M：DL2000 Marker

1：阳性质粒；2：野生型植株；3～24：转DdICE1的植株株系。

图5为定量及半定量RT-PCR检测外源基因在转基因寒菊中的表达。

A：半定量RT-PCR检测；B：定量RT-PCR检测；

WT：野生型植株；Ti1～Ti10：转DdICE1的植株株系。

图6为转基因植株与未转化植株半致死温度(LT₅₀)和脚芽恢复生长存活率分析。

A：转基因植株及未转化植株脚芽低温胁迫处理(-6℃，-9℃)和未胁迫处理(23℃)后恢复生长；

B：转基因植株及未转化植株低温处理后半致死温度；

C：转基因植株及未转化植株脚芽低温胁迫处理和未处理后的存活率。

图7为转基因植株与未转化植株干旱胁迫处理及盐胁迫处理后恢复生长存活率分析。

A：转基因植株及未转化植株脚芽干旱胁迫处理后恢复生长；

B：转基因植株及未转化植株脚芽干旱胁迫处理后恢复生长后存活率；

C：转基因植株及未转化植株脚芽盐胁迫处理后恢复生长；

D：转基因植株及未转化植株脚芽盐胁迫处理后恢复生长存活率。

图8为转基因植株与未转化植株干旱胁迫处理及盐胁迫处理后表型分析。

A：转基因植株及未转化植株脚芽干旱胁迫处理表型；

B：转基因植株及未转化植株脚芽盐胁迫处理表型。

具体实施方式

下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：

实施例1

1.植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1的构建

设计引物进行PCR反应，在目的基因DdICE1的上游和下游分别引入酶切位点Sal I和Not I，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒用Sal I和Not I双酶切得到的DdICE1片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应(Invitrogen，USA)，转化，提取阳性质粒。

上游引物DdICE1-gateway-F：5′-GCGTCGACATGCTACCGGAAAACGACA-3′

下游引物DdICE1-gateway-R：5′-TTGCGGCCGCGAAATGGCACCATGATAACCT-3′

以菊属异色菊叶片cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS RCR Buffer 5.0μL，DdICE1-gateway-F、DdICE1-gateway-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.6μL；反应程序：95℃预变性4min，然后94℃解链30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min 30sec，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN，USA)回收，连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-T Simple-DdICE1；

取gateway入门载体pENTR1A(Invitrogen，USA)和pMD 19-T Simple-DdICE1用Sal I和Not I双酶切，双酶切体系(50μL)：10×H Buffer 5μL，BSA 5μL，质粒pENTR1A或pMD19-T Simple-DdICE1 15μL，Sal I 2μL，Not I 2μL，ddH₂O 21μL；37℃反应3h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTR1A大片段和DdICE1片段。用T₄DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10μL)：10×T₄ ligase Buffer 1μL，pENTR1A大片段2μL，pMD19-T Simple-DdICE1小片段6μL，T₄DNA连接酶1μL；16℃过夜连接反应，取5μL连接产物转化TOP10感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pENTR1A-DdICE1。

取质粒pENTR1A-DdICE1用Nsi I单酶切，酶切体系(20μL)：10×RE Buffer 2μL，Acetylated BSA 2μL，质粒pENTR1A-DdICE1 10μL，Nsi I 1μL，ddH₂O 5μL；37℃反应3h，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pENTR1A-DdICE1大片段。将回收的片段与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，反应体系(5μL)：pENTR1A-DdICE1大片段3μL，pEarleyGate103质粒1μL，LR Clonase^TM II enzyme mix 1μL；25℃反应1h，加入1μL Proteinase K，37℃反应10min；取2μL重组产物转化TOP10感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pEarleyGate103-DdICE1，电泳和测序验证。植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1的构建成功(如图1、图2)。

2、农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取10μL pEarleyGate103-DdICE1载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。

采用的农杆菌指包含DdICE1基因的植物表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转基因植株后代命名为Ti，以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将异色菊(Dendranthema dichrum)中克隆得到的DdICE1基因导入菊花。取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cm*0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3～5d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株(图3)。

菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；筛选培养基：MS+草胺磷(GFP)20mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+草胺磷(GFP)8mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L。

2、将转DdICE1基因抗性植株进行分子检测(PCR、荧光定量RT-PCR及半定量RT-PCR)呈阳性，获得转基因菊花株系

1)PCR检测

取生根筛选得到的草胺磷抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将GFP基因作为检测目标，根据GFP基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为434bp，引物序列为：

上游引物G1：ATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGA，

下游引物G2：TGTTGTGGCGGGTCTTGAAGT。

分别以草胺磷抗性植株和未转化植株DNA为模板，以G1和G2为引物，进行PCR检测。扩增体系为：1μL DNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，1.5μL 2.5mmol·L^-1MgCl²，5U·μL^-1Taq酶0.2μL，G1和G2各1μL，去离子水补足25μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。图中可以看到，转DdICE1的植株中有16个株系扩增出与阳性对照相同的特异扩增带，6个株系没有扩增出此条带；野生型植株没有扩增出条带。

2)荧光定量RT-PCR检测

提取抗草胺磷植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对DdICE1基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(Green RealtimePCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，扩增条件：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃45s，40个循环。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的C_T值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物片段长为323bp，序列为：

上游引物I1：TTCACCTTCACAATCACACTCA，

下游引物I2；TGTTGGAAATGAAGCTAGGGTC；

以psaA扩增的基因片段为内标，片段长度为127bp，引物序列：

上游引物P1：CCAATAACCACGACCGCTAA，

下游引物P2：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

根据荧光定量RT-PCR检测结果(图5B)，与野生型相比，转DdICE1的植株株系基因表达量有所提高，Ti2、Ti3、Ti4株系表达量明显较高。证实外源基因已经转入切花菊基因组DNA中并表达。

3)半定量RT-PCR检测

采用TaKaRa公司生产的RNAiso Reagent试剂盒，提取抗草胺磷植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用半定量RT-PCR对DdICE1基因的表达量进行检测。用特异性引物扩增，扩增体系为：1μL DNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，1.5μL 2.5mmol·L^-1MgCl²，5U·μL^-1Taq酶0.2μL，特异性引物各1μL，去离子水补足25μL。特异引物片段长为323bp，序列为：

上游引物I1：TTCACCTTCACAATCACACTCA，

下游引物I2；TGTTGGAAATGAAGCTAGGGTC；

以psaA扩增的基因片段为内标，片段长度为127bp，引物序列：

上游引物P1：CCAATAACCACGACCGCTAA，

下游引物P2：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

预备试验：分别用五个不同循环数(27、30、33、36、39)对内标基因和目的基因进行扩增，分析扩增产物的1％琼脂凝胶电泳结果，以条带亮度作为选择循环数的根据。最后明确，内标基因和目的基因在33个循环数时都在RT-PCR反应产物积累的线性增长阶段，所以确定33个循环数为RT-PCR检测的扩增循环数。扩增条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，33个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

半定量RT-PCR检测结果(图5A)与定量RT-PCR(图5B)情况一致，转DdICE1的10个株系特异基因片段的扩增条带都亮于野生型的扩增条带，且Ti2、Ti3、Ti4株系表达量明显较高。证实外源基因已经转入切花菊基因组DNA中并转录。

3、转基因植株后代的抗性分析

1)转基因株系及野生型植株不同低温胁迫下相对电导率回归方程、半致死温度(LT₅₀)和脚芽恢复生长存活率分析

采集转基因株系和未转化植株生长一致的脚芽叶片各约10g，先用自来水冲洗干净，然后用去离子水漂洗3次，在滤纸上吸干。将叶片分成5份，每份约3g，用湿纱布包好置于试管中，于4℃冰箱过夜。第2天在低温循环仪(Polyscience公司，Mode：19610)中进行低温处理。根据当月平均温度设置温度梯度为-3，-6，-9，-12，-15℃。供试材料在各温度下冷冻1h，匀速降温30min，处理后置于4℃冰箱解冻4h后将每处理分成3等份(3个重复)，各0.25g置于试管中，加入去离子水30ml，在室温下浸提16h。第3天用电导仪(上海康仪仪器，Mode：DDS-320)测定电导率，然后置于沸水浴中20min，冷却后测定其煮沸电导率。相对电导率(REC，％)＝冰冻电导率/煮沸电导率×100。相对电导率拟合Logistic回归方程为：y＝K/(1+ae^-bx)。其中y代表细胞伤害率，x代表处理温度，K为细胞伤害率的饱和容量，a、b为方程参数。为了确定a，b的值，将方程进行线性化处理，ln[(K-y)/y]＝lna^-bx，令y1＝ln[(K-y)/y]，则转化为细胞伤害率(y₁)与处理温度(x)的直线方程。通过直线回归的方法求得a，b值及相关系数R，半致死温度LT₅₀＝ln[(1/a)]/b(盖钧镒，2000)。所得数据统一使用SYSTAT 7.0(SYSTAT，1997)软件进行单因素方差分析(表1)。

根据半致死温度进行脚芽恢复生长试验，处理温度为-6，-9℃，对照温度为23℃。低温处理后，将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗种植于营养钵中，栽培基质为按1∶1比例混和的泥炭∶珍珠岩混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中恢复生长两周，然后统计存活率并拍照。

如表1，图6B，与野生型(WT)相比，转基因株系(Ti2、Ti3、Ti4)半致死温度明显较低，而转反义的株系半致死温度要较高。由图6A，C可知，与未转化植株相比，Ti2的存活率明显较高。脚芽恢复生长试验与半致死温度测定结果基本一致，表明半致死温度可作为转基因菊花抗寒性评价的一个可靠指标。

表1转基因植株及野生型植株不同低温胁迫下相对电导率回归方程及半致死温度

注：表中数值为平均值±标准误差，A、B、C、D代表经Tukey检验为显著差异(P＜0.05)

2)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系Ti2及野生型植株进行干旱胁迫处理。将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗各20棵种植于营养钵中，栽培基质为按1∶1比例混和的泥炭∶珍珠岩混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中，待植株展叶8～10片时即可进行干旱胁迫处理，各株充分浇水，然后置于光照培养箱(温度为35℃，相对湿度为30％)中，控水处理9天(d)，然后将温度降至23℃，浇足水恢复生长两周，统计植株存活率。

由图8A可以看出，在水分亏缺下，与野生型植株相比，Ti2转基因株系萎蔫进程较慢，受到的胁迫伤害较轻；由图7A，B可以看出，干旱胁迫处理后，Ti2转基因株系的大部分植株顶端仍然保持绿色，只有基部叶片皱缩、萎蔫下垂；恢复生长后，存活率为90％；而野生型植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率只有40％。

3)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系Ti2及野生型植株进行盐胁迫处理。将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗各20棵种植于营养钵中，栽培基质为按1∶1比例混和的泥炭∶珍珠岩混和物，种植于温室(23土2℃，12h光周期)中，待转基因及未转基因植株展叶8～10片时控水处理4d，然后浇灌NaCl溶液15d，以5d为周期逐渐提高NaCl溶液浓度，分别为100mM、200mM、300mM，然后将植株根系用去离子水冲洗3遍，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长两周，统计植株存活率。

由图8B可以看出，随着NaCl溶液浓度逐渐提高，与未转基因植株相比，Ti2转基因株系萎蔫进程较慢，只有基部部分叶片萎蔫。由图7C，D可以看出，野生型植株只有少部分植株顶端保持绿色，叶片大部分皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率只有60％；而Ti2转基因株系的大部分植株仍然保持绿色，只有基部叶片皱缩、萎蔫下垂，恢复生长后，存活率为100％。

Claims (6)

1.一种通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)构建DdICE1基因植物表达载体：以菊属异色菊cDNA为模板，设计引物进行PCR反应，在目的基因DdICE1的上游和下游分别引入Sal I和Not I酶切位点，上游引物DdICE1-gateway-F：SEQ ID NO.2，下游引物DdICE1-gateway-R：SEQ ID NO.3，PCR产物连接到pMD19-T Simple载体，转化TOP10感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Sal I和Not I双酶切得到的DdICE1片段与Sal I和Not I双酶切的pENTR1A连接，转化，提取的阳性质粒经Nsi I单酶切线性化后与pEarleyGate103载体质粒进行LR重组反应，得到DdICE1基因植物表达载体pEarleyGate103-DdICE1，所述的DdICE1基因的序列为SEQID NO.1；

(2)采用农杆菌介导法将步骤(1)构建的DdICE1基因植物表达载体转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。

2.根据权利要求1所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于步骤(2)中所述的采用农杆菌介导将DdICE1基因转入菊花的过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(1)中构建的DdICE1基因植物表达载体转入感受态的农杆菌中，挑选阳性克隆，摇菌至OD 0.5，离心后，弃上清，用MS(pH5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养基中培养3d，然后浸入上述备好的转入了DdICE1的植物表达载体的农杆菌菌液中侵染8～10min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再将其接种到共培养基上，暗培养3～5d，然后转入筛选培养基上继代培养3～4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。

3.根据权利要求2所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.5mg/L；筛选培养基：MS+草胺磷20mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6-苄氨基嘌呤1mg/L+萘乙酸0.1mg/L；生根培养基：1/2MS+草胺磷8mg/L+萘乙酸0.1mg/L。

4.根据权利要求1或2所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于所用的农杆菌菌株为EHA105。

5.根据权利要求1或2所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于将转DdICE1基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR及半定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系：

(1)PCR检测

取生根筛选得到的草胺磷抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将GFP基因作为检测目标，根据GFP基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长为434bp，引物序列为：

上游引物G1：ATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGA

下游引物G2：TGTTGTGGCGGGTCTTGAAGT

分别以草胺磷抗性植株和未转化植株DNA为模板，以G1和G2为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

(2)荧光定量RT-PCR检测

提取抗草胺磷植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为323bp，引物序列为：

上游引物I1：TTCACCTTCACAATCACACTCA，

下游引物I2：TGTTGGAAATGAAGCTAGGGTC；

以psaA扩增的基因片段为内标，片段长度为127bp，引物序列：

上游引物P1：CCAATAACCACGACCGCTAA，

下游引物P2：CACAGTCCTCCCAAGTAA；

(3)半定量RT-PCR检测

用半定量RT-PCR对DdICE1基因的表达量进行检测，用特异性引物扩增，特异引物扩增出的片段长为323bp，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，引物序列为：

上游引物I1：TTCACCTTCACAATCACACTCA，

下游引物I2；TGTTGGAAATGAAGCTAGGGTC；

以psaA扩增的基因片段为内标，片段长度为127bp，引物序列：

上游引物P1：CCAATAACCACGACCGCTAA，

下游引物P2：CACAGTCCTCCCAAGTAA。

6.根据权利要求5所述的通过转DdICE1基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于对通过PCR、半定量RT-PCR及荧光定量RT-PCR分子检测所获得转基因植株后代进行抗性分析：

(1)采集转基因株系和未转化植株生长一致的脚芽叶片，进行不同低温胁迫处理，温度梯度为-3，-6，-9，-12，-15℃，并测定相对电导率，拟合Logistic回归方程，得到半致死温度(LT₅₀)，根据半致死温度进行脚芽恢复生长试验，处理温度为-6，-9℃，对照温度为23℃，低温处理后，将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况；

(2)转基因株系及野生型植株干旱胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的干旱胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行干旱胁迫处理，处理后，将转基因及未转基因植株脚芽扦插苗种植于营养钵中恢复生长两周，然后统计存活率并观察生长情况；

(3)转基因株系及野生型植株盐胁迫处理后恢复生长存活率分析

为检测转基因植株的盐胁迫耐性，对转基因株系及野生型植株进行盐胁迫处理，处理后将植株根系用去离子水冲洗，并种植于新营养钵中浇足水恢复生长两周，统计植株存活率并观察生长情况。

Images