CN114680046A - 一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法 - Google Patents

一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法。属于植物营养、组织培养、栽培技术领域。步骤如下：选择携带目标嵌合体观赏性状叶片的腋芽作为外植体；将外植体消毒后接种到诱导培养基Ⅰ，之后放置于培养室，诱导潜伏腋芽萌发；培养室温度、光照、湿度条件的控制；潜伏腋芽诱导20～50d，长出芽后，接种到丛生芽增殖培养基Ⅱ，培养20～40d，待形成丛生侧芽后再次继代转接；将丛生侧芽经复壮后转接到诱导生根培养基Ⅳ，之后放置于培养室暗培养；组培苗生根定植后暗培养4～5d后移至温室大棚，在自然光下驯化，之后出瓶移栽。相对目前嵌合体组培扩繁的技术，本发明方法稳定可靠高效，不额外增加成本，环保。

Description

一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法
技术领域
本发明涉及植物营养、组织培养、栽培技术领域，更具体的说是涉及一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法。
背景技术
彩叶植物兼具观花类植物和观叶植物二者的优点，一方面，彩叶植物既有如同花朵般艳丽的色泽，又有很长的观赏期(因为其观赏器官也是叶片所以相对于花朵对环境有很强的适应性)；另一方面相对开花植物，彩叶植物对设施要求、能源消耗更低，而利润附加值更高。
现代农业技术——植物组织培养技术的发展已经使得很多植物的量产不再受到种苗数量不足的限制。但是目前在嵌合体植物的组培扩繁中仍存在很大问题：组培扩繁的子代种苗中嵌合体性状不能得到稳定保留，子代种苗很大一部分变为不同于嵌合体性状的纯合体。例如在叶片携带金边(白边)的、花瓣金边或红色边的蝴蝶兰经过目前组织培养扩繁后子代种苗中会有不少苗无法保留绿叶镶金边这种优良的观赏性状，一分部苗变为纯绿叶植株观赏价值下降，另一部分则为纯白化(黄色)的植株因缺少叶绿素无法光合作用合成养分而最终难以成活。
嵌合体植物和纯合体植物的区别在于嵌合体是一遗传镶嵌现象，在顶端分生组织中存在遗传基础不同的细胞。嵌合体中遗传不同的二异质细胞并未融合，仅仅是一种嵌合状态(融合者则为嵌合杂种即核内外已是高度融合)。
组培生产中嵌合体性状不稳定存在于几方面：①一般来说只有在分生组织中或器官原基中存在嵌合现象才能保留持久，如遗传基础不同的细胞在某一器官原基中，嵌合态仅限于那个器官。而且为了保持嵌合态顶端分生组织必须包含2种以上遗传源细胞。经笔者大量实验得知腋芽作为扩繁材料高稳定，而顶芽作为扩繁材料虽增长快但不稳定，这点需要作为嵌合体组培扩繁中稳定性保持能力的内因来遵循。作为组培扩繁的取材不准确是子代种苗嵌合体性状不稳定的一个重要原因；②构成嵌合体的遗传不同的细胞的最适增殖、生长条件有差异，且其各分生组织细胞在生长发育过程中生长速率不同存在强烈的竞争，如不有目的的，会造成不同遗传细胞选择优势的出现，而失去嵌合性状发展为不同性状的纯合体子代。不能针对性修饰培养基组成成分来获得遗传不同的细胞增长的一致性是另一个子代种苗嵌合体性状不稳定的一个重要原因；③不同于植株的顶芽、腋芽，不定芽来源于不同的分生组织，极易丧失嵌合体性状。所以组培扩繁工作中技术层面上因为使用植物生长调节剂不合适等因素而产生来源于不定芽的子代种苗是子代种苗嵌合体性状不稳定的又一个重要原因。
目前从植物生物发育学角度阐述嵌合体形成细胞构成；在组织层面上阐述其不同遗传物质细胞构成、分布对器官、植株嵌合体表型的影响等方面的研究工作及研究文献较多，但是在应用层面上从嵌合体分生组织不同遗传细胞生理习性、其生长所需条件的差异出发，运用调整营养成分、信号物质成分、环境条件等措施，通过协调分生组织中不同遗传细胞的生长速率，促其生长一致性而达到种苗扩繁中稳定保留嵌合体优良性状的研究鲜有报道。
而从业研究工作者在工作中多只注重扩繁材料的选择，少有关注培养基营养成分(如碳氮比、不同遗传物质细胞对氮型态比例、不同类碳水化合物的偏爱等)、如何抑制易发生基因突变的不定芽等方面入手解决，这也是现组培扩繁技术工作中植物嵌合体性状保留不稳定的主要原因。
综上，如何提供一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法。本发明方法从调整培养基营养物质成分、信号物质成分、环境条件等措施入手，通过协调分生组织中不同遗传细胞的生长速率促其生长一致性，获得再生子代稳定保留嵌合性状的增殖扩繁苗。旨在解决彩叶嵌合体观赏植物组培生产中子代种苗性状的不稳定对产业发展的限制问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，包括如下步骤：
(1)材料选择：
选择携带目标嵌合体观赏性状叶片的腋芽作为组培快繁的外植体；
(2)外植体消毒、接种诱导潜伏腋芽萌发：
将所述外植体消毒后接种到诱导培养基Ⅰ，之后放置于培养室，诱导潜伏腋芽萌发；
(3)培养室环境条件控制：
包括温度、光照、湿度条件的控制；
(4)腋芽增殖扩繁：
潜伏腋芽诱导20～50d，长出芽后，接种到丛生芽增殖培养基Ⅱ，培养20～40d，待形成丛生侧芽后再次继代转接；
(5)诱导发根：
将丛生侧芽经复壮后转接到诱导生根培养基Ⅳ，之后放置于培养室暗培养；
(6)组培苗驯化和移栽：
组培苗生根定植后在培养室暗培养4～5d后移至温室大棚，在自然光下驯化，之后出瓶移栽。
所取得的有益效果：①选择稳定、适合的扩繁外植体，从内因上确保扩繁材料的稳定性；②调节培养基基本成分，通过调节培养基碳氮比、使用不同类型的碳水化合物、优化氮型态比例等方面降低培养基成分造成选择性地偏爱(营养、温、光、植物生长调节剂)一种类型的细胞生长的情况，促两种不同遗传物质细胞增长的一致性来确保嵌合性状的稳定性；③对培养基中植物生长调节剂、生长抑制剂协调配合使用而达到通过丛生定芽(腋芽)途径增殖，而抑制基因突变不定芽的发生，促扩繁再生子代苗的性状稳定。
进一步的，步骤(1)的具体操作为：选择携带目标嵌合体观赏性状彩叶的植株，取带有目标嵌合体观赏性状叶片的茎段，仅取叶部位的休眠腋芽作为扩繁的外植体，顶芽和其他的组织器官抛弃不用。
进一步的，步骤(2)中所述外植体消毒的具体操作为：将带有目标嵌合体观赏性状叶片的茎段的叶片自叶迹处切下，不可伤到潜伏腋芽，只留带腋芽的茎段先用75％的酒精溶液浸泡30～60s，之后用质量浓度0.1％的升汞+质量浓度0.1％的吐温-20混合液震荡消毒14～18min，最后用无菌水清洗3～4遍，晾干。
进一步的，步骤(2)中所述诱导培养基Ⅰ包括如下质量浓度的组分：硝酸钾0.95g/L、硝酸铵0.85g/L、磷酸二氢钾0.09g/L、7水合硫酸镁0.185g/L、2水合氯化钙0.22g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L+Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖25g/L、NAA 0.1～0.2mg/L、GA3 0.1～0.3mg/L、6-BA 2～8mg/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
进一步的，步骤(3)中的具体参数为：培养室温度25±1℃；光照1200lux，光照12h/d光周期；相对湿度70～75％。(生根苗驯化组培材料都在该环境条件下培养管理)。
进一步的，步骤(4)中，所述丛生芽增殖培养基Ⅱ中包括如下质量浓度的组分：硝酸钾1.1g/L、硝酸铵0.4g/L、7水硫酸镁0.13g/L、2水氯化钙0.12g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、酪蛋白1g/L、柠檬酸0.15g/L、AVG 30μg/L、TIBA 2～3mg/L、IAA 0.05～0.2mg/L、6-BA 3～8mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇5mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖10g/L、葡萄糖10g/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
进一步的，步骤(4)中，若形成的丛生侧芽增殖系数低于2倍，则继续用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养；若形成的丛生侧芽增殖系数高于3.5倍，则转接到复壮培养基Ⅲ继代培养，待芽体叶生长发育正常后，再次用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养；
每1000mL所述复壮培养基Ⅲ为在丛生芽增殖培养基Ⅱ的基础上添加NAA 0.03～0.1mg、GA3 0.1～0.3mg、6-BA 2～3mg和AVG 30μg，PH为6.0。
进一步的，步骤(4)的具体操作为：潜伏腋芽诱导20～50d(根据材料种生理特性不同而有异)长出芽后，将其从原先的茎段上切下后接种到丛生芽增殖培养基Ⅱ，放置于培养室管理。培养20～40d(根据材料种生理特性不同而有异)，待形成丛生侧芽后再次继代转接。若形成的丛生侧芽增值系数低于2倍则继续用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养，若形成的丛生侧芽增殖系数高于3.5倍，则将芽团切成小块转接到复壮培养基Ⅲ继代培养，待芽体叶生长发育正常后，再次用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养。在整个增殖过程中丛生芽增殖培养基Ⅱ和复壮培养基Ⅲ根据芽体的增殖系数和健壮度情况交替使用。
进一步的，步骤(5)中所述诱导生根培养基Ⅳ中包括如下质量浓度的组分：硝酸钾1.2g/L、硝酸铵0.32g/L、7水硫酸镁0.11g/L、2水氯化钙0.15g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、NAA 0.03～0.1mg/L、IBA 0.1～0.5mg/L、复硝酚钠0.1～0.3mg/L、白砂糖25g/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
进一步的，步骤(6)中所述驯化的具体操作为：驯化期间控制温度25～28℃，光照强度3000～8000lux(逐渐升高)，25～60d可出瓶移栽。
进一步的，步骤(6)中所述出瓶移栽的具体操作为：用镊子将生根组培苗从容器中取出，清洗掉根部黏连的琼脂，控掉水分，用基质水苔包好根系栽培于72孔穴盘，放于温室设施内开始栽培管理。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：本发明方法从调整培养基营养物质成分、信号物质成分、环境条件等措施入手，通过协调分生组织中不同遗传细胞的生长速率促其生长一致性，获得再生子代稳定保留嵌合性状的增殖扩繁苗。相对目前在嵌合体组培扩繁的技术，本发明方法稳定可靠高效，不额外增加生产成本，环保不污染环境。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明实施例2的原性状图；
图2附图为本发明实施例2的子代绿纯图；
图3附图为本发明实施例2的子代白纯图；
图4附图为本发明实施例3的原性状图；
图5附图为本发明实施例3的性状缺失表现例Ⅰ；
图6附图为本发明实施例3的性状缺失表现例Ⅱ。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
步骤1、材料选择：
选择携带目标嵌合体观赏性状彩叶的植株，取带有目标嵌合体观赏性状叶片的茎段，仅取叶部位的休眠腋芽作为扩繁的外植体，顶芽和其他的组织器官抛弃不用。
步骤2、外植体消毒、接种诱导潜伏腋芽萌发：
将带有目标嵌合体观赏性状叶片的茎段的叶片自叶迹处切下，不可伤到潜伏腋芽，只留带腋芽的茎段先用75％的酒精溶液浸泡30～60s后取出晾干。再用质量浓度0.1％的升汞+质量浓度0.1％的吐温-20的混合溶液震荡消毒14～18min。之后用无菌水清洗3～4遍后晾干接种到诱导培养基Ⅰ。接种后放置在培养室管理观察。
诱导培养基Ⅰ包括如下质量浓度的组分：硝酸钾0.95g/L、硝酸铵0.85g/L、磷酸二氢钾0.09g/L、7水合硫酸镁0.185g/L、2水合氯化钙0.22g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L+Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖25g/L、NAA0.1～0.2mg/L、GA3 0.1～0.3mg/L、6-BA 2～8mg/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
步骤3、培养室环境条件控制：
培养室温度25±1℃；光照荧光灯1200lux，光照12h/d光周期；除湿机控制室内相对湿度70～75％。生根苗驯化组培材料都在该环境条件下培养管理。
步骤4、腋芽增殖扩繁：
潜伏腋芽诱导20～50d(根据材料种生理特性不同而有异)长出芽后，将其从原先的茎段上切下后接种到丛生芽增殖培养基Ⅱ放置于培养室管理。丛生芽增殖培养基Ⅱ培养20～40d(根据材料种生理特性不同而有异)待形成丛生侧芽后再次继代转接。如果所形成的丛生侧芽增殖系数低于2倍则继续用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养；如果形成丛生芽增值系数高于3.5倍，则将芽团切成小块转接到复壮培养基Ⅲ继代培养。复壮培养基Ⅲ上培养待芽体叶生长发育正常后，再次用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养。在整个增殖过程中丛生芽增殖培养基Ⅱ和复壮培养基Ⅲ根据苗芽体的增殖系数和健壮度情况交替使用，直到苗的数量达到预产量。
丛生芽增殖培养基Ⅱ包括如下质量浓度的组分：硝酸钾1.1g/L、硝酸铵0.4g/L、7水硫酸镁0.13g/L、2水氯化钙0.12g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、酪蛋白1g/L、柠檬酸0.15g/L、AVG 30μg/L、TIBA 2～3mg/L、IAA 0.05～0.2mg/L、6-BA 3～8mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇5mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖10g/L、葡萄糖10g/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
复壮培养基Ⅲ：丛生芽增殖培养基Ⅱ的基本培养基+NAA 0.03～0.1mg+GA3 0.1～0.3mg+6-BA 2～3mg+AVG 30μg。PH为6.0。
步骤5、诱导发根：
增殖扩繁达到预产数量，丛生芽经过复壮后单株分切转接到诱导生根培养基Ⅳ，放置于培养室暗培养。
诱导生根培养基Ⅳ包括如下质量浓度的组分：硝酸钾1.2g/L、硝酸铵0.32g/L、7水硫酸镁0.11g/L、2水氯化钙0.15g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、NAA0.03～0.1mg/L、IBA 0.1～0.5mg/L、复硝酚钠0.1～0.3mg/L、白砂糖25g/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
步骤6、组培苗驯化和移栽：
组培苗生根定植后在培养室暗培养4～5d后移到温室大棚，在自然光下驯化。驯化期温室控制温度25～28℃，光照强度3000～8000lux(逐渐升高)。25～60d可出瓶移栽。用镊子将生根组培苗从容器中取出，清洗掉根部黏连的琼脂，控掉水分，小苗用基质水苔包好根系栽培于72孔穴盘，放于温室设施内开始栽培管理。
实施例2
蝴蝶兰小花品种镶边‘小飞象’的花梗潜伏芽取材诱导营养芽后组培增殖扩繁和再生。
2019年1月份从市场购买开花2～3朵的蝴蝶兰镶边‘小飞象’，取材花梗潜伏芽，将花梗顶芽和潜伏腋芽分开编号。增殖扩繁培养基分别用本发明实施例1(下称技术1)：(丛生芽增殖培养基Ⅱ+复壮培养基Ⅲ)；对照方法(下称技术2)：培养基Ⅴ；
培养基Ⅴ：包括如下质量浓度的组分：硝酸钾0.64g/L、硝酸铵0.55g/L、7水硫酸镁 0.13g/L、2水氯化钙0.15g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫 酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化 钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸 0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖20g、NAA 0.2mg/L、6-BA 6mg/L、椰子水100ml、琼脂6g，PH为6.0。
具体实施步骤如下：
①消毒：
花梗潜伏芽腋芽、顶芽用手术刀截下，留芽点上部0.5cm下部1.5cm，先用75％的酒精溶液搅拌浸泡消毒50s后取出晾干。剥去外面的苞叶露出芽点，再用质量浓度0.1％的升汞+质量浓度0.1％的吐温-20的混合溶液震荡分别消毒18min和15min(腋芽18min，顶芽15min)，用无菌水清洗3遍后晾干，接种到蝴蝶兰腋芽启动培养基，接种后放置在培养室管理观察。
蝴蝶兰花梗潜伏芽启动培养基包括如下质量浓度的组分：花宝2号1g/L、白砂糖14g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、NAA0.2、6-BA4mg和琼脂6g，PH为6.0。
②培养室温度25±1℃；光照荧光灯1200lux，光照12h/d光周期；除湿机控制室内相对湿度70～75％。生根苗驯化和组培材料都在该环境条件下培养管理。
③增殖扩繁：
诱导培养基培养50d后切下诱导出的启动芽。分别用技术1：两次丛生芽增殖培养基Ⅱ继代培养后第三次用复壮培养基Ⅲ继代培养，继代周期35～40d；技术2：用培养基Ⅴ继代增殖培养，培养周期35～40d。技术1和技术2接种相同的外植体数，后期转接管理中都同步进行。花梗顶芽诱导启动后用技术2的培养基Ⅴ增殖，转接管理同上。
④复壮：
两个增殖技术体系各继代增殖8次，单个分切，转入蝴蝶兰复壮培养基Ⅵ。
蝴蝶兰复壮培养基Ⅵ包括如下质量浓度的组分：花宝1号3g/L、白砂糖25g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、蛋白胨3g/L、椰子水90ml、琼脂6g/L、活性炭1g/L和香蕉泥40g/L，PH为5.8。
⑤诱导生根：
蝴蝶兰复壮培养基Ⅵ接种后培养室内培养45～50d后茎苗高度达到2.5～3cm，转接到诱导生根培养基Ⅳ。培养室培养4～5d后转到温室继续培养驯化。驯化60d可出瓶移栽管理。
移栽后统计结果如下表1。
表1蝴蝶兰镶边‘小飞象’嵌合性状保留扩繁结果
Figure BDA0003610853640000101
表明增殖扩繁技术1(丛生芽增殖培养基Ⅱ+复壮培养基Ⅲ)体系从增殖扩繁效率和子代苗嵌合体保留稳定性方面皆优于目前常规之技术2。
实施例3
天南星科(Araceae Juss.)嵌合体彩叶植物彩叶粗肋草(Aglaonema Schott)‘吉利红’选具有目标嵌合体叶的植株取材。
2018年9月份从市场获得带嵌合体叶片的粗肋草‘吉利红’盆栽苗。增殖扩繁培养基分别用本发明实施例1(下称技术1)：(丛生芽增殖培养基Ⅱ+复壮培养基Ⅲ)；对照方法为目前生产所用常规方法(下称技术3)：培养基Ⅶ；
培养基Ⅶ：1/2MS培养基+白砂糖30g+NAA0.1mg+6-BA 5～8mg+琼脂6g，PH为6.0。
具体实施步骤如下：
①只取材嵌合体叶片所带的腋芽和株顶芽，分开编号。
②外植体消毒、接种诱导：
将取材的带叶茎段的叶片自叶迹处切下，不可伤到潜伏腋芽。只留带腋芽的茎段先用75％的酒精溶液搅拌浸泡消毒60s后取出晾干。再用质量浓度0.1％的升汞+质量浓度0.1％的吐温-20的混合溶液震荡消毒16min，用无菌水清洗3～4遍后晾干接种到诱导培养基Ⅰ。接种后放置在培养室管理观察。
③培养室温度25±1℃；光照荧光灯1200lux，光照12h/d光周期；除湿机控制室内相对湿度70～75％。生根苗驯化和组培材料都在该环境条件下培养管理。
④增殖扩繁：
诱导培养基Ⅰ培养45d后切下诱导出的启动芽。分别用技术1：两次丛生芽增殖培养基Ⅱ继代培养后第三次用复壮培养基Ⅲ继代培养，继代周期30～40d；技术2：用培养基Ⅶ继代增殖培养，培养周期30～40d。技术1和技术2后期转接管理中都同步进行。株顶芽诱导启动后用技术1增殖，转接管理同上。
⑤诱导生根：
两种技术体系同时转接6代，培养45d后，转接到生根培养基Ⅳ诱导再生。培养室培养4～5d后转到温室驯化。驯化60d可出瓶移栽管理。
移栽后统计结果如下表2。
表2粗肋草‘吉利红’嵌合性状及性状保留扩繁结果
Figure BDA0003610853640000111
表明增殖扩繁技术1(丛生芽增殖培养基Ⅱ+复壮培养基Ⅲ)体系从增殖扩繁效率和子代苗嵌合体保留稳定性方面皆优于目前常规之技术3。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)材料选择：
选择携带目标嵌合体观赏性状叶片的腋芽作为组培快繁的外植体；
(2)外植体消毒、接种诱导潜伏腋芽萌发：
将所述外植体消毒后接种到诱导培养基Ⅰ，之后放置于培养室，诱导潜伏腋芽萌发；
(3)培养室环境条件控制：
包括温度、光照、湿度条件的控制；
(4)腋芽增殖扩繁：
潜伏腋芽诱导20～50d，长出芽后，接种到丛生芽增殖培养基Ⅱ，培养20～40d，待形成丛生侧芽后再次继代转接；
(5)诱导发根：
将丛生侧芽经复壮后转接到诱导生根培养基Ⅳ，之后放置于培养室暗培养；
(6)组培苗驯化和移栽：
组培苗生根定植后在培养室暗培养4～5d后移至温室大棚，在自然光下驯化，之后出瓶移栽。
2.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)中所述外植体消毒的具体操作为：将所述外植体先用75％的酒精溶液浸泡30～60s，之后用质量浓度0.1％的升汞+质量浓度0.1％的吐温-20混合液震荡消毒14～18min，最后用无菌水清洗3～4遍，晾干。
3.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)中所述诱导培养基Ⅰ包括如下质量浓度的组分：硝酸钾0.95g/L、硝酸铵0.85g/L、磷酸二氢钾0.09g/L、7水合硫酸镁0.185g/L、2水合氯化钙0.22g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖25g/L、NAA0.1～0.2mg/L、GA30.1～0.3mg/L、6-BA 2～8mg/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
4.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)中的具体参数为：培养室温度25±1℃；光照1200lux，光照12h/d光周期；相对湿度70～75％。
5.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)中，所述丛生芽增殖培养基Ⅱ中包括如下质量浓度的组分：硝酸钾1.1g/L、硝酸铵0.4g/L、7水硫酸镁0.13g/L、2水氯化钙0.12g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、酪蛋白1g/L、柠檬酸0.15g/L、AVG 30μg/L、TIBA 2～3mg/L、IAA 0.05～0.2mg/L、6-BA 3～8mg/L、盐酸硫胺素10mg/L、盐酸吡哆醇5mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、白砂糖10g/L、葡萄糖10g/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
6.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)中，若形成的丛生侧芽增殖系数低于2倍，则继续用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养；若形成的丛生侧芽增殖系数高于3.5倍，则转接到复壮培养基Ⅲ继代培养，待芽体叶生长发育正常后，再次用丛生芽增殖培养基Ⅱ转接培养；
每1000mL所述复壮培养基Ⅲ为在丛生芽增殖培养基Ⅱ的基础上添加NAA 0.03～0.1mg、GA30.1～0.3mg、6-BA 2～3mg和AVG 30μg，PH为6.0。
7.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(5)中所述诱导生根培养基Ⅳ中包括如下质量浓度的组分：硝酸钾1.2g/L、硝酸铵0.32g/L、7水硫酸镁0.11g/L、2水氯化钙0.15g/L、磷酸二氢钾0.16g/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、4水合硫酸锰22.3mg/L、7水合硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、5水合硫酸铜0.025mg/L、6水合氯化钴0.025mg/L、7水合硫酸亚铁28.7mg/L、Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L、肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、甘氨酸2mg/L、NAA0.03～0.1mg/L、IBA0.1～0.5mg/L、复硝酚钠0.1～0.3mg/L、白砂糖25g/L和琼脂6g/L，PH为6.0。
8.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(6)中所述驯化的具体操作为：驯化期间控制温度25～28℃，光照强度3000～8000lux，25～60d可出瓶移栽。
9.如权利要求1所述的一种保持彩叶嵌合体观赏植物性状稳定的组培快繁方法，其特征在于，步骤(6)中所述出瓶移栽的具体操作为：用镊子将生根组培苗从容器中取出，清洗掉根部黏连的琼脂，控掉水分，用基质水苔包好根系栽培于72孔穴盘，放于温室设施内开始栽培管理。
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