CN116746486A - 一种提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法 - Google Patents
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- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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Abstract
本发明涉及天冬的组培方法，公开了一种提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其中生根预处理培养基包括基础培养基、2.5‑3.0mg/L植物生长调节剂、0.01‑0.5mg/L三碘苯甲酸，通过本发明的预分化诱导培养基，能够有效的提高天门冬根丛的生根率，能够实现天门冬大量繁殖的需求。
Description
技术领域
本发明涉及天冬的组培方法，特别涉及一种提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法。
背景技术
天冬是百合科天门冬属植物天冬(Asparagus cochinchinensis(Lour.)Merr.)的干燥块根，也被称为明天冬或者天门冬，是一种常见药食兼用药材，以干燥块根入药或入膳，其主要有效成分为氨基酸、多糖、皂苷等，有养阴生津、润肺清心的功能，具有治疗肺结核、支气管炎、白喉、百日咳、糖尿病和大便燥结等作用。
目前，随着人们生活水平和保健意识的不断增强，天冬的市场需求量大增，但野生天冬资源急剧下降，急需依靠人工栽培满足天冬日益增长的需求，而组培技术实现了天冬大量繁殖的需求。
天门冬组培步骤一般包括从(1)外植体诱导愈伤及腋芽、(2)根丛诱导培养、(3)根丛增殖培养、(5)根丛生根培养，其中步骤(2)和步骤(3)的目的是对步骤(1)的芽进行诱导增殖，产生大量的小根丛，，最后通过(4)生根培养使得步骤(3)的根丛产生肉质根，天门冬肉质块根的生长情况与步骤(4)的生根培养有关息息相关。目前针对天门冬生根难、生根率低和生根不一致的问题，技术人员主要是在天门冬生根阶段，主要通过调配不同植物生长调节剂及浓度或者采用“两段生根法”(即不同阶段采用不同蔗糖浓度)实现的天门冬生根诱导,天门冬肉质根诱导率60％，如专利CN201710141841.8一种针对兴安天门冬的组培快繁方法。
三碘苯甲酸常见的生根剂，应用在植物组培时，一般应用在生根培养阶段培养基中。在植物组培时，在培养基中加入活性炭，可利用其吸附作用，减少有害物质的影响，同时活性炭使培养基变黑，有利于植物生根，对植物形态变化和器官形成有良好效应。一般认为在植株的生根诱导中，加入活性炭可以有助于植株肉质根的生长。
本专利天冬肉质根的诱导过程主要为：天冬芽初代诱导，愈伤诱导，愈伤分化，丛生芽增殖阶段，生根预处理阶段(也可称根原基诱导阶段)，天冬肉质根诱导阶段。预处理阶段主要用于诱导根丛的根原基，并非可以等同于边增殖边生根。
发明内容
为此，需要提供一种提高天门冬肉质块根诱导率的诱导培养基及其应用，解决现有天门冬组培生根难、肉质根诱导率低的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，包括以下步骤：
(1)生根预处理：使用生根预处理培养基对增殖后的天门冬根丛进行预处理，生根预处理培养基包括基础培养基、2.5-3.0mg/L植物生长调节剂、0.01-0.5mg/L三碘苯甲酸，生根预处理培养基不包括活性炭；
(2)生根诱导：步骤(1)处理后的天门冬根丛转移至生根培养基进行生根培养，所述生根培养基包括基础培养基、0.5-3g/L活性炭、2.0-3.0mg/L植物生长调节剂。
进一步，所述生根预处理培养基中，所述植物生长调节剂为激动素和/或6-苄基氨基嘌呤。
进一步，所述生根预处理培养基中所述基础培养基包括1/2MS、20-60g/L蔗糖、1-10g/L胶凝剂。
进一步，所述生根预处理培养基包括1/2MS、20g/L蔗糖、6g/L琼脂粉、0.1mg/L激动素、2.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0.1mg/L三碘苯甲酸、pH为6.0。
进一步，所述生根培养基中，植物生长调节剂包括脱落酸、6-苄基氨基嘌呤和吲哚丁酸。
进一步，所述生根预处理培养基中所述基础培养基包括AMS、40-50g/L香蕉、40-50g/L蔗糖、0.1-0.5g/L胰蛋白胨、1-5g/L卡拉胶、1-5g/L琼脂。
进一步，生根诱导时，生根培养基的组分包括AMS、50g/L香蕉、1g/L活性炭、40-50g/L蔗糖、0.2g/L胰蛋白胨、2g/L卡拉胶、3g/L琼脂、0.1mg/L脱落酸、0.2mg/L 6-苄基氨基嘌呤、2.5mg/L吲哚丁酸、50g/L土豆泥。
进一步，所述生根预处理的时间为30d，所述生根诱导的时间为30d。
上述技术方案具有以下有益效果：
本发明中针对天门冬的组培生根培养，划分为预处理阶段和生根培养阶段，在预处理阶段中添加三碘苯甲酸，使培养出来的材料更适用于后期的生根诱导，另外，通过筛选天门冬肉质块根诱导的专用配方，使得天门冬肉质块根诱导率达80％以上，块根有明显的纺锤状，粗壮，这样也可提高天门冬瓶苗后期驯化成活率且不经过炼苗阶段，大大降低成本，有利于推进天门冬的产业发展。
附图说明
图1为具体实施方式选取的增殖天门冬根丛。
图2为具体实施方式所述试验组1-13生根预处理后天门冬根丛的图片。
图3为具体实施方式所述试验组10生根预处理后单丛天门冬根丛的图。
图4为具体实施方式所述试验组10生根预处理后天门冬根丛经过生根诱导培养的图片。
图5为具体实施方式所述试验组1-14生根预处理后天门冬根丛经过生根诱导培养的图片。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
一、天门冬根丛的预处理
1.天冬根丛，经过常规(1)外植体诱导愈伤及腋芽、(2)根丛诱导培养、(3)根丛增殖培养得到的天冬小根丛，每个小根丛具有3-4个带有带基团的芽，选取的天冬根丛如附图1所示。
2.试验周期：1个月
3.试验处理：
以1/2MS+糖20g/L+琼脂粉6g/L为基础培养基，搭配不同的组分，分别配置不同的诱导培养基。不同诱导培养基的组成试验下表1：
表1.不同诱导培养基的组成
| 试验处理 | KT | 三碘苯甲酸 | IBA | 活性炭 |
| 1 | 0 | 0.1 | 0 | 0 |
| 2 | 0.01 | 0.01 | 2.0 | 0 |
| 3 | 0.01 | 0.05 | 2.5 | 1.0 |
| 4 | 0.01 | 0.1 | 3.0 | 2.0 |
| 5 | 0.05 | 0.01 | 2.5 | 2.0 |
| 6 | 0.05 | 0.0 | 3.0 | 0 |
| 7 | 0.05 | 0.1 | 2.0 | 1.0 |
| 8 | 0.1 | 0.01 | 3.0 | 1.0 |
| 9 | 0.1 | 0.05 | 2.0 | 2.0 |
| 10 | 0.1 | 0.1 | 2.5 | 0 |
11、MS+KT0.05 mg/L+IBA2.5 mg/L+活性炭2g/L。
12、MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L+活性炭2g/L。
13、MS+谷氨酰胺0.2g/L+KT0.2 mg/L+NAA0.2mg/L+嘧啶醇0.2mg/L+活性炭2g/L。
14、基础培养基+KT0.1 mg/L+IBA2.5 mg/L。
15、基础培养基+KT0.01 mg/L+IBA2.0 mg/L。
16、基础培养基+KT0.01 mg/L+三碘苯甲酸0.01mg/L+IBA 2.0mg/L+活性炭2g/L。
17、基础培养基+KT0.1 mg/L+三碘苯甲酸0.1mg/L+IBA 2.5mg/L+活性炭2g/L。
18、基础培养基+KT0.01 mg/L+NAA0.3 mg/L+IBA 2.0mg/L。
19、基础培养基+KT0.01 mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+嘧啶醇0.2mg/L+IBA2.0mg/L。
20、基础培养基+KT0.1 mg/L+NAA0.3 mg/L+IBA 2.5mg/L+活性炭2g/L。
21、基础培养基+KT0.1 mg/L+谷氨酰胺0.2g/L+嘧啶醇0.2mg/L+IBA 2.5mg/L+活性炭2g/L。
4.试验结果：
试验组1-13不同预处理对天冬根丛生长的影响的结果如图2所述，试验组10生根预处理后单丛天门冬根丛如图3，其观察结果如下表2：
表2：不同预处理对天冬根丛生长的影响
由上述实验的可知，试验2、试验10与试验14和试验15相比可知，在天门冬根丛的预分化培养基中，添加了三碘苯甲酸，能够使得根丛茎枝分化程度高，株形好；
由试验2、试验10和试验16和实验17相比可知，在进行天门冬的生根预处理阶段，三碘苯甲酸与活性炭不能共用，活性炭的使用将抑制天门冬根原基的诱导。
由试验2、试验10与试验18-21相比可知，本发明中三碘苯甲酸的添加对天门冬根丛的根预分化效果显著高于本领域中常规生根剂NAA、谷氨酰胺、嘧啶醇的使用。
二、天门冬生根预处理培养基的组分的试验
生根预处理培养基包括MS、20-60g/L蔗糖、1-10g/L胶凝剂、2.5-3.0mg/L植物生长调节剂、0.01-0.5mg/L三碘苯甲酸，进行不同组分配比，
表3，不同生根预处理培养基的组分
根预分化诱导培养基包括MS、20-60g/L蔗糖、1-10g/L胶凝剂、2.5-3.0mg/L植物生长调节剂、0.01-0.5mg/L三碘苯甲酸，在该范围内均能够有效促进天冬根丛根原基的诱导。
三、天门冬肉质块根诱导培养
1.将天冬生根预处理下的各种材料转接到天冬肉质块根诱导培养基中，对比不同生根预处理下的材料对肉质块根诱导的影响，筛选合适的天冬肉质块根诱导培养基。
2.试验材料：天冬生根预处理阶段预处理过的编号1-21的天冬根丛。
3.试验周期：30d。
4.试验处理：AMS+香蕉50g/L+活性炭1g/L+蔗糖30g/L+胰蛋白胨0.2g/L+卡拉胶2g/L+琼脂3g/L+ABA0.1 mg/L+6-BA0.2 mg/L++IBA2.5 mg/L+土豆50g/L，pH为6.0，AMS母液成分如下表。
表4.AMS基础培养基母液配制表
5.试验结果与分析
表5.试验结果与分析
从上表5可以看出，试验组1-14的肉质根诱导结果如图5，经过三碘苯甲酸及其他激素组合处理过的天冬根丛转接到肉质根诱导培养基后肉质根诱导率高。较好的天冬根丛生根预处理配方为试验组10：1/2MS+糖20g/L+琼脂粉6g/L+KT0.1 mg/L+三碘苯甲酸0.1mg/L+IBA 2.5mg/L，pH为6.0。试验组10的生根处理结果如图4。
四、天门冬肉质块根诱导培养的蔗糖浓度优化
对天冬肉质块根诱导的培养基中，涉及不同的蔗糖浓度进行肉质根培养。以实验一预处理试验组10得到的预处理天门冬根丛进行不同培养基的生根培养。
基础培养基：AMS+香蕉50g/L+活性炭1g/L+胰蛋白胨0.2g/L+卡拉胶2g/L琼脂3g/L+ABA0.1 mg/L+6-BA0.2 mg/L++IBA2.5 mg/L+土豆50g/L，pH为6.0。
表6.天门冬肉质块根诱导培养的蔗糖浓度优化
随着蔗糖浓度的升高，肉质根诱导率、生根量，根长有所提高，但是超过一定的浓度后，诱导率开始下降，蔗糖浓度对块根诱导影响较大，较合适的浓度为3％-6％。综上，较好的天冬根丛肉质根诱导配方为：AMS+香蕉50g/L+活性炭1g/L+蔗糖40g/L-50g/L+胰蛋白胨0.2g/L+卡拉胶2g/L+琼脂3g/L+ABA0.1 mg/L+6-BA0.2 mg/L++IBA2.5 mg/L+土豆泥50g/L，pH6.0。
由此，通过本发明的预分化诱导培养基，能够有效的提高天门冬根丛的生根率，能够实现天门冬大量繁殖的需求。
五、天门冬肉质块根诱导培养的不同活性炭和植物植物生长调节剂培养
以实验一预处理试验组10得到的预处理天门冬根丛进行不同培养基的生根培养。
试验1：生根诱导时，生根培养基的组分包括AMS、50g/L香蕉、0.5g/L活性炭、40g/L蔗糖、0.2g/L胰蛋白胨、2g/L卡拉胶、3g/L琼脂、0.2mg/L脱落酸、0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤、2.5mg/L吲哚丁酸、50g/L土豆泥。
试验2：生根诱导时，生根培养基的组分包括AMS、50g/L香蕉、2g/L活性炭、40g/L蔗糖、0.2g/L胰蛋白胨、2g/L卡拉胶、3g/L琼脂、0.2mg/L脱落酸、0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤、2.0mg/L吲哚丁酸、50g/L土豆泥。
试验3：生根诱导时，生根培养基的组分包括AMS、50g/L香蕉、3g/L活性炭、40g/L蔗糖、0.2g/L胰蛋白胨、2g/L卡拉胶、3g/L琼脂、0.2mg/L脱落酸、0.3mg/L 6-苄基氨基嘌呤、1.5mg/L吲哚丁酸、50g/L土豆泥。
以上预处理天门冬根丛经过上述3组试验的生根培养基进行培养时，肉质根诱导率均为80％以上，块根长可以达到5cm以上。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (8)
1.一种提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)生根预处理：使用生根预处理培养基对增殖后的天门冬根丛进行预处理，生根预处理培养基包括基础培养基、2.5-3.0mg/L植物生长调节剂、0.01-0.5mg/L三碘苯甲酸，生根预处理培养基不包括活性炭；
(2)生根诱导：步骤(1)处理后的天门冬根丛转移至生根培养基进行生根培养，所述生根培养基包括基础培养基、0.5-3g/L活性炭、2.0-3.0mg/L植物生长调节剂。
2.如权利要求1所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，所述生根预处理培养基中，所述植物生长调节剂为激动素和/或6-苄基氨基嘌呤。
3.如权利要求2所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，所述生根预处理培养基中所述基础培养基包括1/2MS、20-60g/L蔗糖、1-10g/L胶凝剂。
4.如权利要求3所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，所述生根预处理培养基包括1/2MS、20g/L蔗糖、6g/L琼脂粉、0.1mg/L激动素、2.5mg/L6-苄基氨基嘌呤、0.1mg/L三碘苯甲酸、pH为6.0。
5.如权利要求1所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，所述生根培养基中，植物生长调节剂包括脱落酸、6-苄基氨基嘌呤和吲哚丁酸。
6.如权利要求5所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，所述生根预处理培养基中所述基础培养基包括AMS、40-50g/L香蕉、40-50g/L蔗糖、0.1-0.5g/L胰蛋白胨、1-5g/L卡拉胶、1-5g/L琼脂。
7.如权利要求6所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，其特征在于，生根诱导时，生根培养基的组分包括AMS、50g/L香蕉、1g/L活性炭、40-50g/L蔗糖、0.2g/L胰蛋白胨、2g/L卡拉胶、3g/L琼脂、0.1mg/L脱落酸、0.2mg/L6-苄基氨基嘌呤、2.5mg/L吲哚丁酸、50g/L土豆泥。
8.如权利要求1-7任一所述的提高天门冬肉质块根诱导率的诱导方法，所述生根预处理的时间为30d，所述生根诱导的时间为30d。
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