CN109526749A - 一种马蹄莲块茎组织培养方法 - Google Patents

一种马蹄莲块茎组织培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种马蹄莲块茎组织培养方法，该方法为：通过消毒清洗、叶片愈伤组织诱导、对块茎愈伤愈伤组织在MS培养基进行诱导、对块茎愈伤组织的诱导、愈伤组织的分化诱导和分化苗生根诱导及其移栽炼苗获得马蹄莲，本发明筛选出愈伤组织基本培养基为MS；MS+6‑BA（2mg/L）+KT（1.0mg/L）+NAA(0.5mg/L)+琼脂（6g/L）+蔗糖（30g/L）为最佳愈伤组织诱导培养基；愈伤组织在MS+6‑BA（2.0mg/L）+NAA(0.2mg/L)+琼脂（6g/L）+蔗糖（30g/L）中分化达20株以上；分化苗在1/2MS+NAA（0.5mg/L）+AC（0.5g/L）+琼脂（6g/L）+蔗糖（30g/L）中生根率达100%且在草炭土：腐殖土：蛭石=2:2:1中成活率高达95%。

Description

一种马蹄莲块茎组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种马蹄莲块茎组织培养方法，属于马蹄莲块茎组织技术领域。
背景技术
马蹄莲(Zantedeschia aethiopica(L.)Spreng.)，是天南星科马蹄莲属球根植物，因色彩鲜艳，花色多样且可作为鲜切花；深受广大市民的欢迎喜爱，具有很大的发展潜力。马蹄莲通常采用块茎分割繁殖，其繁殖系数低且速度慢，本研究通过植物组织培养技术对马蹄莲进行扩繁，加快了种球繁殖时间，获得大量性状一致、稳定的小球茎。迄今为止，研究马蹄莲快繁外植体的污染问题是一大难题，为了降低感染率，通常的方法是将球茎在室内进行培养一段时间、增加消毒时间、增加消毒剂浓度或向培养基中加入抗生素等；然而研究报道通常以芽眼作为外植体，通过其诱导愈伤组织、愈伤组织增殖分化、分化苗的生根和移栽炼苗途径进行扩繁。但并未记载对马蹄莲块茎的培养技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种马蹄莲块茎组织培养方法，以解决上述现有技术中存在的问题。
本发明采取的技术方案为：一种马蹄莲块茎组织培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)戴上手套取出马蹄莲球茎，去掉叶柄后将球茎在自来水下用毛刷刷洗干净，然后用手术刀片清理掉球茎上的表皮及其芽眼上的泥土；然后将直径大于5cm的球茎切成两半，再用多菌灵处理30min后，取出块茎并加入3滴吐温-20在自来水下冲洗30min，将其转移至无菌操作台上进行消毒，消毒完毕后切掉块茎与消毒液接触部分切成约1cm×1cm×1cm的方块，接种至培养基中；
(2)基本培养基选择：将块茎接种至MS培养基中，基本培养基中添加6-BA+NAA+琼脂+蔗糖，对块茎愈伤愈伤组织进行诱导，培养条件为：25±2℃，暗培养条件下；
(3)对块茎愈伤组织的诱导：以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA、KT和NAA，培养条件为:温度为25±2℃，暗培养；
(4)愈伤组织的分化诱导：将白色、乳白色愈伤组织或者有芽点的愈伤组织转接至原培养基中继代1-2次，使其愈伤增殖，然后转至分化培养基中进行分化，以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA与NAA，培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；
(5)分化苗生根诱导及其移栽炼苗：当分化苗长势良好，叶片翠绿，高长至1.8-2.5cm，即将其切下接种至诱导生根培养基中，培养基中添加生长素NAA、活性炭AC，培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃，移栽炼苗，在驯苗过程中使用草炭土：腐殖土：珍珠岩＝2:2:1生根苗。
优选的，上述步骤(1)中消毒方法为：先用75％乙醇处理30s，无菌水清洗2遍；0.1％升汞5min，无菌水清洗2遍；再用2％NaClO分别处理10min，无菌水清洗4遍。
优选的，上述步骤(2)中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1.5mg/L、0.5mg/L、6g/L和30g/L。
优选的，上述步骤(3)中6-BA、KT和NAA的量分别为2mg/L、1mg/L和0.5g/L。
优选的，上述步骤(4)中6-BA与NAA的量分别为2mg/L和0.2mg/L。
优选的，上述步骤(5)中NAA与AC的量分别为0.5-1mg/L和0.5-1g/L。
本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明筛选出愈伤组织基本培养基为MS；MS+6-BA(2mg/L)+KT(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)+琼脂(6g/L)+蔗糖(30g/L)为最佳愈伤组织诱导培养基；愈伤组织在MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+琼脂(6g/L)+蔗糖(30g/L)中分化达20株以上；分化苗在1/2MS+NAA(0.5mg/L)+AC(0.5g/L)+琼脂(6g/L)+蔗糖(30g/L)中生根率达100％且在草炭土：腐殖土：蛭石＝2:2:1中成活率高达95％。
附图说明
图1为基本培养基对块茎愈伤组织的诱导(图a、b、c和d分别代表在MS、1/2MS、N6和B5培养基中培养的块茎)；
图2为愈伤组织诱导过程中的三种类型；
图3为愈伤组织的增殖与分化；
图4为试管苗的生根与驯苗。
具体实施方式
下面结合附图及具体的实施例对本发明进行进一步介绍。
实施例1：一种马蹄莲块茎组织培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)戴上手套取出马蹄莲球茎，去掉叶柄后将球茎在自来水下用毛刷刷洗干净，然后用手术刀片清理掉球茎上的表皮及其芽眼上的泥土；然后将直径大于5cm的球茎切成两半，再用多菌灵处理30min后，取出块茎并加入3滴吐温-20在自来水下冲洗30min，将其转移至无菌操作台上进行消毒，消毒完毕后切掉块茎与消毒液接触部分切成约1cm×1cm×1cm的方块，接种至培养基中；
(2)基本培养基的筛选：将块茎接种至MS培养基中，基本培养基中添加6-BA+NAA+琼脂+蔗糖，对块茎愈伤愈伤组织进行诱导，培养条件为：25±2℃，暗培养条件下；
(3)对块茎愈伤组织的诱导：以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA、KT和NAA，培养条件为:温度为25±2℃，暗培养；
(4)愈伤组织的分化诱导：将白色、乳白色愈伤组织或者有芽点的愈伤组织转接至原培养基中继代1-2次，使其愈伤增殖，然后转至分化培养基中进行分化，以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA与NAA，培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；
(5)分化苗生根诱导及其移栽炼苗：当分化苗长势良好，叶片翠绿，高长至1.8-2.5cm，即将其切下接种至诱导生根培养基中，培养基中添加生长素NAA、活性炭AC，培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃，移栽炼苗，在驯苗过程中使用草炭土：腐殖土：珍珠岩＝2:2:1生根苗。
优选的，上述步骤(1)中消毒方法为：先用75％乙醇处理30s，无菌水清洗2遍；0.1％升汞5min，无菌水清洗2遍；再用2％NaClO分别处理10min，无菌水清洗4遍。
优选的，上述步骤(2)中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1.5mg/L、0.5mg/L、6g/L和30g/L。
优选的，上述步骤(3)中6-BA、KT和NAA的量分别为2mg/L、1mg/L和0.5g/L。
优选的，上述步骤(4)中6-BA与NAA的量分别为2mg/L和0.2mg/L。
优选的，上述步骤(5)中NAA与AC的量分别为0.5-1mg/L和0.5-1g/L。
为了进一步说明本发明的效果，进行如下实验：
1试验材料与方法
1.1试验材料
试验材料采集于赤峰市赤峰天鑫花卉繁育基地马蹄莲繁育14号大棚。
1.2试验方法
1.2.1材料消毒方法
戴上手套取出马蹄莲球茎，去掉叶柄后将球茎在自来水下用毛刷刷洗干净，然后用手术刀片清理掉球茎上的表皮及其芽眼上的泥土；然后将直径大于5cm的球茎切成两半，再用多菌灵处理30min后，取出块茎并加入3滴吐温-20在自来水下冲洗30min，将其转移至无菌操作台上进行消毒。消毒方法为：先用75％乙醇处理30s，无菌水清洗2遍；0.1％升汞5min，无菌水清洗2遍；再用2％NaClO分别处理10min，无菌水清洗4遍；消毒完毕后切掉块茎与消毒液接触部分切成约1cm×1cm×1cm的方块，接种至培养基中。
1.2.2基本培养基的筛选
将块茎接种至MS、1/2MS、B5和N6培养基中，每组培养基中添加MS+6-BA(1.5mg/L)+NAA(0.5mg/L)+琼脂(6g/L)+蔗糖(30g/L)，对块茎愈伤愈伤组织进行诱导。培养条件为：25±2℃，暗培养条件下；每隔10天观察块茎愈伤情况。
1.2.3 6-BA、KT与NAA对块茎愈伤组织的诱导
试验以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA、KT和NAA，其中6-BA浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L；KT浓度为0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L；NAA浓度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L。采用L9(3^4)正交试验筛选最佳愈伤组织的激素组合。培养条件为:温度为25±2℃，暗培养。每隔10天观察块茎愈伤组织变化情况。
1.2.3 6-BA与NAA组合对愈伤组织的分化诱导
将白色、乳白色愈伤组织或者有芽点的愈伤组织转接至原培养基中继代1-2次，使其愈伤增殖，然后转至分化培养基中进行分化。以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA与NAA，其中6-BA浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L；NAA浓度为0.1mg/L、0.2mg/L。培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；每隔15天观察块茎愈伤组织的分化情况。
1.2.4 NAA和活性炭组合对分化苗生根诱导及其移栽炼苗
当分化苗长势良好，叶片翠绿，高长至2cm左右，即可将其切下接种至诱导生根培养基中，培养基中添加生长素NAA(0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L)，活性炭AC(0.5g/L、1.0g/L)。培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；每隔一周观察一次生根情况。
2结果与分析
2.1不同基本培养基对愈伤组织诱导的影响
将块茎接种至不同基本培养基中添加相同激素情况下对其愈伤组织进行诱导，结果如下表1，在MS培养基中诱导的块茎诱导第7天芽眼基部开始有变化，并且第15天左右在块茎四周有愈伤组织出现(见图1-a)，诱导率为68％，与1/2MS、N6、B5具有显著性差异(见图1-b，1-c和1-d)；本试验得出高盐基本培养基以MS培养基为适宜块茎愈伤组织培养基。
表1不同基本培养基对芽眼愈伤组织诱导的影响
2.2不同激素组合对块茎愈伤组织诱导的影响
不同激素浓度6-BA，KT和NAA对块茎的影响从下表2可以得出，6-BA因素以2mg/L为最佳，KT因素以1.0mg/L为最佳，NAA因素以0.5mg/L为最佳；方差分析见表3可得6-BA在诱导过程中具显著性。块茎愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA(2mg/L)+KT(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)。然而在诱导愈伤组织过程中诱导出三种类型愈伤组织，第一种为绿豆大小颗粒状愈伤(见图2-B)，第二种为柔软白色透明且排列紧密愈伤(见图2-C)，第三种兼顾第一种和第二种愈伤组织(见图2-A)。
表2不同激素正交试验设计表对块茎愈伤诱导的影响
表3不同激素组合对块茎愈伤组织诱导的方差分析表
突变来源 平方和 自由度 均方 均方比 F<sub>a</sub>
A 0.15 2 0.073 27.96*
B 0.04 2 0.021 8.13 F<sub>0.05</sub>(2,2)＝19.0
C 0.09 2 0.047 18.12 F<sub>0.01</sub>(2,2)＝99.0
e 0.01 2 0.003
∑ 0.29 8
2.3不同激素组合对愈伤组织的分化影响
挑选白色或者乳白色且有分化能力的的愈伤组织，接种至下列不同分化培养基中(见表4)，由表可得，在同一NAA浓度下，随着6-BA浓度的提高，芽丛数也随着提高；在同一6-BA的浓度下，随着NAA浓度的提高分化数也增加，并且愈伤在分化培养基中培养，愈伤组织增殖和分化同时进行，分化芽生长良好。从下表可得：第5组(见图3-1分化17天的分化芽)和第6组(见图3-2分化30天的芽丛)培养基与第1,2,3,4组培养基诱导愈伤组织分化具有显著性，所以筛选出MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)为适宜愈伤组织分化基本培养基。
表4 6-BA与NAA不同浓度组合对愈伤组织的分化影响
注：同列数据后不同小写字母表示具有显著性差异(P<0.05)
2.4 NAA与活性炭对分化苗的生根影响
挑选壮实的分化苗进行生根诱导情况见表5，从下表可以看出，不同浓度NAA激素和不同浓度活性炭对分化苗的生根没有明显的差异，诱导率均高达90％，且分化苗在接种第8天均有生根现象，苗的生长现象良好，培养至20天试管苗的根分化完全，见图4-①为第2组的生根试管苗，图4-②为第3组的生根试管苗，苗比较壮实为后期提供高质量的试管苗和进行驯苗试验和栽培创造条件。在驯苗过程中使用草炭土：腐殖土：珍珠岩：＝2:2:1生根苗的成活率达95％以上。通过试验可以得出适宜分化苗生根的培养基为：1/2MS+NAA(0.5-1.0mg/L)+AC(0.5-1.0g/L)。
表5 NAA与活性炭对分化苗的生根诱导
3小结
(1)块茎在MS、1/2MS、N6和B5培养基中培养，然而块茎在MS培养基诱导愈伤组织的效果最佳；
(2)对块茎在不同激素不同组合下正交试验诱导愈伤组织，试验得出块茎愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+6-BA(2mg/L)+KT(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)；
(3)试验使用6-BA和NAA组合对愈伤组织的分化进行全面对比试验，筛选出MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)为适宜愈伤组织分化基本培养基；
(4)将分化芽进行生根诱导，在生根诱导过程中分化芽的生根诱导率均较高达90％，生长均良好，得出1/2MS+NAA(0.5-1.0mg/L)+AC(0.5-1.0g/L)为分化芽的生根培养基。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内，因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种马蹄莲块茎组织培养方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
（1）戴上手套取出马蹄莲球茎，去掉叶柄后将球茎在自来水下用毛刷刷洗干净，然后用手术刀片清理掉球茎上的表皮及其芽眼上的泥土；然后将直径大于5cm的球茎切成两半，再用多菌灵处理30min后，取出块茎并加入3滴吐温-20在自来水下冲洗30min，将其转移至无菌操作台上进行消毒，消毒完毕后切掉块茎与消毒液接触部分切成约1cm×1cm×1cm的方块，接种至培养基中；
（2）基本培养基的筛选：将块茎接种至MS培养基中，基本培养基中添加6-BA+NAA+琼脂+蔗糖，对块茎愈伤愈伤组织进行诱导，培养条件为：25±2℃，暗培养条件下；
（3）对块茎愈伤组织的诱导：以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA、KT和NAA，培养条件为:温度为25±2℃，暗培养；
（4）愈伤组织的分化诱导：将白色、乳白色愈伤组织或者有芽点的愈伤组织转接至原培养基中继代1-2次，使其愈伤增殖，然后转至分化培养基中进行分化，以MS为基本培养基，培养基中添加6-BA与NAA，培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃；
（5）分化苗生根诱导及其移栽炼苗：当分化苗长势良好，叶片翠绿，高长至1.8-2.5cm，即将其切下接种至诱导生根培养基中，培养基中添加生长素NAA、活性炭AC，培养条件：光照强度2000lux，16h/d，温度为25±2℃，移栽炼苗，在驯苗过程中使用草炭土：腐殖土：珍珠岩=2:2:1生根苗。
2.根据权利要求1所述的一种马蹄莲块茎组织培养方法，其特征在于：步骤（1）中消毒方法为：先用75%乙醇处理30s，无菌水清洗2遍；0.1%升汞5min，无菌水清洗2遍；再用2%NaClO分别处理10min，无菌水清洗4遍。
3.根据权利要求1所述的一种马蹄莲块茎组织培养方法，其特征在于：步骤（2）中6-BA、NAA、琼脂和蔗糖的量分别为1.5mg/L、0.5mg/L、6g/L和30g/L。
4.根据权利要求1所述的一种马蹄莲块茎组织培养方法，其特征在于：步骤（3）中6-BA、KT和NAA的量分别为2mg/L、1mg/L和0.5g/L。
5.根据权利要求1所述的一种马蹄莲块茎组织培养方法，其特征在于：步骤（4）中6-BA与NAA的量分别为2mg/L和0.2mg/L。
6.根据权利要求1所述的一种马蹄莲块茎组织培养方法，其特征在于：步骤（5）中NAA与AC的量分别为0.5-1mg/L和0.5-1g/L。
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