CN109496840A - 怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法 - Google Patents

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钱晶晶
胡友军
高青海
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    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

本发明公开了一种怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，以怀远玉石籽石榴的茎尖、茎段及叶片为外植体，灭菌条件为0.1％HgCl2，10min，愈伤组织诱导的培养基为MS+6‑BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+35g蔗糖+5.5g琼脂，诱导芽的培养基为WPS+6‑BA 1.0mg/L+35g蔗糖+5.5g琼脂，生根诱导培养基为WPS+IBA 0.8mg/L+35g蔗糖+5.5g琼脂。本发明的培育方法有利于培养高质量的石榴种苗，提高石榴结果的数量和质量。

Description

怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法
技术领域
本发明涉及果蔬培育技术领域，尤其涉及一种怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法。
背景技术
怀远石榴(Punicaceae，Punica L.)(石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica L.)植物)种类繁多、栽培历史悠久、品质优异，久负盛名，是安徽省重要的经济果树之一。
玉石籽石榴(white peel pomegranate cultivar)是安徽省怀远县主栽的优良石榴品种之一，是石榴中唯一一种白花、白籽、白实的品种。其果实品质佳，含糖量高，口味纯正，在国内外有较高的知名度。但在目前白花玉石籽石榴的繁殖始终局限于传统的是扦插、分株等方法，易出现病株、弱株、易早衰、提前减产和品种退化现象等诸多问题；另外在依靠扦插进行推广优良品种的过程中由于受到季节及外界环境等客观因素的制约，不能形成工厂化、标准化生产，导致优质种苗少，价格高，推广受限,并且石榴品种繁育时间长，效率较低。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，可以缩短植物的繁殖周期，避免了外界的光、水、养分和菌落的差异，有效的统一了植物的培养环境，避免外界干扰，有利于培养高质量的石榴种苗。
本发明的技术方案如下：
一种怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，包括如下步骤：
1)外植体选择及预处理：选择健壮的无病虫害玉石籽石榴的新生腋芽、嫩茎段及新生叶片，作为组织培养的外植体，用流水冲洗10min后采用10mg/L GA3浸泡30min后备用；
2)外植体接种：
腋芽接种：取10mg/L GA3浸泡好的腋芽用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台，在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，再用解剖针剥去芽鳞，后用0.1％HgCl2消毒8min，无菌水冲洗5遍后切去腋芽下方木质部，接种于初代腋芽接种培养基上；
茎段接种：取10mg/L GA3浸泡好的茎段用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台，在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，后用0.1％HgCl2消毒5min，无菌水冲洗5遍，切长1.0-1.5cm、只含1个节点的茎段，接种在初代茎段培养基上；
叶片接种：取10mg/L GA3浸泡好的叶片用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台，在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，后用0.1％HgCl2消毒3min，无菌水冲洗5遍，将叶片切成1.0×1.0cm2小块，并将叶片背面划伤，将背面贴向培养基，接种于初代叶片接种培养基上；
3)增殖培养：上述腋芽接种25d、茎段接种20d、叶片接种40d后，将生长好外植体取切成1.5-2cm茎段，每段含有1-2个茎节，接种于增殖培养基中，在培养室培养35-40d；
4)生根培养：上述外植体增殖培养35-40d后，将外植体切除底部愈伤，然后接种于生根培养基中，在培养室培养45d；
5)炼苗：打开组培瓶盖，进行炼苗，炼苗时间为3-5d；
6)移栽：炼苗后，挑选健壮幼苗洗净根部培养基，移栽到基质育苗盘中，放置于温室中，光照为自然光照，空气相对湿度70％，每日早晚于叶片上喷水，保持叶面及土壤湿润，每隔两周喷施稀释10倍WPM工作液，移栽30d后，大田种植。
优选的，步骤1)中外植体来源是怀远县石榴协会天榴坊基地。
优选的，步骤2)中外植体接种时间为3-9月份。
优选的，步骤2)中培养室的培养条件为：光照3000LX，温度24-26℃，光照时间12h/d，相对湿度在60％，培养时间为35-40d。
优选的，步骤2)中腋芽和嫩茎段的接种培养基成分如下：WPM培养基，1mg/L 6-BA，0.5g/L活性炭，20g蔗糖，5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
优选的，步骤2)叶片的接种培养基成分如下：MS培养基，0.8mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，0.5g/L活性炭，20g蔗糖，5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
优选的，步骤3)中增值培养的培养基成分如下：WPM培养基，0.8mg/L 6-BA，1.5g/L活性炭，20g蔗糖，5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
优选的，步骤4)中生根培养的培养基成分如下：WPM培养基+0.8mg/LIBA+20g蔗糖+5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
优选的，步骤5)中炼苗培养条件为：光照1200LX，温度24-26℃，光照时间12h/d，相对湿度在60％。
优选的，步骤6)中基质成分为蛭石：田园土重量比为3:1。
本发明中的有益效果：通过本发明的石榴快速繁育方法，可大大缩短植物的繁殖周期，成功的避免了石榴漫长的育种过程。避免了外界的光、水、养分和菌落的差异，有效的统一了植物的培养环境，避免外界干扰，有利于培养高质量的石榴苗，进而优化石榴生活习性，提高石榴结果的数量和质量。通过添加活性炭用于减少外植体褐化的现象，提高转接成活率，实验数据中加入活性碳的外植体成活率(100％)是不加活性碳(63.33％)的1.6倍。在3-9月份石榴生长的季节接种，可提高工作效率。通过本发明的快速繁育方法可大大提升石榴育种时间，同时移栽存活率可达98％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
各材料试剂来源：
石榴外植体来源于怀远县石榴协会天榴坊基地，采集健壮的无病虫害玉石籽石榴的新生腋芽、嫩茎段及新生叶片，作为组织培养的外植体，用流水冲洗10min后采用10mg/LGA3浸泡30min后备用。
培养室培养条件光照3000LX，温度：24-26℃，光照时间：12h/d，相对湿度在60％。
不同培养基类型对白花玉石籽石榴的茎高及出芽率的影响见表1：
表1不同培养基类型对白花玉石籽石榴的茎高及出芽率的影响
注：该实验在培养室内进行，其中添加6-BA浓度0.5mg/L，活性炭浓度0.5g/L，培养时间为20d。
不同6-BA浓度对白花玉石籽石榴增殖的影响见表2：
表2不同6-BA浓度对白花玉石籽石榴增殖
注：该实验在培养室内进行，采用WPM培养基，活性炭浓度为0.5g/L，培养时间为25d。
不同活性炭添加量对白花玉石籽石榴无性苗褐化及成活的影响见表3：
表3不同活性炭添加量对白花玉石籽石榴无性苗褐化及成活的影响
注：该实验在培养室内进行，采用WPM培养基，6-BA浓度为0.8mg/L，培养时间为20d。
不同活性炭添加量对白花玉石籽石榴无性苗褐化及成活的影响见表4：
表4不同IBA浓度对白花玉石子石榴生根的影响
注：该实验在培养室内进行，采用WPM培养基，培养时间为25d。
不同光照强度对白花玉石子石榴炼苗成活率的影响见表5：
表5不同光照强度对白花玉石子石榴炼苗成活率的影响
注：该实验在炼苗室内进行：光照1200LX，温度：24-26℃，光照时间：12h/d，相对湿度在60％。
不同湿度对移栽成活率的影响见表6：
表6不同湿度对移栽成活率的影响
注：该实验在温室内进行：光照为自然光照，温度为16-30℃(夜间-白天)。
根据实验结果，选取各外植体不同阶段培养基配方如下：
腋芽和嫩茎段接种培养基：WPM+1mg/L 6-BA+0.5g/L活性炭+20g蔗糖+5.5g琼脂，pH在6.2-6.5之间。
叶片接种培养基：MS+0.8mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5g/L活性炭+20g蔗糖+5.5g琼脂，pH在6.2-6.5之间。
增殖培养基：WPM+0.8mg/L 6-BA+1.5g/L活性炭+20g蔗糖+5.5g琼脂，pH在6.2-6.5之间。
生根培养基：WPM+1mg/L IBA+20g蔗糖+5.5g琼脂，pH在6.2-6.5之间。
外植体接种
腋芽接种：取10mg/LGA3浸泡好腋芽用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台。在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，再用解剖针剥去芽鳞，后用0.1％HgCl2消毒8min，无菌水冲洗5遍，最后切去腋芽下方木质部，接种于初代腋芽接种培养基上。
茎段接种：取10mg/LGA3浸泡茎段用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台。在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，后用0.1％HgCl2消毒5min，无菌水冲洗5遍，切长1.0-1.5cm、只含1个节点的茎段，接种在初代茎段培养基上。
叶片接种：取10mg/LGA3浸泡好叶片75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台。在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，后用0.1％HgCl2消毒3min，无菌水冲洗5遍，将叶片切成1.0*1.0cm2小块，并将叶片背面划伤，将背面贴向培养基，接种于初代叶片接种培养基上。
增殖培养：
腋芽接种25d、茎段接种20d、叶片接种40d后，将生长好外植体取切成1.5-2cm茎段，每段含有1-2个茎节，接种于增殖培养基中，在培养室培养35-40d。
生根培养：
增殖培养35-40d后外植体长度超过5cm，将外植体切除底部愈伤，然后接种于生根培养基，在培养室培养45d。
炼苗：
炼苗室培养条件：光照1200LX，温度：24-26℃，光照时间：12h/d，相对湿度在60％，打开组培瓶盖，进行炼苗，炼苗时间为3-5d。
移栽：
炼苗后，挑选健壮幼苗洗净根部培养基，移栽到蛭石：田园土(种植园中挖取)＝3:1的基质育苗盘中，放置于温室中。移栽温室条件：光照为自然光照，空气相对湿度70％，每日早晚少量于叶片上喷水，保持叶面及土壤湿润。每隔两周喷施稀释10倍WPM工作液(0.27gWPM粉末溶于1L蒸馏水中)。移栽成活率可达到98％。移栽30d后，可随时大田种植。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)外植体选择及预处理：选择健壮的无病虫害玉石籽石榴的新生腋芽、嫩茎段及新生叶片，作为组织培养的外植体，用流水冲洗10min后采用10mg/L GA3浸泡30min后备用；
2)外植体接种：
腋芽接种：取上述GA3浸泡好的腋芽，用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台，在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，再用解剖针剥去芽鳞，后用0.1％HgCl2消毒8min，无菌水冲洗5遍后切去腋芽下方木质部，接种于初代腋芽接种培养基上；
茎段接种：取上述GA3浸泡好的茎段用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台，在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，后用0.1％HgCl2消毒5min，无菌水冲洗5遍，切长1.0-1.5cm、只含1个节点的茎段，接种在初代茎段培养基上；
叶片接种：取上述GA3浸泡好的叶片用75％酒精浸泡30sec后移入超净工作台，在超净工作台上，先用无菌水冲洗3遍，后用0.1％HgCl2消毒3min，无菌水冲洗5遍，将叶片切成1.0*1.0cm2小块，并将叶片背面划伤，将背面贴向培养基，接种于初代叶片接种培养基上；
3)增殖培养：上述腋芽接种25d、茎段接种20d、叶片接种40d后，将生长好外植体取切成1.5-2cm茎段，每段含有1-2个茎节，接种于增殖培养基中，在培养室培养35-40d；
4)生根培养：上述外植体增殖培养35-40d后，将外植体切除底部愈伤，然后接种于生根培养基中，在培养室培养45d；
5)炼苗：打开组培瓶盖，进行炼苗，炼苗时间为3-5d；
6)移栽：炼苗后，挑选健壮幼苗洗净根部培养基，移栽到基质育苗盘中，放置于温室中，光照为自然光照，温度为16-30℃，空气相对湿度70％，每日早晚于叶片上喷水，保持叶面及土壤湿润，每隔两周喷施稀释10倍WPM工作液，移栽30d后，大田种植。
2.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，所述步骤1)中外植体来源是怀远县石榴协会天榴坊基地。
3.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤2)中外植体接种时间为3-9月份。
4.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤2)中培养室的培养条件为：光照3000LX，温度24-26℃，光照时间12h/d，相对湿度在60％，培养时间为35-40d。
5.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤2)中腋芽和嫩茎段的接种培养基成分如下：WPM培养基，1mg/L 6-BA，0.5g/L活性炭，20g蔗糖，5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
6.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤2)叶片的接种培养基成分如下：MS培养基，0.8mg/L 6-BA，0.5mg/LNAA，0.5g/L活性炭，20g蔗糖，5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
7.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤3)中增值培养的培养基成分如下：WPM培养基，0.8mg/L 6-BA，1.5g/L活性炭，20g蔗糖，5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
8.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤4)中生根培养的培养基成分如下：WPM培养基+1mg/L IBA+20g蔗糖+5.5g琼脂，pH为6.2-6.5。
9.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤5)中炼苗培养条件为：光照1200LX，温度24-26℃，光照时间12h/d，相对湿度在60％。
10.根据权利要求1所述的怀远白花玉石籽石榴无性快速培育方法，其特征在于，步骤6)中基质成分为蛭石：田园土重量比为3:1。
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