CN113016609B - 以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法采用三年生翠竹实生苗生长健壮植株的竹鞭侧芽为外植体；然后将无菌外植体接种在诱导培养基上诱导丛芽；然后经增殖培养得到丛芽；最后采用高效生根培养基能较短时间内获得大量翠竹生根苗。本发明优化了翠竹组织培养生根丛苗快速繁殖技术，以鞭芽为外植体的翠竹丛芽生根时间相对较短而且根数量较多，缩短了翠竹的组培快繁时间，使翠竹的组培效率大大提高。

Description

以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法。

背景技术

翠竹(Pleioblastus pygmaeus)竹亚科大明竹属植物，植株矮小，耐阴，叶片翠绿，且极耐修剪，是一种十分优良的地被类观赏植物。尤其近年来，地被类竹种以及彩叶竹种在园林绿化上的应用愈来愈广泛，其经济价值近年来也逐渐飙高(姚文静,王茹,林树燕,王星,杨蒙,郑毅,丁雨龙.翠竹实生苗生长发育规律及构件生物量模型拟合.南京林业大学学报(自然科学版),2020,44(6):103-110)。但受到繁殖材料的获得困难及繁殖方法的限制，传统的繁育方式已无法满足翠竹日益增大的市场需求，且园林用竹对植物的遗传构成一致性和植株大小的一致性要求较高。在这样的背景下，构建高效的翠竹组培快繁再生体系势在必行。

目前，国内外关于竹子的组织培养已取得了一些进展。自1982年起，国外相继报道了印度箣竹、勃氏甜龙竹等数十个竹种的组织培养技术研究情况(张春玲.竹子组织培养研究进展.现代园艺,2019,(12):7-8)。我国的竹子组织培养技术研究起步较晚，但经几代科研工作者的不懈努力，目前麻竹、慈竹、甜龙竹、巨龙竹等重要经济竹种的组培快繁技术在生产上的应用已经十分成熟。平安竹、菲白竹、铺地竹等园林观赏用竹也都已实现了利用试管快繁技术进行批量繁殖(王光萍,丁雨龙,黄敏仁,王明庥.观赏竹的试管快繁研究.林业科学,2005,41(5):51-55)。由于竹类植物的花和种子不易稳定地获得，且除种胚外其余外植体类型都很难通过诱导愈伤分化获得再生植株，所以以单芽为外植体，诱导产生芽丛，经诱导生根后移至土壤，这种不经过脱分化过程直接获得大量完整植株的繁殖方式应用更为广泛，有关翠竹组培快繁的文章仅见1篇，其外植体材料为秆芽(张春霞,骆仁祥,丁兴萃,白瑞华,田新立,李伟成,吴寿国.翠竹的组织培养和快速繁殖.植物生理学通讯,2010,46(5):477-478.)。鞭芽是竹子出笋成竹、长鞭形成地下根系结构的基础。至今未见以鞭芽为外植体材料进行竹子组织快繁的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，该方法以翠竹的鞭芽为试验材料，尝试构建翠竹组织培养快繁高效再生技术体系，为翠竹工厂化大规模生产和其园林应用推广奠定基础。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，包括翠竹鞭芽外植体的准备、无菌体系的建立、丛芽诱导及丛芽增殖、丛芽生根后获得生根苗；其中丛芽诱导培养基为MS+0.1mg·L^-1TDZ+0.5mg·L^-1NAA，丛芽增殖培养基为MS+5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA；丛芽生根增殖培养基为1/2MS+1mg·L^-16-BA+1.5mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-1IBA。

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，翠竹鞭芽外植体的准备：以翠竹三年生实生苗生长健壮植株的竹鞭侧芽作为外植体材料，将采集的外植体进行预处理后备用；预处理方法为：先将翠竹实生苗竹鞭剪成1.5cm的带芽鞭段，用洗洁精清洗后，在自来水流水下冲洗24h。

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，无菌体系的建立为：处理好的外植体经消毒剂灭菌处理后，无菌水冲洗数次，再用次氯酸钠消毒，无菌水冲洗数次。

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，处理好的外植体经70％酒精处理60s，无菌水冲洗5次，再用2.5％次氯酸钠消毒15min，无菌水冲洗5次。

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，在丛芽诱导及丛芽增殖前先将外植体材料接种在基本培养基上培养至少20天，基本培养基为MS+2mg·L^-16-BA。

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，具体包括以下步骤：

(1)以翠竹三年生盆栽实生苗生长健壮植株的竹鞭侧芽作为外植体材料，将采集的翠竹实生苗竹鞭剪成1.5cm的带芽鞭段，用洗洁精清洗后，在自来水流水下冲洗24h，备用；

(2)在无菌操作台上，处理好的外植体经消毒剂灭菌处理后，无菌水冲洗数次，再用次氯酸钠消毒，无菌水冲洗数次；

(3)接种在基本培养基上，基本培养基为MS+2mg·L^-16-BA；

(4)20d后将无菌的靓竹外植体接种到诱导培养基上进行丛芽诱导以及增殖，一个月后丛芽形成；其中，丛芽诱导培养基为MS+0.1mg·L^-1TDZ+0.5mg·L^-1NAA，丛芽增殖培养基为MS+5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA；

(5)将丛芽转接到增殖培养基上继代5～6次，将得到的丛芽转移到生根培养基中，21-28d大量生根苗形成；其中，生根培养基为1/2MS+1mg·L^-16-BA+1.5mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-1IBA；

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，基本培养基、诱导培养基、增殖培养基、生根培养基中还含有30g/L蔗糖，2.25g/L植物凝胶。

所述以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，步骤(3)、(4)、(5)中的培养条件为温度25±1℃，光周期为14h/黑暗10h，培养物表面的光照强度为1500lx。

有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：

(1)本发明填补了翠竹组织培养丛苗快速生根的空白，以鞭芽为外植体材料，结合不同生长调节剂的组合，筛选出适合翠竹丛芽诱导的培养基。

(2)本发明对鞭芽进行丛芽增殖以及生根，与一般竹类植物组培生根时间35d相比，本申请在21-28d即可形成大量生根苗，因此能快速获得大量翠竹苗，克服了传统的母株移栽效率低、运输成本高等缺点，且不受季节的限制，为翠竹的快速繁殖奠定了坚实的基础，对于实现翠竹工厂化生产具有重要的意义，是一种方便、快捷和有效的翠竹再生植株培养方法。

附图说明

图1为处理后翠竹带芽鞭段图；

图2为翠竹在诱导培养基上30d后的生长情况图；

图3为翠竹在增殖培养基上继代5次后的丛芽图；

图4为翠竹在生根培养基上生长28d后生根苗产生图；

图5为处理组T4、T6和T11中翠竹组培苗平均生根数结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

实施例1

一种以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，包括以下步骤：

(1)外植体的选择以及无菌体系的建立：将三年生盆栽翠竹实生苗取出，清水处理后把竹鞭切分成1.5cm长的带芽鞭段，在洗洁精清洗、流水冲洗的基础上，本试验选用了75％酒精与2.5％NaClO溶液两种消毒剂搭配使用。

结果显示(表1)，处理1的污染率最高，为94.00％，处理8、处理9的污染率最低，为4.67％、6.67％，这说明70％酒精与2.5％NaClO溶液的消毒剂组合可以有效地杀死大部分微生物，且随着处理时间的增长，污染率逐步降低。从外植体成活率来看，对于酒精处理而言，处理90s的平均成活率最低，为47.50％，处理60s的平均成活率最高，高达87.05％；对于NaClO处理而言，处理20min的平均成活率最低，为57.30％，处理15min的平均成活率最高，为69.15％。这说明，虽然长时间处理的杀菌效果更好，但过长的消毒时间会导致芽段成活率较低。

综合污染率、成活率两项指标来看，最佳消毒方案为70％酒精处理60s+2.5％NaClO溶液处理15min，这样的组合既有着不错的灭菌效果，且不会对芽的活性造成影响，有着较好的成活表现(图1)。

表1不同消毒方案对启动培养污染率及成活率的影响

污染率(％)＝污染外植体数/接种外植体总数×100；

成活率(％)＝萌芽外植体数/接种后无菌茎段总数×100；

(2)将步骤(1)中9种无菌处理的翠竹外植体接种在基本培养基上，基本培养基组成为：MS+3mg/L6-BA，培养20d；

(3)翠竹丛芽的诱导以及增殖：步骤(2)中得到的无菌外植体需要在丛芽诱导和增殖培养基处理下才能产生芽丛，丛芽诱导培养基为MS+0.1mg·L^-1TDZ+0.5mg·L^-1NAA，待瓶苗诱导培养30d后(图2)，再将其接种在增殖培养基上。增殖培养的基本培养基仍选用MS培养基，生长调节剂则选用6-BA(3、4、5mg·L^-1)与NAA(0.05、0.3、0.5mg·L^-1)，共9种处理，每个处理接种30瓶，每瓶接种1个无菌芽段，继代5～6次，即增殖培养100～120d后，研究不同浓度的6-BA与NAA对翠竹鞭芽芽苗扩繁的影响(表2)。

不同组合的植物生长调节剂处理对芽丛增殖的效果不同(表2)。分析表2中数据可以看出，对于6-BA而言，随着其浓度从3mg·L^-1提高到5mg·L^-1，增殖系数也从2.99提高到了5.91，芽丛长势也在逐渐提高。对NAA而言，浓度为0.05mg·L^-1时，增殖系数最小，增殖效果也较差；浓度为0.3mg·L^-1时，增殖系数最高，芽丛增殖效果最好；浓度为0.5mg·L^-1时，芽段仍正常生长，芽丛长势也较好，但新生苗丛芽较少，增殖系数也相对较低。可见，随着细胞分裂素6-BA的浓度提高，芽丛的增殖效果越来越佳，6-BA浓度为5mg·L^-1时，增殖效果最好。而培养基中生长素NAA的浓度过低时，芽丛的生长状况不佳，增殖效果也较差，随着NAA浓度的提高，芽丛的长势逐渐变好，增殖系数也随之提高，但随着NAA浓度的继续升高，芽苗高度越长越高，新生丛苗却没有随之增多。结果表明，当6-BA浓度为5mg·L^-1、NAA浓度为0.3mg·L^-1时，翠竹芽段的增殖系数最高，为7.24，新生芽丛数最多，且长势健壮，叶片宽大，颜色翠绿，增殖效果最好。

表2不同植物生长调节剂配比对翠竹芽段增殖的影响

注：a、b、c、d、e、f、g分别表示α＝0.05水平下的差异显著性。Note:a、b、c、d、e、f、gindicate the significance at the level ofα＝0.05.

(4)翠竹丛芽的生根：增殖后的芽苗继代培养5～6次后，丛芽增殖到20～30个时，将丛芽接种到生根培养基上。图3翠竹在增殖培养基上继代5次后的丛芽图，丛芽增殖培养基为MS+5mg·L^-16-BA+0.3mg·L^-1NAA，丛芽长势良好。生根培养基选用1/2MS作为基本培养基，以6-BA(0、0.5、1mg·L^-1)、NAA(1、1.5mg·L^-1)与IBA(0.5、1mg·L^-1)3种生长调节剂设置12个处理组合，每个组合接种30瓶，自生根后观察统计生根数、根长并计算生根率。

不同植物生长调节剂配比对翠竹芽段生根效果见表3和图5，瓶苗的根按生长长度进行分级，具体分成0～2cm、2～5cm、5～10cm、>10cm四个级别，分别统计每级内的根数及总根数，并以1cm、3.5cm、7.5cm、10cm代表每级根长，计算每个时期的平均根长。由表3可知，不同处理间生根率差异较大，处理4、处理6与处理11诱导生根效果较好，生根率分别达到了100％、85％与90％。其中，图4为翠竹在生根培养基上生长28d后生根苗产生图，该图中的生根苗使用的生根培养基为1/2MS+1mg·L^-16-BA+1.5mg·L^-1NAA+0.5mg·L^-1IBA。

表3不同植物生长调节剂配比对翠竹芽段生根的影响

处理	6-BA/mg·L<sup>-1</sup>	NAA/mg·L<sup>-1</sup>	IBA/mg·L<sup>-1</sup>	生根率/％
					1	0	1	0.5	25
2	0	1	1	10
					3	0	1.5	0.5	50
4	0	1.5	1	100
					5	0.5	1	0.5	15
6	0.5	1	1	85
					7	0.5	1.5	0.5	30
8	0.5	1.5	1	65
					9	1	1	0.5	35
10	1	1	1	50
					11	1	1.5	0.5	90
12	1	1.5	1	45

图5为处理组T4、T6和T11中翠竹组培苗平均生根数结果图，从图5中可以看出，T4生根最早，在0～7d阶段已诱导出根，随后不断有新根产生；且在7～14d阶段内根数增长速度较快，增幅较大；第21d后，其增长趋势逐渐平缓，每个阶段的增幅也较小。T6生根最晚，在28～35d阶段才有根生出，此阶段根数增长速度同样最快，7d内有约30条新根产生。T11虽在21～28d时才有根产生，但在此期间生根数增长速度最快。在第49d时，T11的平均生根数为50.5条，超过了T4的48.83条。

综上所述，从诱导生根的速度来看，T4最早诱导出根，T6与T11则出根较晚。从诱导出根后根数的增长速度上来看，T4在诱导出根后，经42d根数才增长至46条左右，增长速度较为平缓；而T11在出根后，仅用21d根数便增长至相同水平，增长速度极快；T6在相同时间21d内，其根数也仅增长至42条，可见，T11在诱导出根后，其平均生根数增长速度最快。

Claims (1)

1.以翠竹鞭芽为外植体同时高效生根获得瓶苗的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）以翠竹三年生盆栽实生苗生长健壮植株的竹鞭侧芽作为外植体材料，将采集的翠竹实生苗竹鞭剪成1.5 cm的带芽鞭段，用洗洁精清洗后，在自来水流水下冲洗24 h，备用；

（2）在无菌操作台上，处理好的外植体经70%酒精处理60 s，无菌水冲洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15 min，无菌水冲洗5次；

（3）接种在基本培养基上，基本培养基为MS+2 mg·L^-1 6-BA；

（4）20 d后将无菌的靓竹外植体接种到诱导培养基上进行丛芽诱导以及增殖，一个月后丛芽形成；其中，丛芽诱导培养基为MS+0.1 mg·L^-1 TDZ+0.5 mg·L^-1 NAA，丛芽增殖培养基为MS+5 mg·L^-1 6-BA+0.3 mg·L^-1 NAA；

（5）将丛芽转接到增殖培养基上继代5~6次，将得到的丛芽转移到生根培养基中，21-28d大量生根苗形成；其中，生根增殖培养基为1/2 MS+1 mg·L^-1 6-BA+1.5 mg·L^-1 NAA+0.5mg·L^-1 IBA；

基本培养基、诱导培养基、增殖培养基、生根培养基中还含有30g/L蔗糖，2.25g/L植物凝胶；

步骤（3）、（4）、（5）中的培养条件为温度25±1℃，光周期为14h/黑暗10h，培养物表面的光照强度为1500lx。

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