CN117099686B - 北美冬青组培快速繁殖方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种北美冬青组培快速繁殖方法及应用，步骤包括：外植体消毒、初代丛生芽诱导、继代丛生芽增殖和丛生芽生根。本发明消毒污染率仅为4.6%，丛生芽诱导率高达100%且不产生愈伤，增殖系数高达7.0以上，生根率提高至100%，同时可使叶片展开度降低，茎有木质化趋向，能更大程度的有利于驯化成活率的提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体来说是一种北美冬青组培快速繁殖方法及应用。
背景技术
北美冬青（学名：Ilex verticillata），别名轮生冬青、美洲冬青、轮叶冬青，是冬青科冬青属多年生灌木。
北美冬青秋冬落叶，树高2-3米，浅根性树种，单叶互生，长卵型或卵状椭圆形；为雌雄异株植物，花乳白色。挂果期从10月持续至次年3月。多生长在沼泽、潮湿灌木区和池塘边等低洼区。原产于北美，分布于中国、美国、加拿大和法国。果实具有亮丽的鲜红色，如同红玛瑙，有很高的观赏价值。它是插花、花艺的极好材料，也是很好的干花材料。
为保持冬青的观赏价值，扩大推广范围，无性繁殖是保持遗传特色的最好方法，而组织培养法是快速获得大量繁殖苗的最佳方法。但由于目前落叶冬青组培苗增殖系数少、生根慢、生根率低，限制了其大规模的推广和繁殖。无性繁殖已经成为了北美冬青快速繁殖的方法，现有技术已公开了大量北美冬青组培快繁的方法，但是其仍然存在着很多难于解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对背景技术中存在的问题，提供一种北美冬青组培快速繁殖方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：北美冬青组培快速繁殖方法，步骤包括：
（1）外植体消毒：选择端部未木质化的幼嫩枝条，清洗后依次用酒精、升汞、双氧水、升汞消毒；具体为：75%酒精消毒20～30 s，无菌水涮洗2～3次；0.1%升汞溶液消毒1～2min，无菌水涮洗3～4次；5%双氧水溶液消毒15～18 min，无菌水涮洗2～3次；0.05%升汞溶液消毒5～6 min，无菌水涮洗6～7次；
（2）初代丛生芽诱导：经消毒后的外植体，接种于初代丛生芽诱导培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养40～45天；
所述初代丛生芽诱导培养基配方为：MS+NAA 0.05～0.1 mg/L+2,4-D 0.01～0.02mg/L+2-iP 0.3～0.5 mg/L +KT 5.0～6.0 mg/L；
（3）继代丛生芽增殖：初代诱导的丛生芽切成单芽，接种于丛生芽增殖培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养30～35天；
所述继代丛生芽增殖培养基配方为：改良MS+NAA 0.02～0.05 mg/L+BR 0.05～0.08 mg/L+KT 3.0～4.0 mg/L+GA3 0.2～0.4 mg/L+硝酸银0.1～0.2 μg/L+椰乳20～30g/L；
（4）丛生芽生根：将继代丛生芽切成单芽，接种于生根培养基中，置于温度25±2℃，每日照光14h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养20～25天；
所述生根培养基配方为：1/2改良MS+NAA 0.3～0.5 mg/L+IAA 1.5～2.0 mg/L+椰汁 50～80 mL/L+CH 20～30 mg/L。
进一步的：步骤（3）和（4）中，所述改良MS为在原MS培养基的基础上，硝酸铵改为1.3 g/L，硝酸钾改为0.9 g/L，二水氯化钙改为0 g/L，硫酸镁改为0.26 g/L，磷酸二氢钾改为0.15 g/L，肌醇改为0.13 g/L，同时添加硝酸钙0.4 g/L，其余成分不变。
进一步的：所述初代丛生芽诱导培养基配方为：MS+NAA 0.075 mg/L+2,4-D 0.01mg/L+2-iP 0.4 mg/L +KT 5.5 mg/L。
进一步的：所述继代丛生芽增殖培养基配方为：改良MS+NAA 0.04 mg/L+BR 0.07mg/L+KT 3.5 mg/L +GA3 0.3 mg/L+硝酸银0.15 μg/L+椰乳25 g/L。
进一步的：所述生根培养基配方为：1/2改良MS+NAA 0.4 mg/L+IAA 1.7 mg/L+椰汁65 mL/L+ CH 25 mg/L。
本发明的有益技术效果是：
1、本发明消毒污染率仅为4.6%，各消毒成分的浓度及消毒时间搭配几乎不会导致外植体消毒死亡，同时亦不会导致褐化的产生。
2、本发明在初代诱导培养基中，采用适宜浓度的2,4-D，NAA，2,ip，KT搭配，可使丛生芽诱导率高达100%且不产生愈伤。
3、本发明在丛生芽继代增殖培养基中，采用适宜浓度的NAA，BR，KT，GA3，可使增殖系数高达7.0以上，但高浓度的细胞分裂素极易导致北美冬青的苗纤弱、玻化率高等情况发生，而创造性的添加适宜浓度的硝酸银和椰乳，可使苗更加健壮，同时最大程度的降低了玻化率的发生。
4、本发明在丛生芽的生根培养基中，结合NAA和IAA，创造性的添加适宜浓度的椰汁和CH，可使生根率提高至100%，同时可使叶片展开度降低，茎有木质化趋向，能更大程度的有利于驯化成活率的提高。
5、在继代增殖和生根培养时，采用常规的MS为基本培养基时，时常发生叶色泽偏黄甚至枯黄后脱落，一方面使苗的商品性降低，另一方面亦在一定程度的提高了培养过程中苗的损失率，本发明在丛生芽继代增殖和生根培养时，基本培养基采用改良MS，可使叶片颜色更加鲜绿，几乎可杜绝苗继代或生根培养过程中的叶黄化、落叶等情况发生。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明方法实施例1培育的组培苗；
图2是本发明方法实施例2培育的组培苗。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种北美冬青组培快速繁殖方法，步骤包括：
（1）外植体消毒：选择端部未木质化的幼嫩枝条，清洗后依次按：75%酒精消毒20s，无菌水涮洗2次；0.1%升汞溶液消毒1min，无菌水涮洗3次；5%双氧水溶液消毒15 min，无菌水涮洗2次；0.05%升汞溶液消毒5min，无菌水涮洗6次。
（2）初代丛生芽诱导：经消毒后的外植体，接种于MS+NAA 0.05mg/L+2,4-D0.01mg/L+2-iP 0.3mg/L + KT 5.0mg/L的初代丛生芽诱导培养基中，置于温度23℃、每日照光12h、光强2000lx的光暗交替下培养40天。
（3）继代丛生芽增殖：初代诱导的丛生芽切成单芽，接种于改良MS+NAA 0.02mg/L+BR 0.05mg/L+KT 3.0mg/L+GA3 0.2mg/L+硝酸银0.1μg/L+椰乳20g/L的丛生芽增殖培养基中，置于温度23℃、每日照光12h、光强2000lx的光暗交替下培养30天；增值培养后的结果如图1所示，增殖苗健壮且无玻化现象发生。
（4）丛生芽生根：将继代丛生芽切成单芽，接种于1/2改良MS+NAA 0.3mg/L+IAA1.5mg/L+椰汁 50mL/L+CH 20mg/L的生根培养基中，置于温度23℃、每日照光14h、光强2000lx的光暗交替下培养20天；生根培养后结果如图2所示，生根苗根系健壮且发达。
改良MS为在原MS培养基的基础上，硝酸铵改为1.3 g/L，硝酸钾改为0.9 g/L，二水氯化钙改为0 g/L，硫酸镁改为0.26 g/L，磷酸二氢钾改为0.15 g/L，肌醇改为0.13 g/L，同时添加硝酸钙0.4 g/L，其余成分不变。
实施例2
一种北美冬青组培快速繁殖方法，步骤包括：
（1）外植体消毒：选择端部未木质化的幼嫩枝条，清洗后依次按：75%酒精消毒30s，无菌水涮洗3次；0.1%升汞溶液消毒2 min，无菌水涮洗4次；5%双氧水溶液消毒18 min，无菌水涮洗3次；0.05%升汞溶液消毒6 min，无菌水涮洗7次。
（2）初代丛生芽诱导：经消毒后的外植体，接种于MS+NAA 0.1 mg/L+2,4-D 0.02mg/L+2-iP 0.5 mg/L +KT 6.0 mg/L的初代丛生芽诱导培养基中，置于温度27℃、每日照光12h、光强3000lx的光暗交替下培养45天。
（3）继代丛生芽增殖：初代诱导的丛生芽切成单芽，接种于改良MS+NAA 0.05 mg/L+BR0.08 mg/L+KT 4.0 mg/L+GA3 0.4 mg/L+硝酸银0.2 μg/L+椰乳30 g/L的丛生芽增殖培养基中，置于温度27℃、每日照光12h、光强3000lx的光暗交替下培养35天。
（4）丛生芽生根：将继代丛生芽切成单芽，接种于1/2改良MS+NAA 0.5 mg/L+IAA2.0 mg/L+椰汁80 mL/L+CH 30 mg/L的生根培养基中，置于温度27℃、每日照光14h、光强3000lx的光暗交替下培养25天。
改良MS为在原MS培养基的基础上，硝酸铵改为1.3 g/L，硝酸钾改为0.9 g/L，二水氯化钙改为0 g/L，硫酸镁改为0.26 g/L，磷酸二氢钾改为0.15 g/L，肌醇改为0.13 g/L，同时添加硝酸钙0.4 g/L，其余成分不变。
实施例3
一种北美冬青组培快速繁殖方法，步骤包括：
（1）外植体消毒：选择端部未木质化的幼嫩枝条，清洗后依次按：75%酒精消毒25s，无菌水涮洗2次；0.1%升汞溶液消毒1.5 min，无菌水涮洗3次；5%双氧水溶液消毒17 min，无菌水涮洗3次；0.05%升汞溶液消毒5.5 min，无菌水涮洗7次。
（2）初代丛生芽诱导：经消毒后的外植体，接种于MS+NAA 0.075 mg/L+2,4-D 0.01mg/L+2-iP 0.4 mg/L +KT 5.5 mg/L的初代丛生芽诱导培养基中，置于温度25℃、每日照光12h、光强2500lx的光暗交替下培养43天。
（3）继代丛生芽增殖：初代诱导的丛生芽切成单芽，接种于的改良MS+NAA 0.04mg/L+BR 0.07 mg/L+KT 3.5 mg/L +GA3 0.3 mg/L+硝酸银0.15 μg/L+椰乳25 g/L丛生芽增殖培养基中，置于温度25℃、每日照光12h、光强2500lx的光暗交替下培养32天。
（4）丛生芽生根：将继代丛生芽切成单芽，接种于1/2改良MS+NAA 0.4 mg/L+IAA1.7 mg/L+椰汁65 mL/L+ CH 25 mg/L的生根培养基中，置于温度25℃、每日照光14h、光强2500lx的光暗交替下培养23天。
改良MS为在原MS培养基的基础上，硝酸铵改为1.3 g/L，硝酸钾改为0.9 g/L，二水氯化钙改为0 g/L，硫酸镁改为0.26 g/L，磷酸二氢钾改为0.15 g/L，肌醇改为0.13 g/L，同时添加硝酸钙0.4 g/L，其余成分不变。
对比例1
按照（刘瑞等《2个北美冬青新品种组培快繁高效再生技术体系的建立》[J], 《植物研究》2021, 41 (2): 221-231）的最佳方法实施。
对比例2
按照（张俊林、余有祥等发表的《北美冬青‘奥斯特’的组织培养和快速繁殖研究》[J]《植物生理学报》2014.50（10）.1541-1545）的最佳方法实施。
对比例3
按申请号为：201711469701X、名称为：一种快速培育落叶冬青组培苗的方法（授权公告号：CN108029559B）的方法操作。
对比例4
按申请号为：2022106652696、名称为：一种红精灵北美冬青组培苗的培育方法（申请公布号CN114982634A）的方法实施。
对比例5
按申请号为：2021112216596、名称为：一种丛生北美冬青苗的快速培育方法（申请公布号：CN113875590A）的方法实施。
对比例6
按申请号：2013104760574、名称为：一种北美冬青的组织培养方法（授权公告号CN103563745B）的方法实施。
对比例7
按照（顾征洋等《北美冬青奥斯特茎段组织培养技术研究》[J], 《现代农业科技》。2023(13)，119-122）的最佳方法实施。
将实施例1-3和对比例1-7进行消毒污染率、消毒死亡率、褐化率、初代丛生芽诱导率、增殖系数、增殖苗玻化率和生根率进行统计比较，结果见下表1。
表1 统计结果
| 消毒污染率 | 消毒死亡率 | 褐化率 | 初代丛生芽诱导率 | 增殖系数 | 增殖苗玻化率 | 生根率 | |
| 实施例1 | 3.94% | 0.13% | 无 | 100% | 7.1 | 0.4% | 100% |
| 实施例2 | 3.76% | 0.18% | 无 | 100% | 7.4 | 0.7% | 100% |
| 实施例3 | 3.81% | 0.11% | 无 | 100% | 7.6 | 1.3% | 100% |
| 对比例1 | 29.4% | 0 | 19.7% | 86.7% | 6.2 | 13.1% | 91.4% |
| 对比例2 | 4.3% | 24.6% | 11.4% | 40.3% | 4.8 | 1.5% | 90.7% |
| 对比例3 | 3.60% | 0.12% | 无 | 100% | 5.4 | 2.0% | 87.9% |
| 对比例4 | 1.18% | 31.67% | 10.9% | 26.7%（大量出愈） | 1.6 | 无 | 80.1% |
| 对比例5 | 1.43% | 30.7% | 14.2% | 54.1% | 4.1 | 4.6% | 96.5% |
| 对比例6 | 6.91% | 21.3% | 9.8% | 53.3% | 4.3 | 1.9% | 93.7% |
| 对比例7 | 3.85% | 0.18% | 无 | 100% | 3.8 | 21.3% | 60.9% |
从上表可知本发明方法用于快速培养北美冬青组培苗过程中，不会发生褐化现象，初代丛生芽诱导率和生根率达到100%，其增值系数远远高于现有技术对比例1-7，增殖苗玻化率显著低于现有技术对比例1-7。虽然对比例中3、4、5的消毒污染率低于实施例1-3，对比例1和7消毒死亡率低于实施例1-3，对比例2和7无褐化现象，对比例3和7初代丛生芽诱导率与实施例1-3相等，对比例4无增殖苗玻化率，但其除了其由于实施例1-3的指标外，其他指标均不如实施例1-3的指标。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (5)
1.北美冬青组培快速繁殖方法，其特征在于，步骤包括：
（1）外植体消毒：选择端部未木质化的幼嫩枝条，清洗后依次用酒精、升汞、双氧水、升汞消毒；具体为：75%酒精消毒20～30 s，无菌水涮洗2～3次；0.1%升汞溶液消毒1～2 min，无菌水涮洗3～4次；5%双氧水溶液消毒15～18 min，无菌水涮洗2～3次；0.05%升汞溶液消毒5～6 min，无菌水涮洗6～7次；
（2）初代丛生芽诱导：经消毒后的外植体，接种于初代丛生芽诱导培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养40～45天；
所述初代丛生芽诱导培养基配方为：MS+NAA 0.05～0.1 mg/L+2,4-D 0.01～0.02 mg/L+2-iP 0.3～0.5 mg/L +KT 5.0～6.0 mg/L；
（3）继代丛生芽增殖：初代诱导的丛生芽切成单芽，接种于丛生芽增殖培养基中，置于温度25±2℃，每日照光12h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养30～35天；
所述继代丛生芽增殖培养基配方为：改良MS+NAA 0.02～0.05 mg/L+BR 0.05～0.08mg/L+KT 3.0～4.0 mg/L+GA3 0.2～0.4 mg/L+硝酸银0.1～0.2 μg/L+椰乳20～30 g/L；
（4）丛生芽生根：将继代丛生芽切成单芽，接种于生根培养基中，置于温度25±2℃，每日照光14h，光强2000～3000lx的光暗交替下培养20～25天；
所述生根培养基配方为：1/2改良MS+NAA 0.3～0.5 mg/L+IAA 1.5～2.0 mg/L+椰汁50～80 mL/L+CH 20～30 mg/L；
步骤（3）和（4）中，所述改良MS为在原MS培养基的基础上，硝酸铵改为1.3 g/L，硝酸钾改为0.9 g/L，二水氯化钙改为0 g/L，硫酸镁改为0.26 g/L，磷酸二氢钾改为0.15 g/L，肌醇改为0.13 g/L，同时添加硝酸钙0.4 g/L，其余成分不变。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述初代丛生芽诱导培养基配方为：MS+NAA0.075 mg/L+2,4-D 0.01 mg/L+2-iP 0.4 mg/L +KT 5.5 mg/L。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述继代丛生芽增殖培养基配方为：改良MS+NAA 0.04 mg/L+BR 0.07 mg/L+KT 3.5 mg/L +GA3 0.3 mg/L+硝酸银0.15 μg/L+椰乳25g/L。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述生根培养基配方为：1/2改良MS+NAA 0.4mg/L+IAA 1.7 mg/L+椰汁65 mL/L+ CH 25 mg/L。
5.根据权利要求1-4任一项所述方法在北美冬青组培快速繁殖中的应用。
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