CN116569844B - 利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，涉及人参娃儿藤的组织培养领域。本发明的方法包括外植体获得，清洗消毒、丛生芽诱导培养和增殖培养，以及初代诱导或继代增殖的丛生芽生根培养步骤。其中，丛生芽诱导培养基为改良MS+NAA0.1‑1.0mg/L+2,4‑D1.0‑3.0mg/L+CPPU0.2‑0.3mg/L；丛生芽增殖培养基为改良MS+BA1.0‑2.0mg/L+GA30.1‑1.0mg/L+BR0.01‑0.05mg/L；生根培养基为1/2改良WPM+IBA 0.2‑0.5mg/L+CCC0.5‑1.0mg/L+AC 0.5g。本发明的方法生根苗驯化成活率高，降低了生产成本，缩短了生产周期。
Description
技术领域
本发明涉及中药材以及生物技术领域，特别涉及人参娃儿藤的组织培养领域。
背景技术
人参娃儿藤（Tylophora kerrii Craib）又名土人参、土牛七、山豆根，为萝藦科娃儿藤属攀援小灌木，根入药，具有清肝明目，行气止痛的功效，主要用于两目视物昏花，脘腹胀痛。现代中医药研究表明，娃儿藤属植物中分离得到娃儿藤碱(Tylophorine)、异娃儿藤碱(Tylocrebrine)、娃儿藤宁碱(Tylophorinine)的抗癌活性显著，是很好的药物资源，具有很高的开发利用价值。
现有的人参娃儿藤药用植物资源极少，医学上的需求日趋增多，但人工繁殖娃儿藤属植物生物技术方面研究较少，因此不能满足需求。
中国专利《一种人参娃儿藤两步成苗组织培养的方法》（CN 105532453 A )公开了一种通过对人参娃儿藤带芽茎段进行诱导、不定芽生根建立两步成苗组织培养体系技术。但该技术在实际生产中使得生产步骤相对繁琐，增加了生产成本，不利于大规模推广。
发明内容
本发明提出一种直接利用茎段诱导丛生芽，再通过生根获得完整植株的组培快繁方法。
利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1，取人参娃儿藤植株枝条顶端20-30cm幼嫩茎段及顶芽为外植体；
步骤2，外植体去叶，并剪成2-3cm具芽小段；
步骤3，清洗外植体；
步骤4，外植体消毒；
步骤5，丛生芽诱导培养；
步骤6，丛生芽增殖培养；
步骤7，初代诱导或继代增殖的丛生芽生根培养；
步骤4所述的消毒是将清洁好的外植体用75%酒精消毒10-20s，无菌水涮洗3-4次，饱和漂白粉溶液消毒20-25min，无菌水涮洗3-4次，然后用0.05%升汞溶液消毒8-10min，无菌水涮洗6-8次；
步骤5采用的丛生芽诱导培养基为改良MS+NAA0.1-1.0mg/L+2,4-D1.0-3.0mg/L+CPPU0.2-0.3mg/L；
步骤6采用的丛生芽增殖培养基为改良MS+BA1.0-2.0mg/L+GA30.1-1.0mg/L+BR0.01-0.05mg/L；
步骤7采用的初代诱导或继代增殖的丛生芽生根培养基为1/2改良WPM+IBA 0.2-0.5mg/L+CCC0.5-1.0mg/L+AC 0.5g；
步骤5及步骤6所述的改良MS为MS成分不变，pH调整为5.4的MS；
步骤7所述的改良WPM为WPM成分不变，pH调整为5.4的WPM。
步骤3清洗外植体，具体是用0.1-0.5%肥皂液涮洗10-12min，自来水漂洗至无明显肥皂液残留，后滴加2-3滴吐温-80，并加适量水后震摇10-15min，最后用自来水冲淋50-60min。
步骤5的丛生芽诱导培养是置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养25-30天。
步骤6的丛生芽增殖培养是置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养25-30天。
步骤7的生根培养是置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光12h的环境下培养15-20天。
所述BR为芸苔素内酯。
步骤5及步骤6所述的改良MS为MS成分不变，pH调整为5.4的MS。
步骤7所述的改良WPM为WPM成分不变，pH调整为5.4的WPM。
本发明的方法，具备以下的技术效果：
1、本发明在外植体消毒时，使用升汞消毒时，较常规采用的0.1%浓度降低了一半，同时搭配75%酒精以及漂白粉溶液，一方面可使消毒污染率控制在20%以内，另一方面消毒剂几乎不损伤外植体。
2、本发明在初代诱导时采用NAA、2,4-D和CPPU的适宜浓度组合，可直接诱导出丛生芽，未采用组培过程中常规的愈伤诱导、愈伤分化成芽途径，减少了愈伤分化成芽的环节，一定程度的缩短了生产周期、简便了生产环节、降低了生产成本，同时还能有效避免愈伤受外界因子影响带来的变异风险。
3、本发明在增殖过程中采用GA3和BR的组合，可使增殖系数稳定到7以上，苗更加健壮。
4、一般组培苗进行生根培养时，均需30-40天的培养时间，更有甚者需更长时间或者进行二次生根培养。本发明在增殖过程中，GA3和BR的组合，可使苗更加健壮，同时一定程度的促进了基部根原基的形成，在结合1/2WPM与IBA和CCC的适宜浓度组合的生根培养基时，可在15-20天即可形成合格的生根苗。
附图说明
图1为实施例1丛生芽继代增殖苗图；
图1显示丛生芽继代增殖苗无愈伤出现，无玻化苗，增殖系数高。
图2为实施例2丛生芽20天生根苗图；
图2显示苗及根系健壮。
具体实施方式
实施例1：利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，包括以下步骤：
步骤1，选择健壮无病虫害人参娃儿藤植株，取枝条顶端20-30cm幼嫩茎段及顶芽为外植体。
步骤2，剪下的外植体去叶，并剪成2-3cm具芽小段。
步骤3，用饱和肥皂液溶液涮洗10min，自来水漂洗至无明显肥皂液残留，后滴加3滴吐温-80，并加适量水后震摇10min，最后用自来水冲淋50min。
步骤4，将清洁好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒10s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗3次，0.05%升汞溶液消毒8min，无菌水涮洗8次。
步骤5，将消毒好的外植体，剪去两端伤口，保留1-2cm具芽小段，用无菌纸吸去表面水分，按生理极性接种于改良MS+NAA0.1mg/L+2,4-D1.0mg/L+CPPU0.2mg/L的丛生芽诱导培养基，并置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养25天。
步骤6，将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按生理极性接种于改良MS+BA1.0mg/L+GA30.2mg/L+BR0.01mg/L的丛生芽增殖培养基，并置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养30天。
步骤7，将初代诱导或继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种于1/2改良WPM+IBA0.2mg/L+CCC0.5mg/L+AC 0.5g的生根培养基，并置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光12h的环境下培养20天。
步骤8，将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量1:1泥炭土与田园土混合的基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
步骤5及步骤6所述的改良MS为MS成分不变，pH调整为5.4的MS。
步骤7所述的改良WPM为WPM成分不变，pH调整为5.4的WPM。
实施例2：利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，包括以下步骤：步骤1，选择健壮无病虫害人参娃儿藤植株，取枝条顶端20-30cm幼嫩茎段及顶芽为外植体。
步骤2，剪下的外植体去叶，并剪成2-3cm具芽小段。
步骤3，用饱和肥皂液溶液涮洗12min，自来水漂洗至无明显肥皂液残留，后滴加3滴吐温-80，并加适量水后震摇15min，最后用自来水冲淋60min。
步骤4，将清洁好的外植体转移至超净工作台，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗4次，饱和漂白粉溶液消毒25min，无菌水涮洗4次，0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水涮洗8次。
步骤5，将消毒好的外植体，剪去两端伤口，保留1-2cm具芽小段，用无菌纸吸去表面水分，按生理极性接种于改良MS+NAA0.15mg/L+2,4-D1.2mg/L+CPPU0.2mg/L的丛生芽诱导培养基，并置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养30天。
步骤6，将诱导出的丛生芽，剪成单芽，按生理极性接种于改良MS+BA2.0mg/L+GA30.8mg/L+BR0.05mg/L的丛生芽增殖培养基上，并置于温度为25±2 ℃，光照强度2000~3000LX，日照光10h的光暗交替环境下培养25天.
步骤7，将初代诱导或继代增殖的丛生芽，剪成单芽，接种1/2改良WPM+IBA 0.5mg/L+CCC1.0mg/L+AC 0.5g的生根培养基上，并置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光12h的环境下培养20天。
步骤8，将生根苗出瓶后，洗净培养基，栽植于按质量1:1泥炭土与田园土混合的基质中，同时进行常规的组培苗驯化管理。
步骤5及步骤6所述的改良MS为MS成分不变，pH调整为5.4的MS。
步骤7所述的改良WPM为WPM成分不变，pH调整为5.4的WPM。
对比例1：依照中国专利《一种人参娃儿藤两步成苗组织培养的方法》（CN105532453 A )实施例1公开的技术方案进行外植体消毒、无菌芽的诱导、不定芽的生根，并记录实施过程的相应指标，具体列于下表1中。
表1
| 实施例 | 消毒污染率 | 消毒死亡率 | 初代诱导丛生芽率 | 初代诱导愈伤率 | 继代丛生芽增殖系数 | 15天生根率 | 30天生根率 | 生根苗驯化成活率 |
| 实施例1 | 18.7% | 1.4% | 64.6% | 0 | 7.9 | 100% | 100% | 100% |
| 实施例2 | 17.9% | 1.7% | 68.4% | 0 | 7.2 | 100% | 100% | 100% |
| 对比例1 | 15.6% | 51.4% | 2.6% | 42.9% | 5.1 | 32.7% | 94.6% | 95.4% |
由上表可以看出，对比例1消毒污染率相对较本发明略低，但消毒死亡率远高于本发明，而消毒成功率（综合消毒污染率及消毒死亡率）在很大程度上决定了生产周期。此外，高的消毒成功率，能较大程度降低前期成本。
同时，在初代诱导时，对比例1几乎无丛生芽发生，诱导出的大多为愈伤组织，虽然愈伤后期在增殖过程中能继续分化，但一方面就丛生芽诱导率看，远低于本发明，另一方面，对比例1愈伤分化的芽，玻化率较高，最高时可达到13.6%。在组培实际生产种苗过程中，丛生芽增殖系数多少，几乎决定了生产成本的高低和生产周期的长短，而丛生芽玻璃化和诱导褐化率，亦在很大程度上决定了生产成本和生产周期。
在生根方面，本发明20天即可100%形成可出瓶的生根苗，而对比例1在20天时仅只有约33.7%的生根率，且仅12.5%左右达到出瓶标准，本发明的方法，生根成苗时间大幅缩短。
Claims (5)
1.利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤1，取人参娃儿藤植株枝条顶端20-30cm幼嫩茎段及顶芽为外植体；
步骤2，外植体去叶，并剪成2-3cm具芽小段；
步骤3，清洗外植体；
步骤4，外植体消毒；
步骤5，丛生芽诱导培养；
步骤6，丛生芽增殖培养；
步骤7，初代诱导或继代增殖的丛生芽生根培养；
步骤4所述的消毒是将清洁好的外植体用75%酒精消毒10-20s，无菌水涮洗3-4次，饱和漂白粉溶液消毒20-25min，无菌水涮洗3-4次，然后用0.05%升汞溶液消毒8-10min，无菌水涮洗6-8次；
步骤5采用的丛生芽诱导培养基为改良MS+NAA0.1-1.0mg/L+2,4-D1.0-3.0mg/L+CPPU0.2-0.3mg/L；
步骤6采用的丛生芽增殖培养基为改良MS+BA1.0-2.0mg/L+GA30.1-1.0mg/L+BR0.01-0.05mg/L；
步骤7采用的初代诱导或继代增殖的丛生芽生根培养基为1/2改良WPM+IBA 0.2-0.5mg/L+CCC0.5-1.0mg/L+AC 0.5g；
步骤5及步骤6所述的改良MS为MS成分不变，pH调整为5.4的MS；
步骤7所述的改良WPM为WPM成分不变，pH调整为5.4的WPM。
2.如权利要求1所述的利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤3清洗外植体，具体是用0.1-0.5%肥皂液涮洗10-12min，自来水漂洗至无明显肥皂液残留，后滴加2-3滴吐温-80，并加适量水后震摇10-15min，最后用自来水冲淋50-60min。
3.如权利要求1所述的利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤5的丛生芽诱导培养是置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养25-30天。
4.如权利要求1所述的利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤6的丛生芽增殖培养是置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光10h的环境下培养25-30天。
5.如权利要求1所述的利用人参娃儿藤茎段诱导丛生芽的组培快繁方法，其特征在于所述的步骤7的生根培养是置于温度为25±2 ℃，光照强度2000-3000LX，每日日照光12h的环境下培养15-20天。
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Application publication date: 20230811 Assignee: Nujiang Angda Biotechnology Development Co.,Ltd. Assignor: INSTITUTE OF MEDICINAL PLANTS, YUNNAN ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2023980054565 Denomination of invention: A tissue culture and rapid propagation method for inducing clustered buds using the stem segments of ginseng and baby vine Granted publication date: 20230919 License type: Common License Record date: 20231228 |