CN115005098A - 一种民间中草药舒筋草的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及民间中草药种苗繁殖方法，具体地说，涉及一种民间中草药舒筋草的快速繁殖方法，包括依次进行的如下步骤：舒筋草外植体采集、不定芽诱导、增殖培养、生根培养、炼苗移栽；所述的用于不定芽诱导培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6‑BA、1.0～2.0mg/L TDZ、1.0～2.0mg/L IBA、20～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭、50～100ml/L椰子汁，不定芽诱导培养基pH为5.4～5.8，本发明选择舒筋草当年生未木质化茎段为外植体，经不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等步骤，其不定芽诱导率可达到50％以上，生根率达到了63.5％以上，移栽成活率达到79.1％以上，实现了民间中草药舒筋草种苗的快速繁殖，从而实现了本发明的目的。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养的方法，具体地涉及一种民间中草药舒筋草的快速繁殖方法。
背景技术
民间中草药舒筋草(Lycopodium japonicum Thunb)系石松科藤石松属蕨类植物的干燥全草，也称之为藤石松。舒筋草多为民间用药，具有祛风除湿、舒筋活血、明目、解毒等功效，可用于风湿痹痛、腰肌劳损、跌打损伤、女性月经不调、盗汗、结膜炎、夜盲症、烫伤、疮疡肿毒、消炎除湿、小儿外感发热等。舒筋草主要的药效成分石松定碱型生物碱，其药品商品名为“双益平”、“哈伯因”，1993年美国FAD已批准上市，1996年我国批准为二类新药，用于阿尔海默茨病(AD)的治疗，因此舒筋草具有良好的开发前景。舒筋草主要分布于华南、西南及湖北、湖南、福建、台湾等地，生于森林边缘及灌木丛中。目前舒筋草于野生状态，但由于药农无序采挖，其野生资源锐减，因此人工种植舒筋草显得十分迫切。舒筋草主要通过分株方式繁殖，但均存在周期长、繁殖系数低下等缺点，限制了舒筋草种苗的生产。
目前，国内外尚未有舒筋草组织培养技术的报道，也未有舒筋草组培快繁专利的申请。
发明内容
本发明的目的是提供一种民间中草药舒筋草的快速繁殖方法，选择舒筋草当年生未木质化茎段为外植体，经不定芽诱导、增殖、生根、炼苗以及移栽等步骤，其不定芽诱导率可达到50％以上，种苗移栽成活率达到了85％以上，实现了民间中草药舒筋草种苗的快速繁殖。
本发明提供的技术方案为：一种民间中草药舒筋草的快速繁殖方法，步骤依次包括采集舒筋草外植体、诱导外植体不定芽、增殖培养、生根培养、移栽；其中，诱导外植体不定芽采用的不定芽诱导培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/L TDZ、1.0～2.0mg/L IBA、20～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭、50～100ml/L椰子汁，不定芽诱导培养基pH为5.4～5.8。
所述的诱导外植体不定芽培养操作的方法为：将舒筋草当年生未木质化茎段经消毒后切成3.0～4.0cm的茎段并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全黑暗培养90～120天可诱导形成不定芽。
所述的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/L TDZ、1.0～2.0mg/L IBA、20～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭，增殖培养基pH为5.4～5.8。
所述的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的不定芽去除顶端后接种到增殖培养基中培养70～90天即可实现不定芽的增殖。
所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：1/2MS培养基、1.0～2.0mg/LGGR、0.5～1.0mg/L IBA、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭，生根培养基pH为5.4～5.8。
所述的生根培养操作具体为：将增殖培养操作得到的长2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养45～60天即能实现试管苗的生根。
所述的移栽操作的具体方法为：将经生根培养操作得到的高约4～5cm、有2～3条根、生长健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗5～7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:松树皮:农家肥＝5:4:1)中栽培成苗即得种苗。
增殖培养、生根培养操作中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为10～12小时/天。
有益效果：
本发明选择舒筋草当年生未木质化茎段为外植体，经不定芽诱导、增殖、生根、炼苗以及移栽等步骤，建立了民间中草药舒筋草的组织培养技术。本发明具有技术性强、成本低廉、工艺简单等特点，可直接用于舒筋草种苗的工厂化生产，对于促进民间中草药舒筋草产业化开发利用具有重要的现实意义。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的舒筋草植株当年生未木质化茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，切去针形叶后，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒20秒钟，无菌水冲洗3次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成3.0～4.0cm左右的茎段并接种到诱导培养基中，置于25℃进行全黑暗培养120天即可诱导形成不定芽，诱导率为50％，污染率为低于15％。所述的诱导培养基为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭+50ml/L椰子汁，pH为5.4。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约1.0～2.0cm的茎段去除顶端后接种到增殖培养基中培养90天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到1.8倍。所述的增殖培养基为：MS培养基+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.4。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养60天即能实现试管苗的生根，生根率为63.5％。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+1.0mg/L GGR+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.4。
(5)移栽：将步骤(4)高约得到的高约4～5cm、有2～3条根、生长健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗5天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:松树皮:农家肥＝5:4:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为85.6％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为10小时/天。
实施例二
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的舒筋草植株当年生未木质化茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，切去针形叶后，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒25秒钟，无菌水冲洗4次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成3.0～4.0cm左右的茎段并接种到诱导培养基中，置于26℃进行全黑暗培养105天即可诱导形成不定芽，诱导率为57.9％，污染率为低于13％。所述的诱导培养基为：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L TDZ+1.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.7g/L活性炭+75ml/L椰子汁，pH为5.6。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约1.0～2.0cm的茎段去除顶端后接种到增殖培养基中培养80天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到2.3倍。所述的增殖培养基为：MS培养基+1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L TDZ+1.5mg/L IBA+25g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.7g/L活性炭，pH为5.6。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养52天即能实现试管苗的生根，生根率为67.9％。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+1.5mg/L GGR+0.7mg/L IBA+0.8mg/L NAA+17g/L蔗糖+3.5g/L琼脂+0.7g/L活性炭，pH为5.6。
(5)移栽：将步骤(4)高约得到的高约4～5cm、有2～3条根、生长健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗6天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:松树皮:农家肥＝5:4:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为78.9％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为1700lx，光照时间为11小时/天。
实施例三
(1)外植体采集：在野外选取生长健壮、无明显病害的舒筋草植株当年生未木质化茎段为外植体，采集后立即进行保水保湿处理并及时带回实验室。
(2)外植体诱导：当步骤(1)采集回实验室外植体先在自来水下冲洗过夜，切去针形叶后，置于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒30秒钟，无菌水冲洗5次并用无菌滤纸吸干表面水珠后，置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干表面水珠后切成3.0～4.0cm左右的茎段并接种到诱导培养基中，置于28℃进行全黑暗培养90天即可诱导形成不定芽，诱导率为64.5％，污染率为低于10％。所述的诱导培养基为：MS培养基+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+1.0g/L活性炭+100ml/L椰子汁，pH为5.8。
(3)不定芽增殖：将步骤(2)诱导得到的无根不定芽切成长约1.0～2.0cm的茎段去除顶端后接种到增殖培养基中培养70天即可实现不定芽的增殖，增殖系数达到2.6倍。所述的增殖培养基为：MS培养基+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L TDZ+2.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+1.0g/L活性炭，pH为5.8。
(4)生根培养：从基部切取步骤(3)增殖得到的长约2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养45天即能实现试管苗的生根，生根率为73.6％。所述的生根培养基为：1/2MS培养基+2.0mg/L GGR+1.0mg/L IBA+1.0mg/L NAA+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+1.0g/L活性炭，pH为5.8。
(5)移栽：将步骤(4)高约得到的高约4～5cm、有2～3条根、生长健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质(栽培基质的配比为炭土:松树皮:农家肥＝5:4:1)中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率为79.1％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为12小时/天。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种民间中草药舒筋草的快速繁殖方法，其特征在于：包括依次进行的如下步骤：采集舒筋草外植体、诱导外植体不定芽、增殖培养、生根培养、移栽；
所述的诱导外植体不定芽采用的不定芽诱导培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/L TDZ、1.0～2.0mg/L IBA、20～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭、50～100ml/L椰子汁，不定芽诱导培养基pH为5.4～5.8。
2.根据权利要求1所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述的外植体诱导培养操作的方法为：将舒筋草当年生未木质化茎段经消毒后切成3.0～4.0cm的茎段并接种到诱导培养基中，置于25～28℃进行全黑暗培养90～120天可诱导形成不定芽。
3.根据权利要求1所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述的增殖培养操作所用到的增殖培养基包括：MS培养基、1.0～2.0mg/L 6-BA、1.0～2.0mg/LTDZ、1.0～2.0mg/L IBA、20～30g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭，增殖培养基pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求3所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述的增殖培养操作具体为：将外植体诱导培养操作得到的不定芽去除顶端后接种到增殖培养基中培养70～90天即可实现不定芽的增殖。
5.根据权利要求1所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述的生根培养操作所用到的生根培养基包括：1/2MS培养基、1.0～2.0mg/L GGR、0.5～1.0mg/LIBA、0.5～1.0mg/L NAA、15～20g/L蔗糖、3.0～4.0g/L琼脂、0.5～1.0g/L活性炭，生根培养基pH为5.4～5.8。
6.根据权利要求5所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述的生根培养操作具体为：将增殖培养操作得到的长2.0～3.0cm的无根不定芽并接种到生根培养基中培养45～60天即能实现试管苗的生根。
7.根据权利要求1所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述的移栽操作的具体方法为：将经生根培养操作得到的高约4～5cm、有2～3条根、生长健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗5～7天，洗净根部的培养基移栽于经消毒处理后的栽培基质中栽培成苗即得种苗。
8.根据权利要求1-6任一所述的一种民间中草药舒筋草的组培快繁方法，其特征在于：所述增殖培养操作、生根培养操中培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为10～12小时/天。
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