CN116267613B - 一种大花君子兰未成熟胚乳诱导愈伤组织的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种大花君子兰未成熟胚乳诱导愈伤组织的方法。其工艺步骤包括：选择授粉后100天收获的大花君子兰幼果，切割幼果并选择种皮完整的种子，剔除全部种胚。将包含部分果肉、种皮和液体胚乳的外植体，接种到附加1.0 mg·L‑1 PIC的MS培养基。以果肉和种皮组织孵育培养液体胚乳，保持液体胚乳不接触培养基且暴露于空气。80天后，液体胚乳逐渐转变为固体。去除果肉和种皮组织，将胚乳转接至附加1.0 mg·L‑1 NAA和0.5mg·L‑1 TDZ的培养基中，完全黑暗培养70~90天，胚乳表面形成淡黄色、颗粒状愈伤组织。本发明首次通过未成熟胚乳培养成功诱导大花君子兰胚性愈伤组织，其具有旺盛增殖和再分化能力，诱导方法简单易行，不污染环境，为创制三倍体大花君子兰新品种提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于多倍体育种技术领域，具体涉及一种大花君子兰未成熟胚乳培养诱导胚性愈伤组织的方法。
背景技术
大花君子兰(CliviaminiataRegel)别名大叶石蒜，宽叶君子兰，达木兰等，是石蒜科君子兰属多年生草本花卉，原产于非洲。大花君子兰花色鲜艳和叶形独特，深受人民喜爱，在世界各地广泛栽培。目前，大花君子兰的育种大多通过芽变选种、诱发突变和杂交育种等传统方法培育，育种周期长，杂种后代分离广泛、性状稳定性差，新品种培育困难，育种效率低。
多倍体是植物进化的重要途径之一。与二倍体相比，多倍体植株常具有花冠大而厚实，花色更深，叶片宽厚，适应性增强等优良性状。因此，多倍体育种也成为花卉新品种选育的重要方向。目前，秋水仙素诱导法是植物多倍体育种最常用的方法，处理材料主要有种子、幼苗、茎尖生长点和离体培养材料等。然而，秋水仙素诱导法也有很多不足之处。首先，秋水仙素对植物有毒害作用，常使培养材料生长受到抑制或死亡，也会造成培养环境的污染。其次，秋水仙素处理所得多倍体，以四倍体、六倍体等双倍体为主，三倍体植株分离困难。此外，使用秋水仙素诱导法所得植株以嵌合体为主，往往需要经过长时间的分离、纯化和鉴定，才能最终获得纯合多倍体。
胚乳是被子植物双受精产物之一，属于天然的三倍体组织。以胚乳为外植体进行离体培养，可直接获得三倍体植株，且具有取材方便，操作简单，育种周期短等优点。然而，由于胚乳属于程序性退化组织，其离体再生困难，仅少数植物通过胚乳培养获得了三倍体植株。胚乳脱分化诱导胚性愈伤组织是胚乳培养获得三倍体植株的关键，愈伤组织的生理状态直接决定了下一步再分化的成败。目前，以大花君子兰胚乳为材料，诱导获得胚性愈伤组织尚未见报道。
发明目的
针对现有大花君子兰育种技术体系的不足，本发明的目的是提供一种大花君子兰未成熟胚乳诱导具有旺盛分裂和再生能力的胚性愈伤组织的方法，进而建立高效、稳定的三倍体大花君子兰再生技术体系，解决现有大花君子兰多倍体育种中，秋水仙素导致环境污染、嵌合体分离纯化困难、育种周期长的问题，为大花君子兰种质创新和开发利用提供技术支持，也可为其他植物三倍体育种提供参考依据。
发明内容
发明所采用的技术方案是：一种大花君子兰未成熟胚乳培养诱导胚性愈伤组织的方法。其技术要点是，取人工授粉100天的大花君子兰幼果，切割后挑选具有完整种皮的种子并剔除种胚，使液体胚乳暴露在空气中。将分离后的外植体，接种于MS+1.0mg·L-1PIC培养基中，完全黑暗条件培养，液体胚乳逐渐固化。培养80天后，切去果肉和种皮组织，将分离的胚乳转接于MS+1.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-1TDZ培养基中，完全黑暗条件培养70～90天后，诱导产生胚性愈伤组织。
上述方案中，所述大花君子兰幼果是指：5年生以上大花君子兰植株，人工授粉100天后获得的幼嫩果实，该幼果果皮呈绿色、果皮稍软。
上述方案中，所述完整种皮的种子是指：将幼嫩果实分别沿纵向和横向切割成均匀的八部分。观察幼果切割面，挑选具有完整种皮，并且种胚暴露在切割面外侧的种子。
上述方案中，所述外植体分离方法是：使用锋利的解剖刀将种子横向切去1/4左右，剔除未成熟种子的种胚，使液体胚乳暴露在空气中。切割过程中，尽量保持液体状胚乳的完整性，减少胚乳损失。切割完成后，外植体由部分果肉组织、部分种皮组织和液体状胚乳共同组成。
上述方案中，所述外植体接种方式是：果肉组织置于培养基表面，种皮组织破损部位向上，液体胚乳位于种皮组织内。即，使果实和种皮组织孵育培养液体状胚乳，避免液体胚乳接触固体培养基表面。在转接过程中，持续保持液体胚乳暴露在空气中，且不接触培养基表面。
上述方案中，所述液体胚乳固化是指：外植体接种后，每10天更换一次培养基，随着培养时间的延长，胚乳逐渐由液体状向固体转变。培养40天后，胚乳呈现半透明果冻状。培养60天后，果冻状胚乳细胞分裂速度加快，胚乳体积迅速增大并突出于种皮。
上述方案中，所述胚性愈伤组织特征是：淡黄色、颗粒状的固体胚性愈伤组织，具有旺盛的分裂、增殖能力，能够进一步再生不定芽，并形成完整植株。
本发明的优点和积极优势是：
1.本发明首次通过胚乳培养成功诱导获得大花君子兰胚性愈伤组织，且所得胚性愈伤组织，连续多次继代培养仍具有旺盛的分裂和增殖能力并能再生完整植株，为创制三倍体君子兰新品种提供技术支持；
2.大花君子兰的胚乳是天然三倍体，外植体选材易于获得、不伤害母株、不破坏整体观赏性，培养过程不使用有毒药剂，不污染环境，可用于价格高昂的珍稀君子兰品种的取材和培养；
3.培养过程中，使用固体培养基，并通过保留部分果肉和种皮，孵育培养液体状胚乳。与液体培养法和半固体培养法相比，本方法简单易行。
附图说明
图1外植体处理；
图2培养40天后果冻状胚乳组织；
图3培养60天后胚乳细胞分裂加速，突出于种皮组织表面；
图4固化分离的胚乳组织；
图5胚乳诱导胚性愈伤组织；
图6胚性愈伤组织再生不定芽。
具体实施方式
使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图1～6和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
大花君子兰品种‘大胜利’未成熟胚乳再生三倍体植株的方法，包括以下步骤：
(1)人工授粉
选择生长健壮的5年生大花君子兰植株，在盛花期选择当天开放的花进行人工授粉。授粉后，使用羊皮纸袋进行套袋隔离。2天后，取下羊皮纸袋，进行二次人工授粉并再次套袋。授粉后，观察花器官发育情况，子房膨大后，取下羊皮纸袋。
(2)切割幼果，分离外植体
人工授粉100天后，获得大花君子兰未成熟幼果，果皮为绿色，果皮表面稍软。在超净工作台上，对幼果进行消毒。使用以下消毒灭菌程序：70％酒精浸泡30秒，2％次氯酸钠浸泡15分钟，无菌水冲洗5次，每次3分钟。将消毒后的果实，纵向切割为均匀的两部分，观察种子的发育情况，此时绿色的种皮组织清晰可见，种皮薄且软。将每部分果实，再均匀的分为四块，挑选具有完整种皮，且种胚暴露在外侧的种子。使用锋利的解剖刀，将种子横向切去1/4左右，剔除全部种胚，使液体状胚乳暴露在空气中。切割过程中，注意保存完整的液体胚乳。切割后的外植体由部分果肉组织、部分种皮组织以及液体状胚乳共同组成(附图1)。
(3)液体胚乳培养和固化
将切割分离后的外植体接种于MS+1.0mg·L-1PIC培养基中。每升培养基附加30g蔗糖和7g琼脂，调整pH 5.8，121℃高压灭菌20分钟，采用不透气封口膜，保证瓶内湿度达到80～90％。接种时，果肉组织置于培养基表面，切割后种皮组织破损部位向上，液体胚乳位于种皮组织内。培养室温度为25±1℃，完全黑暗培养。
接种后，每10天更换一次培养基，转接过程中整个培养阶段，保持液体胚乳不接触培养基表面。随着培养时间的延长，胚乳逐渐由液体状向固体胚乳转变。接种20天后，液体胚乳颜色加深，由无色转变为半透明状态，表面粗糙。培养40天后，胚乳呈现半透明果冻状(附图2)。培养60天后，果冻状胚乳细胞分裂速度加快，胚乳体积迅速增大并突出于种皮(附图3)。
(4)脱分化和胚性愈伤组织诱导
接种80天后，完全切除果肉和种皮组织，将固体状胚乳组织转入MS+1.0mg·L-1NAA+0.5mg·L-1TDZ培养基中(附图4)。每升培养基附加30g蔗糖和7g琼脂，pH 5.8，采用不透气封口膜，保证瓶内湿度达到80～90％，完全黑暗培养。每20天更换新的培养基。继续培养70～90天后，胚乳组织上诱导产生淡黄色、颗粒状的胚性愈伤组织(附图5)。该胚性愈伤组织具有旺盛的分裂、增殖能力。外植体发育时期对愈伤组织诱导具有重要的影响(见表1)。
表1胚乳发育时期对胚乳愈伤组织诱导率的影响
| 胚乳发育期(天) | 胚乳发育状态 | 褐化率(％) | 诱导率(％) |
| 60 | 液体状胚乳，种子小，难以分辨种胚 | 0 | 0 |
| 100 | 液体状胚乳，种胚容易分离 | 6.3 | 90.6 |
| 140 | 半固体胚乳，种胚容易分离 | 9.4 | 56.3 |
| 180 | 固体胚乳，难以分割种胚 | 68.8 | 9.4 |
| 成熟胚乳 | 固体，难以分割种胚 | 100.0 | 0 |
(5)再生三倍体植株
胚性愈伤组织切成1cm3的大小团状，转移至MS+0.5mg·L-1NAA+2.0mg·L-1BAP培养基中，每天16小时光照，8小时黑暗，光照强度为36μmol·m-2·s-1，培养室温度为25±1℃，采用不透气封口膜，保证组培瓶内湿度达80～90％。培养90天后，胚性愈伤组织诱导不定芽发生(附图6)。当不定芽长至2.0cm后，转移至生根培养基1/2MS+0.5mg·L-1NAA，45天后再生完整植株。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (3)
1. 一种大花君子兰未成熟胚乳诱导愈伤组织的方法，其特征在于：以大花君子兰幼果为材料，灭菌后分割幼果，挑选未成熟种子并去除种胚，使液体状胚乳暴露于空气中，将切割好的外植体接种至MS+1.0 mg·L-1 PIC培养基中，完全黑暗培养，每10天更换一次培养基，培养80天左右，液体状胚乳转变为固体，去除果肉和种皮组织，将固化后的胚乳组织转接至MS+1.0 mg·L-1 NAA+0.5mg·L-1 TDZ培养基中，完全黑暗培养70~90天后，胚乳组织表面形成淡黄色、颗粒状愈伤组织；培养过程中，使果肉和种皮组织孵育培养液体胚乳，具体方法为，外植体接种时，将果肉组织置于培养基表面，种皮组织破损部位向上，液体胚乳位于种皮组织内，避免液体胚乳接触培养基。
2.根据权利要求1所述大花君子兰未成熟胚乳诱导愈伤组织的方法，其特征在于：外植体的切割和接种方法是，锋利的解剖刀将未成熟种子横向切去1/4左右，剔除全部种胚，切割过程中，尽可能保持液体胚乳完整，切割后，使液体胚乳暴露在空气中，切割好的外植体由部分果肉组织、部分种皮组织以及液体状胚乳共同组成。
3. 根据权利要求1所述大花君子兰未成熟胚乳诱导愈伤组织的方法，其特征在于：所述大花君子兰未成熟种子是指：取自人工授粉100天后形成，横径约1.0 cm的未成熟果实，果皮为绿色，果皮表面稍软，切割后，挑选幼果内未成熟种子，种子应具有完整的绿色幼嫩种皮，种胚在幼果切割面清晰可见。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 君子兰未成熟胚四倍体诱导及染色体数鉴定;王冲等;《园艺学报》;第38卷(第07期);第1371-1376页 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116267613A (zh) | 2023-06-23 |
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