CN102907322A - 一种创制结缕草高频再生系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种创制结缕草高频再生系的方法。本发明提供一种创制结缕草高频再生系的方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草高频再生系。本发明的实验证明，本发明提供了一种创制结缕草高频再生愈伤组织系或再生植株及专用培养基，本发明通过筛选日本结缕草品种，以单粒种子为外植体，分别诱导出不同的愈伤系，经培养基配比组合和多次干化继代培养，筛选出分化能力强的愈伤系，每一系增殖的大量高频再生愈伤组织均为同质。最终，建立一种创制结缕草高频再生系的方法，为提高结缕草组织培养再生率和遗传转化效率提供实用方法。

Description

一种创制结缕草高频再生系的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种创制结缕草高频再生系的方法。

背景技术

草坪草具有景观功能、生态功能和运动功能。随着经济的快速发展和人民生活水平的不断提高，草坪对于城市的绿化和环境改善起着越来越重要的作用。人们利用有性杂交、轮回选育等常规育种手段培育出一些草坪草新品种。转基因技术具有可以定向改良、打破生殖隔离等优点，是草坪草遗传改良的一种非常有前途的手段。

草坪草与其他植物一样，组织培养是遗传转化操作的前提。目前，尽管有不少报道已建立了各草种的再生体系，但由于大多数草坪草属异花授粉植物，遗传背景复杂，组织培养比其他植物更具有难度。

结缕草属植物（Zoysia L.）是世界上重要的暖季型草坪草之一，具有很强的生命力和抗逆性，尤其以超群的耐践踏、耐瘠薄和抗病能力而著称。结缕草被誉为“最有前途”的草种，其形成的草坪弹力是早熟禾的30-40倍，耗水量比草地早熟禾少30-40%，建植和管理费用比早熟禾低80%左右（胡叔良，1997，发展草坪绿地关键问题的探讨，中国草地，5（2）：67-70）。正是由于结缕草所具有的这些独特的优良性状，使它们成为运动场、开放绿地、边坡绿化以及水土保持的重要草种，也是适合我国水资源贫乏国情的草坪草种。同时，结缕草也是我国唯一具有出口创汇能力的草种。

因此，建立稳定高效的结缕草组织培养体系不仅具有重要的理论意义，还有实际应用价值。

在结缕草组织培养和遗传转化方面，前人已做过一些探索和研究，并取得了一定的研究成果。早在1987年，Al-Khayri等以日本结缕草成熟胚作为实验材料，通过切离成熟胚诱导愈伤组织，最终获得再生植株（A1-Khayri J M,Huang F H,Thompson LF,et a1.1987,In vitro plant regeneration of zoysia grass(Zoysia japonicaSteud.).In Vitro,23:3;A1-Khayri J M,Huang F H,Thompson L F,et a1.1989,Plant regeneration of zoysia grass from embryo-derived callus.Crop Science,29(5):1324-1325）。但结缕草种子较小，成熟胚的分离操作相对困难，限制其广泛应用。Inokuma等在1996年首次报道通过培养日本结缕草悬浮细胞系，用纯化得到的原生质体再生出植株（INOKUMA C,SUGIURA K,CHO C,et a1.1996,Plant regenerationfrom protoplasts of Japanese lawn grass.Plant Cell Reports,15(10):737-741）。但该操作不仅比较繁琐，而且再生率较低。之后，人们又以结缕草幼穗、幼胚和根茎作为外植体，试图通过体胚发生途径获得再生植株（NOH H Y,CHOI J S,AHN B J.1995,Plant regeneration through somatic embryogenesis in zoysia grasses(Zoysiaspp.).Journal of the Korean Society for Horticultural Science,36(4):582-587；玄松南,陈慧哲,傅亚萍,等.1997，两种草坪草愈伤组织的诱导及其分化研究.浙江农业学报,9:295-299；GE Yaxin,TINA Norton,WANG Zeng-Yu.2006,Transgeniczoysiagrass(Zoysia japonica)plants obtained by Agrobacterium-mediatedtransformation.Plant Cell Rep,25:792–798），但该方法不仅取材受季节所限，无菌外植体的获得也是一个难题。不管以哪种外植体再生植株，均有诸多因素影响再生率（齐春辉,韩烈保,黄麟,等.2005，几种因素对日本结缕草愈伤组织诱导与生长影响的研究.四川草业,4:1-3；张俊卫,唐蜻,包满珠.2006，日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导及植株再生的影响因子分析.中国农业科学,39(2):368-374）。

目前，尚未见有关结缕草高频再生系的创制方法相关报道或专利。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种创制结缕草再生愈伤组织系的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草再生愈伤组织系。

上述方法中，上述诱导培养、所述第一次继代培养、所述第二次继代培养和所述第三次继代培养采用的培养材料均源自同一个种子。

上述方法中，所述诱导培养为将所述结缕草种子在诱导培养基中诱导培养，得到诱导愈伤组织；

所述第一次继代培养为将所述诱导愈伤组织在第一代继代培养基中第一代继代培养，得到第一次愈伤组织；

所述第二次继代培养为将所述第一次愈伤组织在第二代继代培养基中第二代继代培养，得到第二次愈伤组织；

所述第三次继代培养为将所述第三次愈伤组织在第三代继代培养基中第三代继代培养，得到再生愈伤组织系；

所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、终浓度的0.15mg/L 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、终浓度30g·L^-1的蔗糖、终浓度7.0g·L^-1的琼脂、终浓度0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度1mg·L^-1的VB₁（维生素B1）、终浓度1mg·L^-1的VB₂（维生素B2），用水补足体积；

所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA（脱落酸）、终浓度为40g·L^-1的蔗糖、终浓度为9.0g·L^-1的琼脂、终浓度为0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度为1mg·L^-1的VB₁和终浓度为1mg·L^-1的VB₂，用水补足体积；

所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g·L^-1、琼脂终浓度调整为8.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积；

所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g·L^-1、琼脂终浓度调整为7.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积。

上述方法中，所述诱导培养的条件为温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1下暗培养1个月；

所述第一次、第二次、第三次继代培养条件均为温度24-26℃、黑暗培养20天。

上述方法中，在所述第一次继代培养后和所述第二次继代培养前还包括如下步骤：选取第一次继代愈伤组织中的胚性愈伤组织；所述选取第一次继代愈伤组织中的胚性愈伤组织具体为剥离松软第一次继代愈伤组织，而选取质地变硬的第一次继代愈伤组织。

上述方法中，所述结缕草种子为去颖后的结缕草种子。

在上述方法中，也可以在第二次、第三次继代培养时均选用胚性愈伤组织作为培养材料。

本发明的另一个目的是提供一种制备结缕草再生植株的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在上述创制结缕草再生愈伤组织系的方法中的第三次继代培养后，将所述结缕草再生愈伤组织系依次经分化培养和生根培养，得到结缕草再生植株；

所述分化培养为将所述结缕草再生愈伤组织系在分化培养基中进行分化培养，得到生芽愈伤组织；

所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT（6-糠氨基嘌呤）、终浓度为0.5mg/L ZT（玉米素）、终浓度为30g·L^-1蔗糖、终浓度为7.0g·L^-1琼脂、终浓度为0.5g·L^-1水解酪蛋白，终浓度为1mg·L^-1VB₁、终浓度为1mg·L^-1VB₂，用水补足体积。

上述获得再生植株的方法中，在所述分化培养中，所述结缕草再生愈伤组织系的直径大小均为0.3-0.5cm；

上述获得再生植株的方法中，所述生根培养为将所述生芽愈伤组织在所述生根培养基中进行生根培养，得到结缕草再生植株；

所述生根培养基为在液体1/2MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L VB₁、终浓度为0.25mg/L IBA（吲哚丁酸）、终浓度为25g·L^-1蔗糖和终浓度为7.0g·L^-1琼脂，用水补足体积。

上述获得再生植株的方法中，所述分化培养和所述生根培养的条件均如下：温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。

本发明的第三个目的是提供一种创制结缕草再生愈伤组织系或制备结缕草再生植株的培养基组。

本发明提供的培养基组，包括诱导培养基、第一次继代培养基、第二次继代培养基和第三次继代培养基；

所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、终浓度的0.15mg/L 6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）、终浓度30g·L^-1的蔗糖、终浓度7.0g·L^-1的琼脂、终浓度0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度1mg·L^-1的VB₁（维生素B1）、终浓度1mg·L^-1的VB₂（维生素B2），用水补足体积；

所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA（脱落酸）、终浓度为40g·L^-1的蔗糖、终浓度为9.0g·L^-1的琼脂、终浓度为0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度为1mg·L^-1的VB₁和终浓度为1mg·L^-1的VB₂，用水补足体积；

所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g·L^-1、琼脂终浓度调整为8.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积；

所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g·L^-1、琼脂终浓度调整为7.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积。

所述培养基组还具体包括分化培养基；所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT（6-糠氨基嘌呤）、终浓度为0.5mg/L ZT（玉米素）、终浓度为30g·L^-1蔗糖、终浓度为7.0g·L^-1琼脂、终浓度为0.5g·L^-1水解酪蛋白，终浓度为1mg·L^-1VB₁、终浓度为1mg·L^-1VB₂，用水补足体积。

所述培养基组还进一步具体包括生根培养基，所述生根培养基为在液1/2MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L VB₁、终浓度为0.25mg/L IBA（吲哚丁酸）、终浓度为25g·L^-1蔗糖和终浓度为7.0g·L^-1琼脂，用水补足体积。

所述培养基组中的各种培养基的pH值均为5.8。

本发明的第四个目的是提供一种愈伤组织的继代保存的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将愈伤组织按照上述的创制结缕草再生愈伤组织系中的第三次继代培养2次，得到继代产物；再将所述继代产物按照上述创制结缕草再生愈伤组织系的方法中的第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养依次进行培养；

所述愈伤组织具体为上述创制结缕草再生愈伤组织系中结缕草再生愈伤组织。

本发明的实验证明，本发明提供了一种创制结缕草高频再生系的方法，本发明的方法具有如下优点：1）由于结缕草属异花授粉植物，不同种子可能是不同的基因型，植物再生能力很大程度上依赖于其自身的基因型，本发明通过筛选日本结缕草品种，以单粒种子为外植体，分别诱导出不同的愈伤系，经培养基配比组合和多次干化继代培养，筛选出分化能力强的愈伤系，每一系增殖的大量高频再生愈伤组织均为同质，可以最大程度上将具有较强再生能力的基因型保留下来，淘汰再生能力弱的基因型；2）由于结缕草品种内基因型复杂，不同基因型的表型可能有差异，建立单独的高频再生系而不是混系，有利于转基因后代或变异株系与亲本在遗传背景一致的条件下进行比较分析；3）本发明采用的专用培养基制备高频再生愈伤系，该高频再生愈伤系分化率高，且保存时间长。

附图说明

图1为结缕草高频再生系的诱导培养

图2为结缕草高频再生系的继代培养

图3为结缕草高频再生系的扫描电镜鉴定

图4为结缕草高频再生系的分化和生根培养

图5为结缕草高频再生系的创制过程

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的结缕草以日本结缕草品种‘Qingdao’（克劳沃集团http://www.bjclover.com/center/aboutcp1.asp，产品目录号zj-011-02）为例，也可以换为其他所有结缕草属（Zoysia Willd.）植物。

本发明发现了影响结缕草植株再生率的关键因素是如何高效地将非胚性愈伤组织调整为胚性愈伤组织。具有同一基因型、再生力强的胚性愈伤组织，在本专利称之为“高频再生愈伤组织系”。

下述实施例中液体MS培养基中的组分如表1所示，液体MS培养基为将表1的溶质按所示的终浓度均溶于水配制：

表1为MS培养基中的组分

大量元素	培养基中终浓度（g·L-1）
		NH4NO3	1.65
KNO3	1.9
		KH2PO4	0.17
MgSO4.7H2O	0.37

CaCl2	0.44
		微量元素	培养基中浓度（mg·L-1）
FeSO4.7H2O	27.8
		Na2EDTA	37.3
MnSO4.4H2O	22.3
		ZnSO4.4H2O	8.6
H3BO3	6.2
		KI	0.83
Na2MoO4.2H2O	0.25
		CuSO4.5H2O	0.025
CoCl2.6H2O	0.025
		有机成分	培养基中浓度（mg·L-1）
甘氨酸	2.0
		盐酸硫胺素	0.4
盐酸吡哆素	0.5
		烟酸	0.5
肌醇	100

实施例1、结缕草高频再生愈伤组织系和再生植株的获得

下述实施例中采用的日本结缕草品种‘Qingdao’种子先用细砂纸打磨去颖，再用自来水冲洗约1h，无菌条件下70%酒精处理30s，然后用10%次氯酸钠溶液（体积百分比，并加入1滴吐温20）于超声清洗仪中处理10min，以无菌水清洗6次，并用无菌水浸泡过夜，准备接种。

一、结缕草高频再生愈伤组织系的获得

创制高频再生愈伤组织系必须满足3个条件：1）诱导率要高，诱导率除了与诱导条件有关外，还与诱导品种有关；2）在一定诱导时间下（一般为诱导1个月）愈伤组织增殖快；3）诱导出的愈伤组织有利于后期胚性状态的调整。

1、诱导培养愈伤组织

不同组分诱导培养基配方：在MS培养基的基础上优化了生长素（2.0mg/L 2,4-D）与分裂素（0.1-0.2mg/L 6-BA和0.1-1.0mg/L KT）的组合配比，部分培养基添加葡萄糖为20g·L^-1，其余蔗糖浓度为30g·L^-1，琼脂7.0g·L^-1，水解酪蛋白0.5g·L^-1，VB₁1mg·L^-1，VB₂1mg·L^-1，pH 5.8，部分培养基还添加0.5%甘露醇；具体配方见表2。

诱导培养条件：在温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1下暗培养1个月。

诱导率为（诱导愈伤组织数/种子数）*100%。

诱导培养愈伤组织的方法具体如下：

将前天消毒处理的每一粒日本结缕草品种‘Qingdao’种子分别接种在不同组分的诱导培养基上诱导培养，得到每一粒种子的愈伤组织（为1个愈伤组织系）；每种培养基配置6个培养皿，每个培养皿中接种约30粒种子（分隔开接种），培养条件为温度25℃暗培养1个月。

统计各处理诱导愈伤组织诱导率，结果见如表2。

表2日本结缕草愈伤组织诱导培养基

根据上述结果，确定最佳诱导培养基为Md，其组分及各组分在培养基中的终浓度如下：在液体MS培养基中添加终浓度2mg/L 2,4-D、终浓度0.15mg/L 6-BA、终浓度30g·L^-1蔗糖、终浓度7.0g·L^-1琼脂、终浓度0.5g·L^-1水解酪蛋白、终浓度1mg·L^-1VB₁、终浓度1mg·L^-1VB₂，用水补足体积；调节pH值为5.8。

观察在最佳诱导培养基Md下诱导愈伤组织结果如图1所示，a为消毒结缕草种子接种于最佳诱导培养基上3天；b为消毒结缕草种子在最佳诱导培养基上诱导15天后出现的愈伤组织；可以看出，在最佳诱导培养基Md下诱导培养愈伤组织增殖明显，表面湿润、松软，颜色呈乳白或透明状，少数出现淡黄色颗粒突起，为非胚性愈伤组织，诱导率达50%以上；在此条件下诱导出的愈伤组织有利于调整为胚性愈伤组织。

而诱导培养基中添加KT(激动素)、甘露醇和葡萄糖对结缕草愈伤组织诱导并无明显改观，而且后期不利于愈伤组织胚性状态的调整。

2、愈伤组织系的继代培养

创制结缕草高频再生愈伤组织系的关键是通过继代培养将非胚性愈伤组织调整为高频再生系。经过多年的摸索和研究发现，不管哪种基因型的成熟胚，其刚诱导出的愈伤组织总是非胚性的，表现为质地松软，颜色乳白，水样化；这样的非胚性愈伤组织必须经过继代培养调整为具有分化能力的愈伤组织。

继代培养的目的：1）是经过优化的继代培养将大多数再生能力较强的基因型“挖掘”出来，即调整为高频再生愈伤组织；2）是将每一粒种子诱导出的愈伤组织经继代培养增殖为一个高频再生系。

不同组分继代培养基配方：在液体MS培养基的基础上优化了生长素（1.0mg/L2,4-D）与分裂素（0.05-0.2mg/L 6-BA和0.2mg/L ABA）的组合配比，培养基添加蔗糖浓度为30-45g·L^-1，琼脂7.0-9.0g·L^-1，水解酪蛋白0.5g·L^-1，VB11mg·L^-1，VB21mg·L^-1，pH 5.8；具体配方见表3。

继代培养条件是在温度24-26℃、黑暗培养20天。

将上述1中在最佳诱导培养基中得到的来源于同一种子的诱导愈伤组织分别接种到如下表3中的培养基中，依次进行第一代、第二代、第三代继代培养；且三次继代培养采用同一种培养基，统计每一次继代后的胚性愈伤组织（深黄色，质地很坚硬）的诱导率；其中，胚性愈伤组织表面深黄色，质地坚硬；非胚性愈伤组织表面浅白色，质地很松软，结果如表3所示：

第一次继代培养胚性愈伤组织诱导率=（第一次继代培养得到的胚性愈伤组织数/接种在第一次继代培养基上的愈伤组织数）*100%；

第二次继代培养胚性愈伤组织诱导率为（第二次继代培养得到的胚性愈伤组织数/接种在第二次继代培养基上的愈伤组织数）*100%；

表3日本结缕草愈伤组织继代培养基

通过上述培养基的摸索，愈伤组织继代培养的方法具体如下：

（1）第一次继代培养

第一次继代培养首先要调整激素水平，即降低生长素2,4-D的浓度，并增加分裂素6-BA和ABA的浓度；另外，还要通过增加蔗糖和琼脂浓度来调节培养基的渗透压，使继代培养的愈伤状态发生转变；因此第一代继代培养基为在MS培养基中添加终浓度为1mg/L 2,4-D、终浓度为0.2mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L ABA、终浓度为40g·L^-1蔗糖、终浓度为9.0g·L^-1琼脂、终浓度为0.5g·L^-1水解酪蛋白、终浓度为1mg·L^-1VB₁和终浓度为1mg·L^-1VB₂；用水补足体积；调节pH值为5.8(在方法中为MiA培养基)。

第一次继代培养条件：温度25℃暗培养20天。

第一次继代培养方法如下：将上述1中在最佳诱导培养基中得到的来源于同一种子的诱导愈伤组织从种子上剥离下来，在第一次继代培养基上划出网格，将每一个种子的愈伤组织建立一个愈伤组织系，进行第一次继代培养（图2a），得到第一次继代愈伤组织系。

（2）第二次继代培养

由于第一次继代培养基为高渗培养基不利于高频再生系的创制，而使愈伤组织变得过于硬实，不利于分化，因此第二次继代培养基为在第一次继代培养基的基础上逐步降低了培养基的渗透压，具体为将第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g·L^-1、琼脂终浓度调整为8.0g·L^-1，其他成分和浓度不变(在方法中为MiB培养基)，用水补足体积，调节pH值为5.8。

第二次继代培养的条件：温度25℃暗培养20天；

第二次继代培养的方法：将选取上述（1）中在最佳第一次继代培养基中得到的来源于同一种子的第一次继代愈伤组织系中的胚性愈伤组织；上述（1）中在第一次继代培养基中得到的来源于同一种子的第一次继代愈伤组织系直接转移至第二次继代培养基上，进行第二次继代培养，得到第二次继代愈伤组织系。

上述选取上述（1）中在最佳第一次继代培养基中得到的来源于同一种子的第一次继代愈伤组织系中的胚性愈伤组织为剥离松软、选取增殖明显或质地变硬的第一次继代愈伤组织系，这对筛选高频再生愈伤系非常重要，有利于创制高比例的高频再生愈伤系。

结果如图2b所示，每个第二次继代愈伤组织系中约75%以上为胚性愈伤系，表现为颜色鲜艳，为浅黄色，质地硬实，为颗粒状。

（3）第三次继代培养

为了在保持高再生能力的基础上使胚性愈伤组织迅速增殖，创制出较多的高频再生系，有利于后期植株再生或遗传转化利用，因此第三次继代培养基配方是在第二次继代培养基的基础上逐步降低了培养基的渗透压，具体为将第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g·L^-1、琼脂终浓度调整为7.0g·L^-1，其他成分和浓度不变（在方法中为MiC培养基）。

第三次继代培养条件：温度25℃暗培养20天。

第三次继代培养方法：将选取上述（2）中在最佳第二次继代培养基中得到的来源于同一种子的第二次继代愈伤组织系转移至第三次继代培养基上，进行第三次继代培养，得到第三次继代愈伤组织系，即为再生愈伤组织系。

结果如图2C，再生愈伤组织系的重量约为1.0-2.0g/系，再生能力也达到最佳。

通过电子扫描显微镜观察确定再生愈伤组织系的表面结构，以诱导愈伤组织（肉眼观察为非胚性）为对照，结果如图3所示，3a-3b为扫描电镜鉴定的经过三次继代培养得到的再生愈伤组织系表面结构；c-g扫描电镜鉴定的诱导愈伤组织的表面结构；可以看出，再生愈伤组织系的表面呈紧密排列的细胞团，放大可见球形或心型等胚状体类似物或细胞团（图3c-g），表明这些愈伤组织已具备胚性，均为胚性愈伤组织；而诱导愈伤组织表面无明显成型细胞团（图3a-b），均为非胚性愈伤组织。

二、再生愈伤组织系的分化培养

通过调整优化分化培养基成分，再生愈伤组织系不仅快速再生出芽，而且每块愈伤组织再生出的芽较多。

不同分化培养基是在液体MS培养基的基础上优化了不同分裂素（0.05-1.0mg/L6-BA、0.2-0.5mg/L KT、0-0.5mg/L ZT和0-0.2mg/L GA3）的组合配比，培养基添加蔗糖浓度为30g·L^-1，琼脂7.0g·L^-1，水解酪蛋白0.5g·L^-1，VB₁1mg·L^-1，VB₂1mg·L^-1，pH 5.8，分化培养基配比见表4。

表4日本结缕草愈伤组织分化培养基

分化培养条件：在温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。

分化率=（出芽的愈伤组织数/接种分化培养基的再生愈伤组织系数）*100%。

分化培养的方法如下：

将上述一的（3）中在最佳第三次继代培养基中得到的来源于不同的种子的再生愈伤组织系均编号，把稍大的愈伤组织块用无菌镊子夹碎，直径大小约为0.3-0.5cm；然后将上述一的（3）中在第三次继代培养基中得到的来源于同一的种子的再生愈伤组织系（同质再生愈伤组织系）转移至不同分化培养基上，进行分化培养，得到分化出芽的愈伤组织。分化培养条件为在温度25℃、光照强度2000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。

统计各处理再生愈伤组织系的分化率，结果如表4。

根据上述结果，确定最佳分化培养基为Yufen3培养基，具体为在液体MS培养基上添加了终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT、终浓度为0.5mg/L ZT，终浓度为30g·L^-1蔗糖，终浓度为7.0g·L^-1琼脂，终浓度为0.5g·L^-1水解酪蛋白，终浓度为1mg·L^-1VB₁，终浓度为1mg·L^-1VB₂，用水补足体积，pH 5.8。

观察在最佳分化培养基下分化结果如图4a-b所示，4a为结缕草再生愈伤组织系在最佳分化培养基上15天后转绿；4b为结缕草再生愈伤组织系在最佳分化培养基上25天分化情况；可以看出，一个再生愈伤组织系（约0.3-0.5cm大小）培养20天可再生出15-25个芽；再生愈伤组织系的分化率达到95%以上，其为高频再生愈伤组织系。

三、结缕草高频再生愈伤组织系的鉴定

将单粒日本结缕草种子按照上述一和二的方法中的最佳诱导培养基、最佳第一次继代培养基、最佳第二次继代培养基和最佳第三次继代培养基（采用的培养基如下表5所示），得到再生愈伤系（即为高频再生愈伤系）；每次实验采用300粒种子。同时采用常规的诱导培养方法对日本结缕草种子进行培养（采用的培养基如下表5所示），得到对照愈伤组织；培养方法均同上述一和二中的培养方法。实验重复三次，结果取平均值。

将上述再生愈伤系和对照愈伤组织均转接至上述二得到的最佳分化培养基上，分化培养1个月比较；分化培养条件为在温度25℃、光照强度2000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月

结果如表5所示，高频再生愈伤系分化快，出芽多，每块愈伤组织分化出的芽数达20-25个，分化率达到95%以上；而常规方法获得的对照愈伤组织在该培养基上尽管分化率也达到56-62%，但分化慢，且出芽少，每块愈伤组织出芽5-10个。进一步表明，通过本专利由单粒种子制备筛选出的愈伤系为高频再生愈伤系。

表5日本结缕草高频再生愈伤系与常规愈伤组织分化培养比较

四、分化出芽的愈伤组织的生根培养得到再生植株

创制高频再生的目的就是再生植株或通过转基因及体细胞诱变后再生植株，生根培养是获得再生植株的最后一步。

生根培养基为在液体1/2MS培养基中添加终浓度为10mg/L VB₁、终浓度为0.25mg/L IBA、终浓度为25g·L^-1蔗糖和终浓度为7.0g·L^-1琼脂，用水补足体积，pH 5.8。

生根培养的条件为：在温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。

生根培养的方法：将在上述二中在最佳分化培养基中得到的来源于同一的种子的出芽的愈伤组织转移至生根培养基，温度25℃、光照强度2000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下生根培养1个月，得到生根的再生株系。

经过检测，经过生根培养的再生株系仅10天后就再生出5条以上的白根，20天后根系粗壮即可移栽入土，成活率达100%（图4c）。

总之，上述结缕草再生株系的创制过程如图5所示，其中，a-b为结缕草种子诱导培养得到愈伤组织；c-g为结缕草愈伤组织继代培养得到高频再生愈伤组织系；h-j为高频再生愈伤组织系分化、生根培养得到结缕草再生株系。

实施例2、结缕草高频再生愈伤组织系的继代保存

高频再生愈伤组织系除了直接利用外，还探讨了结缕草高频再生系的继代保存方法。由于继代保存愈伤组织若干代以后，其再生能力下降，导致分化率降低，高频再生系就失去了创制的意义和效果。所以，继代保存首先要保证其分化率不下降。

保存方法具体如下：

先将经上述实施例1的步骤一获得的再生愈伤组织系（高频再生愈伤系）在第三次继代培养基上继代培养2次；再重复上述实施例1的步骤一的2进行第二轮继代培养（第一、二、三次继代培养），此时每个增殖的高频再生愈伤组织系都达到5-6皿（约重5-6g/系）。60%的高频再生愈伤组织系可以进行2-3轮回继代培养，可继代保存5-6个月；仅30%的高频再生系可继代保存10-12个月；保存前后分化率变化无显著差异。

通过继代保存，高频再生系得到大量增殖，避免浪费人力物力重新筛选好的高频再生系，还为后期获得大量同质再生株系开展研究工作提供重要的材料和方法保障。

Claims (10)

1.一种创制结缕草再生愈伤组织系的方法，包括如下步骤：将单粒结缕草种子依次经诱导培养、第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养，得到结缕草再生愈伤组织系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述诱导培养、所述第一次继代培养、所述第二次继代培养和所述第三次继代培养采用的培养材料均源自同一个种子；

所述诱导培养为将所述结缕草种子在诱导培养基中诱导培养，得到诱导愈伤组织；

所述第一次继代培养为将所述诱导愈伤组织在第一代继代培养基中第一代继代培养，得到第一次愈伤组织；

所述第二次继代培养为将所述第一次愈伤组织在第二代继代培养基中第二代继代培养，得到第二次愈伤组织；

所述第三次继代培养为将所述第三次愈伤组织在第三代继代培养基中第三代继代培养，得到再生愈伤组织系；

所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的2,4-D、终浓度的0.15mg/L 6-BA、终浓度30g·L^-1的蔗糖、终浓度7.0g·L^-1的琼脂、终浓度0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度1mg·L^-1的VB₁、终浓度1mg·L^-1的VB₂，用水补足体积；

所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA、终浓度为40g·L^-1的蔗糖、终浓度为9.0g·L^-1的琼脂、终浓度为0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度为1mg·L^-1的VB₁和终浓度为1mg·L^-1的VB₂，用水补足体积；

所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g·L^-1、琼脂终浓度调整为8.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积；

所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g·L^-1、琼脂终浓度调整为7.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述诱导培养的条件为温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1下暗培养1个月；

所述第一次、第二次、第三次继代培养条件均为温度24-26℃、黑暗培养20天。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

在所述第一次继代培养后和所述第二次继代培养前还包括如下步骤：选取第一次继代愈伤组织中的胚性愈伤组织。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述结缕草种子为去颖后的结缕草种子。

6.一种制备结缕草再生植株的方法，包括如下步骤：在权利要求1-5任一项中的方法中的第三次继代培养后，将所述结缕草再生愈伤组织系依次经分化培养和生根培养，得到结缕草再生植株；

所述分化培养为将所述结缕草再生愈伤组织系在分化培养基中进行分化培养，得到生芽愈伤组织；

所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT、终浓度为0.5mg/L ZT、终浓度为30g·L^-1蔗糖、终浓度为7.0g·L^-1琼脂、终浓度为0.5g·L^-1水解酪蛋白，终浓度为1mg·L^-1VB₁、终浓度为1mg·L^-1VB₂，用水补足体积；

在所述分化培养中，所述结缕草再生愈伤组织系的直径大小均具体为0.3-0.5cm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述生根培养为将所述生芽愈伤组织在所述生根培养基中进行生根培养，得到结缕草再生植株；

所述生根培养基为在液体1/2MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L VB₁、终浓度为0.25mg/L IBA、终浓度为25g·L^-1蔗糖和终浓度为7.0g·L^-1琼脂，用水补足体积。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：

所述分化培养和所述生根培养的条件均如下：温度24-26℃、光照强度1000-3000umol m^-2s^-1及光照14h/黑暗10h的条件下培养1个月。

9.一种制备结缕草再生植株的培养基组，包括诱导培养基、第一次继代培养基、第二次继代培养基和第三次继代培养基；

所述诱导培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度2mg/L的2,4-D、终浓度的0.15mg/L 6-BA、终浓度30g·L^-1的蔗糖、终浓度7.0g·L^-1的琼脂、终浓度0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度1mg·L^-1的VB₁、终浓度1mg·L^-1的VB₂，用水补足体积；

所述第一代继代培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1mg/L的2,4-D、终浓度为0.2mg/L的6-BA、终浓度为0.2mg/L的ABA、终浓度为40g·L^-1的蔗糖、终浓度为9.0g·L^-1的琼脂、终浓度为0.5g·L^-1的水解酪蛋白、终浓度为1mg·L^-1的VB₁和终浓度为1mg·L^-1的VB₂，用水补足体积；

所述第二代继代培养基为将所述第一次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为35g·L^-1、琼脂终浓度调整为8.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积；

所述第三代继代培养基为将所述第二次继代培养基中的蔗糖终浓度调整为30g·L^-1、琼脂终浓度调整为7.0g·L^-1，其他成分和浓度不变，用水补足体积；

所述培养基组还具体包括分化培养基；所述分化培养基为在液体MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为1.0mg/L 6-BA、终浓度为0.2mg/L KT、终浓度为0.5mg/L ZT、终浓度为30g·L^-1蔗糖、终浓度为7.0g·L^-1琼脂、终浓度为0.5g·L^-1水解酪蛋白，终浓度为1mg·L^-1VB₁、终浓度为1mg·L^-1VB₂，用水补足体积；

所述培养基组还进一步具体包括生根培养基，所述生根培养基为在液1/2MS培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为10mg/L VB₁、终浓度为0.25mg/L IBA、终浓度为25g·L^-1蔗糖和终浓度为7.0g·L^-1琼脂，用水补足体积；

所述培养基组中的各种培养基的pH值均具体为5.8。

10.一种愈伤组织的继代保存的方法，包括如下步骤：将愈伤组织按照权利要求1-5中任一所述的方法中的第三次继代培养2次，得到继代产物；再将所述继代产物按照权利要求1-5中任一所述的方法中的第一次继代培养、第二次继代培养、第三次继代培养依次进行培养；

所述愈伤组织具体为权利要求1-5中任一所述的方法中结缕草再生愈伤组织。

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