CN102630565A - 一种诱导沟叶结缕草愈伤组织分化成苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导沟叶结缕草愈伤组织分化成苗的方法，包括：选取沟叶结缕草的胚性愈伤组织，置于含有6-苄氨基腺嘌呤0～0.4mg/L、反式玉米素核苷0～0.4mg/L的固体培养基中进行培养，4周后分化出小苗。本发明采用含有6-BA和ZR两种激素的培养基，对长期继代的愈伤组织进行再生培养，显著提高了长期继代的沟叶结缕草愈伤组织再生率，有效解决了多年继代沟叶结缕草愈伤组织再生率低的问题，进一步完善了沟叶结缕草的组培再生体系，为其细胞工程育种和基因转化研究奠定了基础，该方法操作简单，效率高。
Description
技术领域
本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种诱导沟叶结缕草愈伤组织分化成苗的方法。
背景技术
植物组织培养技术已广泛应用于各个研究领域，渗透到育种学、遗传学、分子生物学等学科中，成为生命科学中重要的研究技术和手段。组培狭义指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
沟叶结缕草(Gram ineae Zoysia matrella(L.)Merr.)是禾本科画眉草亚科结缕草属多年生草本植物，又称马尼拉草，广泛分布于亚洲和澳洲的热带和亚热带地区，我国福建和广东及广西等地有野生种，是一种比较优良的暖季型草坪草。其叶细、色绿、绿期长、草层密集而无从状草丘突起，具有较强的耐旱性、耐盐碱性、耐荫性、对土壤要求不严等特性，被认为是一种高质量的草坪草，适宜景点绿化、休憩广场和高级运动场的草坪建植树，已成为我国南方大部分地区的主要草坪栽培种；具横走根茎和匍匐茎，秆细弱，直立，秆高12～20厘米。总状花序线形，小穗卵状披针形，黄褐色或略带紫色。但沟叶结缕草也存在一些突出的缺陷，如成坪速度慢、叶量少、易感锈病、抗寒性较差、季节变换时易变黄等，颖果卵形，细小，且其种子不易萌发、雌花早熟等，使通过传统杂交育种获得后代的难度大，这些问题在一定程度上都可以通过遗传育种的手段得到改良。
利用植物组织和细胞培养技术与体细胞突变体筛选技术相结合的方法是植物遗传育种途径之一，已在很多作物上获得抗病、耐盐、耐重金属等多种类型的突变体；采用基因工程技术，可将抗逆功能基因导入特定品种的愈伤组织或原生质体，获得改良的转基因植物，无论细胞工程或是基因工程方法培育作物新品种，首先必需建立高频、稳定的植物再生系统。
综合已发表的研究文献，发现沟叶结缕草植株再生均伴有愈伤组织形成过程，但存在愈伤组织生长缓慢、维持困难、分化率低等问题，使其组培快繁的相关研究工作难度增加。一般来说，初诱导产生的植物胚性愈伤组织或经过短期培养的胚性愈伤组织较易产生体细胞胚，但随着培养时间的延长和继代次数的增多，体细胞胚发生能力会降低。这在一些常见的禾本科植物的组培中已有相关文献的发表。而对连续继代5年以上的沟叶结缕草愈伤组织的再生分化，国内外学者并没有相关的研究，如何提高长期继代沟叶结缕草愈伤组织的分化再生能力，是组培工作者急需解决的一个技术难题。
发明内容
本发明提供了一种诱导沟叶结缕草愈伤组织分化成苗的方法，该方法操作简单，解决了长期继代的沟叶结缕草愈伤组织再生率低的问题。
一种诱导沟叶结缕草愈伤组织分化成苗的方法，包括：选取沟叶结缕草的胚性愈伤组织，置于含有6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0～0.4mg/L、反式玉米素核苷(ZR)0～0.4mg/L的固体培养基中进行培养，4周后分化出小苗。
如表1所示，当所述的固体培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/L、反式玉米素核苷0～0.4mg/L时，愈伤组织的平均再生率均大于50％；当所述的固体培养基中含有反式玉米素核苷0.05mg/L时，愈伤组织的平均再生率大于其它浓度；当6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/L、反式玉米素核苷0.05mg/L时，愈伤组织的平均再生率高达70.0％。
胚性愈伤组织结构致密，颜色嫩滑光泽，显微镜下观察细胞较小，大多为圆形，且其内容物丰富，具有较强的再生能力，属体细胞胚发生途径。
细胞分裂素是从玉米或其他植物中分离到的一种N6-异戊烯酰嘌呤，是一类促进胞质分裂的物质，促进多种组织的分化和生长，在促进细胞分裂中起活化作用，6-BA为较常用的细胞分裂素，能促进植物组织细胞的分裂、生长；反式玉米素核苷，中文别名6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤核苷，白色或类白色结晶，是一种刺激植物细胞分裂的物质，一般用于瓜果等经济作物的增产。
所述固体培养基的配方为：MS粉1.0～1.2g/L、蔗糖25～30g/L、Phytagel植物凝胶2.5～3g/L。与普通的MS基本培养基相比，本发明培养基具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养进而加速愈伤组织的生长。因配方中含有较高的离子浓度，无机养分的数量和比例适中，保证了配制、贮存和消毒等过程中离子间的相互平衡，能够满足植物细胞的生长需求。
所述培养的条件为：温度25±2℃，12h光照/天。一般沟叶结缕草愈伤组织诱导在黑暗中进行，而愈伤的分化需要光照。温度是影响分化的又一因素，过高、过低温度都不利于愈伤的分化。
所述的胚性愈伤组织为继代8年的愈伤组织，愈伤低分化率是沟叶结缕草组培的一个难题，随着愈伤继代次数的增多，培养时间的延长，体细胞胚发生能力会降低，而沟叶结缕草多以无性繁殖方式进行种质保存与扩繁，有必要通过有关技术提高长期继代后愈伤组织的再生能力。
所述的胚性愈伤组织为致密型胚性愈伤组织，饱满且呈黄绿色，致密的胚性愈伤组织表面光滑有光泽，结构致密，多为淡黄色或黄绿色，易于再生芽。
本发明采用含有6-BA和ZR两种激素的培养基，对长期继代的愈伤组织进行再生培养，显著提高了长期继代的沟叶结缕草愈伤组织再生率，有效解决了多年继代沟叶结缕草愈伤组织再生率低的问题，进一步完善了沟叶结缕草的组培再生体系，为其细胞工程育种和基因转化研究奠定了基础，该方法操作简单，效率高。
附图说明：
图1为沟叶结缕草胚性愈伤组织；
图2为转绿的胚性愈伤组织；
图3为胚性愈伤组织分化成芽；
图4为含0.05mg/L 6-BA及0.05mg/L ZR的固体培养基中愈伤分化成芽；
图5为不同生长调节剂组合对沟叶结缕草愈伤组织再生的影响。
具体实施方式
实施例
(1)在超净工作台上从继代8年的沟叶结缕草愈伤组织中选取质地硬，饱满且呈黄绿色的直径为约3mm胚性愈伤组织(如图2所示)；
(2)将上述胚性愈伤组织转接于含6-BA和ZR的固体培养基中，每个柱形瓶接种20粒；
固体培养基配方：1.1g/L MS粉，30g/L蔗糖，3g/L Phytagel植物凝胶，pH5.8～6.0，其中6-BA和ZR配比如表1所述；
(3)将接种完成的柱形瓶置于25±2℃恒温无菌培养室，12h光照/天培养；
(4)每日观察并比较其再生情况，经4周分化成苗(如图3所示)后，统计愈伤组织的平均再生率，结果如表1所示。
愈伤组织再生率按以下公式计算：
再生率(％)＝再生小苗的愈伤组织块数/总愈伤组织块数；将两次重复实验的再生率取平均值，即得愈伤组织平均再生率。
将实验结果进行统计学分析，方差分析，结果见表2：
6-BA浓度的P值＜0.01，即6-BA浓度对实验结果影响极显著；ZR浓度的P值＜0.05，即ZR浓度对实验结果影响显著。因此，6-BA为本实验的主要影响因素，ZR为次要因素。
按方差分析法的观点，只需对显著影响的因素选择最佳水平，而对试验结果影响较小的因素，按实际需要选择适当的水平，由表1及图5可知：本例试验中两激素浓度的最佳搭配为0.05mg/L 6-BA和0.05mg/L ZR。
表1不同植物生长调节剂组合对沟叶结缕草愈伤组织再生的影响
| 组合号 | 6-BA浓度(mg/L) | ZR浓度(mg/L) | 平均再生率(％) |
| 1 | 0.00 | 0.00 | 5.0 |
| 2 | 0.00 | 0.05 | 17.5 |
| 3 | 0.00 | 0.10 | 2.5 |
| 4 | 0.00 | 0.20 | 25.0 |
| 5 | 0.00 | 0.40 | 10.0 |
| 6 | 0.05 | 0.00 | 55.0 |
| 7 | 0.05 | 0.05 | 70.0 |
| 8 | 0.05 | 0.10 | 57.5 |
| 9 | 0.05 | 0.20 | 52.5 |
| 10 | 0.05 | 0.40 | 50.0 |
| 11 | 0.10 | 0.00 | 2.5 |
| 12 | 0.10 | 0.05 | 7.5 |
| 13 | 0.10 | 0.10 | 7.5 |
| 14 | 0.10 | 0.20 | 17.5 |
| 15 | 0.10 | 0.40 | 30.0 |
| 16 | 0.20 | 0.00 | 17.5 |
| 17 | 0.20 | 0.05 | 25.0 |
| 18 | 0.20 | 0.10 | 22.5 |
| 19 | 0.20 | 0.20 | 12.5 |
| 20 | 0.20 | 0.40 | 17.5 |
| 21 | 0.40 | 0.00 | 2.5 |
| 22 | 0.40 | 0.05 | 17.5 |
| 23 | 0.40 | 0.10 | 2.5 |
| 24 | 0.40 | 0.20 | 12.5 |
| 25 | 0.40 | 0.40 | 2.5 |
表2方差分析表
Claims (8)
1.一种诱导沟叶结缕草愈伤组织分化成苗的方法，包括：选取沟叶结缕草的胚性愈伤组织，置于含有6-苄氨基腺嘌呤0～0.4mg/L、反式玉米素核苷0～0.4mg/L的固体培养基中进行培养，4周后分化出小苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固体培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/L、反式玉米素核苷0～0.4mg/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固体培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0～0.4mg/L、反式玉米素核苷0.05mg/L。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的固体培养基中含有6-苄氨基腺嘌呤0.05mg/L、反式玉米素核苷0.05mg/L。
5.根据权利要求1任一所述的方法，其特征在于，所述固体培养基的配方为：MS粉1.0～1.2g/L、蔗糖25～30g/L、Phytagel植物凝胶2.5～3g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度25±2℃，12h光照/天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚性愈伤组织为继代8年的愈伤组织。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚性愈伤组织为致密型愈伤组织，饱满且呈黄绿色。
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