CN1736173A - 一种提高结缕草遗传转化效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种提高结缕草遗传转化效率的方法，主要步骤包括：以结缕草属草坪草成熟种子或幼穗为原始受体材料，诱导并筛选出淡黄色、颗粒状愈伤组织为转基因直接受体材料，采用改进了的农杆菌转化法，结缕草愈伤组织共培养3－5天后GUS瞬时活性可达400～550个蓝斑/克组织。转化后的愈伤组织保持较高的再生能力，分子检测结果表明，转化率达6％以上。

Description

一种提高结缕草遗传转化效率的方法

技术领域：

本发明明涉及一种提高结缕草遗传转化效率的方法，属生物技术领域。

背景技术：

结缕草属(Zoysia Willd.)是一类多年生、低矮、C4型禾本科草本植物，主要分布于亚洲东部，在非洲等温暖地区亦有分布。结缕草在我国分布广泛，北起辽宁北部，南到福建、台湾，东起吉林鸭绿江上游，西到陕西省东南部均有分布(刘建秀等，1997；董厚德等，1999)。结缕草属植物主要具备以下优势：(1)结缕草属植物被认为是最抗盐的草坪植物之一，(2)抗旱性强，(3)病虫害较少，因而在草坪草开发利用上有重要价值。在韩国和日本，目前有70-80％的草坪均采用结缕草属植物来建植，包括家庭草坪、高尔夫球场、运动场、公园草坪等。在我国，结缕草种植面积也在日益扩大。结缕草的缺点主要是不耐寒，当气温持续下降到10℃以下时，地上茎叶开始变紫发黄，逐渐枯死。因此在北方寒温带地区结缕草的绿期只有180-200天。绿期短导致结缕草的观赏价值和使用价值降低。培育抗寒性强的新品种(系)，成为结缕草育种的主要目标之一。

利用基因工程技术把外源基因有目的、有针对性地导入特定品种的愈伤组织或原生质体，获得改良的转基因植物，提高草坪草的抗逆性，成为草坪草育种领域研究的前沿。4种转基因方法用于草坪草的遗传转化：基因枪、原生质体DNA吸收，碳化介导的DNA发送和农杆菌介导的转化(柴明良，2002)。目前仅一例报道基因的瞬时表达试验采用碳化硅纤维介导的DNA发送系统。通过原生质体再生植株很困难，而且原生质体吸收DNA法常导致多拷贝基因的整合以及转基因的重排等，限制了该方法的应用。基因枪吸收法是草坪草遗传转化中常用的方法，它不受寄主范围的影响，也无需通过原生质体途径再生，但基因枪法也有外源基因多拷贝插入等问题，获得稳定遗传的转基因植株也有较多的困难。与前三种方法比较，农杆菌介导转化的方法具有明显优点：首先是费用相对低廉，操作程序也不复杂，更主要的是通过此方法获得的转基因植株通常只有1-3个拷贝的完整外源DNA。虽然单子叶植株不属于农杆菌固有的寄主范围。但是，自从1994年日本在水稻上证实农杆菌技术可以以来，农杆菌技术在重要的单子叶植物，如水稻、玉米和大麦上的应用快速发展，在草坪草的转基因研究中也取得了成功。

柴明良通过A.tumefaciens LBA4404介导结缕草胚性愈伤组织，获得了具有潮霉素磷酸转移酶(HPT)和葡萄糖苷酸酶(GUS)基因共整合的瞬时表达转基因再生植株，是世界上首例用农杆菌介导法获得草坪草转基因成功的报道(柴明良，2000)。Rahman等(2002)研究了A.tumefaciens菌株、感染及共培养时间、乙酰丁香醇(AS)和潮霉素浓度等关键因子对A.tumefaciens介导转化效果的影响，建立了A.tumefaciens介导的日本结缕草(Z.japonica Steud.cv YK-EM2)转化体系。Toyama(2003)通过农杆菌成功地将bar基因导入结缕草基因组中获得抗除草剂株系。农杆菌介导的结缕草遗传转化仍然有转化率低的问题，中华结缕草的相关研究未见报道。

发明内容：

针对现有技术存在的不足，本发明以结缕草属草坪草种获得的愈伤组织为转基因的受体材料，通过改进了的农杆菌介导法将外源基因高效率的导入受体细胞，并经选择培养获得较高诱导再生频率的转基因再生植株，从而建立了一种中华结缕草高效遗传转化的方法。

本发明的方案是通过选择生长状态良好的愈伤组织、调整农杆菌浮悬液体培养基及共培养基成分及培养方式，将外源基因导入结缕草愈伤组织，通过选择培养及再生诱导培养，使遗传转化效率明显提高。

本发明中，农杆菌介导的遗传转化程序基本上同石田(Ishida，1996)等报道，不同之处在于，在常用的浮悬农杆菌转染液或共培养培养基中添加了1～5mg/L精氨酸(Arg)，将愈伤组织放在浮悬农杆菌转染液中浸染10～20min，然后接种到在共培养基表面铺的一层无菌滤纸上，保持愈伤组织周围无积水。在滤纸上接种农杆浸染了的愈伤组织，保持愈伤组织周围相对干燥，使愈伤组织保持较好的生长活性，以提高转化效率。转化体在含有适宜抗生素的培养基上抑菌，在含有合适浓度选择剂的培养基上筛选，诱导出较高再生频率的转化植株。

本发明中，高频再生体系的建立是遗传转化体系建立的重要技术前提，培养方法完全参考孙振元等(已申请专利：200510087733.4)的方法。即在诱导愈伤组织培养基通过添加一定配比的2，4-D和6-BA以及高浓度碳源以有效提高愈伤组织的诱导率，在继代培养到再生培养过程，通过不断改变植物生长调节剂浓度配比及核黄素等含量，以提高植株再生率。

愈伤组织的筛选标准为淡黄色、颗粒状、直径约2mm的愈伤组织。新诱导产生的愈伤组织，必须经过3-5次继代培养，才能筛选到上述优质的给与伤组织。

本发明中选用的植物材料为中华结缕草，包括中华结缕草、沟叶结缕草、大叶结缕草等。

提高中华结缕草遗传转化效率的方法包括如下步骤：(1)挑取一个农杆菌单菌落转移到3mL液体LB培养基(含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，200rmp，28℃条件下培养12-16小时，1mL菌液转移到含有50mL的LB培养液的250mL三角瓶内扩繁4-5h至OD600为0.3-0.4。(2)用50ml离心管收集菌液，以4000rmp离心10min，沉淀等用等体积的农杆菌重悬培养液(另加100μg/L的乙酰丁香酮)重悬殊菌体，作转化备用液。(3)取15mL的备用液与60块胚性愈伤混合，在60kPa负压条件下静置10分钟。愈伤取出后用无菌滤纸吸干菌液，接种到共培养基(另加100μg/L的乙酰丁香酮)的滤纸上。(4)在25℃下黑暗中共培养3-5d后，用无菌清洗愈伤组织至清洗液澄清，无菌滤纸吸干多余的液体，转到新的继代培养基(含250mg/L头孢霉素)上恢复培养7-10d，然后转选择培养上培养。(5)选择培养基是在继代、分化培养基中分别加入1、2、5mg/L草丁膦(Sigma公司生产)和250mg/L头孢霉素。(6)在选择继代培养基上培养15-20d后，转到选择分化培养基上诱导植株再生。

在前人转化方法的基础上，结合本发明方法，结缕草愈伤组织共培养3-5天后GUS瞬时活性可达400～550个蓝斑/克组织。

本发明的特点在于，在建立了完善的中华结缕草再生体系的基础上，通过改进前人的转化方法，使农杆菌介导的中华结缕草遗传转化效率明显提高。并适应用于不同基因型结缕草。

说明附图：

图1转化受体材料，

图2共培养后愈伤组织的GUS瞬时活性，

图3抗性愈伤组织分化

图4再生抗性植株。

具体实施方式：

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例1

采用的原始受体材料为中华结缕草(zoysia sinica Hance)。诱导愈伤组织的材料为中华结缕草成熟种子。

质粒p3301IC，含有衰老特异性启动子SAG12调控的异戊烯基转移酶(IPT)基因ipt，以及玉米泛素启动子UBI调控冷诱导基因转绿因子CBF1基因cbf1，CaMV35s启动子调控的GUS基因(uidA)，筛选基因为bar(图1)。农杆菌菌株为LBA4404和EHA105，由中国林业科学院林业研究所保存。

农杆菌感受态的制备：

(1)试剂的配制

农杆菌LB：NaCL 10g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物10g/L，pH7.0，固体培养基加琼脂15g/L。

(2)挑取根癌农杆菌(LBA4404或EHA105)单菌落于3mL的LB液体培养基(加入25mg/L利福平)中，28℃下180rpm振荡培养过夜；

(3)取过夜培养菌液2mL，接种于含有50mL LB液体培养基的500mL三角瓶内，28℃振荡培养至OD600为0.5-0.6；

(4)5000rpm，离心5min，去上清；

(5)加10mL 0.15M灭菌的NaCL缓慢的悬浮农杆菌细胞；

(6)5000rpm，离心5min；

(7)1mL预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，24h内置于4℃，或分装成每管200L(加入15％甘油)，液氮中速冻1s，置-70℃保存备用。

质粒p3301IC转入农杆菌

取200μL感受态细胞，加入1μg质粒DNA，冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL LB培养基，28℃慢速振荡培养4h；2000rpm离心1min，弃上清，加入0.1mL LB或YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB平板上，28℃下培养48h。

阳性克隆的鉴定和保存

挑取单菌落，划线，PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌株加入15％甘油，混匀后保存于-70℃。

转化受体的制备

用中华结缕草成熟种子为外植体诱导愈伤组织，50天后将愈伤组织继代到新的培养基上。以后每30天继代一次，共3次，每次都挑选淡黄色、结构密实的愈伤组织。最后一次继代培养15天后，取愈伤组织进行转化。

愈伤组织的转化与抗性植株的筛选

挑取一个农杆菌单菌落转移到3mL液体LB培养基(含有100mg/L卡那霉素和25mg/L利福平)中，200rmp，28℃条件下培养12-16小时，1mL菌液转移到含有50mL的LB培养液的250mL三角瓶内扩繁4-5h至OD600为0.3-0.4。用50ml离心管收集菌液，以4000rmp离心10min，沉淀等用等体积的农杆菌重悬培养液(另加100μg/L的乙酰丁香酮)重悬殊菌体，作转化备用液。取15mL的备用液与60块胚性愈伤混合，在60kPa负压条件下静置10分钟。愈伤取出后用无菌滤纸吸干菌液，接种到含2mg/L精氨酸(Arg)的共培养基(另加100μg/L的乙酰丁香酮)的滤纸上。在25℃下黑暗中共培养3-5d后，用无菌清洗愈伤组织至清洗液澄清，无菌滤纸吸干多余的液体，转到新的继代培养基(含250mg/L头孢霉素)上恢复培养7-10d，然后转到选择培养上培养。选择培养基是在继代、分化培养基中分别加入1、2、5mg/L草丁膦(Sigma公司生产)(经多次预备试验确定的筛选压)和250mg/L头孢霉素。在选择继代培养基上培养15-20d后，转到选择分化培养基上诱导植株再生。植物再生率达60％。

分子鉴定

转化植株的PCR与Southern杂交方法参考《分子克隆》(第三版)PCR与Southern杂交检测如下图。结果表明转化率达7.75％。

拷贝数的确定采用NcoI、EcoR1酶切中华结缕草总DNA，再做Southern杂交。结果表明为转入的基因是单拷贝。

实施例2

培养及转化程序同实施例1，不同之处在于，采用的原始受体材料为中华结缕草幼穗。

转化受体的制备是用中华结缕草幼穗为外植体诱导愈伤组织，40天后将愈伤组织转到新的继代培养基上。每30天继代一次，共4次，每次都挑选淡黄色、结构密实的愈伤组织。最后一次继代培养12天后，取愈伤组织进行转化，添加2.5mg/L精氨酸(Arg)。植物再生率达62％。

转化植株的PCR与Southern杂交结果表明转化率达6.75％，为单拷贝。

实施例3

培养及转化程序同实施例1，不同之处在于，采用的原始受体材料为大叶结缕草成熟种子。

转化受体的制备是用大叶结缕草成熟种子为外植体诱导愈伤组织，40天后将愈伤组织转到新的继代培养基上。每30天继代一次，共3次，每次都挑选淡黄色、结构密实的愈伤组织。最后一次继代培养15天后，取愈伤组织进行转化，共培养基中添加3mg/L精氨酸(Arg)。植物再生率达63.55％。

转化植株的PCR与Southern杂交结果表明转化率达6.35％，为单拷贝。

实施例4

培养及转化程序同实施例1，不同之处在于，采用的原始受体材料为沟叶结缕草成熟种子。

转化受体的制备是用沟叶结缕草成熟种子为外植体诱导愈伤组织，45天后将愈伤组织转到新的继代培养基上。每30天继代一次，共3次，每次都挑选淡黄色、结构密实的愈伤组织。最后一次继代培养15天后，取愈伤组织进行转化，添加4mg/L精氨酸(Arg)。植物再生率达67.5％。

转化植株的PCR与Southern杂交结果表明转化率达7.25％，为单拷贝。

Claims (7)

1.一种提高结缕草遗传转化效率的方法，其特征在于：(1)筛选愈伤组织作为转化受体材料，(2)农杆菌重悬液体培养及共培养，(3)农杆菌液与培养物的共培养及培养基。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步特征在于作为遗传转化受体的愈伤组织的筛选标准为淡黄色、颗粒状。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步特征在于改进了常规的农杆菌浮悬液体培养基及共培养培养基配方，在常用的农杆菌重悬液体培养或共培养培养基中添加了1～5mg/L精氨酸(Arg)。

4.根据权利要求3所述的方法，其进一步特征在于常规农杆菌重悬培养液及共培养培养基配方为MS基本成分(不含氯化钙)+10g/L葡萄糖，pH 5.2。

5.根据权利要求1所述的方法，其进一步特征在于共培养的方法为，在共培养基表面铺一层无菌滤纸，保持愈伤组织周围无积水。

6.根据权利要求1所述的方法，其进一步特征在于采用该方法，结缕草愈伤组织共培养3-5天后GUS瞬时活性可达400~550个蓝斑/克组织。

7.根据权利要求1所述的方法，其进一步特征在于转化后的愈伤组织具有较强的再生能力，转化率在6％以上。

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