CN109924130B - 一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，步骤如下：铁皮石斛成熟蒴果制作种子悬浮液，点播至一步成苗培养。本发明可以使铁皮石斛种子在没有填加任何激素的有机物培养基中，不需要转接，即可完成铁皮石斛从种子直接分化、生长发育为8～10cm带有根茎叶的健壮小苗。不仅消除了成苗过程中的人工转接次数，降低了人工成本与转接带来的组培苗污染率，并且消除了因转接伤苗带来的缓苗期，从而缩短了铁皮石斛组培苗的生长周期，极大程度上简化了铁皮石斛种苗的生产步骤，降低了生产成本，还可以避免组培过程中由于激素添加引起的铁皮石斛组培苗的遗传变异，从而最大限度上保持其原有性状，可作为铁皮石斛组培苗生产的重要方法。

Description

一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属草本植物，又名黑节草，是中国传统名贵中药之一，位居中华九大仙草之首。因其种子极为细小，胚胎发育不完全，且无胚乳组织，在自然状态下萌发率极低，自然繁殖能力也较弱。再加上生态环境日益遭受严重破坏，野生铁皮石斛资源濒临灭绝，现已被国家列为重点保护的药用植物之一。为了保护这一濒危的名贵中药，国内外研究者们开展了铁皮石斛的组培快繁、种子萌发及菌根方面的繁殖研究，并取得了较好的进展，实现了快速繁殖种苗化生产与人工集约化栽培。

铁皮石斛种苗主要通过植物组织培来获取。虽然现有组织培养技术已经不断进行改进，并已形成了以种子为外植体的三步成苗的工艺流程：种子无菌萌发→丛生苗壮苗→大苗生根。但是此流程需要进行三次转接，步骤依旧繁琐，多次的换瓶转接，不仅浪费人力、财力、物力，而且增大组培苗的污染率，从而导致铁皮石斛组培苗出瓶率的降低，造成种苗生产成本居高不下。而且，培养基中激素的添加对铁皮石斛组培苗的成长存在着一定的影响，不当的激素添加则可能造成组培苗的性状与遗传变异。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，所述方法相比于现有的培养方法，操作简单，节省人工，污染率低，生产成本低，而且组培苗出瓶率高，种苗性状稳定。

本发明所述的一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，包括以下步骤：

(1)摘取授粉植株结出的成熟的蒴果；

(2)制作种子悬浮液：将步骤(1)摘取的铁皮石斛蒴果消毒，清洗，将蒴果从顶部切一个圆孔，置于无菌水上方，制成浓度为30～50粒/毫升的种子悬浮液；

(3)无菌播种：吸取配好的种子悬浮液1ml于无激素一次成苗培养基中进行点播，每毫升培养液分5-7滴点播，相邻每滴间间隔1.5～2.0cm；

(4)一步成苗培养：组培室进行培养，八个月以后即可长成8～10cm的带有根茎叶的健壮小苗。

进一步的，本发明提供一种步骤(1)获取成熟的蒴果的方法：在四月份中旬，于铁皮石斛种植区内选取三年生的紫杆、软脚生长健壮的铁皮石斛开花植株进行人工异花授粉；待授粉植株长到十一月份时，摘取授粉植株结出的成熟的蒴果。

本发明所述的选取三年生的紫杆、软脚生长健壮的铁皮石斛，在于三年生的铁皮石斛授粉成功率高；茎秆呈紫色的铁皮石斛品质比茎秆呈青色、青黄色的铁皮石斛品质好；软脚铁皮石斛比硬脚铁皮石斛的茎含有的纤维更少，因此嚼之残渣少，品质优良。

步骤(1)中所述的成熟蒴果，一般是蒴果外部果皮颜色由绿泛白，内部种子为黄绿色粉末时，表明蒴果成熟，摘取的蒴果，可以存放于冰箱备用。

进一步，步骤(2)中消毒的详细步骤为：蒴果在75％的酒精里浸泡25～30s，然后置于0.1％的升汞溶液中浸泡5～8min；浸泡时蒴果应全部浸入溶液中，以防止不必要的污染；消毒之后再用无菌水漂洗4～5次。

步骤(2)中蒴果从顶部切一个圆孔可以用无菌手术刀进行操作，切好后可以用镊子夹住果柄，置于无菌水上方，轻轻敲打镊子，使种子全部洒落至无菌水中，制成浓度为30～50粒/毫升的种子悬浮液。

步骤(2)种子悬浮液密度控制，可以将种子悬浮液吸取0.1ml于载玻片上，于光学显微镜下观察，数出里面的种子数量，重复五次，得出平均值，计算种子悬浮液内种子密度。根据种子密度，往种子悬浮液中添加一定量的无菌水，制成浓度为30～50粒/毫升的种子悬浮液。

步骤(2)种子悬浮液浓度为30～50粒/毫升的时候，点播方式可以更好的促进铁皮石斛种苗的生长，铁皮石斛种子萌发分化后易形成丛，可相互促进生长，缩短成苗时间；而当种子浓度高于50粒/瓶时，则不利于铁皮石斛植株后期生长，会使得铁皮石斛成苗植株较为矮小。

进一步，步骤(3)中无激素一步成苗培养基的成分，包含以下成分：每升培养基中含2.47g的1/2MS基本培养基、土豆60～80g，香蕉90～110g，蔗糖20～30g，琼脂6～7g、pH值为5.6～5.8。本发明所述的无激素一步成苗培养基，不含有激素，并添加了土豆与香蕉两种天然有机混合物，其中，香蕉的添加有利于铁皮石斛原球茎的分化、对幼苗的生根与茎秆的粗壮程度有促进作用；而土豆的添加则利于铁皮石斛幼苗进行分株，同时对幼苗的株高有促进作用。

其中，培养基配方中的土豆、香蕉汁可以按照常规方法进行加工，将土豆和香蕉削皮后切成1cm大小得方块，加入少量水，置于豆浆机中进行打碎，将打碎后的汁液加入培养基中。

发明人意外发现，通过本发明的点播方式，点播的铁皮石斛种子萌发分化后易形成丛，丛生苗植株间可相互促进生长，缩短成苗时间；如果点播少于5滴，会不利于生长前期所有原球茎分化为幼苗，使得原球茎分化不完全；而当种子点播大于7滴时，在形成幼苗时丛生性不明显，对促进幼苗生长没有明显作用。

进一步，步骤(3)优选的操作步骤：用移液枪吸取1ml的种子悬浮液，将其均匀的滴在培养基中，为5～7滴，不要晃动，使其自然生长。在无菌播种后，禁止摇晃瓶子，使种子悬浮液液滴均匀分布于培养基上。

步骤(4)中的组培室可以为常规组培室，例如组培室内温度维持在23～25℃，湿度维持在40～70％之间，光照为12h/d，光强为1500～2000lx。

本发明还公开一种无激素一步成苗培养基，即培养基中不添加任何植物激素，包含以下成分：每升培养基中含2～3g的1/2MS基本培养基、土豆60～80g，香蕉90～110g，蔗糖20～30g，琼脂6～7g、pH值为5.6～5.8。

本发明还提供了所述一步成苗培养基的配制方法，以一升培养基为例：往400～600ml的水中加入2.47g的1/2MS基本培养基、土豆60～80g，香蕉90～110g，加入蔗糖20～30g，搅拌均匀，将体积用水添加至1000ml，调pH值为5.6～5.8，最后加入6～7g琼脂即可。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1，本发明所述的无激素一步成苗培养基为固体培养基法，种子撒播到培养基中，不需要任何转接过程即可长成根茎叶健全的种苗。本发明可以从铁皮石斛种子撒播直接长为幼苗，不需要繁琐的人工进行二次换瓶转接，避免了转接对苗的伤害，消除了苗的缓苗期，不仅降低了人工成本，污染率等问题，降低了生产成本，极大程度上提高了生产效率。

2.培养基中不含有任何激素，对苗不会造成不良影响，不添加激素苗也可以正常萌发、分化、生根长成健全种苗；消除了因为激素添加带来的铁皮石斛组培苗的遗传变异，从而最大程度上维护了铁皮石斛的现有性状。

3.培养基中加入恰当比例的香蕉汁与土豆汁混合有机物，其有机物质极大程度上促进了铁皮石斛种子的分化与后期幼苗的生长，从而使得铁皮石斛的育苗周期缩短了将近十分之一。

4.铁皮石斛种子悬浮液采用移液枪进行点播，不仅控制了种子密度，而且大大提高了其种子萌发率与原球茎分化率，使得种子萌发率、原球茎分化率几乎接近百分之百。

5.铁皮石斛的点播，使得铁皮石斛在后期分化为一丛一丛的丛生苗，相对现有的均匀撒播来说，铁皮石斛幼苗在后期的成长过程中，可以利用铁皮石斛的丛生性加快其生长，幼苗成长速度更快，从而缩短育苗周期，从现在的十个月，缩短为八个月。

6.常规的组培室，不需要进行改进，即可满足种子一步成苗的日常生长需求。

附图说明

图1为实施例1成熟铁皮石斛种子的显微状态；

图2为实施例1铁皮石斛种子播种三周后变绿的显微状态；

图3为实施例1铁皮石斛种子两个月后形成圆球茎的显微状态；

图4为工厂化生长瓶苗两个月的铁皮石斛圆球茎；

图5为实施例1一次成苗点播生长两个月圆球茎；

图6为实施例2一次成苗均匀撒播生长两个月圆球茎；

图7为实施例1一次成苗点播生长三个月圆球茎分化；

图8为实施例2一次成苗均匀撒播生长三个月圆球茎分化；

图9为实施例1一次成苗点播生长四个月分化丛生小苗；

图10为实施例2一次成苗均匀撒播生长四个月分化丛生小苗；

图11为实施例1一次成苗点播生长八个月成苗。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、铁皮石斛种子无激素一步成苗快繁技术

(1)准备成熟的铁皮石斛蒴果

在四月份中旬，于铁皮石斛种植区内选取三年生的紫杆、软脚生长健壮的铁皮石斛开花植株进行人工异花授粉；待授粉植株长到十一月份时，摘取授粉植株结出的成熟的蒴果，十一月份时，于铁皮石斛种质圃中摘取成熟的铁皮石斛蒴果，存放于4℃冰箱备用。如图1所示为成熟的铁皮石斛种子显微状态。

(2)准备常规的组培室

可以为现在多数的组培工厂，培养条件为恒温：23～25℃，湿度为40％～70％，光强为1500～2000LX，每天光照12小时。

(3)制作种子悬浮液

将铁皮石斛蒴果于超净工作台内在75％的酒精里浸泡25～30s，然后置于0.1％的升汞溶液中浸泡5～8min，浸泡时蒴果应全部浸入溶液中，以防止不必要的污染；消毒之后可以用无菌水漂洗4～5次，用无菌手术刀将蒴果从顶部切一个圆孔，用镊子夹住果柄，将蒴果置于无菌水上方，用手术刀轻轻敲打镊子，使种子全部洒落至无菌水中，轻轻摇晃，制成种子悬浮液。

(4)种子悬浮液镜检

将初次配制好的种子悬浮液吸取0.1ml溶液于光学显微镜下镜检，重复五次计算出平均值。往悬浮液中加计算好量的无菌水，将种子悬浮液浓度调为每毫升30～50粒。

(5)准备无激素一步成苗培养基

一步成苗无激素培养基的配制，往500ml的自来水中加入2.47g的1/2MS基本培养基、加入打碎的土豆汁60～80g，香蕉汁100g，加入蔗糖20～30g，将体积添加至1000ml，调pH值为5.6～5.8，最后加入6～7g琼脂，即可。

(5)无菌播种

于超净工作台中用移液枪吸取配好的种子悬浮液1ml于超净工作台中点播至无激素一次成苗培养基中，相邻每滴间隔1.5～2.0cm。

(6)铁皮石斛一步成苗培养

组培室进行培养，八个月以后即可长成8～10cm的带有根茎叶的健壮小苗。

实施例2

无菌播种时采用均匀撒播的方式，具体为在移液枪将铁皮石斛种子悬浮液播种至无激素培养基后，将培养瓶进行均匀摇晃，使得铁皮石斛种子较为均匀得分布于培养基表面。其他同实施例1。

如图2所示，为实施例1铁皮石斛种子撒播进培养基中，三周后种子变绿的显微状态。

如图3所示，为实施例1铁皮石斛种子撒播进培养基中，两个月后种子萌发形成原球茎的显微状态，并且原球茎已经分化出明显的叶芽。

如图4所示，为正常视野下工厂化铁皮石斛种子直接撒播于培养基表面的种子(大于200粒/瓶)密度获取的原球茎，图5为实施例1正常视野下一步成苗点播铁皮石斛获取的原球茎。实施例6为实施例2一次成苗均匀撒播生长两个月圆球茎。图5、图6中，每毫升30～50粒的铁皮石斛种子撒播密度更利于铁皮石斛种子的成活，且实施例1点播的铁皮石斛在形成原球茎后形成了原球茎丛。

在原球茎生长后期，如图7、图8，每毫升30～50粒铁皮石斛原球茎均能顺利进行原球茎分化，两者都分化出了明显的叶芽，分化率达百分之百，并且图8实施例1的点播的铁皮石斛原球茎丛的长势也比图7的实施例2的均匀撒播的原球茎长势好。

在原球茎继续生长过程中，如图9、图10所示，几乎所有原球茎全部顺利分化，并长为根茎叶健全的铁皮石斛幼苗，另外图9实施例1点播形成的丛生铁皮石斛植株生长速度比图10中实施例2均匀撒播的单株的铁皮石斛植株生长更快。

经过后期生长，实施例1铁皮石斛幼苗长为如图11所示的健壮铁皮石斛8～10cm健壮成苗植株。

Claims (4)

1.一种快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）摘取授粉植株结出的成熟蒴果；

（2）制作种子悬浮液：将步骤（1）摘取的铁皮石斛蒴果消毒，清洗，将蒴果从顶部切一个圆孔，置于无菌水上方，制成浓度为30~50粒/毫升的种子悬浮液；

（3）无菌播种：吸取配好的种子悬浮液于无激素一次成苗培养基中进行点播，每毫升种子悬浮液分5-7滴点播，相邻每滴间间隔1.5~2.0cm；无激素一步成苗培养基，包含以下成分：每升培养基中含2.47g的1/2MS基本培养基、土豆60~80g，香蕉90～110g，蔗糖20~30g，琼脂6~7g、pH值为5.6~5.8；点播的具体方式：用移液枪吸取1ml的种子悬浮液，将其均匀的滴在培养基中，为5~7滴，不要晃动，使其自然生长；

（4）一步成苗培养：组培室进行培养，八个月以后即可长成8~10cm的带有根茎叶的健壮小苗。

2.根据权利要求1所述的快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，其特征在于，步骤（2）中消毒的步骤为：蒴果在75%的酒精里浸泡25~30s，然后置于0.1%的升汞溶液中浸泡5~8min。

3.根据权利要求1所述的快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，其特征在于，步骤（4）组培室温度维持在23~25℃，湿度维持在40~70%之间。

4.根据权利要求1所述的快速繁殖铁皮石斛种苗的方法，其特征在于，步骤（4）组培室光照为12h/d，光强为1500~2000lx。

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