KR100318090B1

KR100318090B1 - 생물반응기를이용한산삼부정근(세근)의대량생산방법

Info

Publication number: KR100318090B1
Application number: KR1019980043718A
Authority: KR
Inventors: 이보식; 손성호; 윤승노; 권오웅
Original assignee: 대한민국(관리청:특허청장, 승계청:산림청 임업연구원장)
Priority date: 1998-10-19
Filing date: 1998-10-19
Publication date: 2002-06-20
Also published as: KR20000026257A

Abstract

본 발명은 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 대량생산 방법, 좀더 상세하게는 산에서 자생하고 있는 산삼조직으로부터 캘러스를 유도한 다음 이로부터 직접 부정근을 유도하거나, 액체현탁 배양을 통해 부정근을 유도하여 이를 생물반응기 배양으로 대량증식시킴으로써 생산성을 극대화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 산삼 부정근(세근)을 생물반응기를 이용하여 생산함으로써 수요에 비해 공급이 턱없이 부족하여 일반대중에 거의 보급이 불가능한 신비의 약초인 산삼을 연중 생산할 수 있는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.

본 발명에 의한 방법으로 산삼을 대량생산할 경우 산삼의 유효성분을 연구하는 의약계에 대량의 산삼을 공급함으로써 산삼의 숨겨진 약리효과에 대한 집중적인 연구가 진행될 수 있으며, 배양된 산삼을 값싼 가격으로 일반대중에게 공급할 수 있다.

Description

생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 대량생산 방법

본 발명은 생물반응기를 이용한 산삼 (Panax schinsengNEES) 부정근(세근)의 대량생산 방법, 좀더 상세하게는 산에서 자생하고 있는 산삼조직으로부터 캘러스(미원시 분화세포괴)를 유도한 다음 이로부터 직접 부정근을 유도하거나, 액체현탁 배양을 통해 부정근을 유도하여 이를 생물반응기 배양으로 대량증식시킴으로써 생산성을 극대화하는 방법에 관한 것이다.

지금까지 식물 조직배양기술을 이용한 인삼세포의 대량배양이나 인삼 캘러스로부터 부정근(세근)을 유도하여 이를 대량배양하는 기술은 일부 학술전문지 또는 특허 (일본국 공개특허 제 소58-43725호, 제 소58-43726호, 제 소58-43727호, 제 소58-179836호)로 등록된 예가 있으나, 산삼의 경우 지금까지 보고된 바가 없으며, 산삼의 액체현탁배양 세포로부터 직접 부정근을 유도시킨 경우는 본 발명이 최초이다.

한편, 산삼 부정근(세근)의 경우 배양과정에서 덩어리를 형성할 경우 그 내부에 존재하는 세근조직이 급격히 노화되는 문제점이 있다.

산지에서 90년 가량 자란 산삼을 시료로 사용함으로써 무균재료를 얻기 위해 특별한 소독방법이 개발되어야 하며, 무균재료로부터 캘러스를 유도하여 이로부터 부정근을 유도하여 대량증식을 시킬 경우 배양 4주 후 수확량은 초기접종량에 비해 약 10배 정도 밖에 기대할 수 없다. 따라서, 현탁배양세포 수준에서 부정근을 유도하여야 산업적인 규모로 대량배양이 가능하며, 초기 접종량에 비해 약 100배 이상의 수확량을 기대할 수 있으므로 이에 대한 기술개발이 필요하였다.

이에 본 발명자는 상기의 문제점을 해결하고 산삼 부정근의 대량배양 기술을확립하기 위한 연구를 수행하던 중, 수동식 또는 자동식 생물반응기를 이용하여 산삼 부정근(세근)을 대량으로 배양하기 위한 최적조건을 찾아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 산삼 부정근(세근)을 생물반응기를 이용하여 생산함으로써 수요에 비해 공급이 턱없이 부족하여 일반대중에 거의 보급이 불가능한 신비의 약초인 산삼을 연중 생산할 수 있는 방법을 제공함에 있다.

도 1은 본 발명의 시료로 사용한 강원도산 90년생 산삼,

도 2의 A는 산삼조직에서 유도된 캘러스, B는 캘러스를 액체현탁배양한 세포로부터 유도된 산삼 부정근(세근),

도 3은 500L 용량의 생물반응기에서 배양 6주 후에 수확된 산삼 부정근(세근)의 모습,

도 4의 A는MseI조각을 프라이머로 사용한 PCR 산물, B는EcoRI조각을 프라이머로 사용한 PCR에 의한 DNA분석 결과 (화살표는 산삼에만 특이적으로 나타나는 DNA 밴드.

도 5는 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 자연생 산삼의 정성 및 정량을 분석한 결과,

도 6은 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 배양 산삼의 정성 및 정량을 분석한 결과이다.

본 발명은 강원도에서 자라고 있는 산삼을 시료로 하여 이로부터 산삼과 동일한 유전자형과 물질을 지니고 있는 산삼 부정근(세근)을 대량증식하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의한 산삼 부정근(세근)의 대량생산 방법은 산지에 자생하는 산삼조직을 재료로 하여 1) 시료의 표면소독에 의한 무균재료화 단계, 2) 무균재료로부터 캘러스 유도단계, 3) 캘러스의 액체배양에 의한 현탁배양세포 증식단계, 4) 현탁배양 세포 또는 캘러스로 부터 부정근 유도단계, 5) 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 배양단계로 이루어져 있다.

무균재료로부터 켈러스 유도를 위한 배치는 MS(Murashige and Skoog) 배지를 이용하며, 이때 식물 생장조절물질을 오옥신류 중에서 IAA (Indoleacetic acid), IBA (Indolebutyric acid), NAA (Naphthalene acetic acid) 또는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 1-10 ppm, 바람직하게는 2-5 ppm 처리하여 캘러스를 유도하는데, 2,4-D를 2-5 ppm 처리할 경우 캘러스 유도효과가 가장 우수하다.

캘러스의 액체배양에 의한 현탁배양세포 증식은 액체 현탁배양 배지로 MS, WPM(Lloyd and McCown), SH(Schenk and Hilderandt) 배지를 사용하여 세포접종량을 배지 총량의 8-12%, 바람직 하게는 10%로 맞추어 주는 것이 효과적이다. 대수생장기에 있는 세포를 지속적으로 다량 얻기 위해서 2주 간격으로 계대배양하면 4주배양후 2배 이상의 생체중량이 증가하게 된다.

부정근의 유도는 캘러스로 부터 직접유도하거나, 액체현탁배양 세포로 부터 유도할 수 있는데, 첫째로 캘러스로 부터의 부정근 유도는 지름 1cm에서 1.5cm 정도의 캘러스 덩어리를 생장조절 물질인 IBA 또는 NAA를 0.1 에서 10 ppm을 첨가한 mB5(modified Gamberg), MS (Murashige and Skoog); 1/2 MS, B5 (Gamberg), SH (Schenk and Hildebrandt), LP (Quoirin and Lepoivre), White, WPM(Lloyd and McCown), GD (Gresshoff and Doy), DKW (Driver and Kuniyuki) 또는 DCR (Gupfa and Durzan)배지에 배양하여 부정근을 유도한다. 이때 배양배지는 WPM 배지에 IBA를 2 ppm에서 5 ppm 첨가하거나, NAA를 2 ppm에서 4 ppm 첨가하여 주는 것이 가장 효과적이다.

다음으로 플라스크 수준에서나 공기부양식 생물반응기에서 배양을 할 경우 세포수적인 증가는 관찰할 수 있으나 현탁배양 세포로 부터의 세근의 분화는 이루어지지 않는다. 그러나, 원통형의 배양병을 옆으로 뉘여 회전시킬 수 있는 회전기기(roller apparatus)를 이용할 경우 현탁배양 세포로 부터 다량의 부정근(세근)을 유도할 수 있다. 이때 배양배지는 상기 배지중 WPM 배지가 가장 효과적인데, 배양세포로 부터 부정근(세근)을 유도하기 위해서는 약 2 ppm에서 5 ppm의 IBA를 첨가하는 것이 필수적이며, 접종시 세포의 밀도는 배지 총량의 0.1%에서 0.5% 정도로 조절시킨 다음, 배양 4주에서 6주 정도 동일배지에 유지시켜야 부정근(세근)의 분화가 가능하다.

생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근)의 배양은 5L 용량의 공기부양식 생물 반응기에 산삼 부정근(세근)을 배양시 초기 접종량은 0.5 % 정도가 적당하며, 배지의 공급은 배양 부정근(세근)이 엉키기 시작하는 시점인 7일 단위로 첨가해주는 방식이 회분식 배양 (one batch culture)방식 보다 훨씬 효과적인데, 이때 길이가 0.5cm에서 2.0cm의 길이로 부정근(세근)을 접종할 경우 수확시 생중량 이 크게 증가하게 된다.

공기부양식 생물반응기에서 산삼의 부정근(세근)을 배양할 경우 배양온도가 부정근(세근)의 증식에 가장 민감한 반응을 보이는데, 일반적인 식물조직이나 세포배양 온도인 26℃ 보다 낮은 20℃에서 25℃에서 급속한 생장을 얻을 수 있으며, 배양 온도가 28℃ 이상에서는 극히 저조한 생장을 보인다. 파이롯트급 생물반응기에서 산삼 부정근(세근)을 배양할 경우 7주 간격으로 많은 양의 공기를 주입하여 부정근(세근)의 엉킴을 방지해 주는 것이 배양의 필수조건이다. 파이롯트급 생물반응기를 이용하여 다량의 산삼 부정근(세근)을 얻기 위한 또 하나의 중요 요건 중 하나는 씨드(seed) 상태의 산삼시료를 0.5cm 에서 2.0cm 크기로 조제하거나, 대형 배양 탱크에서 칼날을 이용하여 잘라 준 다음 이를 더 큰 규모의 생물반응기로 이송시킬 수 있는 기술이다. 전자의 경우 전기드릴 등에 무균적으로 소독된 칼날을 부착하여 사용할 수 있으며, 후자의 경우 생물반응기에 메카니칼 실(mechanicalseal) 내부에 칼날을 달아주는 방법으로 가능하다. 이때 칼날의 각도는 세근을 0.5cm 에서 2.0cm 크기로 자를 수 있도록 조절되어야 한다.

본 발명에서 사용된 생물반응기는 이미 국내에 특허를 출원한 모델(특허출원 제97-37406호, 제97-37407호, 제97-35751호)과 동일하다.

이하, 실시예에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1.(시료의 표면소독)

본 발명에 사용한 시료는 강원도산 90 년생의 산삼으로서 배양을 위해서 뿌리 부분을 분리한 후, 뿌리에 붙어있는 토양 및 오염균을 1차로 제거하기 위하여 세척제(Tween-20)가 몇 방울 들어있는 수도물로 여러 차례 세척하였다.

표면소독을 위해서는 시료를 횡으로 이등분하여 윗쪽 부위는 껍질을 제거한 후 시료를 다시 횡으로 10등분하여 이를 70% 에탄올에 30초간 침적시킨 다음, 멸균수로 1번 행구어 준 다음 각 2개의 시료에 대해 1% 차아염소산 용액에 30초, 1분, 3분, 5분, 10분 동안 처리하였으며, 아랫쪽 부위는 껍질이 붙어있는 상태에서 10 등분을 한 다음, 이를 70% 에탄올에 30초간 침적시킨후, 멸균수로 1번 행구어준 다음 각 2개의 시료에 대해 2% 차아염소산 용액에 30초, 1분, 3분, 5분, 10분 동안 처리하였다.

표면 소독이 끝난 시료는 식물조직배양에 사용되는 영양배지 중 MS배지에 치상한 후 약 1주일간 오염의 정도를 조사한 결과를 표 1에 나타내었다. 껍질을 벗기고 소독한 경우 1% 차아염소에 1분 이상 침적시키는 것이 효과적이었으나, 5분이지날 경우 조직이 심하게 손상을 입는 것을 관찰할 수 있었으며, 껍질이 붙어 있는 상태로 표면소독을 실시한 경우에는 2% 차아염소산 용액에 3분 이상 침적시키는 것이 효과적이었으며, 10분까지는 조직이 크게 해를 입기 않았다.

○ 39-20% △ 60-40% × 100-70%

실시예 2.(무균재료로 부터의 캘러스유도)

표면소독 후 오염이 되어있지 않으며, 조직에서 흰색의 분비물이 거의 없는 시료를 선별하여 이를 4등분한 다음, 식물 생장조절물질이 함유되어 있는 배지에 접종하여 캘러스 증식상태를 관찰하였다. 이때 사용된 배양배지는 MS 배지를 이용하였으며, 식물 생장조절물질은 오옥신류 중에서 IAA, IBA NAA 및 2,4-D를 0.5 ppm (mg/L)에서 10 ppm까지 0.5 ppm 구배로 처리하였다.

그 결과 2,4-D와 NAA, IBA에서 대체로 효과가 있었으나, 그 중에서도 2,4-D 1.0 ppm-5.0 ppm에서 가장 효과가 뛰어난 것으로 확인되었다. 캘러스는 조직이 비후된 다음 배양체 위쪽에서 주로 발생하였으나, 이를 분리하여 계대배양을 4주 간격으로 3회 이상 배양하였을 때 생장이 빠른 캘러스를 얻을 수 있었다. 그 결과를표 2에 나타내었다.

실시예 3.(캘러스로 부터 현탁배양 세포증식)

생장속도가 비교적 빠르고 흰색 또는 옅은 노란색을 띄는 캘러스를 메스로 잘게 부순 다음 이를 액체배양 배지에 현탁시킨 후 약 1달 간격으로 계대배양하였다. 이때 연속적인 계대배양을 위하여 계대시 거즈로 세포덩어리를 제거시켜 주었다.

액체 현탁배양시 초기 세포접종량은 배지 총량의 10%로 맞추어 주는 것이 효과적이었으며, 4주 배양후 3배 이상의 생체중량이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

액체 현탁배양시 MS, WPM (Lloyd and McCown), SH (Schenk and Hildebrandt) 배지를 사용한 결과 세포생장량 증가에 있어서 배지간의 차이는 거의 보이지 않았으나, MS 배지가 다소 좋은 것으로 관찰되었는데, 액체현탁 배양시 배지가 세포생장에 미치는 영향을 표 3에 나타내었다.

대수생장기에 있는 세포를 지속적으로 다량 얻기 위해서는 계대배양 시기를 2주 간격으로 실시하는 것이 좋았으며, 산삼의 경우 일부 박테리아나 곰팡이류에 오염이 될 경우에도 배양세포가 분비하는 미확인 물체에 의해 오염의 징후가 보이기 않고 있다가 온도의 변화등에 따라 갑자기 오염이 나타나는 경우가 많기 때문에 씨드(seed)로 사용되는 세포주는 계대배양시 균배양 배지를 이용하여 오염여부를 확인하였다.

실험결과의 재현성을 높이기 위하여 20L급 공기부양식 생물반응기에서 종배양하였으며, 이후 배양세포로부터 부정근(세근)을 유도하기 위하여 동일한 생물반응기에서 생장시킨 세포를 비교실험에 사용하였다.

실시예 4.(캘러스로부터 부정근(세근)의 유도)

생장속도가 비교적 빠르고 흰색 또는 옅은 노란색을 띄는 캘러스를 선발하여 고체배지에서 2주간 생장시킨 다음 부정근(세근)을 유도하였다. 부정근의 유도는 일반적인 식물 조직배양 방법으로 실시하였다.

배양배지는 mB5, MS, 1/2 MS, B5, SH, LP, White, WPM, GD, DKW 및 DCR 배지에 생장조절 물질인 IBA 및 NAA를 2 ppm 구배로 2-6 ppm을 첨가한 배기를 사용하였다.

캘러스의 경우 지름 1cm에서 1.5cm 정도의 덩어리를 배양하는 것이 효과적이었으며, 이때 배양배지는 WPM 배지에 IBA를 2 ppm에서 6 ppm 넣어주거나 NAA를 2 ppm첨가하는 것이 가장 효과적이었다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

실시예 5.(현탁배양세포로 부터 부정근(세근)의 유도)

현탁배양된 산삼세포는 플라스크 수준에서나 또는 공기부양식 생물반응기에서 배양을 할 경우 세포수적인 증가는 관찰할 수 있었으나 세근의 분화는 이루어지지 않았다. 그러나, 원통형의 배양병을 옆으로 뉘여 회전을 시킬 수 있는 회전기기 (roller apparatus)를 이용하였을 경우 다량의 부정근(세근)유도가 가능하였다. 이때 배양배지는 WPM 배지가 효과적 이었다.

배양세포로 부터 부정근(세근)을 유도하기 위해서는 약 2 ppm에서 5 ppm 정도의 IBA를 넣어주는 것이 필수적이었으며, 접종시 세포의 밀도는 배지 총량의 0.1%에서 0.5% 정도로 조절시킨 다음 배양 4주에서 6주 정도 동일배지에 유지시켜야 부정근(세근)의 분화가 가능하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

실시예 6.(소규모 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근) 배양)

배양세포 및 캘러스로부터 유도된 부정근(세근)은 대체로 길이가 2cm에서 7cm 정도이며, 부정근(세근) 수는 약 40개에서 60개 정도이었다. 이 시료를 사용하여 소규모 생물반응기에서 연속 생산할 수 있는 최적조건을 찾기 위하여 부정근(세근)의 규격이 생장에 미치는 영향을 조사한 결과, 길이가 0.5cm에서 2.0cm의 길이로 부정근(세근)을 접종할 때 수확시 생중량 증가가 크게 일어남을 관찰할 수 있었다. 5L 용량의 생물반응기에 산삼 부정근(세근)을 배양시 초기접종량은 0.5 % 정도가 적당하였으며, 배지의 공급은 배양 부정근(세근)이 엉키기 시작하는 시점인 7일 단위로 첨가해주는 방식이 회분식 배양 (one batch culture)방식 보다 훨씬 효과적임을 알 수 있었다. 5L 용량의 공기부양식 생물반응기 (air lift bioreactor)에서 생장시킨 산삼 부정근(세근)은 배양 4주후에 다시 20L 용량의 공기부양식 생물반응기에 계대배양하였으며, 이때 수확된 부정근(세근)은 칼날을 이용하여 0.5cm에서 2.0cm 크기로 자른 다음 접종하였다. 공기부양식 생물반응기에 의한 부정근 배양효과를 표 6에 나타내었다.

실시예 7.(파이롯트 규모의 생물반응기를 이용한 산삼 부정근(세근) 배양)

20L 용량의 생물반응기에서 무균적으로 수확된 산삼 시료 약 0.5 kg을 0.5cm에서 2.0cm 크기로 조제한 다음, 이를 수동식 생물반응기에 접종한 결과 배양 6주 후에 생체중량으로 약 70 kg을 얻을 수 있었다. 파이롯트 (pilot)급 생물반응기를 이용하여 산삼 부정근(세근)을 배양할 경우 산삼 부정근(세근)은 약 7일 간격으로 서로 엉키는 현상을 관찰할 수 있었는데, 엉킨 상태로 배양을 계속할 경우 내부에 있는 산삼 부정근(세근)은 노화가 되어 갈색으로 변하는 것을 관찰 할 수 있었으며, 갈변된 부정근(세근)의 산삼 사포닌 함량은 외부의 부정근(세근)에 비해 현격이 떨어지며, 생장속도도 느린 것이 확인되었다. 파이롯트 규모의 부정근 배양효과를 표 7에 나타내었다.

실시예 8.(산삼과 인삼의 유전변이 분석)

일반적으로 인삼과 산삼의 구별이 극히 어렵기 때문에 여러 가지 방법으로 구별을 하고 있으나 그중에서도 DNA 수준의 유전변이 분석이 가장 효과적인 것으로판단되어 우리나라에 자생하고 있는 7개 지역의 인삼과 산삼캘러스 및 산삼 부정근(세근)에 대해 최근에 개발된 유전형질 분석법(AFLP : amplified fragment length polymorphism)을 이용하여 분석을 실시하였다. 각각의 시료는 CTAB (Cetyl Trimethyl Amonium Bromide) 방법으로 DNA를 추출하여 정량한 다음, 개체별로 각각 250 ng씩을 두 개의 제한효소인MesI과EcoRI으로 8시간 이상 37℃에서 절단하였다. 유도체 DNA 조각 (MseI (5'-GAC GAT GAG TCC TGA G-3') 조각과EcoRI (5'-CTC GTA GAC TGC GTA CC-3') 조각)을 T₄DNA 접합효소를 사용하여 16℃에서 16시간 이상 접합시킨 후, 접합산물을 10배 희석하여MseI 조각(5'-GAC GAT GAG TCC TGA GTA AA-3')과EroRI 조각(5'-AGA CTG CGT ACC AAT TCC-3')을 프라이머로 사용하여 1차 중합효소 연쇄반응(94℃에서 30초, 56℃ 30초, 72℃ 1분간 30회 연쇄반응-MJ Research PTC200 반응기 이용)을 실시하였다. 1차 중합효소 연쇄반응산물을 50배 희석하여 두 개의 염기가 더 부착된 프라이머는 2쌍 [MseI-AGG 조각(GAC GAT GAG TCC TGA GTA AAG G)과EcoRI-CTC 조각(AGA CTG CGT ACC AAT TCC TC) 쌍과MseI-AGT 조각(GAC GAT GAG TCC TGA GTA AAG T)과EcoRI-CTC 조각(AGA CTG CGT ACC AAT TCC TC) 쌍]을 이용한 2차 중합효소 연쇄반응을 다음과 같이 수행하였다. 즉, 94℃에서 30초, 64℃ 30초, 72℃ 1분간 1회 실행한 후, 11회에 걸쳐 점차적으로 매 반응시 프라이머 결합온도를 0.7℃씩 낮춰가며 연쇄반응을 수행한 다음, 94℃에서 30초,56℃ 30초, 72℃ 1분간의 과정을 23회 반복해서 중합효소반응을 수행하였다. 반응이 끝난 후 증폭산물을 염기서열 분석용 6% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용해서 전기영동을 수행하여 분획하였다. 전기영동이 끝난 후 DNA를 은정색반응법에 의해서 정색반응을 수행하고 실온에서 건조시킨 다음 관찰한 결과, 도 4에서 화살표로 나타난 것처럼 산삼에만 특이적으로 나타난 DNA 밴드(band)를 관찰 할 수 있었다. 앞으로 인삼과 산삼의 확실한 구별을 위해 더 많은 수의 프라이머 (primer)를 이용한 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.

실시예 9.(산삼과 배양산삼 부정근(세근)의 물질분석)

산삼과 배양하여 수확한 산삼 부정근(세근)은 이론적으로 영양번식에 의해 증식되는 것임으로 유전적으로는 100% 동일 하나 산삼은 수십년 동안 산지 지형에서 자라는 것에 비해 생물반응기에서 생산된 배양산삼의 경우 약 6주 정도의 배양기간이 소요되기 때문에 물질생산성 측면에서는 차이가 생길 수 있다. 이에 대한 분석을 고성능 액체크로마토그라피를 이용하여 수행하였다. 분석을 위해서 산삼과 배양산삼의 시료 0.5 g에서 1 g을 이용하였으며 용매는 70% 에탄올 20 ml에서 40 ml로 조절하였다. 산삼은 용매에 침적 후 블렌딩 (blending)을 하였으나, 배양 산삼은 침적만 하여도 추출에 문제가 없었기 때문에 블렌딩은 따로 실시하지 않았다. 추출은 마이크로웨이브 (microwave)로 실시하였으며, 이때 온도는 150℃로 30분간 추출하였다. 분석시 이동상으로는 물과 MeCN의 농도구배를 초기에는 80:20로 하고 이후 60:40으로 희석시켜 주었다. 흐름속도(flow rate)는 분당 0.8 ml로 40분간 실시하였다 이때 건출 파장은 UV 203 nm에서 실시한 결과 도 5과 도 6에서 보는 바와같이 성분이 거의 동일 한 것을 알 수 있었다.

특히, 생물반응기를 이용할 경우 배양산삼에서 생산되는 물질의 양을 인위적으로 조절할 수 있기 때문에, 확인된 약리효과를 토대로 신의약품을 개발할 경우 그 부가가치가 상당히 높을 것이다.

Claims

산삼시료의 표면소독에 의한 무균재료화 단계와,

무균재료를 IAA, IBA, NAA 또는 2,4-D에서 선택된 적어도 1종의 생장조절물질을 1∼10ppm 첨가한 배지에서 캘로스를 유도하는 단계와,

세포접종량을 액체배양배지의 8∼12%로 현탁배양하며 배양세포를 증식하는 단계와,

mB5, MS, 1/2 MS, B5, SH, LP, White, WPM, GD, DKW 또는 DCR배지로 구성된 군에서 선택된 1종의 배지에 IBA를 2∼5ppm 첨가하고 동배지에 증식된 현탁배양세포를 배양하여 부정근을 유도하는 단계와,

부정근을 0.5∼2cm 크기로 하여 생물반응기를 통해 20∼25℃의 온도에서 부정근을 배양하는 단계를 포함하는 생물반응기를 이용한 산삼부정근 대량생산방법.
제 1항에 있어서, 캘러스 유도단계시 배지에 2.4-D를 2∼5ppm 첨가함을 특징으로 하는 생물반응기를 이용한 산삼부정근 대량생산방법.
제 1항에 있어서, 현탁배양세포를 증식하는 단계에서 증식배지로는 MS, WPM 또는 SH 배지에서 선택된 1종으로 함을 특징으로 하는 생물반응기를 이용한 산삼부정근 대량생산방법.
제 1항에 있어서, 부정근 유도는 원통형의 배양병을 옆으로 뉘여 회전할 수 있는 회전기기를 이용함을 특징으로 하는 생물반응기를 이용한 산삼부정근 대량생산방법.
제 1항에 있어서, 파이롯트급 생물반응기를 이용하는 경우 산삼 부정근의 배양시 배지 첨가 후 다량의 공기를 7일 간격으로 주입하여 배양함을 특징으로 하는 생물반응기를 이용한 산삼부정근 대량생산방법.