KR20040083963A - 생물공학적 기술에 의한 땃두릅나무 묘목의 대량생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 땃두릅 나무(Oplopanax elatumNakai)를 생물공학적 기술을 이용하여 배양용기내에서 무균적으로 배양하여 묘목을 대량생산하는 방법에 관한 것임. 땃두릅 나무의 대량생산 방법은 캘러스 유도과정을 거치지 않고 어린 유식물 절편표면으로부터 직접 체포배를 유도한 후 이를 발아시킨 다음, 어린 땃두릅 유식물체를 생육시켜 땃두릅 나무 묘목을 생산하는 방법과 캘러스 유도과정을 거친 후 캘러스로부터 땃두릅나무의 체세포배를 유도하여 이를 발아시킨 후 땃두릅 나무의 묘목을 대량생산하는 방법으로 구성됨. 본 발명은 또한 전술한 체세포 및 어린 식물로부터 절편을 절취하여 2차 체세포배를 유도하고 이를 발아시켜 땃두릅나무의 묘목을 생산하는 방법에도 관계됨. 본 발명에 의하면 멸종위기에 있어서 보호수로 지정되었으며 약리성분이 있는 땃두릅나무의 묘목을 생물공학적인 방법에 의하여 대량으로 번식시킬 수 있음.

Description

생물공학적 기술에 의한 땃두릅나무 묘목의 대량생산 방법{Method for mass propagation of Oplopanax elatum Nakai by biotechological technique}

본 발명은 생물공학적 기술을 이용하여 땃두릅나무의 묘목을 대량으로 생산하는 방법에 관계되는 것으로서, 땃두릅나무의 어린 유식물 절편으로부터 직접적 체세포배를 유도하는 방법과 캘러스유도과정을 거친후 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전술한 체세포배로부터 2차 체세포배를 유도하고 이를 발아시켜 땃두릅나무 묘목을 생산하는 방법에도 관여한다.

땃두릅나무(Oplopanax elatumNakai)는 두릅나무과로 한약명은 자인삼(刺人蔘)이라고하며 북한에서는 멧나무라는 이름으로 불리우고 있다. 뿌리는 약용으로 쓰이며, 잎은 넓고 향기 좋아서 보쌈의 재료로 사용할 수 있다. 또한 땃두릅 나무에서 유기게르마늄을 추출해내는 방법이 대한민국 특허 출원(1997-0016027)이 있다.

즉 땃두릅나무에서 유기게르마늄이 추출된다는 것이다. 유기 게르마늄은 난치병으로 알려진 암, 만성성인병등에 놀라운 효과를 나태내는 것을 일본 의과대학의 임상실험 연구보고에 의해 알려지기 시작하면서 일본 후생성은 이를 의사의 처방에 의해 각종 암환자나 난치병 환자들에게 치료용으로 투여하도록 인·허한바 있다. 식물에서는 주로 인삼, 영지버섯, 마늘등에 미량으로 들어있는 것으로 확인되어 있다.

이렇듯 땃두릅나무는 식물체 전체를 유용하게 사용할 수 있으나 현재 멸종위기 식물이며 보호수로 지정되어 있는 실정이고, 종자발아를 통한 땃두릅나무의 대량번식이 이루어진 예가 없는 것으로 알려졌다. 이와같이 번식이 까다로운 식물의 경우는 생물공학적 기술을 이용하는 것이 획기적인 번식수단이 될 수 있다. 따라서 땃두릅나무 묘목을 조직배양방법을 이용하여 실험실내에서 대량으로 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다. 일반적으로 배양용기내에서 무균적으로 식물체를 생산하는 방법은 매우 다양하며, 이러한 방법 중에는 체세포배 발생을 거쳐 식물체를 생산하는 방법이 있는데 체세포배의 발생은 크게 두 가지로 구분되고 있다. 즉, 배양조직의 표면으로부터 체세포배를 직접 유도하여 묘목을 유도하는 방법이 있고, 배양조직으로부터 캘러스를 유도한 다음 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 방법이 있다.

땃두릅나무의 조직배양에 관한 보고는 아직 발표되어진 적이 없다. 따라서 이방법은 땃두릅나무에서 최초의 방법이 될 것이다.

본 발명의 목적은 생물공학적 기술을 이용하여 땃두릅나무 묘목을 대량으로 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

전술한 본 발명의 목적은 땃두릅나무의 조직절편으로부터 고빈도의 체세포배를 발생시키고 또한 이들 체세포배 유래 절편 표면으로부터 다시 2차 배를 생산하여 땃두릅나무 묘목을 생물공학적 기술로 대량생산한 후 지속적으로 유식물체를 생산하는 방법이다.

본 발명은 땃두릅나무의 조직절편으로부터 직접적으로 체세포배를 유도하여 땃두릅나무 묘목을 대량생산하는 방법과 배발생캘러스를 유도하여 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하여 땃두릅나무 묘목을 대량생산하는 방법으로 구성된다.

본 발명은 배발생 캘러스를 유도하고 증식시키는 방법에도 관계된다.

본발명은 또한 전술한 바와 같이 얻어지는 체세포배 유래 유식물 절편으로부터 체세포배를 유도하여 유식물체를 계속적으로 생산하는 방법에도 관계며, 유도된 체세포배를 발아시키는 방법과 발아된 유식물체를 절편으로부터 2차 체세포배를 유도하여 지속적으로 발아시키는 방법에도 관계된다.

본 발명은 상기과정을 통하여 얻은 유식물체를 토양에 이식하여 최종적으로 묘목을 생산하는 방법으로 구성된다.

따라서 본 발명은 땃두릅나무의 절편으로터 체포배를 직접유도하는 1차 체세포배 유도 단계, 배발생능 캘러스를 유도한후 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 단계, 유도된 체세포배 유래의 식물 절편으로부터 2차 배 유도를 유도하는 단계, 유도된 체세포배를 지베렐린으로 처리하여 발아시키고 생육시키는 단계 및 발아된 어린 식물체를 토양에적응하도록 이식하여 묘목을 생산하는 단계를 포함하는 땃두릅나무 묘목 생산방법에도 관계된다. 전술한 방법에서, 묘목을 한꺼번에 대량으로 생산하기 위하여는 2차배 유도 단계를 수차례 반복하는 것이 바람직하다.

도 1은 자연상태의 땃두릅나무

도 2는 땃두릅나무의 캘러스와 체세포배(A,B : 직접적 체세포배 ; C : 캘러스)를 유도하는 사진

도 3은 상기 과정을 거친 땃두릅나무의 유식물체

도 4는 상기 과정을 거쳐 토양에서 대량증식되고 있는땃두릅나무의 사진과 2차배를 형성하는 땃두릅나무의 사진(A: 2차체세포배 ; B,C : 순화된 땃두릅나무)

이하 본 발명의 구성을 단계별로 구체적 설명을 하면 다음과 같다.

1) 땃두릅나무의 조직으로부터 캘러스 및 1차 체세포배 유도단계

땃두릅 나무의 조직절편 및 종자를 무균적으로 적출시켜 부위별로 배양한다. 종자는 먼저 무균적으로 발아시킨 다음, 발아된 유식물체의 부위별 절취하여 뮤라시게와 스쿠스(MS)배지 에 설탕 3∼6%, 2,4-D 0.01∼7mg/L, 한천 0.5∼1.0%를 첨가하여 조제한 고체배지에 배양한후 배양체로부터 캘러스 및 체세포배를 유도한다. 이때 정단분열조직부분에서 효과가 가장 좋았다.

배양실 조건은 1500 LUX 백색형광등으로 16시간 광조명과 지속적인 암배양을 교대로 하고, 온도는 25±1℃로 조정한다.

2) 배양된 유식물 절편으로부터 체세포배를 직·간접으로 유도하는 단계

상기의 배양조건에서 3개월이상 배양했을 때 배양체로부터 배발생능 캘러스가 유도되었다. 이 배발생능 캘러스를 1.0 mg/L 2,4-D가 첨가된 MS고체 및 액체배지에 3∼4주간격으로 계대배양하여 배발생 세포를 증가시킨다. 이때 배양상태는 암배양 하였을 때 더 좋은 효과를 얻을수 있다. 체세포배는 2.4-D가 첨가되지 않는 배지에서 세포괴를 이식하여 3∼4주이상 배양하면 유도된다. 한편 2,4-D가 첨가된 액체배지에서 현탁배양된배발생 세포괴를 200μm 크기의 stainless steel체로 거른 다음 체를 통과한 세포괴를 50∼1000ml Erlenmeyer flask에 넣어 현탁배양하면 대량의 체세포배가 유도된다.

1/8 ∼ 1/1 MS배지에서 유도된 어린 유식물의 잎, 줄기, 뿌리부분의 절편체를 2,4-D가 첨가된 MS고체배지에 각각 4∼6주 이상 배양하였을 때 뿌리> 배축> 자엽순으로 체세포배 및 배발생 캘러스가 발생하였다.

3)유도된 체세포배로부터 식물체를 생산하는 단계

상기 과정에서 발생된 체세포배를 자엽시기의 배에 이르게 한 후 1∼200μM GA3 가 첨가된 배지에 이식하여 배양하면 체세포배가 발아되었다. 발아된 배를 유식물체로 생장시키기 위하여, 1/3 또는 1/2로 희석시킨 MS배지에 배양하면 약 2개월 후에 정상적인 소식물체가 유도되었다.

일반적으로 체세포배는 고빈도로 생산되어도 묘목으로 생장되는 비율이 낮은 경우가 많이 나타난다. 본 발명에서는 2차단계에서 유도된 체세포배를 배양할 배지에 MS(3%설탕, 0.8% 한천 포함)에 GA3를 약 1-200μM로 첨가하여 배양한 결과, 3주정도에 80%이상의 자엽단계의 체세포배가 발아되었다. 따라서 본 발명에서는 발아된 유식물체를 1/3농도로 희석시킨 MS배지에 1%설탕을 첨가한 고체배지 (0.6-0.8% 한천 포함)에 옮겨서 생육시킨 결과 건실한 묘목으로 생장함을 확인할 수 있었다.

4) 유식물체의 토양순화

1)∼3)과정을 거쳐 얻어진 유식물체를 상토 : 모래 : 펄라이트 (1:1:1, v/v)를 함유한 토양에 이식하고 비닐로 덮어 적응시킨후, 비닐을 벗기고 온실에 이식하여 약 1∼3개월 이상 경과되어도 생존을 하고 있는 식물체를 선별한다. 생존하고 있는 식물체를 노지에 이식하여 순화가 이루어진다.

실시 예)

캘러스 및 1차 체세포배 유도단계

땃두릅 나무의 조직절편 및 종자를 무균적으로 70% 알코올에 1분, 1% 차아염소산 나트륨용액에 10∼15분간 처리하여 멸균수로 3∼4회 세척한 다음 부위별로 배양한다. 종자는 먼저 MS Free배지에 파종하여 발아시킨 후 발아된 유식물체의 부위별로 배양한다. 각각 절편체를 MS배지에 설탕 3∼6%, 2,4-D 0.01∼7mg/L, 한천 0.6∼1.0%를 첨가하여 조제한 고체배지에 배양하여 배양체로부터 캘러스 및 1차 체세포배를 유도한다.

배양실 조건은 1500 LUX 백색형광등으로 16시간 광조명과 암배양을 교대로 하고, 온도

25±1℃로 조정한다.

캘러스로부터 체세포배유도 및 2차 체세포배 유도단계

발생된 배발생능 캘러스에서 2,4-D가 첨가되지 않은 조건의 MS고체 및 액체배지에 배양 2-3주후에 체세포배가 발생한다. 또한 앞에서 얻어진 체세포배 또는 이들로부터 발아된 어린 유식물체로부터 1-7mm 크기의 절편을 만든 다음, 실시 예 1에서와 같은 동일한 조건하에 1-3개월동안 배양하여 절편으로부터 배발생능 캘러스 및 직접 체세포배를 유도한다.

발아 및 생육단계

상기 과정에서 발생된 체세포배를 자엽시기의 배에 이르게 한 후 1∼200μM GA3 가 첨가된 배지에 이식하여 2-4주 동안 배양하면 80%이상의 체세포배가 발아되었다. 발아된 배를 유식물체로 생장시키기 위하여, 1/3 또는 1/2 MS배지에 배양하면 약 2개월 후에 정상적인 소식물체가 유도되었다.

본 발명은 생물공학적 방법에 의한 땃두릅나무 묘목의 대량생산 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따르면, 약용 및 식용으로 쓰이는 땃두릅나무의 묘목을 대량생산이 가능해짐에 따라서 농가의 소득증대 및 국민건강과 유기게르마늄시장에도 기여할 수 있을 것이다. 또한 번식이 어려운 지역에서도 땃두릅나무를 대량으로 생산할수 있게 된다.

Claims (7)

1. 땃두릅 나무의 조직절편 및 접합자배를 표면살균하여 무균적으로 1∼7mm 크기의 절편을 만든 후 오옥신이 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체배지에 배양하여 배발생 캘러스 및 체세로배를 유도하는 단계와 접합자배를 발아시켜 얻은 유식물체로부터 절편을 채취한 다음 이 절편을 오옥신이 첨가된 뮤라시게와 스쿠그 고체배지에 배양하여 배양절편으로부터 배발생 캘러스 및 체세포배를 유도하는 단계를 포함하는 생물공학적 기술에 의한 땃두릅나무 묘목의 생산방법
2. 체세포배를 배양하여 캘러스를 0.01-7mg/L 2,4-D가 첨가된 MS고탕 1-5%, agar 0.6-1.0%) 및 액체배지에서 2∼8주간격으로 계대배양하여 증식시키는 단계, 증식된 캘러스를 2,4-D가 첨가되지 않은 고체배지와 액체배지에 배양하여 체세포배를 유도하는 단계. 이 체세포배를 기내에서 줄기와 뿌리를 가진 건실한 식물체로 유도하여 식물체의 잎, 줄기, 뿌리의 조직을 각각 무균적으로 약 1-7mm 크기의 절편을 만든후 오옥신(2,4-D)이 첨가된 MS고체 배지에 배양하여, 배발생 캘러스 및 체세포배를 반복적으로 유도한 후 어린식물체를 얻는 단계, 이상의 단계를 거친 후 어린 식물체를 토양에 순화시키는 생물공학적인 기술을 이용한 땃두릅나무 묘목을 대량생산하는 방법.
3. 제 1항과 2항에서 전술한 체세포배가 땃두릅나무의 잎, 줄기, 뿌리, 발아된 접합자배의 조직절편을 배양하여 캘러스를 거쳐서 이 캘러스로부터 체세포배를 유도하는 단계 및 캘러스형성과정을 거치지 않고 직접 유도한 것임을 특징으로 하는 방법
4. 제 1항과 2항에서, 땃두릅나무의 잎, 줄기, 뿌리, 발아된 접합자배의 조직절편의 배양으로부터 유도된 체세포배를 지베렐린(1∼200μM)이 첨가된 배지에 이식하여 발아를 유도하고, 이를 1/4, 1/3, 1/2, 1/1 MS배지(설탕의 농도는 1%)에 배양하여 잎, 줄기, 뿌리가 발달된 정상적인 소식물체(유식물체)로 생장시키는 단계, 이 방법이 전술한 체세포배로부터 얻은 유식물체의 절편으로부터 배발생 캘러스 및 2차 체세포배를 유도하는 단계, 이로 얻어진 체세포배로부터 땃두릅나무의 유식물체를 얻는 단계를 포함함을 특징으로 하는 단계 및 이를 반복적으로 하여 체세포배를 유도하고, 나아가 식물체를 반복해서 토양순화하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항에서, 고체 배지가 설탕 1-5%, 한천 0.6-1.0% 및 2.4-D 0.01-7mg/L를 포함하는 MS고체배지를 특징으로 하는 단계 및 유도된 자엽시기의 체세포배를 1∼200 μM 지베렐린을 처리하여 발아시키는 방법.
6. 제 1항에서, 발아된 식물체를 더욱 건실한 식물체로 생장시키기 위하여, 1/4 또는 1/2 로 희석한 뮤라시게와 스쿠그 배지(설탕의 농도는 1%)에 배양하여 잎, 줄기, 뿌리가 발달된 정상적인 소식물체를 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 상기의 과정을 거쳐 얻어진 유식물체를 상토 : 모래: 펄라이트 (1:1:1, v/v)를 함유한 토양에 이식하여 약 1∼3개월 이상 생육시켜 건실한 묘목으로 생장시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.