CN108668893B - 一种绶草种子快速育苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种繁殖绶草的方法，特别涉及一种绶草快速育苗的方法，属于植物组织培养技术领域，包括以下依序进行的步骤：(1)采集阶段：每年5月至6月采集蒴果的绶草果穗备用；(2)装袋：将蒴果及种子装入灭菌袋中；(3)灭菌处理：灭菌袋进行灭菌处理，灭菌好的蒴果及种子放入无菌容器内备用；(4)初代培养阶段：将种子培养至萌发形成原球茎或小芽；(5)继代成苗阶段：将原球茎或小芽接种到继代壮苗与生根培养基中进行继代培养；本发明提供的一种绶草种子快速育苗的方法以绶草种子为繁殖材料，优化育苗步骤；无需经过细胞的脱分化和再分化，并且小苗均由胚发育而来，形成的小苗整齐一致，解决了绶草人工栽培中种苗短缺的难题。
Description
技术领域
本发明涉及一种繁殖绶草的方法，特别涉及一种绶草快速育苗的方法，属于植物组织培养技术领域。
背景技术
绶草(Spiranthes sinensis(Pers.)Ames.)系兰科(Orchidaceae)绶草属(Spiranthes)多年生草本植物。植株高15-50㎝，根数条，指状，肉质，簇生于茎基部。茎较短，近基部生2-4枚叶。叶线形或线状倒披针形，长3.5-15厘米，常宽3-12毫米，顶端渐尖至钝，基部楔形。花茎顶生，长5-20厘米，上部被腺状柔毛至无毛；总状花序具多数密生的花，长4-10厘米，呈螺旋状扭转；花苞片卵状披针形，先端长渐尖，下部的长于子房；子房纺锤形，扭转，被腺状柔毛，连花梗长4-5毫米；花小，紫红色、粉红色或白色，在花序轴上呈螺旋状排生；萼片的下部靠合，中萼片狭长圆形，舟状，长4毫米，宽1.5毫米，先端稍尖，与花瓣靠合呈兜状；侧萼片偏斜，披针形，长5毫米，宽约2毫米，先端稍尖；花瓣斜菱状长圆形，先端钝，与中萼片等长但较薄；唇瓣宽长圆形，凹陷，长4毫米，宽2.5毫米，先端极钝，前半部上面具长硬毛且边缘具强烈皱波状啮齿，唇瓣基部凹陷呈浅囊状，囊内具2枚胼胝体。花期7-8月。(林来官,张永田等.福建植物志[M].福州:福建科学技术出版社,1994,第六卷:641-642)。生于海拔200-3400米的山坡林下、灌丛下、草地或河滩沼泽草甸中，产于全国各省区。(中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1999,17:228-230)。
绶草又名盘龙参，具有益气养阴、润肺止咳、清热解毒之功效。主治病后虚弱、少气乏力、热病津伤口渴，阴虚内热、咳嗽吐血、头晕、遗精等疾病(南京中医药大学.中药大辞典[M].上海:上海科学出版社,2006，下册：3048-3049)。
近几年从绶草的野生资源、保护策略、化学成分等方面均有研究报道(董必慧,杨小兰.滩涂濒危物种绶草的生长利用特性和保护策略[J].江苏农业科学,2006,3:193-195；李家敏.不同产地绶草中总黄酮的含量测定[J].湖北农业科学,2012,51(9):1866-1871；张伟，金传山，周亚伟，等.盘龙参研究进展[J].安徽医药，2010，14(7)：748－750.)。但由于绶草自然更新能力弱、种子发芽率低、自我繁衍能力弱、人工栽培尚处于探索阶段等原因，依赖野生资源的应用已使之濒临濒危，中国《国家重点保护野生植物名录(第二批)》列为二级保护植物。
目前绶草的组培和繁殖主要利用肉质根、幼叶、花序轴、花梗腋芽等为外植体，且这些方法增殖倍数低，且均需经过细胞脱分化和再分化过程，变异率高、成苗速度慢、整齐度差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种绶草种子快速育苗的方法，本发明以绶草的一个蒴果中的成千上万粒种子作为繁殖材料，优化育苗步骤后繁殖效率高，能够在短时间内生产出大量的种苗；小苗直接由种胚萌发，无需经过细胞的脱分化和再分化，成苗速度快，并且小苗均由胚发育而来，所形成的小苗整齐一致。从而本发明解决了绶草人工栽培中种苗短缺的难题。
本发明的技术方案如下：
一种绶草种子快速育苗的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的采集阶段
于每年5月至6月采集带有发育饱满的蒴果的绶草果穗备用；
(2)装袋
将步骤(1)采集的蒴果及从蒴果中脱离的种子装入纱网灭菌袋中；
(3)灭菌处理
将步骤(2)装袋后的袋子连同蒴果及从蒴果中脱离的种子进行灭菌处理，取出灭菌好的蒴果及从蒴果中脱离的种子，放入铺有无菌滤纸的无菌容器内备用；
(4)初代培养阶段
将步骤(3)灭菌处理后的蒴果中的种子剥离出来，并且将从蒴果中剥离出来的种子和从蒴果中脱离的种子共同接种到初代培养基进行初代培养至萌发形成原球茎或小芽；其中，所述的初代培养环境温度为21-25℃，光照强度为2500-3500Lx，光照周期为10-14h/d，培养周期为20-40天；
(5)继代成苗阶段
将步骤(4)初代培养萌发所形成的原球茎或小芽，接种到继代壮苗与生根培养基中进行继代培养；其中，所述的继代培养的培养环境温度为21-25℃，光照强度为3000-4500Lx，光照周期为10-14h/d，培养周期为50-90天。
优选地，步骤(1)外植体的采集阶段中，所述的发育饱满的蒴果为果荚微黄的且即将裂开或刚裂开的蒴果。
优选地，步骤(2)装袋时，每15～30个蒴果装一袋。
优选地，步骤(2)所述的纱网灭菌袋的制备方法为：将长为6-10cm、宽为3-5cm的条形纱网沿长度方向对折，然后将两侧用线固定并留下一侧开口，所述的纱网的目数为100～300目。
进一步地，步骤(3)所述的无菌处理包括以下依序进行的步骤：
①将步骤(2)中所准备的装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋用清水冲洗干净；
②转移到灭菌后的超净工作台上，转入无菌瓶一内，倒入能够淹没整个装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的灭菌袋的无菌水进行冲洗；
③加入体积百分比浓度为70％-74％的酒精直至淹没装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋，灭菌30-45秒，用无菌水进行冲洗；
④倒入质量百分比浓度为0.05-0.15％的升汞直至淹没装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋，再添加3-6ml吐温20到溶液中，灭菌3-6分钟；
⑤最后将装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋转移至干净的无菌瓶二内，用无菌水进行冲洗，取出并放置于盛有无菌滤纸的盘子上，用无菌滤纸吸去纱网灭菌袋表面多余的水分，用无菌镊子解开纱网灭菌袋取出灭菌好的蒴果，放入干燥的无菌瓶三内备用。
进一步地，步骤(4)所述初代培养基为：步骤(4)所述初代培养基为：优化后的MS培养基中加入60-85g/L土豆泥、0.2-0.5g/L花宝1号、0.7-0.9g/L蛋白胨、10-18g/L蔗糖和6-9g/L琼脂，所述的初代培养基的pH值为5.3-5.6。增加花宝1号能促进原球茎的生长。蛋白胨能促进种子萌发和原球茎增大。
进一步地，步骤(4)所述初代培养基为：优化后的MS培养基中加入80g/L土豆泥、0.2-0.5g/L花宝1号和0.7-0.9g/L蛋白胨、16g/L蔗糖、8g/L琼脂，所述的初代培养基的pH值为5.3。
其中，土豆泥为土豆去皮后，将土豆切成0.3-0.5cm的薄片，称量重量后，在适量的水中煮20-25分钟，充分成熟，然后用豆浆机打浆即可；
配制培养基时用自来水代替纯净水，并且加入了土豆泥、花宝1号等成分，因此减去了硫酸铜CuSO4·5H2O、氯化钴CoCl2.6H2O两种成分，简化了配制培养基步骤；
进一步地，步骤(4)所述优化后的MS培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：硝酸铵1645-1655mg/L、硝酸钾1895-1905mg/L、氯化钙435-445mg/L、硫酸镁365-375mg/L、磷酸二氢钾165-175mg/L、碘化钾0.80-0.85mg/L、硼酸6.0-6.5mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/L、硫酸锰22.0-22.5mg/L、硫酸锌8.4-8.8mg/L、钼酸钠0.22-0.27mg/L、硫酸铁27.5-28.0mg/L、VB10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L和肌醇95-105mg/L。
与经典的MS培养基配方相比，省略了硫酸铜CuSO4·5H2O和氯化钴CoCl2.6H2O，不仅降低了生产成本和简化了配制过程，且对发芽率和种子萌动率无不良影响。
进一步，步骤(5)所述继代壮苗与生根培养基为：1/2MS培养基+0.5-1.0mg/L的ABT生根粉2号+65-95g/L的香蕉泥+0.3-0.5g/L活性炭+5-10g/L水解酪蛋白+2-5g/L酵母提取物+10-15g/L蔗糖+6-10g/L琼脂，pH值为6.0-6.2。
采用生根粉能促进生根，水解酪蛋白能促进原球茎分化，增加酵母提取物使小苗粗壮，使用该配方小苗分化整齐、粗壮，97％的原球茎可分化为小苗，无黄化等现象产生。叶片分化后，根系逐步长出，生根率可达93％以上。
1/2MS(即大量元素减半)培养基基本组成如下表所述：
优选地，步骤(5)所述继代壮苗与生根培养基为：1/2MS培养基中加入0.8mg/L的ABT生根粉、65-95g/L的香蕉泥、0.2-0.4g/L活性炭、10g/L水解酪蛋白、5g/L酵母提取物、13g/L蔗糖和9g/L琼脂，所述的继代壮苗与生根培养基的pH值为6.1。
较之前的现有技术，本发明具有以下有益效果：
1)特制灭菌网。本发明以绶草蒴果内种子为外植体，绶草蒴果容易开裂，灭菌难度大，首次应用100-300目纱网袋包装，并对灭菌袋的制作、大小、装入的量进行了描述，灭菌时间短提高了灭菌效率。
2)创建无激素培养基。创建了无任何植物生长调节剂的初代培养基，提高种子萌发率，发芽率可达90％以上，降低因添加生长调节剂不适而导致的畸形苗。
3)创建一体化培养基。创建了继代生根一体化培养基，该培养基除应用少量的生根粉外，尚无用其它植物生长调节剂，所形成小苗整齐一致。
4)创造弱逆境环境。生根培养基中，提高了pH值和增加了琼脂量，增强了培养基硬度，并减低蔗糖的含量，创造弱逆境环境，促进根系萌发，能够快速生产出大量的小苗，并提高小苗移栽成活率。
5)在无菌处理阶段，采用酒精和升汞进行二次灭菌，既能保证处理后的外植体具有较高成活率，又能有效降低外植体的污染率。
6)本发明的优化后的MS培养基与经典的MS培养基配方相比，省略了硫酸铜CuSO4·5H2O和氯化钴CoCl2.6H2O，不仅降低了生产成本和简化了配制过程，且对发芽率和种子萌动率无影响。(因培养基中含量甚微，去掉后，降低了生产成本，简化了配制过程，提高了工人工作效率，但对发芽率无不良影响)
7)继代壮苗与生根培养基使小苗分化整齐、粗壮，97％的原球茎可分化为小苗，无黄化等现象产生。叶片分化后，根系逐步长出，生根率可达93％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步阐述：但是不只仅仅局限于以下实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
以下实施例的各个组分均从市场购买所得。
实施例1
一种绶草种子快速育苗的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的采集阶段
于每年5月至6月采集带有发育饱满的蒴果的绶草果穗备用；
(2)装袋
将步骤(1)采集的蒴果及从蒴果中脱离的种子装入纱网灭菌袋中；
(3)灭菌处理
将步骤(2)的装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋进行灭菌处理后，取出灭菌好的蒴果及从蒴果中脱离的种子，放入铺有无菌滤纸的无菌容器内备用；
(4)初代培养阶段
将步骤(3)无菌处理后的蒴果中的种子剥离出来，并且将从蒴果中剥离出来的种子和从蒴果中脱离的种子接种到初代培养基进行初代培养至萌发形成原球茎或小芽；其中，所述的初代培养环境温度为21-25℃，光照强度为2500-3500Lx，光照周期为10h/d，培养周期为20天；
(5)继代成苗阶段
将步骤(4)初代培养萌发所形成的原球茎或小芽，接种到继代壮苗与生根培养基中进行继代培养；其中，所述的继代培养的培养环境温度为21-25℃，光照强度为3000-4500Lx，光照周期为10h/d，培养周期为50天。
步骤(1)外植体的采集阶段中，所述的发育饱满的蒴果为果荚微黄的且即将裂开或刚裂开的蒴果。
步骤(2)所述的纱网灭菌袋的制备方法为：将长为10cm、宽为5cm的条形纱网沿长度方向对折，然后将两侧用线固定并留下一侧开口，所述的纱网的目数为100目。
步骤(3)所述的无菌处理包括以下依序进行的步骤：
①将步骤(2)中所准备的装有蒴果的纱网灭菌袋用清水冲洗干净；
②转移到灭菌后的超净工作台上，转入无菌瓶一内，倒入能够淹没整个纱网灭菌袋的无菌水，冲洗3次；
③加入体积百分比浓度为70％的酒精直至淹没纱网灭菌袋，灭菌30秒，用无菌水冲洗3次；
④倒入质量百分比浓度为0.05％的升汞直至淹没纱网灭菌袋，再添加3ml吐温20的溶液中灭菌3分钟；
⑤最后转移至干净的无菌瓶二内，用无菌水冲洗3次后，取出并放置于盛有无菌滤纸的盘子上，用无菌滤纸吸去纱网灭菌袋表面多余的水分，用无菌镊子解开纱网灭菌袋取出灭菌好的蒴果，放入干燥的无菌瓶三内备用。
步骤(4)所述初代培养基为：优化后的MS培养基+60g/L土豆泥+0.4g/L花宝1号+0.6g/L蛋白胨+10g/L蔗糖+6g/L琼脂，pH值为5.3。
步骤(5)所述继代壮苗与生根培养基为：1/2MS培养基+0.5mg/L的ABT生根粉2号+65g/L的香蕉泥+0.3g/L活性炭+5g/L水解酪蛋白+2g/L酵母提取物+10g/L蔗糖+6g/L琼脂+0.7g/L蛋白胨，pH值为6.0。
优化后的MS培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：硝酸铵1645mg/L、硝酸钾1895mg/L、氯化钙435mg/L、硫酸镁365mg/L、磷酸二氢钾165mg/L、碘化钾0.80mg/L、硼酸6.0mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.0mg/L、硫酸锰22.0mg/L、硫酸锌8.4-8.8mg/L、钼酸钠0.22mg/L、硫酸铁27.5mg/L、VB10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L和肌醇95mg/L。
本实施例的种子接种到初代培养基上后，10天左右即开始萌动，25天左右，即有原球茎形成。将原球茎接种到继代壮苗培养基上，20天左右，即有明显的叶片分化，35天以后，逐步有根系长出，没有观察到黄化现象发生。
实施例2
一种绶草种子快速育苗的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的采集阶段
于每年5月至6月采集带有发育饱满的蒴果的绶草果穗备用；
(2)装袋
将步骤(1)采集的蒴果及从蒴果中脱离的种子装入纱网灭菌袋中；
(3)灭菌处理
将步骤(2)的装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋进行灭菌处理后，取出灭菌好的蒴果及从蒴果中脱离的种子，放入铺有无菌滤纸的无菌容器内备用；
(4)初代培养阶段
将步骤(3)无菌处理后的蒴果中的种子剥离出来，并且将从蒴果中剥离出来的种子和从蒴果中脱离的种子接种到初代培养基进行初代培养至萌发形成原球茎或小芽；其中，所述的初代培养环境温度为21-25℃，光照强度为2500-3500Lx，光照周期为14h/d，培养周期为40天；
(5)继代成苗阶段
将步骤(4)初代培养萌发所形成的原球茎或小芽，接种到继代壮苗与生根培养基中进行继代培养；其中，所述的继代培养的培养环境温度为21-25℃，光照强度为3000-4500Lx，光照周期为14h/d，培养周期为90天。
步骤(1)外植体的采集阶段中，所述的发育饱满的蒴果为果荚微黄的且即将裂开或刚裂开的蒴果。
步骤(2)所述的纱网灭菌袋的制备方法为：将长为10cm、宽为4cm的条形纱网沿长度方向对折，然后将两侧用线固定并留下一侧开口，所述的纱网的目数为300目。
步骤(3)所述的无菌处理包括以下依序进行的步骤：
①将步骤(2)中所准备的装有蒴果的纱网灭菌袋用清水冲洗干净；
②转移到灭菌后的超净工作台上，转入无菌瓶一内，倒入能够淹没整个纱网灭菌袋的无菌水，冲洗5次；
③加入体积百分比浓度为74％的酒精灭菌45秒，用无菌水冲洗5次；
④倒入质量百分比浓度为0.15％的升汞，再添加6ml吐温20的溶液中灭菌6分钟；
⑤最后转移至干净的无菌瓶二内，用无菌水冲洗5次后，取出并放置于盛有无菌滤纸的盘子上，用无菌滤纸吸去纱网灭菌袋表面多余的水分，用无菌镊子解开纱网灭菌袋取出灭菌好的蒴果，放入干燥的无菌瓶三内备用。
步骤(4)所述初代培养基为：优化后的MS培养基+85g/L土豆泥+0.2g/L花宝1号+18g/L蔗糖+9g/L琼脂+0.9g/L蛋白胨，pH值为5.6。
步骤(5)所述继代壮苗与生根培养基为：1/2MS培养基+1.0mg/L的ABT生根粉2号+95g/L的香蕉泥+0.5g/L活性炭+10g/L水解酪蛋白+5g/L酵母提取物+15g/L蔗糖+10g/L琼脂，pH值为6.2。
优化后的MS培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：硝酸铵1655mg/L、硝酸钾1905mg/L、氯化钙445mg/L、硫酸镁375mg/L、磷酸二氢钾175mg/L、碘化钾0.85mg/L、硼酸6.5mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.5mg/L、硫酸锰22.5mg/L、硫酸锌8.8mg/L、钼酸钠0.27mg/L、硫酸铁28.0mg/L、VB10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L和肌醇105mg/L。
本实施例的种子接种到初代培养基上后，10天左右即开始萌动，25天左右，即有原球茎形成。将原球茎接种到继代壮苗培养基上，20天左右，即有明显的叶片分化，35天以后，逐步有根系长出，没有观察到黄化现象发生。
实施例3(最佳实施例)
一种绶草快速育苗的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)外植体的采集阶段
于每年5月至6月采集带有发育饱满的蒴果的绶草果穗备用；
(2)装袋
将步骤(1)采集的蒴果及从蒴果中脱离的种子装入纱网灭菌袋中；
(3)灭菌处理
将步骤(2)装袋后的袋子连同蒴果及从蒴果中脱离的种子进行灭菌处理后，取出灭菌好的蒴果及从蒴果中脱离的种子，放入铺有无菌滤纸的无菌容器内备用；
步骤(1)外植体的采集阶段中，所述的发育饱满的蒴果为果荚微黄的且即将裂开或刚裂开的蒴果。
步骤(2)装袋时，每15～30个蒴果装一袋。
步骤(2)所述的纱网灭菌袋的制备方法为：将长为6-10cm、宽为3-5cm的条形纱网沿长度方向对折，然后将两侧用线固定并留下一侧开口，所述的纱网的目数为100～300目。
步骤(3)所述的无菌处理包括以下依序进行的步骤：
①将步骤(2)中所准备的装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋用清水冲洗干净；
②转移到灭菌后的超净工作台上，转入无菌瓶一内，倒入能够淹没整个装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋的无菌水进行冲洗；
③加入体积百分比浓度为70％-74％的酒精直至淹没装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋，灭菌30-45秒，用无菌水进行冲洗；
④倒入质量百分比浓度为0.05-0.15％的升汞直至淹没装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋，再添加3-6ml吐温20到溶液中，灭菌3-6分钟；
⑤最后将装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋转移至干净的无菌瓶二内，用无菌水进行冲洗，取出并放置于盛有无菌滤纸的盘子上，用无菌滤纸吸去纱网灭菌袋表面多余的水分，用无菌镊子解开纱网灭菌袋取出灭菌好的蒴果，放入干燥的无菌瓶三内备用。
(4)初代培养阶段
将步骤(2)中无菌处理好的外植体，接种到初代培养基进行初代培养；培养环境温度为23±2℃，光照强度为2500-3000Lux，光照周期为12h/d，培养周期为30天；
所述初代培养基为：MS培养基(优化)+80g/L土豆泥+0.5g/L花宝1号+16g/L蔗糖+8g/L琼脂+0.8g/L蛋白胨，pH值为5.3；
(5)继代成苗培养阶段
将步骤(3)中初代培养后萌发的原球茎和小芽，接种到继代培养基中进行继代壮苗培养和生根；培养环境温度为23±2℃，光照强度为3500-4000Lux，光照周期为12h/d，培养周期为70天；
所述继代壮苗培养基为：1/2MS培养基+0.8mg/L生根粉+0.4g/L活性炭+70g/L香蕉泥+10g/L水解酪蛋白+5g/L酵母提取物+13g/L蔗糖+9g/L琼脂，pH值为6.1；
本实施例的种子接种到初代培养基上后，10天左右即开始萌动，25天左右，即有原球茎形成。将原球茎接种到继代壮苗培养基上，20天左右，即有明显的叶片分化，35天以后，逐步有根系长出，没有观察到黄化现象发生。
上述具体实施方式只是对本发明的技术方案进行详细解释，本发明并不只仅仅局限于上述实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种绶草种子快速育苗的方法，其特征在于：所述的方法包括以下依序进行的步骤：
（1）外植体的采集阶段
于每年5月至6月采集带有发育饱满的蒴果的绶草果穗备用；所述的发育饱满的蒴果为果荚微黄的且即将裂开或刚裂开的蒴果；
（2）装袋
将步骤（1）采集的蒴果及从蒴果中脱离的种子装入纱网灭菌袋中；
（3）灭菌处理
将步骤（2）的装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋进行灭菌处理，取出灭菌好的蒴果及从蒴果中脱离的种子，放入铺有无菌滤纸的无菌容器内备用；
（4）初代培养阶段
将步骤（3）灭菌处理后的蒴果中的种子剥离出来，并且将从蒴果中剥离出来的种子和从蒴果中脱离的种子共同接种到初代培养基进行初代培养至萌发形成原球茎或小芽；其中，所述的初代培养环境温度为21-25℃，光照强度为2500-3500Lx，光照周期为10-14 h/d，培养周期为20-40天；
（5）继代成苗阶段
将步骤（4）初代培养萌发所形成的原球茎或小芽，接种到继代壮苗与生根培养基中进行继代培养；其中，所述的继代培养的培养环境温度为21-25℃，光照强度为3000-4500Lx，光照周期为10-14 h/d，培养周期为50-90天；
步骤（4）所述初代培养基为：优化后的MS培养基中加入60-85 g/L 土豆泥、0.2-0.5g/L花宝1号、0.7-0.9g/L蛋白胨、10-18 g/L蔗糖和6-9 g/L琼脂，所述的初代培养基的pH值为5.3-5.6；
步骤（4）所述优化后的MS培养基由以下组分按照以下质量浓度配制而成：硝酸铵1645-1655mg/L、硝酸钾1895-1905mg/L、氯化钙435-445mg/L、硫酸镁365-375mg/L、磷酸二氢钾165-175mg/L、碘化钾0.80-0.85mg/L、硼酸6.0-6.5mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/L、硫酸锰22.0-22.5mg/L、硫酸锌8.4-8.8mg/L、钼酸钠0.22-0.27mg/L、硫酸铁27.5-28.0mg/L、VB10.1mg/L、烟酸0.5mg/L、VB60.5mg/L、甘氨酸2.0mg/L和肌醇95-105mg/L；
步骤（5）所述继代壮苗与生根培养基为：1/2 MS培养基中加入0.5-1.0mg/L 的ABT生根粉、65-95g/L的香蕉泥、0.2-0.5g/L活性炭、5-10g/L水解酪蛋白、2-5g/L酵母提取物、10-15g/L蔗糖和6-10g/L琼脂，所述的继代壮苗与生根培养基的pH值为6.0-6.2。
2.根据权利要求1所述的一种绶草种子快速育苗的方法，其特征在于：步骤（2）装袋时，每15~30个蒴果装一袋。
3.根据权利要求1所述的一种绶草种子快速育苗的方法，其特征在于：
步骤（2）所述的纱网灭菌袋的制备方法为：将长为6-10cm、宽为3-5cm的条形纱网沿长度方向对折，然后将两侧用线固定并留下一侧开口，所述的纱网的目数为100~300目。
4.根据权利要求1所述的一种绶草种子快速育苗的方法，其特征在于：
步骤（3）所述的灭菌处理包括以下依序进行的步骤：
①将步骤（2）中所准备的装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋用清水冲洗干净；
②转移到灭菌后的超净工作台上，转入无菌瓶一内，倒入能够淹没整个装有蒴果和从蒴果中脱离的种子的灭菌袋的无菌水进行冲洗；
③加入体积百分比浓度为70%-74%的酒精直至淹没装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋，灭菌30-45秒，用无菌水进行冲洗；
④倒入质量百分比浓度为0.05-0.15%的升汞直至淹没装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋，再添加3-6ml吐温20到溶液中，灭菌3-6分钟；
⑤最后将装有蒴果及从蒴果中脱离的种子的纱网灭菌袋转移至干净的无菌瓶二内，用无菌水进行冲洗，取出并放置于盛有无菌滤纸的盘子上，用无菌滤纸吸去纱网灭菌袋表面多余的水分，用无菌镊子解开纱网灭菌袋取出灭菌好的蒴果，放入干燥的无菌瓶三内备用。
5.根据权利要求1所述的一种绶草种子快速育苗的方法，其特征在于：步骤（5）所述继代壮苗与生根培养基为：1/2 MS培养基中加入0.8mg/L 的ABT生根粉、65-95g/L的香蕉泥、0.2-0.4g/L活性炭、10g/L水解酪蛋白、5g/L酵母提取物、13g/L蔗糖和9g/L琼脂，所述的继代壮苗与生根培养基的pH值为6.1。
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