CN101773073B - 紫背天葵人工种子的制作方法 - Google Patents

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本发明属于植物人工种子生产技术领域，涉及一种紫背天葵人工种子的制作方法。具体涉及紫背天葵球茎的诱导体系的建立，紫背天葵人工种子的人工种皮包埋基质，人工胚乳及人工种子萌发基质的制备，为紫背天葵规模化人工栽培开辟了新的途径。本发明解决了紫背天葵种苗来源问题，避免了对野生植物资源的破坏，材料易于获得、工艺流程简单、不受季节影响，繁殖速度快，成活率高。

Description

紫背天葵人工种子的制作方法
技术领域
本发明属于植物人工种子生产技术领域，涉及一种紫背天葵人工种子的制作方法。
背景技术
紫背天葵(Begonia fimbristipula Hance)，据《中国植物志》记载为秋海棠科植物，分布于我国广东、广西、福建和江西等地，模式标本采自广东鼎湖山和罗浮山(中国植物志(第五十二卷第一分册)1999，190-192)。它可作为中药使用，内用于中暑发热、淋巴结核、肺热咳嗽、咯血、肺炎、慢性支气管炎、咽喉肿痛。外用于血瘀腹痛、扭挫伤、骨折、烧伤等。同时紫背天葵还含有丰富的红色素，被用于开发出多种紫背天葵的饮品和食品，如紫背天葵茶、紫背天葵软糖、紫背天葵饮料等以紫背天葵为主要原料的各类产品层出不穷，使紫背天葵的使用量迅速大量增加。由于紫背天葵对生态环境要求严格，多锲生于悬崖石壁，数量稀少、生长缓慢(一年只长一片叶子)，自然繁殖系数低。再加上长期采挖野生紫背天葵，自然资源已日益缺乏，现已被列为珍稀保护植物(植物学报，1983，25(3)：238-244；现代农业科技，2008，36(24)：23-24)。
通过用组织培养的方法进行繁殖，能够实现紫背天葵人工栽培，可解决野生资源日益短缺的问题，避免野生紫背天葵的破坏性开采，满足人们生活中对紫背天葵的需求。同时，为紫背天葵的药用研究和大规模综合开发利用提供了基础条件。然而通过常规组织培养获得的再生植株移栽成活困难，影响成活率的因素多样，可控性差，成活率一直不稳定。
人工种子(artificial seeds)是指将植物离体培养中产生的体细胞胚或能发育成完整植株的分生组织(球茎、芽、愈伤组织、胚状体等)包埋在含有营养物质和具有保护功能的外壳内形成的，在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。人工种子在本质上属于无性繁殖，与天然种子相比，它具有繁殖速度快生产周期短，可工厂化大规模制备、贮藏、迅速推广、生产不受季节限制等优点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种紫背天葵人工种子的制作方法，有效解决紫背天葵野生资源日益短缺的问题，满足人们生活中对紫背天葵的需求，材料易于获得、工艺流程简单、不受季节影响、繁殖速度快、成活率高、成本低廉。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
1、紫背天葵球茎的诱导
将新鲜的野生紫背天葵叶片洗净、充分消毒后，剪成1cm×1cm的叶片切块，无菌环境下将其接种在球茎诱导培养基上，培养基组成为MS+3％蔗糖+0.7％琼脂+激素。在23±1℃、每日16光照，光照强度1600Lux条件下培养，30天后分化出球茎。
2、用紫背天葵球茎作为人工种子繁殖体，以MS+2％海藻酸钠+激素+3％蔗糖为人工胚乳成分即包埋剂，2％海藻酸钠+0.5-1.5g/L CaCl2为人工种皮基质，即得人工种子，然后置于MS培养基上萌发。
具体如下：
(1)MS(Murashige和SKoog)成分：
大量元素：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L；
微量元素：MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·4H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L；
铁盐：Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L；
有机成分：甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L；
(2)培养基所含激素种类：6-苄基氨基嘌呤(简称6-BA)、萘乙酸(简称NAA)、赤霉素(简称GA3)、水解乳蛋白(简称LH)、酸水解酪蛋白(简称CH)、酵母提取物(简称YE)。
培养基中诱导不定芽的激素和有机附加物配比如下：
6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+LH、CH和YE各200.0mg/L；
(3)培养基配比方式为：
MS+3％蔗糖+0.7％琼脂+激素+有机附加物
(4)包埋剂所含激素种类：6-BA、GA3
包埋剂的激素配比：0-1.5mg/L 6-BA+0-1.5mg/L GA3
(5)包埋剂配比方式为：
2％海藻酸钠+MS+3％蔗糖+激素，pH为5.8-6.2。
3、在超净工作台内，将诱导出来的球茎用镊子置于盛2％海藻酸钠+MS+3％蔗糖+0-1.5mg/L 6-BA+0或0.5-1.5mg/L GA3的包埋液，即人工胚乳中，用玻璃棒搅拌使球茎和包埋液充分混合；
4、10-15分钟后，用滴管将含有球茎的包埋液滴入0.5％-1.5％的CaCl2中，经过15-30分钟的离子交换反应即形成白色、半透明且具一定硬度的类似胶囊丸的人工种子；
5、用无菌水浸泡15-20分钟，捞出，即得紫背天葵人工种子。
本发明得到的人工种子可置于MS培养基上萌发，培养条件优选为：23±1℃、每日16小时光照，光照强度1600Lux。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：首先克服了常规种子繁殖效率低的问题，其次解决了常规组织培养再生植株移栽成活率低，成活率不稳定的问题。这项发明成果不仅为挽救保护植物紫背天葵提供了技术保障，为其他濒危难繁物种的保存提供了参考依据，也为该类药用植物规模化人工种植所需种子种苗的生产提供了新的途径。
附图说明
图1为制作紫背天葵人工种子的流程图。
图中，A为人工胚乳，B为球茎，C为镊子，D为CaCl2溶液，E为人工种子，F为滤网。
具体实施方式
实施例一：紫背天葵人工种子的制作
1、紫背天葵球茎的诱导
将新鲜的野生紫背天葵叶片洗净、充分消毒后，剪成1cm×1cm的叶片切块，无菌环境下将其接种在球茎诱导培养基上，培养基组成为MS+3％蔗糖+0.7％琼脂+激素。在23±1℃、每日16光照，光照强度1600Lux条件下培养，30天后分化出球茎。
2、用紫背天葵球茎作为人工种子繁殖体，以MS+2％海藻酸钠+激素+3％蔗糖为人工胚乳成分即包埋剂，2％海藻酸钠+0.5-1.5g/L CaCl2为人工种皮基质，即得人工种子，然后置于MS培养基上萌发。
具体如下：
(1)MS(Murashige和SKoog)成分：
大量元素：KNO3为1900mg/L，NH4NO3为1650mg/L，MgSO4·7H2O为370mg/L，KH2PO4为170mg/L，CaCl2·2H2O为440mg/L；
微量元素：MnSO4·4H2O为22.3mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6mg/L，H3BO3为6.2mg/L，KI为0.83mg/L，NaMoO4·4H2O为0.25mg/L，CuSO4·5H2O为0.025mg/L，CoCl2·6H2O为0.025mg/L；
铁盐：Na2-EDTA为37.3mg/L，FeSO4·4H2O为27.8mg/L；
有机成分：甘氨酸为2.0mg/L，盐酸硫胺素为0.1mg/L，盐酸吡哆醇为0.5mg/L，烟酸为0.5mg/L，肌醇为100mg/L；
(2)培养基所含激素种类：6-苄基氨基嘌呤(简称6-BA)、萘乙酸(简称NAA)、赤霉素(简称GA3)、水解乳蛋白(简称LH)、酸水解酪蛋白(简称CH)、酵母提取物(简称YE)。
培养基中诱导不定芽的激素和有机附加物配比：
6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+LH、CH和YE各200.0mg/L；
(3)培养基配比方式为：
MS+3％蔗糖+0.7％琼脂+激素+有机附加物
(4)包埋剂所含激素种类：6-BA、GA3
包埋剂的激素配比：0-1.5mg/L 6-BA+0-1.5mg/L GA3
(5)包埋剂配比方式为：
2％海藻酸钠+MS+3％蔗糖+激素，pH为5.8-6.2。
3、在超净工作台内，将诱导出来的球茎用镊子置于盛2％海藻酸钠+MS+3％蔗糖+0-1.5mg/L 6-BA+0或0.5-1.5mg/L GA3的包埋液，即人工胚乳中，用玻璃棒搅拌使球茎和包埋液充分混合；
4、10-15分钟后，用滴管将含有球茎的包埋液滴入0.5％-1.5％的CaCl2中，经过15-30分钟的离子交换反应即形成白色、半透明且具一定硬度的类似胶囊丸的人工种子；
5、用无菌水浸泡15-20分钟，捞出，即得紫背天葵人工种子。
本发明得到的人工种子可置于MS培养基上萌发，培养条件优选为：23±1℃、每日16小时光照，光照强度1600Lux。
实施例二：紫背天葵人工种子的比较实验
本发明所述的紫背天葵人工种子的制作方法中，包埋剂(人工胚乳)成分中选用的激素为6-BA和GA3，有助于植物生根发芽，为探究两种激素分别在该人工种子萌发中所起作用，进行了以下比较实验，结果如表一：
表一
  序号   激素配比   人工种子萌发情况
  1   0mg/L 6-BA+0mg/L GA3   为实验空白对照
  2   0mg/L 6-BA+1.5mg/L GA3   培养约30天后，人工种子开始萌发、长根，萌发率为68.92％
  3   1.5mg/L 6-BA+0mg/L GA3   经过约30天的培养，人工种子萌发良好，萌发率约为71.59％。
  4   0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3   人工种子的萌发率为27.20％
  5   1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L GA3   人工种子的萌发率为69.14％
  6   1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L GA3   人工种子的萌发率为78.16％
从上表可见，在实验例2和3中，包埋剂所含激素中6-BA和GA3浓度均为1.5mg/L时，单独对人工种子的萌发的效果相近。在实验例4中，包埋剂激素中6-BA与GA3浓度均为0.5mg/L，效果不是很明显。在实验例5中加大两种激素的浓度，两者浓度均为1.0mg/L，增加浓度后效果明显改变。在实施例6中包埋剂激素6-BA和GA3浓度均增加到1.5mg/L，结果证明，在此浓度中人工种子的萌发效果有所提高。
实施例三：紫背天葵人工种子的比较实验
通过实施例二表明，在人工种子中，包埋剂激素浓度变化会引起种子萌发的改变。本实施例的目的是探究人工种皮基质中CaCl2浓度的改变是否也影响人工种子萌发，进行了以下实验：球茎和包埋液充分混合后，在超净工作台内，用镊子将含球茎的包埋液夹入1.0％的CaCl2中，进行15-30分钟的离子交换反应。结果如表二
表二
  序号   激素配比   人工种子萌发情况
  1   0mg/L 6-BA+0mg/L GA3   为实验空白对照
  2   0mg/L 6-BA+1.5mg/L GA3   培养约30天后，人工种子开始萌发、长根，萌发率为73.91％
  3   1.5mg/L 6-BA+0mg/L GA3   经过约30天的培养，人工种子萌发良好，萌发率约为80％。
  4   0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3   人工种子的萌发率为50％
  5   1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L GA3   人工种子的萌发率为74.19％
  6   1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L GA3   人工种子的萌发率为89.66％
球茎和包埋液充分混合后，在超净工作台内，用镊子将含球茎的包埋液夹入1.5％的CaCl2中，进行15-30分钟的离子交换反应。结果如表三
表三
  序号   激素配比   人工种子萌发情况
  1   0mg/L 6-BA+0mg/L GA3   为实验空白对照
  2   0mg/L 6-BA+1.5mg/L GA3   培养约30天后，人工种子开始萌发、长根，萌发率为59.10％
  3   1.5mg/L 6-BA+0mg/L GA3   经过约30天的培养，人工种子萌发良好，萌发率约为56.67％。
 4   0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L GA3   人工种子的萌发率为25％
 5   1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L GA3   人工种子的萌发率为51.70％
 6   1.5mg/L 6-BA+1.5mg/L GA3   人工种子的萌发率为70％
从表二和表三可见，在例1中用1.0％的CaCl2浸泡含球茎的包埋液，在例2中提高CaCl2的浓度为1.5％。经过培养后显示，1.0％和1.5％CaCl2的人工种皮基质中，人工种子萌发效果相差不大。

Claims (3)

1.一种紫背天葵人工种子的制作方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)紫背天葵球茎的诱导：将新鲜的野生紫背天葵叶片洗净、充分消毒后，剪成1cm×1cm的叶片切块，无菌环境下将其接种在诱导球茎的培养基上，在23±1℃、每日16小时光照，光照强度1600Lux条件下培养，30天后分化出球茎；上述诱导培养基包括：MS、3％蔗糖、0.7％琼脂、2.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸、200mg/L水解乳蛋白、200mg/L酸水解酪蛋白和200mg/L酵母提取物；
(2)人工胚乳的制备：在超净工作台内，将诱导出来的球茎用镊子置于人工胚乳中，用玻璃棒搅拌使球茎和人工胚乳充分混合，即可完成人工胚乳制备；所述人工胚乳包括：MS、2％海藻酸钠、3％蔗糖、0-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0-1.5mg/L赤霉素；
(3)人工种皮的制备：球茎和人工胚乳混合10-15分钟后，用滴管将含有球茎的人工胚乳滴入0.5-1.5％的CaCl2中，经过15-30分钟的离子交换反应即形成白色、半透明且具一定硬度的类似胶囊丸的人工种子；
(4)人工种子的获得：用无菌水浸泡15-20分钟，用滤网捞出，即得紫背天葵人工种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤(1)所用材料为新鲜的野生紫背天葵叶片诱导球茎培养基，该培养基包括：MS、2.0mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0.2mg/L萘乙酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中胚乳成分为：2％海藻酸钠、MS、3％蔗糖、0-1.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤、0或0.5-1.5mg/L赤霉素。
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