CN110786235A - 紫点杓兰种子无菌萌发的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了紫点杓兰种子无菌萌发的方法，获取紫点杓兰授粉后发育50‑60天的果实，消毒后从果实中取出种子，播种在改良HA培养基表面，于25±2℃暗培养进行无菌萌发。本发明通过紫点杓兰物候学及种子胚胎学研究，确定了紫点杓兰的物候特征、果实和种子的生物学特征，为无菌萌发体系中种子的最佳采收期及成熟种子萌发困难的原因提供了理论基础；通过探究采种时间、培养基种类对紫点杓兰种子萌发率的影响，为杓兰属植物无菌萌发体系的优化、缩短育种周期及野生资源保育提供技术支持。

Description

紫点杓兰种子无菌萌发的方法

技术领域

本发明涉及组培技术，具体地说，涉及紫点杓兰种子无菌萌发的方法。

背景技术

紫点杓兰(Cypripedium guttatum SW.)隶属于兰科杓兰属(Cypripedium,Orchidaceae)，为国家Ⅰ级重点保护植物。其种子缺少胚乳，自然条件下萌发率极低。

有性生殖是被子植物生长发育过程中的重要阶段，果实是胚珠形成和发育的场所，胚珠的正常发育是种胚和种子发育的前提。目前，国内外开展了多种兰科植物的胚胎学研究，如大花杓兰、台湾杓兰、铁皮石斛和杏黄兜兰等，并以此为基础成功优化了相应兰科植物的无菌萌发体系。但受研究材料稀少及不易获取等因素的影响，紫点杓兰的相关研究尚属空白，这在很大程度上限制了其物种保护与资源开发。据研究报道，地生的杓兰属植物种子成熟时其由于种皮脱水及膜质内种皮紧密包裹种胚，而限制种子从培养基中吸收水分和营养，导致成熟种子在无菌培养基上的萌发率显著低于未成熟的种子。

发明内容

本发明的目的是提供紫点杓兰种子无菌萌发的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的紫点杓兰种子无菌萌发的方法，获取紫点杓兰授粉后发育50-60天(优选60天)的果实，消毒后从果实中取出种子，播种在改良HA培养基表面，于25±2℃暗培养进行无菌萌发。

所述改良HA培养基是以Harvais改良培养基为基础培养基，向其中添加蔗糖、活性炭和马铃薯汁配制而成，其中蔗糖、活性炭和马铃薯汁的终浓度分别为20g/L、0.5g/L和200mL/L。其中，所述马铃薯汁是将新鲜马铃薯去皮切块后与水按照1:1的重量比混合，煮沸过滤得到的；煮沸前将混合体系的pH值调至5.5。

所述Harvais改良培养基是将Harvais培养基中的NH₄NO₃去除，添加2.0mg/L甘氨酸，100mg/L谷氨酰胺及500mg/L酪蛋白水解物配制而成。

前述的方法，紫点杓兰果实的消毒方法为：用洗洁精清洗果实表面，流水冲洗30min；然后在超净工作台中依次用75％酒精处理30s，用2％次氯酸钠溶液处理10min，无菌水冲洗(冲洗5次，每次2min)。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过紫点杓兰物候学及种子胚胎学研究，确定了紫点杓兰的物候特征、果实和种子的生物学特征，为无菌萌发体系中种子的最佳采收期及成熟种子萌发困难的原因提供了理论基础；通过探究采种时间、培养基种类对紫点杓兰种子萌发率的影响，为杓兰属植物无菌萌发体系的优化、缩短育种周期及野生资源保育提供技术支持。

采种时间及培养基种类对紫点杓兰种子的萌发率影响较大，(1)45DAP种子未见萌发；50DAP种子萌发率开始上升，至60DAP种子萌发率最高，为58.96％±7.87％，此时种胚发育至球形胚阶段，易于播种操作；随着种子成熟，萌发率迅速降低，成熟种子萌发率仅为3.06％±1.34％(80DAP)。(2)改良HA培养基上种子萌发率最高，原球茎生长一致。综合考虑紫点杓兰种子发育特征和年际物候变化，50～60DAP的种子为紫点杓兰种子无菌萌发的最佳采种时间，改良HA培养基为种子无菌萌发的最适培养基。

附图说明

图1为本发明实施例1中紫点杓兰生长过程。(a)：示花苞(箭头)；(b)：示花序轴及膨大的花苞；(c)：示完全开放的花；(d)：示未授粉的子房(箭头)及全花；(e)：示10DAP的子房(箭头)；(f)：示15DAP的子房(箭头)；(g)：示30DAP的蒴果；(h)：示40DAP的蒴果；(i)：示50DAP的蒴果；(j)：60DAP，示蒴果及正在枯萎的叶片；(k)：示70DAP的蒴果；(l)：80DAP，示开裂的蒴果(箭头)，叶子完全枯萎。

图2为本发明实施例1中紫点杓兰果实和种子发育过程。(a)：0DAP，示胎座与颗粒状凸起，比例尺＝1mm；(b)：10DAP，颗粒状凸起逐渐充满子房，比例尺＝1mm；(c)：20DAP，示颗粒状凸起分化形成种子，比例尺＝1mm；(d)：30DAP，示椭圆形种子，比例尺＝500μm；(e)：35DAP，示长梭形的种子，比例尺＝1mm；(f)：40DAP，示种子体积增大，种皮上条纹清晰，比例尺＝500μm；(g)：45DAP，大部分种子种皮变为褐色，比例尺＝500μm；(h)：50DAP，示褐色种子，比例尺＝500μm：(i)：55DAP，种子微失水，比例尺＝1mm；(j)：60DAP，多数种子易从胎座上脱离，比例尺＝1mm；(k)：70DAP，示种子与胎座完全脱离，比例尺＝1mm；(l)：80DAP，示成熟种子，种皮呈深褐色，种子粉末状，比例尺＝2mm。

图3为本发明实施例1中紫点杓兰雌配子体发育过程。(a)：0DAP，示已发育的胎座，比例尺＝500μm；(b)：10DAP，示指状突起及孢原细胞(箭头)，比例尺＝100μm；(c)：10DAP，示内珠被开始分化，比例尺＝30μm；(d)：15DAP，示大孢子母细胞减数分裂第一次分裂前期，比例尺＝30μm；(e)：15DAP，示大孢子母细胞减数分裂第一次分裂后期，比例尺＝30μm；(f)：15DAP，示二分体，比例尺＝30μm；(g)：15DAP，示二分体珠孔端细胞体积缩小，比例尺＝30μm；(h)：15DAP，示珠孔端二分体细胞退化(箭头)，合点端细胞体积增大，比例尺＝30μm；(i)：20DAP，示二核胚囊及退化的珠心细胞，比例尺＝50μm；(j)：20DAP，示四核胚囊，比例尺＝20μm；(k)：25DAP，示珠孔端两个核进行有丝分裂，合点端两个核在分裂过程中融合形成一个大的纺锤体，比例尺＝30μm；(l)：30DAP，示卵器，比例尺＝50μm。

图4为本发明实施例1中紫点杓兰胚胎发育过程(a)：30DAP，示合子及复合核，比例尺＝50μm；(b)：30DAP，示合子，比例尺＝50μm；(c)：30DAP，示合子第一次有丝分裂后期，比例尺＝50μm；(d)：30DAP，示2细胞胚，箭头示顶细胞和基细胞，比例尺＝100μm；(e)：30DAP，示3细胞胚，比例尺＝50μm；(f)：30DAP，示T型胚，比例尺＝50μm；(g)：35DAP，示原胚，比例尺＝50μm；(h)：40DAP，示早期球形胚，比例尺＝50μm；(i)：40DAP，早期球形胚体积增大，比例尺＝50μm；(j)：40DAP，示内外种皮间的空气腔，比例尺＝100μm；(k)：45DAP，示体积增大的球形胚，比例尺＝50μm；(l)：50DAP，示球形胚，比例尺＝50μm；(m)：60DAP，示球形胚，比例尺＝50μm；(n)：70DAP，示晚期球形胚及干膜质内种皮，比例尺＝50μm；(o)：80DAP，示成熟种子，比例尺＝50μm。

图5为本发明实施例2中紫点杓兰不同发育时期果实及种子形态特征。(a)：45DAP，示果实横切面及种子形态；(b)：50DAP，示果实横切面及种子形态；(c)：60DAP，示果实纵切面及种子形态；(d)：70DAP，示果实纵切面及种子形态；(e)：80DAP，示成熟果实及种子。

图6为本发明实施例2中不同发育时期紫点杓兰种子活力。(a)：示45DAP种子活力，比例尺＝500μm；(b)：示50DAP种子活力，比例尺＝500μm；(c)：示60DAP种子活力，比例尺＝500μm；(d)：示70DAP种子活力，比例尺＝500μm；(e)：示80DAP种子活力，比例尺＝500μm。

图7为本发明实施例2中不同发育时期紫点杓兰种子萌发率。

图8为本发明实施例2中不同发育时期紫点杓兰种子在改良HA培养基上的萌发情况。

图9为本发明实施例2中不同培养基上紫点杓兰种子萌发率。图中数值＝平均值±标准差。各柱形图上不同大写字母表示种子萌发率在0.01水平上差异显著(N＝10)

图10为本发明实施例2中不同培养基上紫点杓兰种子萌发情况(50DAP)。(a)：种子在改良HA培养基上萌发40d的培养情况；(b)：种子在1/4MS培养基上萌发40d的培养情况；(c)：种子在KC培养基上萌发40d的培养情况。

图11为本发明实施例2中紫点杓兰无菌苗在改良HA培养基上的生长过程。(a)：萌发后60d的原球茎；(b)：萌发后150d的无菌苗；(c)：萌发后240d的无菌苗。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例使用的培养基配方如下：

实施例1 紫点杓兰物候学及胚胎学研究

1.试验材料与方法

1.1试验地点与材料

紫点杓兰居群分布于大海陀国家级自然保护区，大海陀国家级自然保护区位于河北省张家口市赤城县南部(115°42’57”～115°57’E，40°32’14”～40°41’40”N)，地处海陀山西北麓，与北京松山国家级自然保护区相连。大海陀地属暖温带大陆性季风气候，植被垂直分布明显，主峰海拔2241m，海拔1800m以上为亚高山草甸，以多年生草本植物为主，主要树种为华北落叶松及白桦等，雨季集中在7月份，早霜始于9月下旬，年平均气温5.5℃，最热月7月平均气温21℃。此处居群植株分布较为隐蔽，植株未被破坏且分布集中。

试验材料选择紫点杓兰居群中的健壮成年植株，花期对中萼片与唇瓣刚分开的初花期花朵进行人工授粉，并进行套袋处理，待果实开始发育后摘除。每间隔5d采集3个不同成熟度的果实用于试验，直至果实成熟开裂。

1.2试验方法

1.2.1物候观察

2016年6月至2017年9月，观察紫点杓兰植株生长状态及人工授粉后子房发育过程，并用相机拍照记录。

1.2.2体视显微镜观察

用双面刀片将果实横切成厚度约1cm的组织块，置于体视显微镜(Leica DFC500)下观察果实和种子形态特征并拍照。

1.2.3常规石蜡切片观察

去掉上述组织块的果皮，只保留约0.5cm³左右的种子团，置于装有FAA的安玻瓶中，反复抽真空以保证固定液完全浸入到种子团中。4℃固定24h后，经过系列酒精脱水，透明，浸蜡，包埋，切片，番红固绿染色等常规石蜡切片步骤连续切片和制片，光学显微镜(Leica DM2500)下观察切片并拍照。

2.结果与分析

2.1紫点杓兰物候特征

紫点杓兰居群位于大海坨国家级自然保护区海拔1800m以上的亚高山草甸，成年植株高15～20cm。6月上旬，植株株高约10cm，开始出现花苞(图1，a)。约2～3d，花序轴抽出，密被短柔毛和腺毛，花苞继续生长变大(图1，b)。约4～5d后，紫点杓兰花开放，单生，白色，上具淡紫红色斑点，唇瓣深囊状(图1，c)。未授粉时子房长棒状，花柄和子房长1～1.5cm，子房被腺毛(图1，d)。授粉后10d(10days after pollination,10DAP)，子房开始发育，此时花朵仍与子房相连(图1，e)；15DAP花完全枯萎，只留下不断膨大的子房(图1，f)；30DAP果实迅速生长，下垂的果实中部膨大并较两端粗，整体呈梭形，果皮嫩绿色，具果棱(图1，g)；40DAP果实膨大明显，整体呈椭圆形(图1，h)；50DAP果实体积增大，果皮颜色加深至深绿色，果皮及叶片上开始出现褐色斑点(图1，i)；60DAP果实体积不再增大，叶片边缘开始发黄并枯萎(图1，j)；70DAP果皮上斑点逐渐扩展，植株枯萎程度增加，叶片边缘枯萎卷曲(图1，k)；80DAP果实完全成熟，果皮呈黑褐色，因干燥失水，果实体积减小并逐渐开裂，叶片及花序轴呈黑色，植株完全枯萎(图1，l)。

2.2果实及种子生长发育过程

未授粉的紫点杓兰子房细长，三心皮，侧膜胎座，横切子房可见3个胎座上有许多颗粒状的白色突起，子房室中间留有较大空隙，子房壁被腺毛(图2，a)。10DAP子房体积增大，横切子房可见胎座上颗粒状突起增多，几乎填满整个子房(图2，b)。20DAP颗粒状突起颜色变为白色，逐渐分化并形成种子(图2，c)。30DAP种子体积增大，形状从圆形逐渐变为椭圆形，种皮上开始出现细条纹，种子与胎座结合紧密，种子湿润呈团状(图2，d)。35DAP种子纵径明显增加，整体呈两头尖中间宽的长梭形，种子白色，种皮条纹明显(图2，e)。40DAP种子体积继续增大，种皮条纹清晰，开始出现褐色斑点，部分种子与胎座连接处变成淡褐色(图2，f)。45DAP同一果实内大部分种子的种皮从白色逐渐变为褐色，种皮上条纹明显，种子湿润，与胎座连接紧密(图2，g)。50DAP种皮发亮呈褐色，部分种子失水干燥，抖动时可与胎座分离，镜下可见椭圆形的胚位于种子中央部位(图2，h)。55DAP种皮颜色加深，干燥程度增加(图2，i)。60DAP大部分种子易从胎座上直接脱落，少部分种子仍与胎座结合紧密，种子形态与50DAP时相似，镜下种胚体积增大(图2，j)。70DAP种子脱水，与胎座完全分离，深褐色种皮皱缩不饱满(图2，k)。80DAP种子成熟，种皮颜色呈现深褐色，种子如粉末般易于散出(图2，l)。

2.3胚发育

2.3.1雌配子体发育

0DAP紫点杓兰子房内胎座已充分发育，胎座脊上形成3～5级分枝系统形似指状突起，每个指状突起由一层表皮细胞包围一列细胞构成，这些指状突起即胚珠原基(ovuleprimordia)(图3，a)。10DAP胚珠原基顶端紧贴表皮细胞下的细胞体积增大，明显区别于周围细胞，为孢原细胞(archesporial cell)(图3，b)。孢原细胞形成后，其下方3～4个细胞处表皮细胞突起并向上生长分化形成内珠被(图3，c)。随后内珠被基部表皮细胞分化形成外珠被，内外珠被向上生长，包围珠心，在顶端形成珠孔，因此紫点杓兰胚珠具有双珠被(bitegmic)。紫点杓兰胚珠发育早期为直立生长，10～15DAP期间，珠柄开始弯曲，珠孔逐渐向胎座靠近，最终形成倒生胚珠(anatropous ovule)。

孢原细胞形成后，不经过分裂而直接分化形成体积大、细胞质浓的大孢子母细胞(megaspore mother cell)，孢原细胞外的1层表皮细胞则发育形成珠心细胞，随着大孢子母细胞体积的增大，珠心细胞沿平周方向伸长，在大孢子母细胞减数分裂的过程中，珠心细胞逐渐浓缩解体，形成胚囊壁。大孢子母细胞与珠心表皮细胞间没有细胞层，因此紫点杓兰胚珠为薄珠心型(tenuinucellate ovule)。15DAP大孢子母细胞染色质解体，进入减数分裂第一次分裂前期(图3，d)。大孢子母细胞减数分裂第一次分裂没有明显的极性，分裂结束后在两核之间形成细胞板，最后形成2个体积相近的二分体细胞(图3，e-f)。随后靠近珠孔端的细胞逐渐缩小(图3，g)，合点端细胞体积增大并准备进入减数分裂第二次分裂，此时珠孔端细胞只余退化痕迹(图3，h)。20DAP，大孢子母细胞减数分裂第二次分裂结束后形成2个大孢子核，两核间无细胞壁，仅以1个大液泡分隔，此时期即二核胚囊时期(two-nucleateembryo sac)(图3，i)。减数分裂完成后，位于细胞两极的2个大孢子核分别进行1次有丝分裂，各形成2个核，4个核分别位于细胞两极，形成四核胚囊(four-nucleate embryo sac)(图3，j)。在胚囊发育后期，四核胚囊中珠孔端2个核进行正常有丝分裂产生4个核，合点端的2个核在有丝分裂中期，染色体逐渐靠近，聚集形成1个大的纺锤体，最终形成两个二倍体核(图3，k)。这种方式形成的成熟胚囊具有6个核，其中珠孔端3核形成卵器(图3，l)，另1个核向合点端2个二倍体核靠近。因此紫点杓兰胚囊在25DAP左右发育成熟，其发育类型为双孢子葱型(Allium type)。

2.3.2胚胎发育

30DAP紫点杓兰成熟胚囊中的极核向合点端移动，最终与合点端2个核形成1个复合核，卵细胞双受精后形成合子，助细胞逐渐退化(图4，a)。位于合点端的复合核在以后的发育中会与另一个精核融合形成初生胚乳核，以后初生胚乳核不分裂并于35DAP左右退化消失，因此成熟的紫点杓兰种子缺少胚乳。30DAP合子体积增大，极性加强，核靠近合点端，珠孔端形成明显的液泡，准备进入有丝分裂阶段(图4，b)。合子的第一次有丝分裂为横向不均等分裂，分裂完成后形成2个大小不等的细胞，靠近合点端的细胞体积较小，细胞质浓厚，称为顶细胞(terminal cell)，以后参与胚体的形成，靠近珠孔端的细胞体积较大，具有明显液泡，称为基细胞(basal cell)(图4，c-d)。基细胞在胚胎发育过程中不分裂，而是分化为单细胞胚柄，在以后的胚胎发育过程中，胚柄细胞逐渐退化并消失。35DAP顶细胞经过一次横向分裂形成3细胞胚(图4，e)，随后，3细胞胚的顶端细胞经过一次垂周分裂，形成T型胚(图4，f)。胚细胞经过连续分裂后，细胞数目增多，发育形成多细胞原胚(proembryo)(图4，g)。

40DAP原胚细胞经过多次横向及纵向分裂，细胞数目增多，体积增大显著，此时可见内外种皮与胚体紧密接触，为早期球形胚阶段(图4，h-i)。随着胚细胞不断分裂，胚体积增大，内外种皮间空气腔逐渐明显(图4，j)。45DAP细胞仍不断分裂，胚体体积较40DAP时明显增大(图4，k)。50DAP种胚继续发育，体积增大(图4，l)。60DAP胚体体积增长到峰值，细胞有丝分裂停止，保持球形胚状态而不再继续分化(图4，m)。70DAP种子接近成熟，内种皮细胞逐渐脱水变薄，紧密包裹胚体(图4，n)。80DAP种子完全成熟，种皮进一步脱水，种子形态上呈粉末状，内种皮被番红染成红色，紧密包裹胚体，内外种皮之间空气腔明显，胚柄完全退化(图4，o)。紫点杓兰种子成熟过程中，内珠被最终发育成一层致密的干膜质内种皮，外珠被发育形成外种皮，内外种皮之间有巨大的空气腔，种子缺少胚乳，胚柄退化消失，因此成熟的种子结构简单，仅由双层种皮及胚体组成。

综上所述，紫点杓兰从传粉到果实成熟大约历经80d，其果实及种子发育过程中的主要形态特征及发育时期总结如表1所示，0～10DAP果实细长，尚未分化形成种子，此时处于孢原细胞形成时期；20DAP果实纵向伸长，种子乳白色，圆球形，处于大孢子母细胞减数分裂时期；25DAP果实开始膨大，种子白色，纵径伸长，此时成熟胚囊形成，胚囊发育类型为双孢子葱型，成熟胚囊六核；30DAP果实外部形态发育完全，下垂生长，呈梭形，内部种子白色，椭圆形，此时期双受精完成，合子形成；35DAP果实膨大至饱满形态，种子白色，细长，发育至多细胞原胚时期；40DAP果实饱满，种子细长，种皮上开始出现褐色斑点，此时种子发育至早期球形胚时期；50DAP果实饱满，种皮变为褐色，种子湿润并相互粘连，早期球形胚继续发育，胚体积增大，处于球形胚阶段；60DAP果实饱满，果皮上开始出现褐色斑点，植株叶片边缘开始枯萎变色，种子褐色，种皮微脱水，种子易从胎座上脱离，球形胚体积继续增大；70DAP果实饱满，果皮上褐色斑点增多，颜色加深，种子深褐色，几乎与胎座完全脱离，球形胚体积不再增加，处于晚期球形胚阶段；80DAP果实干燥开裂，植株枯萎，种子深褐色，粉末状，胚完全发育成熟，内外种皮均可见，内种皮变成一薄层，紧密包裹胚体。

表1 紫点杓兰授粉后果实与种子形态特征和发育时期

3.小结与讨论

兰科植物胚珠发育有三种方式，一为授粉刺激胚珠的发育；二为胚珠包含分化成熟的孢原细胞或大孢子母细胞；三为成熟的胚珠已经开始准备受精。本发明中，未授粉的紫点杓兰子房横切面可见胎座上发育良好的胚珠原基，与上述第二种胚珠发育方式相吻合，这与前人研究的杓兰亚科植物兜兰属和杓兰属植物的胚珠发育方式一致。

25DAP紫点杓兰胚囊发育成熟，发育方式为双孢子葱型。葱型胚囊的发育方式在许多兰科植物中也有报道，如硬叶兰、白唇杓兰及小叶兜兰等。双孢子葱型胚囊在形成过程中会发生一些变异，且变异的方式各不相同。如白唇杓兰的四核胚囊在后期有丝分裂过程中，只有珠孔端的2个核发生分裂，而合点端的2个核不分裂，最终形成六核胚囊。小黄花杓兰由于合点端2核有的不分裂或有的相互融合，最终形成五或六核胚囊。胚囊中核数量的减少被称为“striking phenomenon”，这种胚珠发育情况已经在多种兰科植物中观察到，通常认为胚囊中核数目的减少可能是由于有丝分裂的失败，或者由于纺锤体的融合或合点核的退化引起的。

兰科植物通常具有1层或2层珠被，但不同的兰科植物珠被发育类型并不相同，从进化的角度认为双珠被的胚珠是初生的性状。部分兰科植物的胚珠由单层珠被包裹，如天麻及小叶兜兰的胚珠具有单层珠被；五唇兰的内珠被在胚囊还未发育完全时细胞就进入程序性死亡过程，种子成熟时只有单层种皮包裹种胚；紫点兜兰、文心兰及墨兰的内珠被细胞在胚发育过程中被吸收，成熟的种子只具有单层种皮。大多数兰科植物的胚珠由双层珠被包围，最终发育形成内外种皮，如羊耳蒜、台湾杓兰、扇脉杓兰和大花杓兰等。本发明中，随着紫点杓兰种子发育成熟，内种皮逐渐发育形成，脱水形成薄薄的一层，紧密包裹着胚体，在显微镜下可见其被番红染成红色。这种结构与台湾杓兰和大花杓兰的致密干膜质内种皮结构相似，推测其上疏水性物质的低渗透性可能对种子造成强制性休眠或者阻碍种子萌发时对水分和营养物质的吸收，从而难以在人工培养基上萌发。这种种皮可以防止种子在传播过程中种胚失水，是一种保护机制。同时兰科植物种子细小、缺少胚乳且需要特定真菌为其萌发提供营养，这种特殊的种皮结构可以保证兰科植物种子有一个较长的休眠期，防止种子在不适宜的条件下萌发。但这种特点却对兰科植物的无菌萌发造成了一定的困难，使得成熟种子难以萌发，因此我们认为内珠被还未完全形成致密干膜质内种皮的时期，应是种子无菌萌发的有利时期，结合本次胚胎学研究结果，授粉后60DAP左右的紫点杓兰种子应处于此有利时期。

紫点杓兰从授粉到种子完全成熟大约需要80d，成熟的紫点杓兰种子缺少胚乳，胚柄结构退化，光学显微镜下可见其由内外两层种皮包裹，致密内种皮被番红染成红色并紧密包裹胚体。膜质内种皮的形成虽是对环境适应的结果，但这种结构并不利于种子的无菌萌发。因此通过紫点杓兰果实和种子形态特征及解剖学特征并结合前人研究资料我们推测：45DAP种子处于早期球形胚阶段，此时期种子或许已具备萌发能力，因此确定其作为后期无菌萌发试验的初始采种时间；50～60DAP的种子胚发育完全，尚未形成致密内种皮，种子形态特征显示轻微脱水，种子可从胎座上脱离，此时期的种子应是无菌萌发状态较好的时期。70～80DAP的成熟种子失水干燥，具有的致密内种皮可能会阻止其从培养基中吸收水分和营养物质，从而抑制种子的萌发。

实施例2 紫点杓兰种子的无菌萌发方法

1.采种时间对紫点杓兰种子无菌萌发的影响

1.1试验材料

试验材料采自大海陀国家级自然保护区紫点杓兰居群，2016年6月9日选择发育正常，中萼片与唇瓣刚分开的初花期花朵进行人工授粉，采集45DAP，50DAP，60DAP，70DAP，80DAP的果实各2个用于无菌萌发实验。

1.2试验方法

1.2.1果实及种子外部形态观察

将采集后的果实用双面刀片剖开后观察种子外部形态特征，并使用相机进行拍照。

1.2.2种子预处理

切除果实两端多余的果柄及宿存花瓣，洗洁精清洗果实表面，并于烧杯中流水冲洗30min后转移至超净工作台中。播种前对果实消毒步骤为：75％酒精30s，2％次氯酸钠溶液10min，无菌水冲洗5次，每次2min。消毒后的果实置于无菌滤纸上，吸干水分，纵切果实以备播种。

1.2.3种子活力检测

采用常规2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法对不同发育阶段的种子进行活力检测。将播种后剩余的种子收集到安玻瓶中，加入1％浓度的TTC溶液后摇匀，用锡纸将安玻瓶包裹严实后置于常温下72h，处理后的种子转移到铺有滤纸的培养皿中，于体视显微镜下观察、统计并拍照。随机选择10个视野观察并记录视野中的种子总数、染色种子数及有胚种子数，按照如下公式计算种子的有胚率及种子活力。

种子有胚率＝(视野下未败育种子数/种子总数)×100％

种子活力＝(视野下染色种子数/未败育种子数)×100％

1.2.4种子无菌播种

改良HA培养基的配制：使用Harvais改良培养基(将Harvais培养基中的NH₄NO₃去除，添加2.0mg/L甘氨酸，100mg/L谷氨酰胺及500mg/L酪蛋白水解物)为基本培养基，并加入20g/L蔗糖、0.5g/L活性炭和200mL/L马铃薯汁。马铃薯汁为新鲜马铃薯经过去皮切块后与水按照1:1的重量比煮沸过滤所得。煮沸前将pH调至5.5。经预处理后的种子用无菌镊子均匀播种在培养基表面，于暗室培养间25±2℃下进行培养。每个处理播种10瓶。播种后100d统计不同培养基中的种子播种总数和萌发种子数，种子萌发以胚膨大突破种皮为标准，按照如下计算公式统计种子萌发率。

萌发率＝(种子萌发数/种子总数)×100％ 式(I)

1.2.5数据统计与处理

试验中统计的相关数据使用SPSS 21.0软件进行统计与分析，检验不同种龄的紫点杓兰种子有胚率、染色率及萌发率的差异显著性。

1.3结果与分析

1.3.1不同发育时期紫点杓兰果实及种子形态变化

不同发育时期紫点杓兰果实及种子形态特征变化如图5所示。45DAP果实绿色，横切果实可见种子与胎座紧密相连，大部分种子种皮变为褐色(图5，a)。50DAP横切果实可见褐色的种子充满整个果实，种子与胎座连接紧密，部分种子从胎座上脱离并散落出来，散落出的种子仍相互粘结(图5，b)。60DAP解剖果实可见大部分种子能从胎座上轻松脱离，仍有少部分种子与胎座连接紧密(图5，c)。70DAP种子干燥程度显著增加，解剖果实可见种子几乎全部脱离胎座，种子在果实内部呈无规则排列状态(图5，d)。80DAP解剖果实可见种子失水严重，整体呈粉末状(图5，e)。

对不同发育时期的种子进行TTC活力检测，染色后可见45DAP种皮颜色浅，种胚颜色鲜艳(图6，a)。50DAP种皮颜色加深，染色的种胚仍清晰可见，呈鲜红色(图6，b)。60DAP种胚体积增大，种皮褐色，种胚颜色橘红色(图6，c)。70DAP种胚体积未见增加，染色率下降，颜色与60DAP的种子相比变化不大(图6，d)。80DAP种子染色率下降，种胚颜色变浅(图6，e)。

1.3.2不同发育时期紫点杓兰种子生活力及其萌发率差异

紫点杓兰不同发育时期的种子有胚率、种子活力和萌发率的生理指标见表2，45DAP种子活力较高为41.68％±11.37％；50DAP种子活力为36.15％±8.11％，此时期大部分种子具有胚，有胚率为61.62％±4.80％；60DAP种子有胚率及种子活力较高，此时期种皮颜色加深，染色后种胚颜色为橘红色；70DAP种子有胚率及种子活力有所下降，此时期种胚体积与60DAP无明显变化，但种子干燥程度增加，与胎座完全脱离；80DAP种子干燥如粉末，此时期果实完全成熟并开始开裂，种皮颜色为深褐色，种子染色较浅，种子活力为26.70％±4.83％。

采种时间是影响紫点杓兰种子萌发率的重要因素，如表2及图7、图8所示，60DAP种子的萌发率最高(58.96％±7.87％)，种子有胚率及种子染色率达到最高水平，分别为72.63％±7.77％和56.46％±8.70％。此时期种胚发育成熟，体积不再增加，种子较之前稍微干燥，大部分种子能与胎座脱离，种子能够均匀地播种在培养基表面，易于播种操作。60DAP种子萌发率、种子活力及有胚率均显著高于其他时期(P<0.05)。50DAP种胚尚未完全发育成熟，种皮颜色为褐色，大部分种子与胎座紧密相连，播种时部分种子成团状，种子萌发率为38.03％±6.99％，萌发后种子发育状态较一致。随着种子接近成熟，种子干燥程度增加，70DAP伴随着种子成熟，种子活力及种子萌发率均下降，萌发率为31.40％±10.17％，此时期的绝大部分种子已经完全与胎座分离。80DAP种子萌发率最低，仅为3.06％±1.34％，种子萌发困难，且萌发时间差别较大。种子有胚率仍处于较高水平，但种子活力显著下降，萌发率与种子活力数值差别较大，同45DAP种子的萌发结果相似。45DAP种子有胚率及种子活力均处于较高水平，但并未发现萌发的种子，推测未成熟的幼嫩种子或者完全成熟的种子可能会因为某种原因而不能在人工培养基上萌发，值得进一步探究。

表2 紫点杓兰不同发育时期种子生理特点

注：表中同列小写字母表示在0.05水平上差异显著(N＝10)

2.培养基类型对紫点杓兰种子无菌萌发的影响

2.1试验材料

试验材料采自大海陀国家级自然保护区紫点杓兰居群，花期选择初花期花朵进行人工授粉。采集3个50DAP的果实用于不同培养基对种子无菌萌发的影响试验。

2.2试验方法

2.2.1种子预处理

种子预处理方法同1.2.2。

2.2.2种子无菌播种

本实验选择1/4MS，KC，Phytomax Orchid Maintenance(POM)，Van Waes Debergh(VWD)，Harvais(HA)，改良Harvais这6种培养基作为基本培养基。所有培养基添加20g/L蔗糖、0.5g/L的活性炭与200mL/L的马铃薯汁。煮沸前培养基pH调至5.5。经预处理后的种子用无菌镊子均匀播种在培养基表面，于暗室培养间25±2℃下进行培养。每个处理播种10瓶。定期观察种子萌发及原球茎生长情况，种子萌发以胚膨大突破种皮为标准，并于播种后100d观察统计不同培养基中的播种总数和萌发种子数，按照式(I)公式计算种子萌发率。

2.2.3数据统计与处理

试验中统计的相关数据使用SPSS 21.0软件进行统计与分析，检验紫点杓兰种子在不同培养基条件下萌发率的差异显著性。

2.3结果与分析

紫点杓兰50DAP的种子在不同基本培养基上的萌发率及在培养基上的萌发状态如图9、图10所示，不同培养基对紫点杓兰种子的萌发率影响较大，其中种子在改良HA培养基上的萌发率最高，萌发率为37.83％±4.94％(N＝10)，萌发后幼苗健壮，根发达(图11)。HA培养基的萌发率为29.70％±3.29％。1/4MS与VWD培养基上种子的萌发率分别为20.20％±4.95％和17.41％±3.74％，显著低于改良HA培养基(P<0.01)，且萌发后原球茎的发育状态不一致，少部分原球茎较早分化出根。种子在KC培养基和POM培养基上萌发率最低，且萌发时间较长，萌发率仅有7.76％±1.44％和6.98％±2.31％，与改良HA培养基萌发率差异显著(P<0.01)。紫点杓兰种子萌发与原球茎的生长发育受培养基类型的影响明显，结果显示，紫点杓兰种子在改良HA培养基上萌发率最高，种子萌发时间较早，种子利用率高，因此可作为紫点杓兰种子无菌萌发的最适培养基；其次为HA培养基。种子在1/4MS及VWD培养基上的萌发率显著低于改良HA培养基(P<0.01)。从种子萌发率到原球茎的生长状态来看，POM与KC培养基不适宜紫点杓兰种子的萌发及原球茎生长，不宜作为紫点杓兰种子无菌萌发体系的基本培养基。

3.小结与讨论

为探讨紫点杓兰种子无菌萌发体系中采种时间和培养基类型对种子萌发率的影响，本发明结合前期试验结果，根据不同发育阶段果实及种子的形态特征和种胚发育的具体时间轴指导无菌萌发试验中的果实采集时间，优化紫点杓兰无菌萌发体系，为紫点杓兰野生资源的保育提供资料与理论基础。

杓兰属植物绿色未成熟蒴果内的种子曾被报道存在一个对萌发有利的最佳采集播种时间，早于这个时期的种子或晚于这个时期的成熟种子难以萌发。因此选择一个适宜紫点杓兰种子无菌萌发的最佳采种时间将大大提高其萌发率并缩短育种周期。紫点杓兰45DAP的种子其种皮开始变色，种胚发育到早期球形胚阶段，但未见种子萌发，结合其他杓兰属植物种子胚胎研究结果推测，该阶段的种子很可能是因为形态上或生理上未成熟造成休眠而不能萌发。此外野外物候等因素也会使每一年份的果实生长状态都有所差异，可能会对紫点杓兰果实生长产生一定的影响。50DAP种子之间相互粘连，与胎座连接较紧密，种胚发育由早期球形胚过渡到球形胚阶段，此时期种子萌发率迅速上升，为38.03％±6.99％，种子萌发后原球茎生长一致。60DAP种胚处于球形胚阶段，种子较湿润，此时期种子萌发率最高，达到58.96％±7.87％。随着种子的成熟，萌发率迅速下降，70～80DAP种子发育成熟，粉末状，外种皮失水皱缩，内种皮呈一薄层紧贴胚体，完全成熟的种子萌发率仅为3.06％±1.34％(80DAP)。因此与成熟种子相比，紫点杓兰种皮未完全干燥而种胚发育至球形胚阶段的种子萌发率最高，萌发效果最好。即紫点杓兰未成熟的种子比成熟种子更适宜用于无菌萌发操作。此结果同许多杓兰属植物种子的萌发结果相似，选择种子的最佳采集时间对提高种子萌发率非常重要。而紫点杓兰成熟种子中由内珠被发育形成的薄层干膜质内种皮，或许是阻止水分和营养进入种胚而影响其成熟种子萌发的主要原因。因此综合不同时期种子的外部形态特征及胚胎发育过程，并考虑到野外环境对紫点杓兰果实发育状态的影响，我们建议使用50～60DAP的种子进行紫点杓兰的无菌萌发试验，此时期种胚基本发育成熟，种皮未完全脱水，且刚刚开始干燥的种子对无菌播种操作十分有利，幼嫩或过于成熟的紫点杓兰种子均不利于其无菌萌发，与胚胎学研究结果一致。

培养基是兰科植物种子萌发的重要基质，为确定适于紫点杓兰种子萌发的最佳培养基，我们根据其种子胚胎发育特点，选择50DAP的种子对6种基本培养基进行了试验。结果表明种子在改良HA培养基上的萌发率最高，原球茎的生根发芽也较一致，改良HA培养基可作为紫点杓兰种子无菌萌发体系中的基本培养基。而在VWD、1/4MS培养基上，种子萌发缓慢且萌发率低于20％；POM培养基及KC培养基上种子的萌发率均低于8％，且种子萌发所需时间较长，萌发不同步等，这些均不利于紫点杓兰大量种苗的获得及其野生资源的保育。改良HA培养基是在HA培养基的基础上去掉了NH₄NO₃，而添加了水解酪蛋白、甘氨酸和谷氨酰胺，对紫点杓兰种子的萌发具有促进作用。此外培养基中添加了200mL/L的马铃薯汁和0.5g/L的活性炭，并将播种后的紫点杓兰培养物置于25±2℃条件下黑暗培养，对紫点杓兰种子的萌发和原球茎发育有良好的影响，种子萌发形成的原球茎褐化程度低，幼苗健壮。因此在培养基选择方面，使用改良HA培养基，添加适宜浓度的有机物、活性炭，在黑暗、恒温条件下培养将有利于紫点杓兰种子的萌发和原球茎的生长，可以获得大量的无菌苗，为紫点杓兰野生资源的保育工作奠定了基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.紫点杓兰种子无菌萌发的方法，其特征在于，获取紫点杓兰授粉后发育50-60天的果实，消毒后从果实中取出种子，播种在改良HA培养基表面，于25±2℃暗培养进行无菌萌发。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良HA培养基是以Harvais改良培养基为基础培养基，向其中添加蔗糖、活性炭和马铃薯汁配制而成，其中蔗糖、活性炭和马铃薯汁的终浓度分别为20g/L、0.5g/L和200mL/L；

所述马铃薯汁是将新鲜马铃薯去皮切块后与水按照1:1的重量比混合，煮沸过滤得到的；煮沸前将混合体系的pH值调至5.5；

所述Harvais改良培养基是将Harvais培养基中的NH₄NO₃去除，添加2.0mg/L甘氨酸，100mg/L谷氨酰胺及500mg/L酪蛋白水解物配制而成。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获取紫点杓兰授粉后发育60天的果实进行无菌萌发。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，紫点杓兰果实的消毒方法为：用洗洁精清洗果实表面，流水冲洗30min；然后在超净工作台中依次用75％酒精处理30s，用2％次氯酸钠溶液处理10min，无菌水冲洗。

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