KR20100056879A

KR20100056879A - 장미 기내 식물체 뿌리로부터 고빈도 체세포배발생 캘러스 유도 및 증식

Info

Publication number: KR20100056879A
Application number: KR1020080115875A
Authority: KR
Inventors: 이수영; 한봉희; 김정희; 한증술; 김원희
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2008-11-20
Filing date: 2008-11-20
Publication date: 2010-05-28
Also published as: KR101077209B1

Abstract

본 발명은 장미의 형질전환 식물체를 얻기 위한 재분화 기술에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 농촌진흥청 육성 장미(Rosa hybrida L.) 품종의 기내 식물체 뿌리로부터 고빈도의 체세포배발생 캘러스(somatic embryogenic callus)를 유도하고 증식하는 방법에 관한 것이며, 국내 육성 품종에 내병성 및 스트레스 저항성 유전자 등 유용유전자를 도입하여 유용형질을 보유한 장미 신품종을 개발하는데 이용가능하다.

장미, 기내 식물체 뿌리, 체세포배발생 캘러스, 배, 식물체 재분화

Description

장미 기내 식물체 뿌리로부터 고빈도 체세포배발생 캘러스 유도 및 증식{Method for inducing and proliferating somatic embryogenic calli induced from roots of rose}

본 발명은 장미의 형질전환 식물체를 얻기 위한 재분화 기술에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 농촌진흥청 육성 장미(Rosa hybrida L.) 품종의 기내 식물체 뿌리로부터 체세포배발생 캘러스(somatic embryogenic callus)를 유도하고 증식하는 방법에 관한 것이다.

장미 신품종은 주로 품종간 또는 종간교잡에 의해 육성되는데, 2006년 말 일본의 산토리(Suntory)사에서 형질전환 기술을 이용하여 푸른색 장미 품종을 개발하였다는 보고와 같이 최근에는 육종의 한 기술로서 형질전환 기술이 이용되고 있다. 그런데 형질전환을 이용하여 품종을 개발하고자 할 때 식물체 재분화 기술의 확립은 필수불가결한 선행조건이다. 식물체 재분화 기술은 조직 절편체로부터 기관형성을 유도하는 직접재분화 방법과 배발생캘러스를 유도한 후 그것으로부터 재분화 식 물체를 획득하는 방법이 있다. 그런데 모든 품종에 대하여 유사한 방법으로 체세포배발생 캘러스를 유도하는 것에는 어려움이 있으며, 또한 현재까지 국내 육성 장미 품종으로부터 체세포배발생 캘러스를 획득하였다는 보고 뿐 아니라 배 및 자엽단계 배를 고빈도로 획득하였다는 보고는 전무하다.

이에, 본 발명은 장미 형질전환 식물체를 개발하기 위하여 국내 육성 장미 품종으로부터 체세포배발생 캘러스를 획득하기 위한 방법 및 이의 증식 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

ⅰ) MS 고체배지(pH 5.8)에서 장미의 신초를 배양, 증식 및 발근시키는 단계;

ⅱ) 상기 ⅰ)단계에서 발근시켜 재분화된 기내 뿌리 절편체를 2,4-디클로로페녹시아세트산 5~11 mg·L^-1 를 첨가한 SH 배지에서 2~8주간 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및

ⅲ) 상기 ⅱ)단계에서 유도된 캘러스를 SH 배지에서 배양하여 배를 발생시키고 2차적으로 배발생 캘러스를 유도하는 단계;

를 포함하는 장미 기내 식물체 뿌리로부터 체세포배발생 캘러스를 유도하는 방법 및 상기 방법으로 장미 기내 식물체 뿌리로부터 유도되는 캘러스를 제공한다.

본 발명은 형질전환 기술을 이용하여 국내 육성 품종에 내병성 및 스트레스저항성 유전자 등 유용유전자를 도입하여 유용형질을 보유한 장미 신품종을 개발하고자 할 때 이용 가능하다.

본 발명은 농촌진흥청 육성 장미 품종의 마디를 기내에 도입하여 증식한 후 발근시킨 뿌리 또는 재분화된 식물체 뿌리를 배양한 후 캘러스를 유도하고 그것으로부터 배 및 배발생캘러스를 2차적으로 발생하게 하며 그것을 형질전환 재료로 이용하기 위해 증식하는 것으로 이루어진다. 그 과정을 간략하게 설명하면 다음과 같다.

초대배양 후 증식 배지에서 한 번 증식 후 발근배지[Murashige & Skoog (MS) 기본배지에 α-나프탈렌아세트산(α-naphtalene acetic acid, 이하 “NAA”라 한다) 0.1 mg·L^-1, 수크로오스 30g·L^-1, 아가(agar) 8g·L^-1 첨가된 배지 (pH 5.8)]에서 배양 2~3주 후 발근된 농촌진흥청 국립원예특작과학원 육성 장미 품종 ‘스위트옐로우(Sweet Yellow)’ 등 7품종의 기내 식물체 뿌리를 Schenk & Hildebrandt (SH) 기본배지에 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 이하 “2,4-D”라 한다) 5~11 mg·L^-1 첨가된 배지에 2~8주 동안 배양하여 캘러스를 유도한다. 이 유도된 캘러스를 SH 기본배지에 2,4-D 3 mg·L^-1 첨가된 배지에서 1~6주 배양하여 배발생 캘러스 및 체세포배를 유도한다. 이 체세포배발생 캘러스를 직 경 1.5~2cm로 모아서 3~6주마다 배지를 교체해 주면서 증식시킨다. 증식과정에서 단계에 따라 배발생 캘러스, 배, 자엽단계 등으로 선발 분리한다. 이러한 방법으로 분리된 자엽단계의 것은 저온처리 등을 거친 후 재분화됨을 확인할 수 있다.

본 발명은 국내 육성 품종에 대해서만 적용가능한 것이 아니며, 수입 품종에 대해서도 적용가능하다. 수입 품종에 대하여 본 발명의 방법을 적용하면 기존의 방법을 이용할 때보다 고빈도의 체세포배발생 캘러스를 얻을 수 있으며, 배발생 유도배지에서 배발생까지의 기간을 단축시킬 수도 있다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 하기와 같으며, 이는 도 1에 도시되어 있다.

가. 마디배양에 의한 기내 도입 및 발근

유리온실의 암면상에서 양액재배되고 있는 농촌진흥청 육성 장미 품종의 신초(4~5마디)를 흐르는 물에 세척한 후 70% 에탄올 용액에 30초간 표면살균한 다음 멸균수로 세척한다. 트윈(Tween) 20 한 방울 첨가된 2% NaOCl 용액에서 15분간 살균하였다. 이 때 진공펌프를 이용하여 살균액이 조직 내부까지 충분히 침투될 수 있도록 한다. 살균 후 멸균수로 3회 세척 후 5분간 멸균수에 담가 두어 혹시 조직에 남아 있을 수 있는 살균액이 제거되도록 한다. 마디를 7mm 내외로 절단 후 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine, 이하 “BAP”라 한다) 2 mg·L^-1, NAA 0.1 mg· L^-1, 수크로오스 30g·L^-1 및 아가(agar) 8g·L^-1이 첨가된 MS 고체배지(pH 5.8)에 2주 배양한다. 액아 유래 신초를 BAP 1 mg·L^-1과 인돌-3-부티르산(indole-3-butyric acid, 이하 “IBA”라 한다) 0.1 mg·L^-1 첨가 MS 고체배지에 4~5주 배양하여 증식한 후 NAA 0.1 mg·L^-1 첨가 MS 고체배지에 2~3주 배양하여 발근시킨다.

나. 기내 뿌리로부터 캘러스 유도

기내 뿌리(10 mm 내외) 절편체를 2,4-D 5~11 mg·L^-1 첨가 SH 배지에 각각 2~8주 배양한다. 2,4-D 11 mg·L^-1 첨가 배지에서 배양된 절편체는 다시 식물생장조절제가 첨가되지 않은 SH배지에 4주 동안 배양한다.

기내 뿌리 절편체를 배양함에 있어, 2,4-D 11 mg·L^-1를 첨가하는 것이 바람직하다. 2,4-D 11 mg·L^-1를 첨가하는 경우 2,4-D 5 mg·L^-1를 첨가하는 배지에서와 비교하여 뿌리배양으로부터 배발생까지의 기간은 더 길어지지만, 배의 단단함 정도를 고려할 때 2,4-D 11 mg·L^-1를 첨가하는 배지가 더 효과적이다.

다. 배발생 및 배발생캘러스 증식

상기 나 단계의 2,4-D 5~11 mg·L^-1 첨가 배지에 배양된 절편체로부터 유도 된 캘러스를 절편체로부터 떼어내지 않은 상태로 2,4-D 3 mg·L^-1, L-프롤린 300 mg·L^-1, 수크로오스 30 g·L^-1, 피타겔(phytagel) 4 g·L^-1 등이 첨가된 SH 배지로 옮겨 배양한 후 3~6주 간격으로 배지를 교체해 주면서 배양한다. 이렇게 배양한 캘러스 중에서 배 발생 주변의 캘러스만을 선발 후 직경 1.5~2 cm의 원형으로 밀도있게 모아서 배지를 교체해 2차 배발생캘러스를 유도하고 증식한다.

라. 식물체 재분화

배 또는 자엽전개 배를 7일간 4℃ 저온처리 또는 암처리 후 BAP 0.3 mg·L^-1 첨가 MS 고체배지에서 명배양하여 신초를 재분화시킨다. 재분화된 신초는 상기 발근배지로 옮겨 발근시킨 후 순화과정을 거쳐 온실로 옮겨 펄라이트(삼손, 규격1호)와 바이오상토 1호(흥농)와 부산물 퇴비(바이오 콩)가 10:5:4로 조제된 상토 400g을 채운 15cm 화분에 정식하여 재배한다.

상기와 같은 방법으로 국내 육성 장미 품종으로부터 고빈도의 체세포배발생 캘러스를 획득할 수 있으며, 국내 육성 품종에 키틴네이즈 진(chitinase gene) 등의병 저항성 증진 유전자 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 진(superoxide dismutase gene) 등의 스트레스 저항성 증진 유전자 등 유용유전자를 도입하여 유용형질을 보유한 장미 신품종을 개발하는데 상기 체세포배발생 캘러스를 형질전환을 위한 재료로 사용할 수 있다.

이하 본 발명은 하기의 실시예를 통하여 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해서만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 체세포배발생 캘러스 유도 능력이 우수한 품종 선발

유리온실의 암면상에서 양액재배되고 있는 농촌진흥청 육성 장미 품종인 스위트 옐로우, 펄레드, 허니드롭, 핑크볼, 오렌지쥬얼, 스노우드롭 및 프레이야 7품종을 가지고 도 1에 도시한 방법으로 캘러스를 유도하였다.

온실 내에서 재배된 스위트 옐로우 등 7품종 장미의 신초를 살균한 후 BAP 2 mg·L^-1, NAA 0.1 mg·L^-1, 수크로오스 30g·L^-1 및 아가(agar) 8g·L^-1이 첨가된 MS 고체배지(pH 5.8)에 2주 배양하였다. 그 후 액아 유래 신초를 BAP 1 mg·L^-1, IBA 0.1 mg·L^-1, 수크로오스 30g·L^-1 및 아가(agar) 8g·L^-1을 첨가한 MS 고체배지에 4~5주 배양하여 증식시킨 후 BAP 1 mg·L^-1, NAA 0.1 mg·L^-1, 수크로오스 30g·L^-1 및 아가(agar) 8g·L^-1을 첨가한 MS 고체배지에 2~3주 배양하여 발근시켰다. 그 다음 기내 뿌리 절편체(10mm 내외)를 2,4-D 5~11 mg·L^-1이 첨가된 SH 배지에서 2~8 주간 배양시켜 캘러스를 유도시켰다. 그 다음 배발생 유도 배지로 옮겨 1~6주 배양하여 7품종에 대한 캘러스 형성을 육안으로 확인하였다. 결과는 하기 표 1에 나타 내었다.

농촌진흥청 육성 장미 7품종의 기내 식물체 뿌리로부터 캘러스 및 배발생

품종	캘러스 형성율 (%)		배발생율 (%)	2차 배발생캘러스 발생 유무
품종	+	+++	배발생율 (%)	2차 배발생캘러스 발생 유무
스위트옐로우	38.5	10.0	13.0	○
펄레드	38.5	13.0	0.0	-
허니드롭	58.4	16.7	0.0	-
핑크볼	15.0	50.0	0.0	-
오렌지쥬얼	100.0	0.0	0.0	-
스노우드롭	40.0	0.0	0.0	-
프레이야	20.0	0.0	0.0	-

(+: 절편체의 일부분만 캘러스 발생, +++: 절편체 전체 캘러스 발생)

상기 표 1에서 알 수 있듯이, 7품종의 장미에 있어서 캘러스의 형성 정도에 있어서는 차이가 있지만, 7품종 전부 캘러스 형성을 확인할 수 있다. 그러나, 캘러스로부터의 배발생은 ‘스위트옐로우’에서만 확인되었다.

[실시예 2] 식물생장조절제(2,4-D)의 농도에 따른 체세포배발생 캘러스 유도에 대한 영향

상기 실시예 1과 같은 방법으로 스위트 옐로우를 이용하여 기내 뿌리로부터 형성된 캘러스로부터 배발생을 유도하는 과정 중, 기내 뿌리 절편체를 2,4-D이 첨가된 SH 배지에서 배양시킬 때, 배지 내에 첨가하는 2,4-D의 양이 달라짐에 따라 캘러스 형성 정도 및 배발생율이 달라짐을 확인하였다. 배지 내에 첨가하는 2,4-D의 농도는 5 mg·L^-1 및 11 mg·L^-1 로 하였으며, 결과는 하기 표 2 및 도 2에 나타내었다.

장미 기내 식물체 뿌리로부터 캘러스 및 배발생에 미치는 배지내 첨가 2,4-D의 영향

2,4-D (mg·L^-1)	캘러스 형성율 (%)		배발생율 (%)
2,4-D (mg·L^-1)	+	+++	배발생율 (%)
5	40.5	0.0	4.5
11	34.7	56.3	11.3

상기 표 2 및 도 2를 보면, 배발생 유도 배지에서 배양한 결과 뿌리로부터 캘러스 형성이나 그 캘러스로부터 배발생에 있어서 2,4-D 11 mg·L^-1 첨가가 효과적임을 알 수 있다. 뿌리배양으로부터 배발생까지의 기간은 2,4-D 5 mg·L^-1 첨가 배지 보다 두 배 더 소요되었으나 배의 단단함 정도를 기준으로 2,4-D 11 mg·L^-1 첨가 배지가 더 효과적이다.

[실시예 3] 재분화 식물체 뿌리를 이용한 배발생 캘러스 획득 효율 증대 확인

상기 실시예 1과 같은 방법으로 수입품종인 차밍과 티네케, 국내품종인 스위트옐로우를 이용하여 장미의 재분화된 기내 식물체의 뿌리로부터 캘러스를 유도한 후 배발생 유도 배지(2,4-D 3 mg·L^-1, L-프롤린 300 mg·L^-1, 수크로오스 30 g·L^-1, 피타겔(phytagel) 4 g·L^-1 등이 첨가된 SH 배지)로 옮겨 배양한 후 3~6주 간격로 옮겨 배양하여 배발생 유도배지에서 배발생까지의 기간을 확인하였다. 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

장미 재분화 식물체 뿌리를 이용한 배발생 캘러스 획득 효율 증대

품종	캘러스 형성율 (%)		배발생율 (%)	배발생 유도배지에서 배발생까지의 기간 (주)
품종	일부	전체	배발생율 (%)	배발생 유도배지에서 배발생까지의 기간 (주)
차밍	29.5	70.5	20.5	1~2
티네케	81.7	7.2	3.9	3~4
스위트옐로우	57.1	0.0	17.9	4~6

상기 표 3을 보면, 실험한 장미 품종간의 차이는 있었지만 빠르게는 배양 1~2주 내에, 늦어도 6주 내에 배발생을 확인할 수 있음을 알 수 있다. 이는 장미를 재분화하는데 일반적으로 8~16주가 소요된다는 기존 보고(Marchant 등 . 1996. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Floribunda rose (Rosa hybrida L.) cvs. Trumpeter and Glad Tidings. Plant Science 120: 95-105)보다 7~10주 앞당긴 것으로서, 본 발명에 따른 방법에 의할 경우 배발생 캘러스를 유도하는데 기존의 방법보다 빠르게 할 수 있어 더 효율적임을 알 수 있다.

[실시예 4] 고빈도 배 및 자엽발생 캘러스의 획득

상기 실시예 1과 같은 방법으로 유도 및 증식된 티네케 품종의 기내 뿌리 유래 캘러스를 챠콜(charcoal) 0.5%(W/V) 함유된 MS 배지에 암배양한 결과 배지의 교체없이 14주까지도 고빈도로 배로부터 자엽전개 배를 획득할 수 있었다. 이는 도 3에 나타내었다.

또한, 비교대상으로서 기내 뿌리로부터 유도하여(상기 나. 단계) 증식중인 티네케 배발생 캘러스를 기존의 보고(Marchant 등, 1996)된 방법으로 배양한 결과를 도 4에 나타내었다. 구체적으로, 티네케 배발생 캘러스를 배성숙배지에서 1달 배양하고, 배로부터 자엽전개를 유도하는 챠콜(charcoal)을 첨가하지 않은 배발아배지에서 배양한 후 4℃에서 1주간 저온처리하고 1달 동안 배양하였다.

도 3 및 도 4를 보면, 본원발명의 방법에 의해 배양할 경우 기존의 방법으로 배양한 경우보다 고빈도로 배가 발생하였음을 확인할 수 있다.

[실시예 5] 배발생 캘러스 증식에 효과적인 배지 조건 및 배양 방법의 확인

스위트옐로우, 챠밍 및 티네케의 배발생 주변 캘러스를 직경 1.5~2 cm의 원형으로 밀도있게 모아서 3~6주간격으로 계대배양하는 것이 배발생캘러스 증식에 효과적이었다. 배 및 자엽단계로 전개된 것을 7일간 4℃ 저온처리 또는 암처리 후 배양하였을 때 신초가 재분화하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에서 왼쪽은 각각 스위트옐로우(상), 차밍(좌하) 및 티네케(우하)이 체세포배발생 캘러스를 나타낸 것이고, 오른쪽은 재분화한 티네케의 신초를 나타낸 것이다.

도 5를 보면, 배발생 주변 캘러스를 밀도있게 모아서 계대배양할 경우 상기 세 가지 종류의 장미에 있어서 모두 배발생캘러스 증식이 효과적으로 이루어짐을 알 수 있다.

[실시예 6] 식물체의 재분화 및 생장 확인

상기 실시예 1과 같은 방법으로 장미의 스위트 옐로우 품종의 재분화된 기내 식물체의 뿌리로부터 유도된 배발생 캘러스를 이용하여 신초를 재분화시킨 후 발근 및 순화과정을 거쳐 온실로 옮겨 펄라이트(삼손, 규격1호)와 바이오상토 1호(흥농)와 부산물 퇴비(바이오 콩)가 10:5:4로 조제된 상토 400g을 채운 15cm 화분에 정식하였다. 이를 재배하여 동종의 스위트 옐로우임을 확인하였다.

도 1은 장미 배발생 캘러스를 유도하는 순서를 도시한 것이다.

도 2는 스위트옐로우의 기내 식물체 뿌리로부터 유도된 배발생캘러스 및 배를 나타낸 것이며, 왼쪽 사진은 배지에 2,4-D 11mg·L^-1를 첨가한 것이고, 오른쪽 사진은 배지에 2,4-D 5mg·L^-1를 첨가한 것이며, 화살표는 배를 가리킨다.

도 3은 고빈도로 배가 발생된 캘러스(왼쪽) 및 배로부터의 자엽전개(오른쪽)를 나타낸 것이다.

도 4는 캘러스가 유도되고 증식중인 티네케 배발생 캘러스를 종래의 방법으로 배양한 후의 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 1.5~2cm의 원형으로 모아서 3~6주 간격으로 계대배양하여 증식시킨 스위트옐로우(상), 챠밍(좌하) 및 티네케(우하)의 체세포배발생 캘러스(왼쪽), 및 재분화한 티네케 신초(오른쪽)를 나타낸 것이다.

Claims

ⅰ) MS 고체배지(pH 5.8)에서 장미의 신초를 배양, 증식 및 발근시키는 단계;

ⅱ) 상기 ⅰ)단계에서 발근시켜 재분화된 기내 뿌리 절편체를 2,4-디클로로페녹시아세트산 5~11 mg·L^-1 를 첨가한 SH 배지에서 2~8주간 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및

ⅲ) 상기 ⅱ)단계에서 유도된 캘러스를 SH 배지에서 배양하여 배를 발생시키고 2차적으로 배발생 캘러스를 유도하는 단계;

를 포함하는 장미 기내 식물체 뿌리로부터 체세포배발생 캘러스를 유도하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 장미는 스위트 옐로우임을 특징으로 하는 체세포배발생 캘러스를 유도하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 체세포배발생 캘러스를 고빈도로 발생시킴을 특징으로 하는 체세포배발생 캘러스를 유도하는 방법.
제 1항에 의한 방법으로 유도된 배발생 캘러스를 1.5~2cm의 원형으로 모아서 3~6주 간격으로 계대배양하여 증식시키는 체세포배발생 캘러스를 증식하는 방법.
ⅰ) 재분화된 식물체의 기내 뿌리 절편체를 2,4-디클로로페녹시아세트산 5~11 mg·L^-1 를 첨가한 SH 배지에서 2~8주간 배양하여 캘러스를 유도하는 단계; 및

ⅱ) 상기 ⅰ)단계에서 유도된 캘러스를 SH 배지에서 배양하여 배를 발생시키고 배발생 캘러스를 유도하는 단계;

를 포함하는 방법으로 장미 기내 식물체 뿌리로부터 유도되는 캘러스.