CN111073903A - 利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，所述利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括：材料处理；基因枪轰击；恢复培养；液体培养基筛选；体细胞胚诱导筛选；成熟的抗性体胚萌发；抗性小苗生根获得完整的转化植株。本发明采用基因枪投送质粒并结合液体培养基筛选的方法，可以更轻易获得再生植株，最终保证并提高香蕉转基因的成功率，试验验证，通过该方法可以得到能正常生长香蕉转基因植株，经检测，再生香蕉的阳性率可以达到100％。

Description

利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，尤其是涉及一种适应于利用基因枪法介导香蕉胚性细胞悬浮系(embryogenic cell suspensions，ECS)为受体的遗传转化方法。
背景技术
目前，最接近的现有技术：香蕉属芭蕉科(Musaceae)、芭蕉属(Musa)，是一种重要的热带水果和粮食作物。由于大多数香蕉栽培种属于三倍体，通过杂交等传统育种方式进行香蕉品种改良具有很大的局限性。转基因技术的发展为香蕉育种提供了一种有效的手段。
目前在香蕉上常用的转基因方法主要有农杆菌介导和基因枪法，所采用的受体材料有原生质体、茎顶端分生组织、假茎薄片、多芽体以及胚性细胞悬浮系，其中以农杆菌介导香蕉胚性悬浮细胞系的研究应用最广。但是，香蕉是单子叶植物，不易被农杆菌侵染,转化频率很低，即使共培阶段通过农杆菌介导获得了少量的转化胚性细胞，但由于香蕉胚性细胞再生率低，最终很难获得转基因植株。前期我们发明了一种利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化的方法(ZL200910192122.4)，该方法利用液体培养基共培，可以有效防止材料褐化，利用液体培养基筛选，可以将液体共培养阶段获得的极少量转化细胞筛选得到扩大繁殖，非转化细胞通过筛选剔除，该方法解决了香蕉遗传转化过程中转化率低的关键问题，极大地提高了转基因香蕉植株的得率。但是该方法并非完美，在实际操作过程中，出现了新的问题，在液体培养基培养下，农杆菌繁殖速度快，以致在液体共培、筛选以及接下来的再生过程中，实验材料被农杆菌污染率非常高，往往难于控制，这就需要在试验后期筛选时需添加高浓度的头孢霉素用来控制农杆菌。而由于高浓度抗生素的存在，又严重影响了香蕉体细胞胚的发育和再生，最终极大程度上影响了试验的成功率。
综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术在液体培养基培养下，农杆菌繁殖速度快，以致在液体共培、筛选以及接下来的再生过程中，实验材料被农杆菌污染率非常高，往往难于控制，在试验后期筛选时需添加高浓度的头孢霉素用来控制农杆菌。由于高浓度抗生素的存在，又严重影响了香蕉体细胞胚的发育和再生，最终极大程度上影响了试验的成功率。
解决上述技术问题的难度：本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，以香蕉胚性细胞悬浮系为受体，采用基因枪法介导并结合液体培养基进行抗性筛选的高效香蕉遗传转化体系。
解决上述技术问题的意义：
采用基因枪法介导并结合液体培养基进行抗性筛选的高效香蕉遗传转化体系，是利用基因枪投送质粒，并结合液体培养基筛选的方法，避免了利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化时出现的试验后期农杆菌污染难控制的问题，从而也避免了试验后期添加高浓度的抗生素，继而避免了由于高浓度抗生素造成的香蕉体细胞胚的发育和再生的问题，可以更轻易获得再生植株，最终保证并提高香蕉转基因的成功率，试验验证，通过该方法可以得到能正常生长香蕉转基因植株，经检测，再生香蕉的阳性率可以达到100％。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法。
本发明是这样实现的，一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，所述利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括如下步骤：
步骤一，材料处理：取在香蕉ECS液体培养中继代培养7～10天的香蕉ECS，离心去上清后，转移到高渗培养基上，每培养皿接种胚性愈伤组织约0.2～0.5mL细胞密实体积(packed cell volume,PCV)。处理4～6小时。
步骤二，基因枪轰击：基因枪为Bio-Rad公司的PDS-1000/He Biolistic型，轰击距离为6、9、12cm,金粉直径0.6um，轰击压为1350psi,真空度为27-28inches Hg(负压)。金粉包被与轰击参照基因枪说明书进行。将以上处理的ECS进行基因枪轰击，每个培养皿轰击1～3枪。该步骤是将要转入的目的基因包裹在金粉上，然后用基因枪打入需要转化的材料，本发明中是需要将GUS基因转入香蕉的ECS,也就是将含有GUS的质粒包裹在金粉上，利用基因枪打入ECS,也就是利用基因枪这个媒介，将外源基因转入ECS中，没有这个步骤，外源基因近进入不了ECS中。农杆菌法是利用以农杆菌为媒介，利用农杆菌的侵染ECS的机会，将外源基因导入ECS。
步骤三，恢复培养：轰击后的ECS在黑暗条件下，过夜培养，之后转至M2液体培养基，转速100～120rpm再恢复培养4～7天。
步骤四，液体培养基筛选：将恢复培养后的ECS，转至SM2液体筛选培养基中，27±2℃，黑暗条件下，培养振荡培养，每15～20天继代一次，连续继代3代以上。利用基因枪将GUS基因导入香蕉ECS后，一部分ECS会被转化，也就是我们常说的转基因ECS，这部分转入GUS基因的同时，也转入了抗生素基因，另外的ECS没有被转化，也就是非转基因ECS。这个液体筛选培养基中含有抗生素，会杀死非转基因ECS，而转基因ECS中由于存在抗生素基因，会对抗生素产生抗性，从而可以存活，这样通过这个含有抗生素的液体筛选培养基筛选，可以杀死非转基因ECS，剩下的都是转基因ECS。然后ECS培养成香蕉植株后，就是阳性转化植株了。
步骤五，体细胞胚诱导筛选：取筛选培养3代以后的培养物静置去上清，然后将悬浮物均匀铺于SM3体胚诱导筛选培养基上，黑暗培养2～3个月，每个月更换一次体胚诱导筛选培养基。
步骤六，体胚萌发：体胚将成熟的抗性体胚转移至M4体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗。
步骤七，小苗生根：将小苗转移至MR生根培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株。
进一步，步骤一中，所述的高渗培养基成为：M2液体培养基+7g/L Agar+0.2mol/LSorbitol+0.2mol/L mannito。
进一步，步骤三中，所述M2液体培养基组成为：MS+1mg·L-1 2,4-D+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+45g·L-1蔗糖，高压灭菌前pH 5.3。
进一步，步骤四中，所述SM2液体筛选培养基组成为：步骤三所述M2液体培养基+相应筛选抗生素，抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
进一步，步骤四中，所述继代的方法是：取悬浮培养物0.1～0.5mL加入到30～40mL新鲜筛选培养基中继续振荡培养，获得的抗性ECS即为转化的香蕉ECS。
进一步，步骤五中，所述SM3体胚诱导筛选培养基组成为：M3体胚诱导培养基+相应筛选抗生素，抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
其中：M3体胚诱导培养基组成为：MS+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+0.2mg·L-1NAA+0.1mg·L-1Kinetin+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
进一步，步骤六中，所述M4体胚萌发培养基组成为：MS+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+0.1mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
进一步，步骤七中，所述的MR生根培养基组成为：MS+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明针对现有技术中存在的不足，建立高效的基因枪介导的香蕉遗传转化体系，以香蕉胚性细胞悬浮系为受体，采用基因枪法并结合液体培养基进行抗性筛选的方法为本发明的首创。
本发明采用基因枪投送质粒并结合液体培养基筛选的方法，避免了利用液体筛选系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化时出现的试验后期农杆菌污染难控制的问题，从而也避免了试验后期添加高浓度的抗生素，继而避免了由于高浓度抗生素造成的香蕉体细胞胚的发育和再生的问题，可以更轻易获得再生植株，最终保证并提高香蕉转基因的成功率，试验验证，通过该方法可以得到能正常生长香蕉转基因植株，经检测，再生香蕉的阳性率可以达到100％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法流程图。
图2是本发明实施例提供的基因枪轰击后，利用液体筛选培养基筛选不同代数的ECS的GUS染色情况示意图；
图中：图(A)是非转化对照；图(B)是未经过筛选的第0代；图(C)是筛选1代；图(D)是筛选第2代；图(E)是筛选第3代。
图3是本发明实施例提供的ECS经液体培养基筛选后的胚诱导及GUS染色情况示意图；
图中：图(A)是未转化的ECS分别转入不含抗生素的M3培养基做正对照；图(B)是未转化的ECS分别转入含抗生素的SM3培养基做负对照；图(C)是转化后未经抗生素筛选的第0代ECS；图(D)是转化并经过液体培养基筛选的第1代ECS；图(E)是转化并经过液体培养基筛选的第2代ECS；图(F)是转化并经过液体培养基筛选的第3代ECS；图(G)是未转化对照胚没有GUS染色反应；图(H)是随机选取的经过液体培养筛选的转化抗性胚可以发生GUS染色。
图4是本发明实施例提供的经液体培养基筛选后不同处理体胚萌发情况示意图；
图中：图(A)未转化的胚对照；图(B)是转化后经过液体筛选培养基筛选第1代ECS诱导的胚；图(C)是转化后经过液体筛选培养基筛选第2代ECS诱导的胚；图(D)是转化后经过液体筛选培养基筛选第3代ECS诱导的胚。
图5是本发明实施例提供的转基因植株的GUS染色、PCR分析和Southern blot杂交鉴定示意图；
图中：图(A)是转基因植株叶和根系的GUS染色；图(B)是转基因植株的PCR；图(C)是转基因植株的Southern blot杂交；M：Marker；P：正对照(质粒pCAMBIA1301 DNA)；N：负对照(未转化植物DNA)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括如下步骤：
S101：材料处理：取在香蕉ECS液体培养中继代培养7～10天的香蕉ECS，离心去上清后，转移到高渗培养基上，每培养皿接种胚性愈伤组织约0.2～0.5mL细胞密实体积(packed cell volume,PCV)。处理4～6小时。
S102：基因枪轰击：基因枪为Bio-Rad公司的PDS-1000/He Biolistic型，轰击距离为6、9、12cm,金粉直径0.6um，轰击压为1350psi,真空度为27-28inches Hg(负压)。金粉包被与轰击参照基因枪说明书进行。将以上处理的ECS进行基因枪轰击，每个培养皿轰击1～3枪。
S103：恢复培养：轰击后的ECS在黑暗条件下，过夜培养，之后转至M2液体培养基，转速100～120rpm再恢复培养4～7天。
S104：液体培养基筛选：将恢复培养后的ECS，转至SM2液体筛选培养基中，27±2℃，黑暗条件下，培养振荡培养，每15～20天继代一次，连续继代3代以上。
S105：体细胞胚诱导筛选：取筛选培养3代以后的培养物静置去上清，然后将悬浮物均匀铺于SM3体胚诱导筛选培养基上，黑暗培养2～3个月，每个月更换一次体胚诱导筛选培养基。
S106：体胚萌发：将成熟的抗性体胚转移至M4体胚萌发培养基上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗。
S107：小苗生根：将小苗转移至MR生根培养基上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株。
本发明实施例提供的S101中的高渗培养基成为：M2液体培养基+7g/L Agar+0.2mol/L Sorbitol+0.2mol/L mannito。
本发明实施例提供的S103中的M2液体培养基组成为：MS+1mg·L-1 2,4-D+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+45g·L-1蔗糖，高压灭菌前pH 5.3。
本发明实施例提供的S104中的SM2液体筛选培养基组成为：S103所述M2液体培养基+相应筛选抗生素，抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
本发明实施例提供的S104中的继代的方法是：取悬浮培养物0.1～0.5mL加入到30～40mL新鲜筛选培养基中继续振荡培养，获得的抗性ECS即为转化的香蕉ECS。
本发明实施例提供的S105中的SM3体胚诱导筛选培养基组成为：M3体胚诱导培养基+相应筛选抗生素，抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
其中：M3体胚诱导培养基组成为：MS+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+0.2mg·L-1NAA+0.1mg·L-1Kinetin+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
本发明实施例提供的S106中的M4体胚萌发培养基组成为：MS+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+0.1mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
本发明实施例提供的S107中的MR生根培养基组成为：MS+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，三个实例都是通过本发明的方法转入gus基因。转化的质粒是pCAMBIA1301，其上T-DNA区域含有潮霉素抗性基因hpt和报告基因gus。
实施例1
本发明实施例提供的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括如下步骤：
(1)取继代培养10d的香蕉主栽品种巴西蕉(Musa Cavendish cv.Baxi，基因型AAA)胚性细胞悬浮系(ECS)，离心去上清后，转移到高渗培养基上，每培养皿接种胚性愈伤组织约0.5mL细胞密实体积(packed cell volume,PCV)，处理4～6小时。
(2)利用为Bio-Rad公司的PDS-1000/He Biolistic型基因枪，轰击距离为9cm，金粉直径0.6um，轰击压为1350psi,真空度为27-28inches Hg(负压)。参照基因枪说明书进行金粉包被与轰击，每培养皿材料轰击2枪，以未轰击材料为对照。
(3)轰击后的愈伤组织在高渗培养基上过夜恢复培养之后，转移至M2液体培养基再恢复培养7天(第0代)。并取部分转至液体筛选培养基中，(27±1)℃，转速100r/min振荡培养，每3星期继代更换新的液体筛选培养基，分别标记为第1代，第2代，第3代。其中前2次继代用的液体筛选培养基潮霉素浓度为10mg/L，以后的抗生素浓度降至5mg/L。取0.2mLPCV的第0代，第1代、第2代、第3代材料进行GUS染色。结果显示，未转基因对照没有GUS染色反应(见图2A)，所轰击的6个培养皿的第0代材料均检测到阳性细胞团，数目最少6个，最多的18个(见图2B)。而经过筛选的第1代、第2代、第3代材料胚性细胞悬浮系，筛选时间越长，GUS阳性率越高。经过3代的筛选，所得的胚性细胞几乎全为转化细胞(见图2C-E)，最终获得了生长良好的转基因的贡蕉抗性ECS。
(4)取0.5ml PCV第O代以及经过液体筛选第1代、第2代和第3代的胚性愈伤转至SM3体胚诱导筛选培养基(M3培养基+潮霉素浓度为5mg/L)上，27±1℃条件下，黑暗培养，每一个月继代一次，以未转基因材料为对照。经过3个月的培养，在没有抗生素的M3体胚诱导培养基上的对照材料(正对照)诱导得到大量发育良好的白色成熟体细胞胚(见图3A)，而在SM3体胚诱导筛选培养基的对照材料(负对照)，没有诱导出胚(见图3B)。未经过选择筛选的第0代材料仅诱导出少量的胚(见图3C)。而液体筛选第1代的香蕉胚性愈伤组织在胚诱导后期，在褐化的愈伤之间出现了较多的白色或黄白色成熟体细胞胚(见图3D)，液体筛选2代的香蕉胚性愈伤组织获得的成熟体细胞胚数量较液体筛选第1代的更多，大小更均一(见图3E)，而经过筛选3代的香蕉胚性愈伤组织，成胚质量和数量与对照之间的差异不大(见图3F)。随机挑取诱导出的抗性胚进行GUS染色发现，诱导的抗性胚都能发现明显的GUS反应(见图3G)，而未转化对照没有染色反应(见图3H)。
(5)将成熟的抗性体细胞胚和对照体细胞胚接种至M4体胚萌发培养基中，光/暗(12h/12h)条件下培养体胚萌发。对照体细胞胚培养2周体胚开始萌发，一个月后得到再生芽。0.5ml PCV的起始愈伤组织，获得发育正常的再生芽356个(见图4A)。未经液体筛选过程的第0代香蕉胚性愈伤组织诱导获得的抗性黄白色胚，由于胚的质量差，数量少，最终未能获得再生芽。而从液体筛选1代、2代和3代愈伤组织诱导的胚均获得正常抗性芽，0.5ml PCV起始胚性愈伤分别为再生芽65个、212个、320个(见图4B-图4D)。其中筛选3代的抗性芽的数量与的对照再生数量已经非常地接近。
(7)将再生芽转移至MR生根培养基上，光/暗(12h/12h)条件下进行培养，2周可以诱导出不定根系，即获得完整的转化植株。取抗性植株叶片，根系进行GUS染色，结果表明对照没有GUS染色，而抗性植株叶片和根系均可以被染成蓝色，阳性率达到100％(见图5A)，这也证明外源gus基因已经整合到贡蕉基因组中并能够表达。
(8)为了验证gus基因在贡蕉基因组中的整合情况，本发明对7株具有GUS活性贡蕉植株进行了PCR检测和Southern杂交。根据gus基因序列设计PCR特异引物：P1：(5'-GACGATTGCGTCGCATCGAC-3')，P2：(5'-CGAAAAGTTCGACAGCGTCTCC-3')。利用引物P1：(5’-CGTTATGTTTATCGGCACT-3’)和引物P2：(5’-TTGGCGACCTCGTATTGG-3’)扩增出含有Hyg基因的DNA片段，并在作为杂交探针进行Southern杂交。结果表明，具有GUS活性的转基因贡蕉株系均可增出844bp的目的条带(见图5B)，而且都有2-3条杂交条带(见图5C)，进一步证明gus基因已整合到贡蕉基因组中，而且再生香蕉的阳性率达到100％。
实施例2
本发明实施例提供的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括如下步骤：
(1)取继代培养10d香蕉主栽品种过山香(Musa Silk cv.Guoshanxiang，基因型AAB)ECS，离心去上清后，转移到高渗培养基上，每培养皿接种胚性愈伤组织约0.5mL PCV，处理4小时。
(2)用Bio-Rad公司的PDS-1000/He Biolistic型基因枪对处理的ECS进行轰击，每个培养皿轰击2枪，轰击距离为9cm,金粉直径0.6um，轰击压为1350psi,真空度为27-28inches Hg(负压)。
(3)轰击后的愈伤组织在高渗培养基上过夜恢复培养之后，转移至M2液体培养基再恢复培养7天。再转至SM2液体筛选培养基中，(27±1)℃，转速100r/min振荡培养，每3星期继代更换新的SM2液体筛选培养基，共继代三次，其中前2次继代用的液体筛选培养基潮霉素浓度为10mg/L，以后的抗生素浓度降至5mg/L。经过3代筛选，可以获得了生长良好的转基因的过山香抗性ECS。
(4)取0.5ml PCV第3代的胚性愈伤转至SM3体胚诱导筛选培养基(M3培养基+潮霉素浓度为5mg/L)上，27±1℃条件下，黑暗培养，每一个月继代一次，以未转基因材料为对照。经过3个月的培养，在没有潮霉素的M3体胚诱导培养基上的对照材料(正对照)诱导得到大量发育良好的白色成熟体细胞胚，而在含有5mg/L潮霉素的SM3培养基的对照材料(负对照)，未能诱导出胚。经过筛选3代的香蕉胚性愈伤组织，也能诱导得到大量发育良好的白色成熟体细胞胚。随机挑取诱导出的抗性胚进行GUS染色发现，诱导的抗性胚都能发现明显的GUS反应，而未转化对照没有染色反应。
(5)将成熟的抗性体细胞胚和对照体细胞胚接种至M4体胚萌发培养基中，光/暗(12h/12h)条件下培养体胚萌发。2周左右体胚开始萌发，一个月后得到再生芽。0.5ml PCV起始对照胚性愈伤和经过筛选3代的抗性芽分别获得再生芽298个和285个，相差不大。这说明抗性芽中已经转入了潮霉素抗性基因hpt。
(7)将再生芽转移至MR生根培养基上，光/暗(12h/12h)条件下进行培养，2周可以诱导出不定根系，即获得完整的转化植株。取抗性植株叶片，根系进行GUS染色，结果表明对照没有GUS染色，而抗性植株叶片和根系均可以被染成蓝色，阳性率达到100％，这也证明外源gus基因已经整合到过山香基因组中并能够表达。
实施例3
本发明实施例提供的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括如下步骤：
(1)取继代培养10d香蕉主栽品种贡蕉(Musa acuminata cv.Mas,AA)ECS，离心去上清后，转移到高渗培养基上，每培养皿接种胚性愈伤组织约0.5mL PCV，处理4小时。
(2)用Bio-Rad公司的PDS-1000/He Biolistic型基因枪对处理的ECS进行轰击，每个培养皿轰击2枪，轰击距离为9cm,金粉直径0.6μm，轰击压为1350psi,真空度为27-28inches Hg(负压)。
(3)轰击后的愈伤组织在高渗培养基上过夜恢复培养之后，转移至M2液体培养基再恢复培养7天。再转至SM2液体筛选培养基中，(27±1)℃，转速100r/min振荡培养，每3星期继代更换新的SM2液体筛选培养基，共继代三次，其中前2次继代用的液体筛选培养基潮霉素浓度为10mg/L，以后的抗生素浓度降至5mg/L。经过3代筛选，可以获得了生长良好的转基因的巴西香蕉抗性ECS。
(4)取0.5ml PCV第3代的胚性愈伤转至SM3体胚诱导筛选培养基(M3培养基+潮霉素浓度为5mg/L)上，27±1℃条件下，黑暗培养，每一个月继代一次，以未转基因材料为对照。经过3个月的培养，在没有潮霉素的M3体胚诱导培养基上的对照材料(正对照)诱导得到大量发育良好的白色成熟体细胞胚，而在含有5mg/L潮霉素的SM3培养基的对照材料(负对照)，未能诱导出胚。经过筛选3代的香蕉胚性愈伤组织，也能诱导得到大量发育良好的白色成熟体细胞胚。随机挑取诱导出的抗性胚进行GUS染色发现，诱导的抗性胚都能发现明显的GUS反应，而未转化对照没有染色反应。
(5)将成熟的抗性体细胞胚和对照体细胞胚接种至M4体胚萌发培养基中，光/暗(12h/12h)条件下培养体胚萌发。2周左右体胚开始萌发，一个月后得到再生芽。0.5ml PCV起始对照胚性愈伤和经过筛选3代的抗性芽分别获得再生芽368个和345个。这说明抗性芽中已经转入了潮霉素抗性基因hpt。
(6)将再生芽转移至MR生根培养基上，光/暗(12h/12h)条件下进行培养，2周可以诱导出不定根系，即获得完整的转化植株。取抗性植株叶片，根系进行GUS染色，结果表明对照没有GUS染色，而抗性植株叶片和根系均可以被染成蓝色，阳性率达到100％，这也证明外源gus基因已经整合到过山香基因组中并能够表达。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
基因序列表
<110>青岛农业大学、广东省农业科学院果树研究所
<120>一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法
<160> 4
<210> 1
<211>20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
GACGATTGCGTCGCATCGAC
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
CGAAAAGTTCGACAGCGTCTCC
<210>3
<211>19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
CGTTATGTTTATCGGCACT
<210>4
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
TTGGCGACCTCGTATTGG

Claims (9)

1.一种利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，所述利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法包括如下步骤：
步骤一，取在香蕉ECS液体培养中继代培养7～10天的香蕉ECS，离心去上清后，转移到高渗培养基上，每培养皿接种胚性愈伤组织0.2～0.5mL细胞密实体积，处理4～6小时；
步骤二，将处理的ECS进行基因枪轰击，每个培养皿轰击1～3枪；
步骤三，轰击后的ECS在黑暗条件下，过夜培养，之后转至M2液体培养基，转速100～120rpm再恢复培养4～7天；
步骤四，将恢复培养后的ECS，转至SM2液体筛选培养基中，27±2℃，黑暗条件下，培养振荡培养，每15～20天继代一次，连续继代3代以上；
步骤五，取筛选培养3代以后的培养物静置去上清，然后将悬浮物均匀铺于SM3体胚诱导筛选培养基上，黑暗培养2～3个月，每个月更换一次体胚诱导筛选培养基；
步骤六，成熟的抗性体胚转移至体胚萌发培养基M4上，光暗交替条件下培养至体胚萌发得到小苗；
步骤七，将小苗转移至MR生根培养基MR上，光暗交替条件下进行培养即获得完整的转化植株。
2.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤一中的高渗培养基成为：M2液体培养基+7g/L Agar+0.2mol/L Sorbitol+0.2mol/L mannito。
3.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤三中M2液体培养基组成为：MS+1mg·L-12,4-D+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+45g·L-1蔗糖，高压灭菌前pH 5.3。
4.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤四的SM2液体筛选培养基组成为步骤三中M2液体培养基+相应筛选抗生素，抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
5.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤四中继代的方法是：取悬浮培养物0.1～0.5mL加入到30～40mL新鲜筛选培养基中继续振荡培养，获得的抗性ECS为转化的香蕉ECS。
6.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤五中SM3体胚诱导筛选培养基组成为：M3体胚诱导培养基+相应筛选抗生素，抗生素根据转化质粒上所用的筛选标记基因而定。
其中：M3体胚诱导培养基组成为：MS+1mg·L-1生物素+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+0.2mg·L-1 NAA+0.1mg·L-1 Kinetin+45g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
7.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤六中:M4体胚萌发培养基组成为：MS+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+0.1mg·L-1 6-BA+0.2mg·L-1IAA+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH5.8。
8.如权利要求1所述的利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法，其特征在于，步骤七中:MR生根培养基组成为：MS+100mg·L-1谷氨酰胺+100mg·L-1麦芽提取物+30g·L-1蔗糖+7g·L-1琼脂粉，高压灭菌前pH 5.8。
9.一种如权利要求1～8任意一项所述利用基因枪法和液体培养基抗性筛选的香蕉遗传转化方法在香蕉育种中的应用。
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