EA028761B1 - Аллели 1-d-дезоксиксилулозо-5-фосфат синтазы, ответственные за усиленный биосинтез терпенов - Google Patents

Аллели 1-d-дезоксиксилулозо-5-фосфат синтазы, ответственные за усиленный биосинтез терпенов Download PDF

Info

Publication number
EA028761B1
EA028761B1 EA201390592A EA201390592A EA028761B1 EA 028761 B1 EA028761 B1 EA 028761B1 EA 201390592 A EA201390592 A EA 201390592A EA 201390592 A EA201390592 A EA 201390592A EA 028761 B1 EA028761 B1 EA 028761B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
misc
feature
seq
sequence
dxs
Prior art date
Application number
EA201390592A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201390592A1 (ru
Inventor
Филипп Южюэне
Эрик Дюшен
Дидье Мердиноглю
Original Assignee
Геноплант-Валор
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Геноплант-Валор filed Critical Геноплант-Валор
Publication of EA201390592A1 publication Critical patent/EA201390592A1/ru
Publication of EA028761B1 publication Critical patent/EA028761B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
    • A01H6/823—Nicotiana, e.g. tobacco
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/88—Vitaceae, e.g. Vitus [grape]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y202/00—Transferases transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C12Y202/01—Transketolases and transaldolases (2.2.1)
    • C12Y202/01007—1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (2.2.1.7)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу усиления активности 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфат синтазы (DXS) растений или бактерий с целью увеличить продукцию терпенов в клетках. Изобретение также относится к усилению последовательности DXS, которая может быть достигнута с помощью этого способа. Настоящее изобретение также относится к способу повышения производства терпенов в клетке-хозяине, содержащей усиленный фермент DXS. Наконец, изобретение относится к трансгенным бактериям или растениям, экспрессирующим этот полипептид.

Description

изобретение относится к способу усиления активности 1-дезокси-Б-ксилулозо-5-фосфат синтазы (DXS) растений или бактерий с целью увеличить продукцию терпенов в клетках. Изобретение также относится к усилению последовательности DXS, которая может быть достигнута с помощью этого способа. Настоящее изобретение также относится к способу повышения производства терпенов в клетке-хозяине, содержащей усиленный фермент DXS. Наконец, изобретение относится к трансгенным бактериям или растениям, экспрессирующим этот полипептид.
028761
Предпосылки изобретения Область изобретения
Настоящее изобретение относится к новому полипептиду, имеющему повышенную активность 1дезокси-О-ксилулозо-5-фосфат синтазы (DXS) по сравнению с белками DXS типичных растений или бактерий. Этот полипептид отвечает за значительное накопление терпенов в клетках.
Изобретение относится также к трансгенным растениям, бактериям или дрожжам, экспрессирующим этот полипептид и допускающим значительное повышение накопления терпенов, по сравнению с растениями, бактериями или дрожжами, экспрессирующими типичный ген DXS.
Изобретение также относится к способу производства терпенов при помощи культивирования трансгенных растений, бактерий или дрожжей, экспрессирующих этот полипептид.
Наконец, изобретение относится к трансгенным растениям, экспрессирующим этот полипептид и устойчивым к кломазону.
Уровень техники
Изопреноиды (также известные как терпеноиды или терпены) считаются крупнейшим семейством натуральных продуктов, встречающимся в природе, которое включает более чем 29000 индивидуальных соединений, идентифицированных на сегодняшний день. Химически они очень разнообразны по своей структуре и сложности. Изопреноиды участвуют во многих фундаментальных биологических функциях и, следовательно, они необходимы для нормального роста и процессов развития всех живых организмов. Так, например, изопреноиды включают стабилизаторы эукариотических мембран (стеролы), животные и растительные гормоны (стероиды, ретиноиды, гиббереллины и абсцизовую кислоту), пигменты для фотосинтеза (каротиноиды и фитол боковой цепи хлорофилла), и носители для транспорта электронов (менахинон, пластохинон и убихинон).
Следовательно, изопреноиды являются большой разнообразной группой сложных природных продуктов, со значительным коммерческим интересом. В настоящее время изопреноиды в основном экстрагируются из растений или химически синтезируются для использования в качестве фармацевтических препаратов (например, таксол, бисаболол и артемизинин), добавок в корма животных и пищевых красителей (различные каротиноиды, такие как ликопен и β-каротин) или приправ и ароматизаторов (например, ментол, пачулол и нуткатон).
Изопреноиды подразделяются на группы в соответствии с числом атомов углерода, которое они содержат; основными группами интереса являются монотерпены (C10), сесквитерпены (C15), дитерпены (C20) и тритерпены (C30).
Все изопреноиды синтезируются через общий метаболический предшественник, изопентенил дифосфат (IPP; C5). Ранее предполагалось, что IPP был синтезирован исключительно из мевалоната с помощью так называемого "мевалонатного пути". Однако более поздние исследования показали, что у эубактерий, зеленых водорослей и растений IPP также синтезируется за счет другого пути, называемого 2C-метил-D-эритритол-4-фосфатным путем (MEP). Таким образом, растения обладают как мевалонатным, так и MEP путями, ответственными за биосинтез IPP в цитозоле и пластидах соответственно.
Первым интермедиатом MEP пути является 1-деоксиксилулозо-5-фосфат (DXP), биосинтез которого от глицеральдегид-3-фосфата (G3P) и пирувата катализируется тиаминзависимым ферментом 1деоксиксилулозо-5-фосфат синтазой (DXS). Было показано, что DXS катализирует скоростьлимитирующий этап в формировании изопреноидов у бактерий и растений. Действительно, в Arabidopsis thaliana и помидорах (Lycopersicon esculentum) сверхэкспрессия ДКФС приводит к повышению уровня изопреноидов, таких как каротиноиды, которые получаются в пластидах. Это также имеет место у ароматических растений, таких как колос лаванды (Lavandula latifolia), где избыточная экспрессия ДКФС приводит к существенному увеличению продукции масел.
Терпеноиды являются частью ароматов и запахов многих растительных продуктов, и среди них монотерпенолы, вносящие существенный вклад в профили ароматов столового винограда и вин. Цветочные ароматы, описанные как ароматы розы или ландыша, связаны с присутствием таких молекул, как линалоол, гераниол, нерол, α-терпинеол или цитронеллол. Самые высокие концентрации этих молекул обнаруживаются в сортах группы Муската или в Гевюрцтраминере (Gewurztraminer), что приводит к очень характерному аромату у этих сортов. Цветочные ароматы появились спонтанно в генотипах, не связанных с группой Муската.
Недостатки предшествующего уровня техники
Некоторые дитерпеноиды коммерчески эксплуатируются, особенно в фармацевтическом секторе. Это справедливо, в частности, для дитерпеноидов из класса таксана, паклитаксела и доцетаксела, используемых в лечении рака молочной железы и рака яичников. Паклитаксел является естественной молекулой, извлекаемой из тиса (Taxus sp), в то время как доцетаксел представляет собой полусинтетическую молекулу, полученную из предшественника паклитаксела, 10-деацетил-баккатина III (или 10-DAB III), также извлекаемую из тиса. Были описаны большинство биосинтетических генов паклитаксела у тиса. Эти молекулы дорогостоящие из-за относительно низкой распространенности 10-DAB III и, особенно, паклитаксела в экстрактах тиса, а также из-за отсутствия синтетического метода, который может быть
- 1 028761
расширен до промышленного масштаба, вследствие сложной структуры молекул.
Таким образом, существует высокий спрос на способы получения интересующих терпенов по более низкой цене, также на производство производных терпенов, которые еще нелегко поддаются синтезу.
Химическая промышленность, производящая органические молекулы путем традиционных химических процессов, все чаще обращается к производственным процессам, в которых используются фабрики из микробных клеток. Основные факторы такого развития зеленой химии в том, что такие так называемые "биотехнологические процессы" более экологически чистые, что многие соединения, продуцируемые микроорганизмами, слишком сложны, чтобы быть получены путем органического синтеза, и что фабрики из микробных клеток предоставляют неограниченные поставки конкретного соединения. В настоящее время изопреноиды производятся в большом масштабе путем экстракции из растений или путем химического синтеза. Основными недостатками этих двух методов являются низкий выход и высокая стоимость. Третьим вариантом получения нужных изопреноидов является ферментативное превращение in vitro, но этот подход ограничен доступностью предшественников и, следовательно, в большинстве случаев экономически не выгоден.
Метаболическая инженерия микроорганизмов для производства изопреноидов может привести к производству больших количеств изопреноидов в ферментативных процессах от дешевых источников углерода, и тем самым решить многие текущие проблемы в промышленном производстве изопреноидов, допуская при этом биотехнологическое использование большого разнообразия группы изопреноиднов, которые найдены в природных соединениях.
Число изопреноидных продуктов, которые были произведены при помощи генной инженерии микроорганизмов, включает лимонен, каротиноиды, эпи-кедрол, таксадиен и другие. В целях повышения производства изопреноидов в E. coli, гены dxs (кодирующие DXP синтазу), dxr (кодирующие DXP редуктоизомеразу) и idi (IPP изомеразу) были сверхэкспрессированны с хорошими результатами для нескольких из вышеупомянутых изопреноидных продуктов (обзор в MAURY et al., 2005). Дальнейшее увеличение производства аморфадиена в E. coli было получено за счет экспрессии пути мевалоната от Saccharomyces cerevisiae в аморфадиен-продуцирующих штаммах E. coli. Некоторые изопреноидные соединения были также получены в дрожжах, в том числе эпи-кедрол в S. cerevisiae, ликопен и β-каротин в S.cerevisiae и Candida utilis. В ряде случаев было показано, что производство изопреноидов в дрожжах может быть повышено за счет сверхэкспрессии HMG1 (кодирующего HMG-CoA-редуктазу) (обзор MAURY et al., 2005).
Несмотря на уровень техники, описанный выше, по-прежнему существует необходимость в дальнейших процессах производства терпенов и терпеноидов и, в частности, в способах накопления терпенов в микроорганизмах с более высоким выходом, менее дорогостоящих и более интенсивных по времени, чем в ранее известных способах. Поэтому предметом настоящего изобретения является создание способа получения терпенов и терпеноидов, который отвечает этим потребностям.
Основным предметом настоящего изобретения является получение микроорганизма, который накапливает и/или секретируют большое количество терпенов в окружающую среду. Предпочтительно производство терпенов таким микроорганизмом является стабильным с течением времени.
Кроме того, предметом настоящего изобретения является инженерия растений с повышенным производством изопреноидов с целью очистки компонентов изопреноидов, как средство повышения питательной ценности пищевых культур или для повышения приспособленности самих растений путем увеличения резистентности к травоядным животным, вредителям или патогенам.
Настоящее изобретение направлено на преодоление этих и других недостатков, присущих предшествующему уровню техники, что обеспечено трансгенными растениями, бактериями или дрожжами, которые экспрессируют один из этих двух генов, и способны значительно повысить накопление терпенов по сравнению с растениями, бактериями или дрожжами, экспрессирующими типичный ген dxs.
Краткое описание фигур
Фигуры составляют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять, используя ссылку на одну или несколько из этих фируг в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов исполнения, представленных в данном документе.
Фиг. 1 - нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующих различным аллелям DXS в V. vinifera cv Muscat Ottonel (Оттонель Мускат) (MO) (MODXS1, SEQ ID NO: 8 and MODXS2, SEQ ID NO: 9) и Gewurztraminer (Гевюртцаминер) (Gw) (GWDXS2, SEQ ID NO: 10). Положения, соответствующие SNP (единичным нуклеотидным заменам), указаны жирным шрифтом.
Фиг. 2 - сравнение белков, соответствующих различным DXS аллелям в MO и Gw с ассоциированной консенсусной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 2.
Фиг. 3 - консенсусная последовательность (по которой последовательность SEQ ID NO: 1 была получена), которая является результирующей после сравнения белков DXS из различных видов растений:
1 строка: консенсусная последовательность,
2 строка: Mo_DXS1,
3 строка: Mo_DXS2,
- 2 028761
4 строка: GW_DXS2,
5 строка: Arabidopsis thaliana (Резуховидка Таля),
6 строка: Capsicum annuum (Перец овощной),
7 строка: Catharanthus poceyc (Катарантус розовый),
8 строка: Glycine max (Соя культурная),
9 строка: Narcissus pseudonarcissus (Нарцисс ложный),
10 строка: Nicotiana Tabacum (Табак обыкновенный),
11 строка: Oryza Sativa (Рис посевной).
Фиг. 4 - содержание терпенолов (пул из 5 основных терпенолов: гераниола, линалола, цитронеллола, нерола, α-терпинеола) в кожице виноградных ягод и DXS генотип в потомстве Мускат Оттонель
(2003 и 2004 гг.) (1: MoDXS1; 2: MoDXS2).
Фиг. 5 - содержание терпенолов (пул из 5 основных терпенолов: гераниола, линалола, цитронеллола, нерола, α-терпинеола) в виноградной ягодной кожице и DXS генотип в потомстве Гевюрцтраминер (2004 и 2005 гг.) (1: GwDXS1 = MoDXS1; и 2: GwDXS2).
Фиг. 6 - ГХ-МС (газово-хроматографический масс-спектрометрический) анализ терпенов, полученных в листьях табака, коэкспрессирующих DXS аллели из виноградной лозы и гераниол синтазу (GES) из базилика. А: Анализ табачных листьев, коэкспрессирующих MoDXS1 и GES. Б: Анализ табачных листьев, коэкспрессирующих MoDXS2 и GES.
Фиг. 7 - биосинтез гераниола в растениях после временной коэкспрессии GES и DXS аллелей в листьях табака, Нетрансформированные листья табака (контроль), экспрессия в листьях одной GES и коэкспрессирующия GES и DXS аллелей, которые были проанализированы с помощью ГХ-МС, 4 дня после Agrobacterium-опосредованной трансформации. Для каждого состояния указанны средние значения количества гераниола (±стандартные ошибки) от 9 независимых экспериментов.
Фиг. 8 - последовательность аминокислот MODXS1 (SEQ ID NO: 3), MODXS2 (SEQ ID NO: 4), усеченную MODXS2 с активностью DXS (SEQ ID NO: 5) и GWDXS2 (SEQ ID NO: 6), усеченную GWDXS2 с активностью DXS (SEQ ID NO: 7).
Фиг. 9 - нуклеотидная последовательность дикого типа гена DXS из E. coli (E. coli DXS), последовательность гена, кодирующего усеченную форму белка DXS (усеченный E. coli DXS), и последовательность генов, кодирующих белок DXS, скрытые мутации K213^N и R306^C (E. coli DXS-K213N и E. coli DXS-K234C соответственно).
Фиг. 10 - сравнение белков, соответствующих различным аллелям DXS в V. vinifera cv Muscat Ottonel (Оттонель Мускат) (MO) (MODXS1, SEQ ID NO: 8 и MODXS2, SEQ ID NO: 9) и Gewurztraminer (Гевюрцтраминер) (Gw) (GWDXS2, SEQ ID NO: 10) с DXS белком из E. coli (Lois et al., 1998). Аминокислоты, соответствующие SNP в MODXS2 и GWDXS2 и соответствующие аминокислоты в DXS из E. coli, выделены жирным шрифтом.
Фиг. 11 - анализ рекомбинантного DXS в додецилсульфат натрия полиакриламидном геле (SDSPAGE), экспрессированного в штамме E. coli BL21-Gold (DE3) pLysS.
Дорожка 1: маркер молекулярной массы.
Дорожка 2: BL21-Gold (DE3) pLysS, трансформированный плазмидой pHGWA-EcoliDXS.
Дорожка 3: BL21-Gold (DE3) pLysS, трансформированный плазмидой pHGWA-TruncatedEcoliDXS.
Дорожка 4: BL21-Gold (DE3) pLysS, трансформированный плазмидами pHGWA-EcoliDXS-K213N.
Дорожка 5: BL21-Gold (DE3) pLysS, трансформированный плазмидами pHGWA-EcoliDXS-K234C. DXS экспрессия была индуцирована с помощью 1 мМ IPTG в течение 24 ч при 28°C.
Стрелка указывает позицию белка DXS, и отображена молекулярная масса маркеров.
Фиг. 12 - коробчатая диаграмма, представляющая содержание монотерпенов в культуральной среде E. coli, трансформированной различными конструкциями DXS: EcoliDXS дикого типа, усеченный EcoliDXS, EcoliDXS-K213N, EcoliDXS-K234C. Содержание монотерпенов представляет собой сумму двух основных монотерпенов, накопленных в культурах E. coli: гераниола и геранила ацетата. Данные соответствуют результатам 4х независимых экспериментов. Для каждой конструкции жирные полосы представляют собой медиану, пределами коробов являются 1-я и 4-я квартили, и полосы снаружи от коробов указывают на крайние значения.
Фиг. 13 - аминокислотная последовательность DXS из E. coli, E. coli DXS-K213N, E. coli DXSK234C и усеченный E. coli DXS.
Фиг. 14 - консенсусная последовательность DXS бактерий (указаны консервативные аминокислоты, точки показывают неконсервативные аминокислоты). Аминокислоты, соответствующие K213 и K234 в белке DXS из E. coli, заштрихованы.
Фиг. 15 - консенсусная последовательность DXS бактерий, включая Deinococcus radiodurans (указаны консервативные аминокислоты, точки показывают неконсервативные аминокислоты).
Фиг. 16 - аминокислотная последовательность белков DXS из E. coli, Shigella dysenteriae, Citrobacter sp., Salmonella enterica, Enterobacter sp., Cronobacter sakazakii, Klebsiella pneumonia, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia pestis, Erwinia sp., Pantoea ananatis, Dickeya dadantii, Pectobacterium atrosepticum, Xenor- 3 028761
habdus nematophila, Rahnella sp., Serratia odorifera и Deinococcus radiodurans.
Фиг. 17 - консенсусная последовательность DXS растений (указаны консервативные аминокислоты, точки показывают неконсервативные аминокислоты). Аминокислоты, соответствующие K284 и R306 в белке DXS из V. vinifera заштрихованы.
Фиг. 18 - аминокислотная последовательность белков DXS из Vitis vinifera, Arabidopsis thaliana, Pinus densiflora, Chlamydomonas reinhardtii и Dunaliella salina.
Подробное описание изобретения
Первый предмет настоящего изобретения относится к способу усиления активности 1-дезокси-Оксилулозо-5-фосфат синтазы (DXS) растений или бактерий с целью увеличить производство терпенов, включающий стадии:
а) определение по меньшей мере одного сайта мутации, предпочтительно двух на полипептиде, имеющим активность DXS из растений или бактерий, делая сравнение последовательностей между референсной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, и последовательностью указанного растения или бактерии;
б) осуществление мутации по меньшей мере одного сайта мутации, предпочтительно двух сайтов мутации;
с) получение полипептида, обладающего повышенной активностью DXS по сравнению с типичной
DXS.
Шаг (а) определения сайта мутации(й) может быть сделан путем проведения сравнения последовательностей. Последовательность растения или бактерии для отключения оптимально может быть выстроена в ряд с референсной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23.
Предпочтительно референсная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20.
Более предпочтительно SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6 используются в качестве референсных последовательностей для определения сайта мутации на растительном полипептиде и SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 20 используются в качестве референсных последовательностей для определения сайта мутации на бактериальных полипептидах.
Так, например, аминокислоты, соответствующие K284 и R306 в DXS из Vitis vinifera (европейского винограда) могут быть идентифицированы в белке DXS из другого организма, используя компьютерную программу для множественного сравнения последовательностей, такую как ClustalW (Thompson et al., 1994) или MUSCLE (Edgar, 2004).
В данном документе термины "усиление активности DXS" и "усиленная DXS" относятся к модифицированной DXS в соответствии с настоящим изобретением, которые позволяют увеличить производство и/или накопление терпенов в клетке-хозяине, например в растении, бактерии или дрожжах, трансформированных этой модифицированной DXS, в сравнении с клеткой-хозяином, экспрессирующей типичный ген DXS.
Выражение "типичный ген DXS", используемое в данном документе, обозначает ген, появляющийся с высокой частотой, например дикий тип DXS MoDXS1, также известный как SEQ ID NO: 8.
Как используется в данном документе, термин "мутация" обозначает любое изменение последовательности исходной последовательности нуклеиновой кислоты. Эти мутации включают мелкие мутации или мутации большого масштаба. Мелкими мутациями являются те, которые затрагивают один или несколько нуклеотидов в гене, включающие точечные мутации, инсерции или делеции одного или нескольких дополнительных нуклеотидов в ДНК. Точечные мутации могут быть молчащими, миссенсмутациями и нонсенс-мутациями. Мутации большого масштаба в геномной структуре, такие как дупликации генов, делеции или мутации, которые сопоставляют ранее разделенные фрагменты ДНК, потенциально объединяют отдельные гены с образованием функционально отличающихся слитых генов. Эти последние мутации включают хромосомные транслокации, интерстициальные делеции, хромосомные инверсии и потерю гетерозиготности.
Предпочтительно настоящее мутации являются точечными мутациями. Точечные мутации являются отдельными заменами, делециями или добавками, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшой процент аминокислот (обычно менее 5%, более типично менее 4, 2 или 1% или менее).
Как используется в данном документе, термин "сайт мутации" обозначает локус полинуклеотида, представленный одним или несколькими нуклеотидами, который является объектом для мутации, как описано ранее.
Способы осуществления указанных мутаций хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, сайт-направленный мутагенез может быть выполнен с использованием набора QuikChange kit (Stratagene, La Jolla, CA).
Способы сайт-направленного мутагенеза также были описаны Zoller & Smith (1982) "Oligonucleo- 4 028761
tide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment" Nucleic Acids Res. 10:6487-6500.
Как используется в данном документе, выражение "увеличение производства терпенов" обозначает, что количество терпенов, полученных и/или накопленных в клетке-хозяине, например растении, бактерии или дрожжах, трансформированных этой модифицированной DXS, выше, чем количество терпенов, полученных и/или накопленных в клетке-хозяине, экспрессирующей типичный ген DXS.
Предпочтительно производство терпенов в соответствии с настоящим изобретением увеличено в десять раз.
Например, мутация K234^C, введенная в полинуклеотид, кодирующий фермент DXS E. coli, позволяет увеличить производство терпенов по меньшей мере в десять раз.
Второй предмет настоящего изобретения относится к полипептиду растения или бактерии, имеющему повышенную активность DXS по сравнению с типичной DXS указанного растения или бактерии, которые могут быть получены по способу настоящего изобретения.
Третий предмет настоящего изобретения относится к выделенному полипептиду, имеющему активность DXS, который содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 21 или с ее фрагментами, в которой аминокислота в положении 213 в SEQ ID NO: 21 представляет собой аспарагин и/или аминокислота в положении 234 в SEQ ID NO: 21 представляет собой цистеин.
SEQ ID NO: 21 представляет собой консенсусную последовательность DXS бактерий, включая Deinococcus radiodurans, который часто описывают в литературе.
В предпочтительном варианте исполнения выделенный полипептид по данному изобретению имеет последовательность SEQ ID NO: 22 или ее фрагменты, в которой аминокислоты в положении 213 в SEQ ID NO: 22 представляет собой аспарагин и/или аминокислоты в положении 234 в SEQ ID NO: 22 представляет собой цистеин.
SEQ ID NO: 22 представляет собой консенсусную последовательность DXS бактерий, отличающуюся от SEQ ID NO: 21 тем, что она не включает последовательность DXS D. radiodurans.
В более предпочтительном варианте исполнения полипептид по настоящему изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 19.
В более предпочтительном варианте исполнения полипептид по настоящему изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 20.
Четвертым предметом настоящего изобретения является выделенный полипептид, имеющий активность дезокси^-ксилулозосинтазы (DXS), который содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1, или с ее фрагментами, где аминокислота в положении 310 SEQ ID NO: 1 представляет собой цистеин и/или аминокислота в положении 288 в SEQ ID NO: 1 представляет собой аспарагин.
Как используется в данном документе, термины "аминокислота" и "аминокислоты" относятся ко всем естественным L-a-аминокислотам или их остаткам. Аминокислоты обозначены либо одной буквой или трехбуквенным обозначением (Asp D аспарагиновая кислота; Ile I изолейцин; Thr T треонин; Leu L лейцин, Ser S серии; Tyr Y тирозин; Glu E глутаминовая кислота, Phe F фенилаланин ; Pro P пролин; Hls H гистидин; Gly G глицин; Lys K лизин; Ala A аланин, Arg R аргинин; Cys C цистеин; Trp W триптофан, Val V валин; Gln Q глутамин; Met M метионин; Asn N аспарагин).
Следует также понимать, что природные аминокислоты могут быть также заменены химически модифицированными аминокислотами. Как правило, такие химически модифицированные аминокислоты позволяют увеличивать период полураспада полипептида.
Термин "1-дезокси^-ксилулозо-5-фосфат синтаза" (сокращенно "DXS") используемый в данном документе, означает фермент, способный катализировать транскетолазный тип конденсации, вовлекающий пируват и глицеральдегид-3-фосфат (GAP) с образованием 1-дезокси^-ксилулозо-5-фосфата. Указанная ферментативная активность может быть легко определена с использованием радиоактивномеченого субстрата, как описано Lois et al. (1998). Ферментативная реакционная смесь состоит из 50 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 мМ MgCl2, 1 мМ тиамина дифосфата, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мМ [2-14С] пирувата (15,9 mCi/ммоль, NEN), 50 мМ пирувата, 50 мМ DL-глицеральдегид-3-фосфата в конечном объеме 50 мкл. После инкубации в течение 2 ч при 37°C реакцию останавливают нагреванием до 80°C в течение 3 мин. После центрифугирования при 13000 g в течение 5 мин, 10 мкл супернатанта (2-5 мл) наносят на TLC-пластинку (силикагель 60, Merck). Меченный D-1-деоксиксилулозо-5-фосфат отделяется от [214С] пирувата с использованием в качестве растворителя н-пропиловый спирт/этилацетат/^O (6:1:3) и подсчитывается с помощью авторадиографии или сцинтилляционного счетчика. В качестве альтернативы может быть использован флуориметрический анализ 1-дезокси^-ксилулозо-5-фосфат синтазы, как описано Querol et al. (2001).
Предпочтительно выделенный полипептид согласно данному изобретению содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2 или ее фрагментами, в которой аминокислота в положении 306 в SEQ ID NO: 2 представляет собой цистеин и/или аминокислота в положении 284 в SEQ ID NO: 2 представляет собой аспарагин.
- 5 028761
Также предпочтительно полипептид согласно данному изобретению имеет ферментативную активность, которая по меньшей мере на 50% выше по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 3, предпочтительно по меньшей мере на 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% выше по сравнению c SEQ ID NO: 3.
В более предпочтительном варианте исполнения полипептид по настоящему изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 4.
В более предпочтительном варианте исполнения полипептид по настоящему изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 6.
Используемый в данном документе термин "процент идентичности" двух аминокислотных последовательностей означает процент идентичных аминокислот между двумя сравниваемыми последовательностями, полученный при лучшем выравнивании указанных последовательностей, этот процент является чисто статистическим и различия между этими двумя последовательностями случайно распределены по аминокислотной последовательности. Используемый в данном документе термин "лучшее выравнивание" или "оптимальное выравнивание" означает выравнивание, для которого определенный процент идентичности (см. ниже) является самым высоким. Сравнение последовательностей между двумя аминокислотными последовательностями обычно реализуется путем сравнения этих последовательностей, которые ранее были выровнены в соответствии с лучшим выравниванием; это сравнение осуществляется на сегментах сравнения для определения и сравнения локальных областей сходства. Лучшее выравнивание последовательностей для выполнения сравнения может быть сделано ручным способом, используя алгоритм глобальной гомологии, разработанный SMITH и WATERMAN (Ad. Арр. Math., vol. 2, p. 482, 1981), используя алгоритм локальной гомологии, разработанный NEDDLEMAN и WUNSCH (J. Mol. Biol., vol. 48, p. 443, 1970), с помощью метода сходства, разработанный PEARSON и LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol. 85, p. 2444, 1988), используя компьютерное программное обеспечение с использованием таких алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA в программном обеспечении Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USA), используя MUSCLE множественный алгоритм выравнивания (Edgar, Robert С, Nucleic Acids Research, vol. 32, p. 1792, 2004). Чтобы получить лучшее локальное выравнивание, предпочтительно можно использовать программное обеспечение BLAST с матрицей BLOSUM 62 или с матрицей PAM 30. Процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей, аминокислотные последовательности могут включать добавления или делеции по отношению к референсной последовательности с целью получить оптимальное выравнивание этих двух последовательностей. Процент идентичности рассчитывают путем определения количества идентичных положений между этими двумя последовательностями, разделив это число на общее количество сравненных позиций и умножив полученный результат на 100, чтобы получить процент идентичности между двумя последовательностями.
В соответствии с предпочтительным вариантом исполнения полипептид согласно данному изобретению имеет идентичность по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно 100% с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В данном документе фрагменты SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2 обозначают полипептиды, имеющие длину по меньшей мере 300 аминокислот, предпочтительно имеющие длину по меньшей мере 400 аминокислот, более предпочтительно имеющие длину по меньшей мере 500 аминокислот.
В качестве примера фрагмента SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, обозначающих полипептид с активностью DXS, можно привести SEQ ID NO: 5, соответствующую усеченному полипептиду MODXS2, или SEQ ID NO: 7, соответствующую усеченному полипептиду GWDXS2.
В качестве примера консенсусной последовательности DXS растений приведена SEQ ID NO: 23. Она включает в себя последовательность DXS V. vinifera (Mo_DXS1) и последовательность DXS A. thaliana, P. densiflora, С. reinhardtii и D. salina.
Пятый предмет настоящего изобретения относится к изолированному полинуклеотиду, кодирующему полипептид, в соответствии с настоящим изобретением.
Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть в форме РНК или в форме ДНК, предпочтительно в форме ДНК.
ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной.
В соответствии с предпочтительным вариантом исполнения полинуклеотид включает последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9 (MODXS2), SEQ ID NO: 10 (GWDXS2), SEQ ID NO: 15 (E. coli DXS-K213N) и SEQ ID NO: 16 (E. coli DXS-K234C).
Шестой предмет настоящего изобретения относится к вектору, содержащему полинуклеотид согласно настоящему изобретению.
Указанный вектор может быть вектором для клонирования или экспрессирующим вектором, предпочтительно экспрессирующим вектором, и может быть, например, в форме плазмиды, космиды, фагемида, вирусной частицы, фага и т.д.
Такие векторы могут включать в себя бактериальные плазмиды, фага ДНК, бакуловирус, плазмиды дрожжей, векторы, полученные из комбинации плазмиды и фаговой ДНК, вирусную ДНК, такую как
- 6 028761
коровья оспа, аденовирус, вирус оспы птиц и псевдобешенство. Большое количество подходящих векторов известно специалистам в данной области техники и является коммерчески доступным. Следующие векторы приведены в качестве примера. Бактериальные: pQE70, pQE60, pQE-9 (QIAGEN), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (STRATAGENE), ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (PHARMACIA). Эукариотические: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (STRATAGENE), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (PHARMACIA). Тем не менее, любой другой вектор может быть использован при условии, что он реплицируется и жизнеспособен в хозяине.
Полинуклеотидная последовательность, предпочтительно последовательность ДНК в экспрессирующем векторе, функционально связана с соответствующей контролирующей последовательностью (промотором) для прямого синтеза мРНК. В качестве репрезентативных примеров таких промоторов, можно упомянуть прокариотические или эукариотические промоторы, такие как ранний промотор CMV, тимидинкиназа HSV, ранний и поздний SV40, LTR от ретровирусов, и мышиный металлотионеин-I. Экспрессирующий вектор содержит также сайт связывания рибосом для инициации трансляции и транскрипционный вектор. Вектор также может включать в себя соответствующие последовательности для усиления экспрессии.
Кроме того, экспрессирующие векторы предпочтительно содержат один или несколько маркерных генов для селекции, чтобы обеспечить фенотипический признак для отбора трансформированных клеток-хозяев, таких как дигидрофолатредуктаза или устойчивость к неомицину для эукариотической клеточной культуры, или таких как устойчивость к тетрациклину или ампициллину в E. coli.
Вектор по данному изобретению, содержащий соответствующую полинуклеотидную последовательность, как описано в данном документе выше, а также соответствующий промотор или контролирующую последовательность, может быть использован для трансформации подходящего хозяина, чтобы дать возможным клетке-хозяину экспрессировать полипептид.
В качестве примера, транскрипция ДНК, кодирующей полипептид, описанный ранее, высшими эукариотами может быть увеличена путем вставки последовательности энхансера в вектор. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно примерно от 10 до 300 pb, которые действуют на промотор, чтобы увеличить его транскрипцию. Примеры энхансера включают SV40энхансер, CMV энхансер раннего промотора и энхансеры аденовируса.
Седьмой предмет настоящего изобретения относится к трансформированной клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид или вектор, описанный выше.
Термины "трансформированная клетка-хозяин", "трансформированный" и "трансформация" относятся к введению ДНК в клетку. Клетки называют "клетка-хозяин", и это может быть прокариотическая или эукариотическая клетка. Типичными прокариотическими клетками-хозяевами являются различные штаммы E. coli. Типичными эукариотическими клетками-хозяевами являются клетки растений, таких как кукуруза, дрожжевые клетки, клетки насекомых или клетки животных. Выбор подходящего хозяина делается специалистом в данной области техники, исходя из доктрины, приведенной в данном документе.
Трансформированная клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением является прокариотической или эукариотической клеткой. Введение полинуклеотида или вектора, описанных ранее, в клетку-хозяин может быть осуществлено способом, хорошо известным специалисту в данной области, таким как кальций-фосфатная трансфекция, DEAE-опосредованная трансфекция или электропорация.
В соответствии с предпочтительным вариантом исполнения трансформируемая клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением является прокариотической клеткой, выбранной из группы, содержащей эубактериальные, архебактериальные и циано-бактериальные клетки.
Более предпочтительно трансформируемая клетка-хозяин в соответствии с настоящим изобретением является прокариотической клеткой и даже более предпочтительно представляет собой клетку Escherichia coli.
Прокариоты могут быть также использованы в качестве клеток-хозяев для начальной стадии клонирования по данному изобретению. Они особенно полезны для быстрого производства больших количеств ДНК, для получения одноцепочечной ДНК-матрицы, используемой для сайт-направленного мутагенеза, для одновременного скрининга большого числа мутантов, и для секвенирования ДНК полученных мутантов. Подходящими прокариотическими клетками-хозяевами являются E. coli K12 штамм 94 (ATCC No. 31,446), E. coli штамм W3110 (ATCC No. 27,325) E. coli X1776 (ATCC No. 31,537) и E. coli В; как бы то ни было, большое число других штаммов E. coli, таких как НВ101, JM101, NM522, NM538, NM539 и много других видов и родов прокариот, в том числе бациллы, такие как Bacillus subtilis, другие энтеробактерии, такие как Salmonella typhimurium или Serratia marcesans, а также различные виды Pseudomonas могут быть использованы в качестве хозяев.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом исполнения трансформируемая клеткахозяин в соответствии с настоящим изобретением является эукариотической клеткой, выбранной из группы, содержащей животные, грибковые, дрожжевые и растительные клетки.
Предпочтительно эукариотическая клетка является грибковым микроорганизмом, в частности дрожжами.
Неполный список подходящих микроорганизмов будет включать в себя следующее: виды, принад- 7 028761
лежащие к роду Saccharomyces, например S. cerevisiae, S. bayanus, S. pastorianus, S. paradoxus, S. exiguous, S. servazzi, S. uvarum, S. Kluyveri и S. castellii, виды, принадлежащие к роду Kluyveromyces, например K. lactis, K marxianus var. marxianus, K. thermotolorens, K. waltii, K. delphensis, K. nonfermentas и K. Wickerhamii, виды, принадлежащие к роду Candida, например C. utilis, C. tropicalis, C. castellii и C. humilis, виды, принадлежащие к роду Zygosaccharomyces, например Z. rouxii, Z. bailii, Z. fermentati, Z. bisporus и Z florentinus, виды, принадлежащие к роду Pichia, например P. stipidis, P. pastoris, P. sorbithophila и P. anomala, или другие виды, например Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Debaromyces hansenii, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbueckii, Ashbya gossipie, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Penecillium chrysogenum, Rhizopus oryzae и Mucor circenelloides.
Более предпочтительно эукариотическая клетка является дрожжевой и даже более предпочтительно, чтобы микроорганизм являлся Saccharomyces cerevisiae. Например, это штамм S.cerevisiae, депонированный в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Mascheroder Weg 1b, D38124 Braunschweig, Germany, номер в каталоге: DSMZ 17900, 27 января 2006.
Гетерологичным путем для достижения цели настоящего изобретения является путь, который в результате своей активности приводит к образованию соединений определенных промежуточных шагов из определенных исходных материалов и не присутствует в диком типе данного микроорганизма. Более предпочтительно, когда гетерологичным путем является путь, полученный из ДНК различных видов.
В качестве альтернативы эукариотической клеткой является клетка растения, более предпочтительно растительная клетка, выбранная из группы, содержащей клетки Vitis vinifera, Nicotiana tabacum и Arabidopsis thaliana, еще более предпочтительно указанная растительная клетка представляет собой клетку Vitis vinifera, еще более предпочтительнее клетку a Vitis vinifera Cv Muscat Ottonel или a Vitis vinifera Cv Gewurztraminer, еще более предпочтительнее клетку a Vitis vinifera Cv Gewurztraminer.
Восьмой предмет настоящего изобретения относится к трансгенной бактерии, содержащий полинуклеотид или вектор, описанный выше.
Девятый предмет настоящего изобретения относится к трансгенному растению, содержащему полинуклеотид, вектор или клетку-хозяин, описан ранее.
Трансформация культивируемых растительных клеток-хозяев, как правило, осуществляется через Agrobacterium tumifaciens. Таким образом, трансгенные растения могут быть получены, например, путем трансформации вектора по настоящему изобретению (например, кодирующего 1-деоксиксилулозо-5фосфат синтазу) и ген селектирующего маркера (например, ген кап, кодирующий устойчивость к канамицину) в Agrobacterium иптГасют.содсржащий хелперную Ti плазмиду, как описано в HOECKEMA et al. (Nature, 303:179-181, 1983), и культивированием клеток Agrobacterium с ломтиками листьев или другими тканями или клетками растения, в которые должны быть трансформированы, как описано в AN et al. (Plant Physiology, 81:301-305, 1986). Тем не менее, могут быть использованы другие способы введения ДНК в клетки, такие как полибрен (Kawai and Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 [1984]), слияние протопластов (Schafer, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 77:2163 [1980]), электропорация (Neumannet al., EMBOJ., 1:841 [1982]) и прямая микроинъекция в ядро (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]).
Трансформированные растительные каллусы могут быть выбраны посредством селективного маркера путем выращивания клеток на среде, содержащей, например, канамицин и соответствующее количество фитогормонов, таких как нафталин уксусная кислота и бензиладенин для каллуса и shootиндукции. Затем растительные клетки могут быть регенерированы, и полученные растения перенесены в почву с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области.
В соответствии с предпочтительным вариантом исполнения трансгенное растение по данному изобретению включает в геном полинуклеотид или вектор, как описано выше.
Предпочтительно указанное растение выбирают из группы, содержащей деревья, овощи, суккуленты и декоративные растения.
Тем не менее предпочтительно, когда трансгенное растение является устойчивым к кломазону, также называемому диметазон (FMC 57020; 2-(2-хлорфенил)метил-4,4-диметил-3-изоксалидинон).
Используемый здесь термин трансгенное растение, которое устойчиво к кломазону, означает растение, которое растет в присутствии 10 мкМ кломазона (Carretero-Paulet L., Cairo A., Botella-Pavia P., Besumbes О., Campos N., Boronat A., Rodriguez-Conception M. (2006). Enhanced flux through the methylerythritol 4-phosphate pathway in Arabidopsis plants overexpressing deoxyxylulose 5-phosphate reductoisomerase. Plant Mol. Biol. 62: 683-95).
Также предпочтительно указанное трансгенное растение обладает усиленным ароматом.
В качестве примера указанное трансгенное растение выбрано из группы, содержащей Lamiaceae (Яснотковые)(например, Ocimum (базилик), Lavandula (лаванда), Origanum (орегано), Mentha (мята), Salvia (шалфей), Rosmecinus (розмарин), Thymus (чабрец), Satureja (чабер) и Monarda (монарда); Umbelliferae (зонтичные) (например, Carum (тмин), Anethum (укроп), Feniculum (фенхеля) и Daucus (морковь)); Asteraceae (астровых) (сложноцветных) (например, Artemisia (эстрагон, кисти шалфея) и Tanacetum (пижма)); Rutaceae (рутовые) (например, цитрусовые растения), Rosaceae (розоцветные) (например, розы); Myrtaceae (миртовые) (например, эвкалипт, Melaleuca (чайное дерево)), Gramineae (злаки) (например, Cymbopogon (цимбопогон) (цитронелла)); Geranaceae (гераниевые) (Geranium (герань)) и не- 8 028761
которых хвойных деревьев, в том числе Abies (пихты) (например, Canadian balsam (канадского бальзама)), Cedrus (кедр) (кедр), Thuja (туи) и Juniperus (можжевельника).
Десятый объект настоящего изобретения относится к потомству любой генерации трансгенных растений настоящего изобретения, указанное потомство содержит полипептид, полинуклеотид, вектор или клетки-хозяева, описанные ранее.
Указанное потомство может иметь форму растения или семян.
Одиннадцатый объект настоящего изобретения относится к способу получения трансгенного растения, как описано выше, включающий стадии:
а) трансформация растительной клетки вектором, как описано выше;
б) выбор трансформированной растительной клетки, которая экспрессирует полипептид, как описано выше, и
в) выращивание трансгенного растения из указанной трансформированной растительной клетки.
Стадия (а) трансформации может быть сделана с помощью хорошо известных методов, как описано выше, таких как электропорация, трансфекция, поглощение голой ДНК, выращивание протопласта, прямой перенос ДНК в пыльцу, эмбриональные или плюрипотентные клетки растения, Agrobacterium опосредованной трансформации, бомбардировки частицами или бомбардировки микрочастицами.
Стадия (б) выбора может быть сделана с помощью хорошо известных методов.
Стадия (в) выращивание кломазон-устойчивого трансгенного растения из указанной трансформированной растительной клетки может быть сделано с помощью хорошо известных методов, таких как выращивание плюрипотентных клеток растений от указанной трансформированной растительной клетки.
В соответствии с предпочтительным вариантом исполнения указанный способ используется для получения семян растений, указанный способ дополнительно включает стадию:
г) получение семян из указанного трансгенного растения.
В соответствии с конкретным вариантом исполнения способ по данному изобретению является способом для получения трансгенного растения, которое устойчиво к кломазону.
Предпочтительно указанное трансгенное растение получают хорошо известными способами, такими как описанные в Klee H., Horsch R., Rogers S. (1987) Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its Further Applications to Plant Biology. Annual Review of Plant Physiology 38, 467-486 and Potrykus I (1991) Gene Transfer to Plants: Assessment of Published Approaches and Results. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42, 205-225.
В соответствии с другим вариантом исполнения способ по изобретению является способом для получения трансгенного растения, которое имеет увеличенные возможности биосинтеза терпенов. Растение с повышенными возможностями биосинтеза терпенов будет синтезировать по меньшей мере на 50% больше терпенов по сравнению с диким типом указанного трансгенного растения, предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 100%.
Предпочтительно к терпенам относятся гераниол, линалол, цитронеллол, нерол и α-терпинеол.
Предпочтительно полипептид по данному изобретению имеет ферментативную активность, которая по меньшей мере на 50% выше по сравнению с полипептидом SEQ ID NO: 3, предпочтительно по меньшей мере на 70% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 100% выше по сравнению c SEQ ID NO: 3.
Указанные растения, которые имеют возможности биосинтеза терпенов, могут быть ароматическими растениями, как, например, Mentha piperita, Lavandula latifolia или Rosmarinus officinalis, и лекарственными растениями, как, например, Artemisia annua, Taxus baccata, Catharanthus roseus или Lithospermum erythrorhizon, а также любыми видами растений, которые продуцируют ценные соединения терпенов, как, например, растения, которые производят каротиноиды, такие как Lycopersicon esculentum, Manihot esculenta или Oryza sativa.
Предпочтительно указанное трансгенное растение выбирают хорошо известными способами, такими, как описаны в Klee et al. (1987) и Potrykus (1991).
Двенадцатый предмет настоящего изобретения относится к способу получения усиленного фермента DXS, который увеличивает производство терпенов в растениях, бактериях или дрожжах, включающий следующие шаги:
а) культивирование трансформированной клетки-хозяина, как описано выше;
б) получение усиления фермента DXS, который позволяет увеличить производство терпенов в растениях или бактериях.
Предпочтительно полипептид, обладающий повышенной активностью DXS, может быть получен по способу, описанному ранее.
Тринадцатый предмет настоящего изобретения относится к способу производства терпенов в клетке-хозяине, включающий стадии:
а) культивирование трансформированной клетки-хозяина, как определено выше, в условиях, эффективных для получения терпенов (например, растений, бактерий или дрожжевых клеток), как описано ранее, в условиях, эффективных для получения большего количества субстрата терпенов (монотерпенов,
- 9 028761
дитерпенов, тритерпенов и/или политерпенов) при помощи фермента DXS2, указанное получение большого количества субстрата терпенов приводит к производству большого количества терпенов путем ферментативной модификации субстратов терпенов.
б) Получение указанных терпенов из указанной клетки-хозяина.
Терпен является насыщенным или ненасыщенным, необязательно с замещенной углеводородной основой или состоит, по существу, из единиц изопрена (C5). Терпены могут быть циклические или ациклические. Терпены, используемые в данном документе, включают терпены, терпеновые производные и соединения, относящиеся к терпеноидам, которые могут или не могут попасть в один из вышеописанных классов соединений. Терпеновые производные включают соединения, которые прошли одну или более стадий функционализации, таких, например, как гидроксилирование, изомеризация, окислениевосстановление или ацилирование. Предпочтительно для целей настоящего изобретения терпен представляет собой соединение, которое соответствует этому условию, и/или у которого углеродный скелет происходит, по крайней мере частично, но предпочтительно полностью, из MEP и/или MEV пути. Соответственно, терпены включают терпеновые спирты, например C15H26O и C10H18O соединения, такие как пачулол, эпи-кедрол, кубебол, линалоол, неролидол, например, и диспирты (дитерпеновые спирты), например склареол. Терпены также включают дифосфатные соединения, такие как борнил-дифосфат (монотерпен) и копалил-дифосфат (дитерпен), и это лишь несколько образцов огромной категории терпенов.
Используемый в данном документе термин "производное" относится к любому соединению, которое получают из известных или предполагаемых соединений и которое содержит основные элементы исходного вещества.
Например, терпены являются соединениями, имеющими углеродный скелет из C10, C15, C20, C30, C40, C45 и так далее.
Соответственно, термин "терпен" включает моно-, сескви-, ди-, три-, тетра- и/или политерпены.
Предпочтительно указанные терпены включают гераниол, линалол, цитронеллол, нерол и αтерпинеол.
В соответствии с предпочтительным вариантом исполнения микроорганизм по настоящему изобретению обеспечивает выход по меньшей мере 30 мкг, более предпочтительно по меньшей мере 100 мкг терпенов на 1 г свежей массы микроорганизма. Выход терпенов с микроорганизма предпочтительно установлен протоколом в примере 2.
Терпены могут накапливаться в клетках. Например, они могут накапливаться в цитоплазме, в митохондриях, клеточных мембранах или других органеллах клетки. Многие терпены являются липофильными соединениями, которые накапливаются в плазматической мембране клетки.
Для целей настоящего изобретения термин "накопление в среде" также охватывает накопление в растворителе в течение двухфазного процесса ферментации.
Способ включает этап культивирования трансформированной клетки-хозяина в условиях, подходящих для получения указанного терпена. Эти условия известны специалистам в данной области техники. Как правило, они могут быть скорректированы путем подбора адекватной среды, сосуда для ферментации, температуры и рН.
Способ получения терпенов может включать этап выделения терпенов из среды, из клеток и/или органического растворителя, в случае, если выполняется двухфазная ферментация. Терпены могут быть выделены любым способом, используемым в данной области, включая, но не ограничиваясь, например, хроматографией, экстракцией и дистилляцией.
Специалисту в данной области техники хорошо известно, что, например, монотерпены обычно получаются в пластидах и сесквитерпены в цитозоле.
В отличие от растений микробные системы, где большое число различных модификаций могут быть сравнены и объединены, являются более пригодными для инженерных проектов с большими объемами продаж. Однако микробы производят некоторые технические недостатки по сравнению с растениями, особенно когда дело доходит до экспрессии гетерологичных генов.
Четырнадцатый предмет настоящего изобретения относится к способу выбора ароматических растений, включающий стадии:
а) определение по меньшей мере одной мутации в DXS, которая приводит к аллельным изменениям DXS с повышенным синтезом терпенов и/или анализ накопления терпенов в биологическом образце от указанного растения;
б) выбор растений, содержащих указанные мутации.
Пятнадцатый предмет настоящего изобретения относится к способу получения фермента DXS, который является более устойчивым к кломазону, включающий стадии:
а) культивирование трансформированной клетки-хозяина, как описано выше;
б) получение фермента DXS, который более устойчив к кломазону, из клеточного экстракта суспензии клеток, белковой фракции, кристаллической фракции, культуры клеток, клеточного гомогената, клеточного лизата, супернатанта клеток, клеточного фильтрата или клеточного осадка из указанной трансформированной клетки-хозяина.
Следующие примеры включены для демонстрации предпочтительных вариантов исполнения изо- 10 028761
бретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что техника, описанная в следующих примерах, представляет собой хорошо функционирующие способы практической стороны настоящего изобретения, обнаруженные изобретателем, и, следовательно, может рассматриваться как предпочтительный способ для его осуществления.
Примеры
1) Клонирование кДНК из DXS Vitis vinifera (Европейского винограда) сорта Мускат Оттонель и Gewurztraminer (Гевюрцтраминер).
кДНК DXS из Vitis vinifera сорта Мускат Оттонель (MO) и Gewurztraminer (Gw) были амплифицированны с помощью ОТ-ПЦР и клонированы. Секвенирование этих клонов показало, что и MO, и Gw являются гетерозиготами по локусу DXS. MO и Gw владеют одной и той же аллелью, обозначенной MoDXS1 (фиг. 1). Кроме того, MO и Gw обладают MoDXS2 и GwDXS2 аллелями соответственно. MoDXS2 и GwDXS2 аллели отличаются от MoDXS1 на 2 и 1 SNP, соответственно, которые модифицируют аминокислотные последовательности соответствующих белков (фиг. 2). K284^N и R306^C мутации (по отношению к SEQ ID NO: 2), характерные для MoDXS2 и GwDXS2, соответственно, влияют на аминокислоты, которые сохраняются во всех последовательностей растительных DXS, доступных в базах данных (фиг. 3). Кроме того, аминокислоты K284 и R306 относятся к активному центру фермента (Xiang et al., 2007), что указывает, что они могут модифицировать активность MoDXS2 и GwDXS2 аллелей по сравнению с MoDXS1.
2) Влияние MoDXS2 и GwDXS2 аллелей на содержание терпенов в виноградных ягодах.
Материалы и методы: выделение свободных и связанных монотерпенолов путем твердофазной экстракции (ТФЭ).
Для каждой точки отбора проб, были выполнены три повтора анализа терпенов. Для каждого повтора по меньшей мере 25 ягод были использованы.
Семена были удалены и кожицы отделены от мезокарпа. После взвешивания кожицы были измельчены в жидком азоте и затем суспендированы в 40 мл воды, после добавления 40 мг сульфита натрия. Супернатант, полученный после 15 мин центрифугирования (11400 g при 4°C), пропускали через стекловолоконный фильтр предварительной очистки и через стеклянный фильтр. 20 мкл раствора 4-нонанол 1 г/л добавляют в качестве внешнего стандарта для количественного определения основных терпенов. Экстракция терпенов была адаптирована из Mateo et al. (1997), этанол был использован вместо метанола. Фильтрат пропускали через 1 г фазы C18 кремний-связанной неполярной SPE колонки (BOND ELUT JR.), предварительно промыв 5 мл метанола и 15 мл особо чистой воды со скоростью примерно одна капля/с. Затем образец был разделен на две равные подвыборки, одна для анализа свободных и гликозидносвязанных монотерпенолов и одна для анализа свободных терпенолов. Все фракции свободных и связанных монотерпенолов элюировали с 4 мл абсолютного этанола. Это общее количество экстракта терпенолов разбавляли в 40 мл цитрат/фосфатного буфера (рН 4,5) и полученный раствор инкубировали с 50 мг AR2000 гликолитических ферментов ((Gist-Brocades, Seclin, France) в течение ночи при 37,5°C, чтобы освободить гликозидно-связанные терпенолы (Tamborra et al. 2004). Высвобожденные терпенолы были разделены при помощи SPE на колонке C18 и элюированы с 4 мл дихлорметана после промывки водой 3x5 мл. Этап гидролиза не проводился для анализа свободных терпенолов, и терпенолы непосредственно элюировали с дихлорметаном после промывки водой. Экстракты сушились в пипетках Пастера, заполненных 0,5 г безводного сульфита натрия, и концентрировались до 500 мкл в слабом потоке азота. К каждому образцу в качестве внутреннего контроля добавляли 20 мкл раствора м-крезола 1 г/л. Образцы хранили при -20°C до газово-хроматографического (ГХ) анализа.
Результаты.
Пример 2 показывает, что DXS аллели имеют большое влияние на содержание терпенола в виноградных ягодах, что показали исследования содержания терпенола в зависимости от DXS аллелей в потомстве MO (фиг. 4) и в Gw (фиг. 5). MoDXS1 (= GwDXS1) гомозиготные генотипы обладают крайне низким уровнем терпенолов, тогда как гетерозиготные или гомозиготные генотипы DXS2 накапливают большое число терпенолов.
3) Функциональная характеристика DXS аллелей в растениях.
Для того чтобы охарактеризовать активность аллелей DXS, изобретатели использовали Agrobacterium-опосредованную временную трансформацию табака (Nicotiana benthamiana), которая позволяет быстро и эффективно экспрессировать гены в листьях табака (Batoko et al., 2000). Этот подход уже был успешно использован для характеристики генов, участвующих во вторичном метаболизме виноградной лозы (Schmidlin et al., 2008; Hugueney et al., 2009). MoDXS1, MoDXS2 и GwDXS2 аллели были экспрессированы в листьях табака вместе с кДНК, кодирующей фермент гераниол синтазу (GES) от basilicum (Ocimum basilicum) (lijima et al., 2004). В этой системе GES была использована в качестве репортерного гена, ответственного за биосинтез монотерпенола гераниола, который обычно не накапливается в табаке. Как было показано, активность DXS ограничивает биосинтез терпенов в растениях (Estevez et al., 2001; Enfissi et al., 2005), количество гераниола, образованного в результате деятельности GES, непосредственно зависит от доступности субстрата DXS и, следовательно, от активности DXS в листьях табака. Таким
- 11 028761
образом, ГХ-МС анализ табачных листьев, коэкспрессирующих GES и DXS аллели, позволяет точно сравнить активность аллелей DXS в растениях.
Материалы и методы.
кДНК DXS виноградной лозы амплифицировали с помощью ПЦР с использованием прямого праймера 5 'GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGGCTCTCTGTACGCTCTCATTTCC-3 '(SEQ ID № 11)
и обратного праймера
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTATAACATGATCTCCAGGGCCTCC-3' (SEQ ID № 12)? и
клонировали в pDONR207 Gateway совместимый вектор (Invitrogen, Carlsbad, CA) с использованием Gateway BP клоназы (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК DXS секвенировали, чтобы убедиться, что не была введена мутация. Для Agrobacterium-опосредованной временной экспрессии кДНК DXS затем переносили в бинарный вектор GATEWAY pMDC32 (Curtis and Grossniklaus., 2003). кДНК гераниол синтазы из basilicum (Ocimum basilicum) (lijima et al., 2004), была клонирована в бинарный вектор GATEWAY pMDC83 (Curtis and Grossniklaus., 2003) и экспрессировалась в виде белка, слитого с GFP. Все конструкции вводили в штамм С58 Agrobacterium tumefaciens (pMP90) путем электропорации. Листья Nicotiana benthamiana инфильтрировали культурой A. tumefaciens (OD600 0,5) в соответствии с Voinnet et al. (2003). Секторы листьев были и анализировались на содержание терпенов через 96 ч после инфильтрации Agrobacterium.
Затем осуществляли экстракцию терпенов из листьев табака. Для каждой точки отбора проб были выполнены три повтора анализа терпенов. После взвешивания секторы табачных листьев (около 1 г) измельчали в жидком азоте, а затем суспензировали в 2 мл особо чистой воды. После 5-минутного центрифугирования (6000 g при 4°C) супернатант собирали и в качестве внешнего стандарта добавляли 20 мкл раствора 4-нонанола 1 г/л. Супернатант пропускали через 1 г фазы С18-кремней связанной неполярной SPE колонки (Bond Elut Jr., Varian), предварительно промыв 5 мл метанола и 15 мл особо чистой воды. Все терпенолы элюировали 2 мл абсолютного этанола. Это общее количество экстракта терпенолов разбавляли в 20 мл цитрат/фосфатного буфера (рН 4,5) и полученный раствор инкубировали с 25 мг AR2000 гликолитических ферментов (Gist-Brocades, Seclin, France) в течение ночи при 37,5°C. Высвобожденные терпенолы были разделены при помощи SPE на С18 колонке и элюированы с 4 мл дихлорметана, после промывки водой 3x5 мл. Экстракты сушились в пипетках Пастера, заполненных 0,5 г безводного сульфита натрия, и концентрировались до 500 мкл в слабом потоке азота. К каждому образцу в качестве внутреннего контроля добавляли 20 мкл раствора м-крезола 1 г/л. Образцы хранили при -20°C до газовохроматографического (ГХ) анализа.
Наконец, терпены анализировали с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХМС) с использованием газового хроматографа Agilent 6890N, оборудованного пробоотборником Gerstel MPS2 XL и соединенным со спектрометром инертных масс Agilent 5975B (Agilent Technologies). Газовый хроматограф был оснащен DB-Wax капиллярной колонкой (60 мх0,32 мм в.д.х0,5 мкм толщина пленки, J & W Scientific), и гелий был использован в качестве газа-носителя (с постоянным потоком 1 мл/мин). Температура печи ГХ была запрограммирована без первоначального времени удержания от 45 до 82°C со скоростью 20°С/мин (удерживание 1 мин), далее от 82 до 235°C (удерживание 15 мин) со скоростью 2,7oC/мин. Инжектор был установлен на 250°C и использовался в импульсном режиме без деления потока (25 фунтов на квадратный дюйм за 0,50 мин). Температура интерфейса, источник ионов MS и квадруполь были 270, 230 и 150°C соответственно. Масс-спектрометр работал в режиме электронно-ударной ионизации (EI, 70 эВ) и массы были отсканированы в a m/z диапазоне от 29 - 300 а.е.м. Программное обеспечение Agilent MSD ChemStation (G1701DA, Rev D.03.00) было использовано для управления прибором и обработки данных. Масс-спектры были сопоставлены с библиотекой Wiley's library опорного спектрального банка.
Результаты.
Agrobacterium-опосредованная временная экспрессия GES в отдельности приводила к накоплению значительных количеств гераниола, биосинтез которых зависит от эндогенной активности DXS в табаке (фиг. 6, 7). Коэкспрессия GES и MoDXS1 приводила к существенному увеличению биосинтеза гераниола за счет увеличенной доступности субстрата DXP. Тем не менее, коэкспрессия GES и MoDXS2 или GwDXS2 приводила, в среднем, к увеличению накопления гераниола в листьях табака в три раза (фиг. 7), указывая, что эти аллели обладают повышенной активностью DXS по сравнению с MoDXS1.
Таким образом, изобретатели заключили, что массовое накопление терпенолов в MO и Gw обусловлено наличием MoDXS2 или GwDXS2. Мутации K284^N и R306^C, которые влияют на аминокислоты в активном центре фермента, придают повышенную активность DXS по сравнению с MoDXS1, который в свою очередь отвечает за повышенное накопление терпенов в растениях.
Целью следующих экспериментов является изучение роли этих мутаций и возможность их расширения на DXS ферменты из других источников. Как модель, авторы выбрали DXS из E. coli, чьи ферментативные свойства хорошо охарактеризованы (Querol et al., 2001; Xiang et al., 2007).
Сравнение последовательностей белков DXS из E. coli и V. vinifera показали, что аминокислоты,
- 12 028761
K284 и R306 в DXS виноградной лозы соответствуют K213 и K234 в DXS из E. coli соответственно (фиг.
10). Для того чтобы оценить влияние MO-и Gw-мутаций на активность нерастительного DXS, мутации K213^N и K234^G были введены в белок DXS E. coli. Влияние этих мутаций на возможности биосинтеза терпенов E. coli впоследствии было исследовано.
4) Клонирование и сайт-направленный мутагенез гена DXS из Escherichia coli.
Материалы и методы.
Ген DXS Escherichia coli (Lois et al., 1998) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием прямого праймера
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGAGTTTTG
ATATTGCCAAATACCC (SEQ ID № 24) и обратного праймера
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTT G (SEQ ID № 25) и кл0. нировали в pDONR207 Gateway совместимый вектор (технология, которая позволяет быстро клонировать один или несколько генов; вошедший вектор вносит резистентность к гентамицину) (Invitrogen, Carlsbad, CA) при помощи ВР клоназы, смеси белков, которые in vitro катализируют рекомбинацию продуктов ПЦР или сегментов ДНК из клонов, (Invitrogen), в соответствии с инструкциями производителя. Ген DXS впоследствии был перенесен в GATEWAY-совместимый экспрессионный вектор pHGWA (Busso et al., 2003) с использованием LR клоназы, смеси ферментов, которые in vitro катализируют рекомбинацию между входящим клоном и назначенным вектором для получения экспрессионного клона (Invitrogen), с получением плазмиды pHGWA-EcoliDXS. Эту плазмиду использовали для сайтнаправленного мутагенеза для того, чтобы ввести мутации K213^N и K234^.('' в белок DXS из E. coli. Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием QuikChange kit (Stratagene, La Jolla, CA) в соответствии с инструкциями производителя. QuikChange kit основан на мутагенных праймерах и ДНКполимеразе. Он разработан, чтобы помочь привнести одну или несколько точечных мутаций в ген выбора, чтобы вырабатывать мутантов ферментов с аминокислотными изменениями, вставками и делециями.
Для введения К213—»N мутации были использованы прямой праймер
GCGCGAAGGCGGGAACAAAGTTTTGTCTGGGGTGCC (SEQ ID № 26) GGCACGCCAGAGAAAACTTTGTTCCCGCCTTCGCGC (SEQ ID № 27) EcoliDXS-K213N.
и обратный праймер с получением плазмиды pHGWAДля введения К234—»С мутации были использованы прямой праймер
CGCACCGAAGAACATATTTGCGGCATGGTAGTGCCTGG (SEQ ID № 28) и обратный праймер
CCAGGCACTACCATGCCGCAAATATGTTCTTCGGTGCG (SEQID№29) q получением плазмиды pHGWA-EcoliDXS-K234C.
Результаты.
Во время сайт-направленного мутагенеза был выделен мутантный ген DXS, несущий рамку. Это приводит к синтезу усеченный белка DXS, который использовали в качестве контроля. Плазмида, кодирующая этот усеченный DXS, называется pHGWA-усеченный EcoliDXS.
pLysS штамм E. coli (Stratagene, La Jolla, CA). Штамм E. coli BL21-Gold (DE3) pLysS является компетентными клетками, которые обеспечивают повышенную эффективность трансформации. Они устойчивы к тетрациклину и хлорамфениколу. Трансформанты культивировали при 28°C в 50 мл среды LB с добавлением глюкозы (10 г/л) в присутствии ампициллина (100 мкг/мл), хлорамфеникола (25 мкг/мл) и тетрациклина (2 мкг/мл). Когда культура достигала OD 0.1, экспрессию DXS индуцировали с помощью 1 мМ изопропил-3^-1-тиогалактопиранозида (IPTG) и культуру выращивали в течение 24 ч.
6) Влияние DXS мутантов на биосинтез терпенов в E. coli.
Воздействие MO- и Gw-подобных мутаций (K213^N и Г234^С соответственно) на активность фермента DXS из E. coli оценивали путем количественного определения терпенов в культуральной среде после индукции экспрессии DXS.
Материалы и методы: анализ терпенов в питательных среде E. coli.
Терпены в культуральной среде были проанализированы с использованием сорбционной экстракции на магнитной мешалке (SBSE), используя способ, адаптированный из Coelho et al. (2009). Мешалка с PDMS покрытием (0.5 ммх10 мм; Twister; Gerstel, Mullheim, Germany) была введена в каждый образец культуральной среды (10 мл). Экстракцию проводили при 20°C в течение 150 мин, при скорости вращения 800 об/мин. Затем терпены анализировали с помощью газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ-МС) с использованием газового хроматографа Agilent 6890N, оборудованного пробоотборником Gerstel MPS2 XL и соединенного с масс-спектрометром Agilent 5975B (Agilent Technologies), как описано выше.
Результаты.
Пример показывает, что мутации, введенные в DXS из E. coli, воздействуют на содержание монотерпенов в культуральной среде (фиг. 5). В частности, мутация Г234^С в DXS из E. coli приводит к значительному возрастанию накопления терпенов в культуральной среде. Таким образом, изобретатели заключили, что нерастительные ферменты DXS могут быть изменены в положениях, соответствующих
- 13 028761
K284 и R306 в белках DXS виноградной лозы, для того чтобы улучшить активность DXS. Такие улучшенные мутанты DXS могут быть использованы для метаболической инженерии микроорганизмов с целью повышения производства целевых изопреноидов.
Перечень последовательностей
<110> ГЕНОПЛАНТ-ВАЛОР
<120> Аллели 1-0-дезоксиксилулозо-5-фосфат синтазы, ответственные за усиленный биосинтез терпенов
<130> GPL-B-0001 РСТ
<150> ЕР 10013809.8 <151> 2010-10-20
<160> 29
<170> Patentln version 3.5
<210> 1 <211> 720
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> plant DXS consens sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3)
<223> X=L or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4)
<223> Х=С or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5)
<223> Х= Т, N or А
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Х= L, F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7)
<223> Х= S or А
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Х= F or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Х= A, S or G
- 14 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> X= Η, Y or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12)
<223> X=F, I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13)
<223> X=S, I or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14)
<223> X= Q, T or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)
<223> X= A, К or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16)
<223> X= G, V or no amino acids
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17)
<223> X= G, A or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18)
<223> X= A, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21)
<223> X= N or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22)
<223> X= P, S, A or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23) . . (23)
<223> X= Q, C or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24) . . (24)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25) ..(25)
<223> X=L, S, P or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26) . . (26)
<223> X= T, L or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (27) ..(27)
<223> X= P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> X= Q or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29) . . (29)
<223> X= C, F, S or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31) . . (31)
<223> X= H, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> X= L, R, S or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> X= F, S, I or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (34) . . (34)
<223> X= L, H or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (35)..(35)
<223> X= G or V
15
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (36) . . (36)
<223> X= no amino acid, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> X= D or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39) . . (39)
<223> X= Q, P or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> X= C, S, F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X= Q, P or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X= C, F, A or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (43)..(43)
<223> X= S, L, H or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> X= Q, K, A or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X= Q, P, К or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46) . . (46)
<223> X= R, N or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> X= S, N, T or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> X= K, N, Q, H or R <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (49)..(49)
<223> X= A, S, V or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (50) . . (50)
<223> X= Η, M or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (51)..(51)
<223> X= R, S or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (52)..(52)
<223> X= К or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (54)..(54)
<223> X=P, R or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (55)..(55)
<223> X= N, A, R or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (56) . . (56)
<223> X= G, К or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58)
<223> X= C, Q, Y or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61)
<223> X= L or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63)
<223> X= D, E or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (64)..(64)
<223> X=R, К or S
16
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (65)..(65)
<223> X=E, G or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (67) . . (67)
<223> X= F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68)
<223> X=H, Y or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (69) . . (69)
<223> X=S, T, G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (70) . . (70)
<223> X= Q, N, E or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73)
<223> X=P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74)
<223> X=T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (76) . . (76)
<223> X=L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (77)..(77)
<223> X=L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (80)..(80)
<223> X=I or V <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (82) ..(82)
<223> X=Y or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84)
<223> X=I, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91)
<223> X=V, L, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (92)..(92)
<223> X=K, H, Q or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95)
<223> X=K or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98)
<223> X=A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99)
<223> X=D, A, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (103) . . (103)
<223> X=S, A or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (104) .. (104)
<223> X=D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (105) .. (105)
<223> X=V, T or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106) . . (106)
<223> X= V or I
17
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (107) . . (107)
<223> X= F, Y or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (108) . . (108) <223> X= N, S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> X=S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> X=K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (117) .. (117)
<223> X=G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (118) .. (118) <223> X=S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (124) .. (124)
<223> X=D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (126)..(126) <223> X=T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (128) .. (128) <223> X=V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (131) .. (131)
<223> X=Y or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (132) .. (132)
<223> X=V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (134) .. (134)
<223> X=N or D <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135)
<223> X=A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (137) . . (137)
<223> X=Q, E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (139)..(139)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (141)..(141)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (148) . . (148)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (150) . . (150)
<223> X= P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (159)..(159)
<223> X= D, G, E or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (160)..(160) <223> X= K, Q or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> X= Η, P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (164)..(164)
<223> X= M, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (168) . . (168) <223> X= D, N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (171)..(171)
<223> X= A or S
- 18 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (174)..(174)
<223> X= T or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (177) .. (177)
<223> X= G, S or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (180)..(180) <223> X= E, I, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (181)..(181) <223> X= Y, H, or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (183) .. (183)
<223> X= C or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (186)..(186) <223> X= T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (192)..(192)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (196)..(196)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (202)..(202) <223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (205)..(205)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (206)..(206) <223> X= L or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (208)..(208) <223> X= R or К <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (209)..(209)
<223> X= N, S or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (211)..(211) <223> X= N or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (213)..(213)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (214)..(214)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (220)..(220) <223> X= A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (233)..(233)
<223> X= A, S or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (235)..(235)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (238)..(238)
<223> X=S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (239)..(239)
<223> X= N or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (240)..(240)
<223> X=M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (243)..(243)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(248)
<223> X= К or R
19
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (258) .. (258)
<223> X= D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (261) . . (261) <223> X= I, S, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (262) .. (262) <223> X= P or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (269) .. (269)
<223> X= S, G, R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (272) .. (272)
<223> X= S, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (273) .. (273)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (276) . . (276)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (277) .. (277)
<223> X= S or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (278) .. (278)
<223> X= R, P, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (279) .. (279)
<223> X= К, P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (280) .. (280) <223> X= L or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (282) .. (282) <223> X= E or Q <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (286) . . (286) <223> X= V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (288) .. (288) <223> X= К or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (289) .. (289)
<223> X= G, S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (290) .. (290)
<223> X= V, M or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (293) . . (293)
<223> X= Q or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (296) .. (296)
<223> X= G or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (297) .. (297)
<223> X= Q or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (298) .. (298)
<223> X= M or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (300)..(300)
<223> X= E or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (301)..(301)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (307) .. (307)
<223> X= E or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (310)..(310)
<223> X= R or C
20
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (313)..(313)
<223> X= I, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (315)..(315)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (316) . . (316)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (318)..(318)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (319)..(319)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (336) . . (336)
<223> X= S or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (337)..(337)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (338)..(338)
<223> X= D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (341)..(341)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (342)..(342)
<223> X= A, S, or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (344)..(344)
<223> X= L or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (345)..(345)
<223> X= K, Q or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (346)..(346)
<223> X= К or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (348)..(348)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (349)..(349)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (350)..(350)
<223> X= T or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (351)..(351)
<223> X= K, R or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (352)..(352)
<223> X= T, A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (353)..(353)
<223> X= T or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (358)..(358)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (360)..(360)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (361)..(361)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (366) . . (366)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (370)..(370)
<223> X= Y or P
21
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (373)..(373)
<223> X= K, R, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (375)..(375)
<223> X= D or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (377)..(377)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (378)..(378)
<223> X= Y or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (382)..(382)
<223> X= T, A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (387)..(387)
<223> X= T, A, P or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (390)..(390)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (394)..(394)
<223> X= S, T, G or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (395)..(395)
<223> X= S, T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (396)..(396)
<223> X= S, A, N, F or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (397)..(397)
<223> X= P, E, К, T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (399)..(399)
<223> X= Q or L <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (403) . . (403)
<223> X= Q or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (408) . . (408)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (410) .. (410)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (411) .. (411)
<223> X= A, К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (415) .. (415)
<223> X= A, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (417) .. (417)
<223> X= K, N, E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (418) .. (418)
<223> X= К or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (419) .. (419)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (420) .. (420)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (421) .. (421)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (432) . . (432)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (434) .. (434)
<223> X= L, Y, F or I
22
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (436)..(436)
<223> X= L, H or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (437) . . (437)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (438) . . (438)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (441)..(441)
<223> X= T, D, N or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (462) .. (462)
<223> X= T, C or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (465)..(465)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (476)..(476)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (479)..(479)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (491)..(491)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (495)..(495)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (498) . . (498)
<223> X= M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (514)..(514)
<223> X= A or S <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (518)..(518)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (519)..(519)
<223> X= F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (527)..(527)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (532)..(532)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (535)..(535)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (536)..(536)
<223> X= E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (538)..(538)
<223> X= F or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (539)..(539)
<223> X= H or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (540)..(540)
<223> X= I or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (545)..(545)
<223> X= A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (546)..(546)
<223> X= A or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (548)..(548)
<223> X= D or N
23
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (552)..(552)
<223> X= S or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (556)..(556)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (562)..(562)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (564)..(564)
<223> X= V, A or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (565)..(565)
<223> X= E, A, Q or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (568)..(568)
<223> X= P, A, T, S or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (569)..(569)
<223> X= G, N or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (570)..(570)
<223> X= Y, N or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (573)..(573)
<223> X= I, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (575)..(575)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (577)..(577)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (579)..(579)
<223> X= К or R <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (582)..(582)
<223> X= I, or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (584)..(584)
<223> X= I, К, M or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (585)..(585)
<223> X= E or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (587)..(587)
<223> X= E, S, D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (588)..(588)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (591)..(591)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (596)..(596)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (597)..(597)
<223> X= A, I or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (600) . . (600)
<223> X= A, S, N or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (602) . . (602)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (603) . . (603)
<223> X= V, G, A or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (605) . . (605)
<223> X= A or S
24
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (606)..(606)
<223> X= A, V, E, G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (607) . . (607)
<223> X= A, V, L, M or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (608)..(608)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (609)..(609)
<223> X= E, K, R or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (610) . . (610)
<223> X= E, Q, S, C or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (611)..(611)
<223> X= H or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (612) . . (612)
<223> X= G or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (613) . . (613)
<223> X= L, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (614)..(614)
<223> X= R, N, Q, S or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (615) . . (615)
<223> X= I, V, P, L or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (620)..(620)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (621)..(621)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (628) .. (628)
<223> X= R, H, G, S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (629) .. (629)
<223> X= A, D, G, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (632) . . (632)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (633) . . (633)
<223> X= T, R, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (635)..(635)
<223> X= A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (636)..(636)
<223> X= A, К or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (637) . . (637)
<223> X= S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (640) . . (640)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (642) .. (642)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (646)..(646)
<223> X= E or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (653) . . (653)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (657) .. (657)
<223> X= V, T, S or A
25
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (658) .. (658)
<223> X= Q or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (659)..(659)
<223> X= F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (660)..(660) <223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (661)..(661) <223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (663) . . (663)
<223> X= N, D, T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (665)..(665)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (669)..(669)
<223> X= T, К, P or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (670)..(670)
<223> X= T, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (672) .. (672)
<223> X= W, V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (673) . . (673)
<223> X= S or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (674)..(674)
<223> X= S or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (675)..(675)
<223> X= I, L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (676) . . (676)
<223> X= V or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (686)..(686) <223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (688)..(688) <223> X= A, V or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (691)..(691)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (692)..(692)
<223> X= A, E, or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (693)..(693)
<223> X= Μ, E, or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (697)..(697)
<223> X= Μ, T, or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (698)..(698)
<223> X= P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (699) . . (699)
<223> X= R, К or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (702) . . (702)
<223> X= A or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (703) . . (703)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (705) . . (705)
<223> X= A, V or I
- 26 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (706)..(706)
<223> X= F or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (707)..(707)
<223> X= N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (708)..(708)
<223> X= I, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (709)..(709)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (710)..(710)
<223> X=G or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (711)..(711)
<223> X= Q, A, К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (712)..(712)
<223> X= T or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (713)..(713)
<223> X= L, Μ, К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (716)..(716)
<223> X= L or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (717)..(717)
<223> X= Q, E or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (718)..(718)
<223> X= I, V, L or no amino acid
<400> 1
Met Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 15 10 15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa 20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40 45
Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Val Xaa Ala Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 50 55 60
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Asp Thr Xaa 65 70 75 80
Asn Xaa Pro Xaa His Met Lys Asn Leu Ser Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Gin 85 90 95
Leu Xaa Xaa Glu Leu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa Xaa Thr 100 105 110
Gly Gly His Leu Xaa Xaa Ser Leu Gly Val Val Xaa Leu Xaa Val Xaa 115 120 125
Leu His Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Pro Xaa Asp Xaa lie Xaa Trp Asp Val 130 135 140
Gly His Lys Xaa Tyr Xaa His Lys lie Leu Thr Gly Arg Arg Xaa Xaa 145 150 155 160
Met Xaa Thr Xaa Arg Gin Thr Xaa Gly Leu Xaa Gly Phe Xaa Lys Arg 165 170 175
Xaa Glu Ser Xaa Xaa Asp Xaa Phe Gly Xaa Gly His Ser Ser Thr Xaa 180 185 190
lie Ser Ala Xaa Leu Gly Met Ala Val Xaa Arg Asp Xaa Xaa Gly Xaa 195 200 205
Xaa Asn Xaa Val Xaa Xaa Val lie Gly Asp Gly Xaa Met Thr Ala Gly 210 215 220
Gin Ala Tyr Glu Ala Met Asn Asn Xaa Gly Xaa Leu Asp Xaa Xaa Xaa 225 230 235 240
lie Val Xaa Leu Asn Asp Asn Xaa Gin Val Ser Leu Pro Thr Ala Thr 245 250 255
27
028761
Ser Xaa Ala Leu Xaa 270
Arg Glu Xaa Ala Xaa 285
Xaa Xaa Ala Ala Lys 300
Xaa Gly Xaa Xaa Leu 320
Val Asp Gly His Xaa 335
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 350
Lys Gly Xaa Gly Tyr 365
Gly Val Xaa Lys Phe 380
Xaa Xaa Thr Xaa Ser 400
Glu Ala Glu Xaa Asp 415
Gly Gly Thr Gly Xaa 430
Phe Asp Val Gly lie 445
Leu Ala Xaa Glu Gly 460
Xaa Gin Arg Xaa Tyr 480
Leu Pro Val Xaa Phe 495
Gly Pro Thr His Cys 510
Pro Asn Met Xaa Val 525
Xaa Val Ala Thr Ala 540
Xaa Pro Arg Gly Asn 560
Gly Xaa Pro Xaa Glu 575
Xaa Val Ala Xaa Leu 590
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa 605
Xaa Xaa Phe Cys Lys 620
Xaa Xaa His Glu Xaa 640
Phe Xaa Ser His Val 655
Gly Xaa Xaa Lys Xaa 670
His Gly Xaa Pro Xaa 685
His lie Xaa Xaa Thr 700
Xaa Xaa Xaa Met Leu 720
- 28 028761
<213> Vitis Vinifera
<220>
<221> misc_feature
<222> (284) .. (284)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (306)..(306)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 2
Met Ala Leu Cys Thr Leu Ser Phe Pro Ala His Phe Ser Gin Ala Ala 15 10 15
Ala Ser Asn Pro Gin Arg Leu Thr Pro Gin Cys Ser His Leu Phe Leu 20 25 30
Gly Val Asp Leu Gin Cys Gin Ser Gin Gin Arg Ser Lys Ala Arg Lys 35 40 45
Arg Pro Asn Gly Val Cys Ala Ser Leu Ser Asp Arg Glu Glu Tyr His 50 55 60
Ser Gin Arg Pro Pro Thr Pro Leu Leu Asp Thr lie Asn Tyr Pro lie 65 70 75 80
His Met Lys Asn Leu Ser Val Lys Glu Leu Lys Gin Leu Ala Asp Glu 85 90 95
Leu Arg Ser Asp Val Val Phe Asn Val Ser Lys Thr Gly Gly His Leu 100 105 110
Gly Ser Ser Leu Gly Val Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val 115 120 125
Phe Asn Ala Pro Gin Asp Arg lie Leu Trp Asp Val Gly His Gin Ser 130 135 140
Tyr Pro His Lys lie Leu Thr Gly Arg Arg Asp Gin Met His Thr Met 145 150 155 160
Arg Gin Thr Asp Gly Leu Ala Gly Phe Thr Lys Arg Ser Glu Ser Glu 165 170 175
Tyr Asp Cys Phe Gly Thr Gly His Ser Ser Thr Thr lie Ser Ala Gly 180 185 190
Leu Gly Met Ala Val Gly Arg Asp Leu Lys Gly Lys Asn Asn Asn Val 195 200 205
lie Ala Val lie Gly Asp Gly Ala Met Thr Ala Gly Gin Ala Tyr Glu 210 215 220
Ala Met Asn Asn Ala Gly Tyr Leu Asp Ser Asp Met lie Val lie Leu 225 230 235 240
Asn Asp Asn Lys Gin Val Ser Leu Pro Thr Ala Thr Leu Asp Gly Pro 245 250 255
lie Pro Pro Val Gly Ala Leu Ser Ser Ala Leu Ser Arg Leu Gin Ser 260 265 270
Asn Arg Pro Leu Arg Glu Leu Arg Glu Val Ala Xaa Gly Val Thr Lys 275 280 285
Gin lie Gly Gly Pro Met His Glu Leu Ala Ala Lys Val Asp Glu Tyr 290 295 300
Ala Xaa Gly Met lie Ser Gly Ser Gly Ser Thr Leu Phe Glu Glu Leu 305 310 315 320
Gly Leu Tyr Tyr lie Gly Pro Val Asp Gly His Asn lie Asp Asp Leu 325 330 335
Val Ala lie Leu Lys Glu Val Lys Ser Thr Lys Thr Thr Gly Pro Val 340 345 350
Leu He His Val Val Thr Glu Lys Gly Arg Gly Tyr Pro Tyr Ala Glu 355 360 365
Lys Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly Val Thr Lys Phe Asp Pro Ala Thr 370 375 380
Gly Lys Gin Phe Lys Ser Ser Ala Pro Thr Gin Ser Tyr Thr Thr Tyr 385 390 395 400
Phe Ala Glu Ala Leu lie Ala Glu Ala Glu Val Asp Lys Asp He Val 405 410 415
Ala He His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Leu Asn Leu Phe His
29
028761
- 30 028761
- 31 028761
- 32 028761
Lys Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly Val Thr Lys Phe 380 Asp Pro Ala Thr
370 375
Gly Lys Gin Phe Lys Ser Ser Ala Pro Thr Gin Ser Tyr Thr Thr Tyr
385 390 395 400
Phe Ala Glu Ala Leu lie Ala Glu Ala Glu Val Asp Lys Asp He Val
405 410 415
Ala lie His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Leu Asn Leu Phe His
420 425 430
Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly He Ala Glu Gin His
435 440 445
Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly lie Lys Pro Phe
450 455 460
Cys Ala lie Tyr Ser Ser Phe Met Gin Arg Ala Tyr Asp Gin Val Val
465 470 475 480
His Asp Val Asp Leu Gin Lys Leu Pro Val Lys Phe Ala Met Asp Arg
485 490 495
Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly Ala Phe Asp
500 505 510
Val Ala Phe Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met Ala Pro Ala
515 520 525
Asp Glu Ala Glu Leu Phe His Met Val Ala Thr Ala Ala Ala He Asp
530 535 540
Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly Val Gly He
545 550 555 560
Glu Leu Pro Pro Gly Asn Lys Gly lie Pro lie Glu Val Gly Arg Gly
565 570 575
Arg lie Leu lie Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly Tyr Gly Thr
580 585 590
Ala Val Gin Ser Cys Leu Val Ala Ser Ser Leu Leu Glu Gin His Gly
595 600 605
Leu Arg lie Thr Val Ala Asp Ala Arg Phe Cys Lys Pro Leu Asp His
610 615 620
Ala Leu . lie Arg Ser Leu Ala Lys Ser His Glu Val Leu He Thr Val
625 630 635 640
Glu Glu . Gly Ser lie Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala Gin Phe Leu
645 650 655
Ala Leu . Asn Gly Leu Leu Asp Gly Thr Thr Lys Trp Ser Pro Met Val
660 665 670
Leu Pre > Asp Arg Tyr lie Asp His Gly Ala Pro Ala Asp Gin Leu Ala
675 680 685
Met Ala . Gly Leu Thr Pro Ser His lie Ala Ala Thr Val Phe Asn He
690 695 700
Leu Gly ' Gin Thr Arg Glu Ala Leu Glu lie Met Leu
705 710 715
<210> 5
<211> 664
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Truncated DXS polypeptide
<400> 5
Val Cys Ala Ser Leu Ser Asp Arg Glu Glu Tyr His Ser Gin Arg Pro
1 5 10 15
Pro Thr ' Pro Leu Leu Asp Thr lie Asn Tyr Pro Lie His Met Lys Asn
20 25 30
Leu Ser ' Val Lys Glu Leu Lys Gin Leu Ala Asp Glu Leu Arg Ser Asp
35 40 45
Val Val Phe Asn Val Ser Lys Thr Gly Gly His Leu Gly Ser Ser Leu
50 55 60
Gly Val . Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His Tyr Val Phe Asn Ala Pro
65 70 75 80
Gin Asp i Arg lie Leu Trp Asp Val Gly His Gin Ser Tyr Pro His Lys
33
028761
- 34 028761
- 35 028761
Leu lie His Val Val Thr Glu Lys Gly Arg Gly Tyr Pro Tyr Ala Glu
Lys Ala Ala Asp Lys Tyr His Gly Val Thr Lys Phe Asp Pro Ala Thr
Gly Lys Gin Phe Lys Ser Ser Ala Pro Thr Gin Ser Tyr Thr Thr Tyr
Phe Ala Glu Ala Leu lie Ala Glu Ala Glu Val Asp Lys Asp lie Val 405 410 415
Ala Tie His Ala Ala Met Gly Gly Gly Thr Gly Leu Asn Leu Phe His
Arg Arg Phe Pro Thr Arg Cys Phe Asp Val Gly Tie Ala Glu Gin His
Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Cys Glu Gly Tie Lys Pro Phe
Cys Ala He Tyr Ser Ser Phe Met Gin Arg Ala Tyr Asp Gin Val Val 465 470 475 480
His Asp Val Asp Leu Gin Lys Leu Pro Val Lys Phe Ala Met Asp Arg
Ala Gly Leu Val Gly Ala Asp Gly Pro Thr His Cys Gly Ala Phe Asp 500 505 510
Val Ala Phe Met Ala Cys Leu Pro Asn Met Val Val Met Ala Pro Ala 515 520 525
Asp Glu Ala Glu Leu Phe His Met Val Ala Thr Ala Ala Ala lie Asp 530 535 540
Asp Arg Pro Ser Cys Phe Arg Tyr Pro Arg Gly Asn Gly Val Gly Val 545 550 555 560
Glu Leu Pro Pro Gly Asn Lys Gly He Pro He Glu Val Gly Arg Gly 565 570 575
Arg He Leu He Glu Gly Glu Arg Val Ala Leu Leu Gly Tyr Gly Thr 580 585 590
- 36 028761
- 37 028761
Cys Leu Val Ala Ser Ser Leu Leu Glu Gin His Gly Leu Arg lie Thr 545 550 555 560
Val Ala Asp Ala Arg Phe Cys Lys Pro Leu Asp His Ala Leu lie Arg 565 570 575
Ser Leu Ala Lys Ser His Glu Val Leu lie Thr Val Glu Glu Gly Ser 580 585 590
lie Gly Gly Phe Gly Ser His Val Ala Gin Phe Leu Ala Leu Asn Gly 595 600 605
Leu Leu Asp Gly Thr Thr Lys Trp Ser Pro Met Val Leu Pro Asp Arg 610 615 620
Tyr lie Asp His Gly Ala Pro Ala Asp Gin Leu Ala Met Ala Gly Leu 625 630 635 640
Thr Pro Ser His He Ala Ala Thr Val Phe Asn lie Leu Gly Gin Thr 645 650 655
Arg Glu Ala Leu Glu He Met Leu 660
<210> 8
<211> 1846
<212> DNA
<213> Vitis Vinifera
<400> 8
cttcaatgtt 60 tccaaaactg ggggtcactt gggctccagc ctcggggttg tggagctcac
tgtggctctt cattatgtct tcaatgcccc tcaagacagg atactatggg atgttggtca
120
tcagtcttac ccacacaaaa ttctaactgg gagaagagat caaatgcata ccatgaggca
180
aacagatggg ttagcgggat tcaccaagcg ctcggagagt gaatatgact gctttggaac
240
cggccacagt tctactacca tctcagcagg cttgggaatg gcggtcggcc gggatctaaa
300
aggaaaaaac aacaacgtca ttgctgtcat aggtgatgga gccatgactg cagggcaagc
360
ttatgaagca atgaacaatg ctggttacct ggattctgac atgattgtta tccttaatga
420
caacaagcag gtttctttac ccactgctac tctagatggg cccataccac ctgtaggagc
480
tttgagcagt gctcttagta ggttacaatc aaacagacct cttagagaat tacgagaggt
540
tgccaagggc gttaccaaac agattggcgg accgatgcat gaattggctg caaaagttga
600
tgaatatgct cgtgggatga tcagtggttc tggatcaaca ctttttgaag agcttggact
660
ctattatata ggtcctgttg atggccacaa catagatgac cttgttgcca ttctcaagga
720
ggttaagagt accaagacaa caggtccagt tctgatccat gttgtcacag agaaaggccg
780
cggatatcca tatgctgaga aagctgcaga taagtaccat ggagtgacca agttcgatcc
tgctactgga aaacaattca aatccagtgc tcctactcag tcctacacaa catattttgc 900
agaggctttg 960 attgcagaag cagaggtgga caaggatatt gttgcaattc atgcagcaat
ggggggtgga acgggcttga atctcttcca tcgccggttc cccacacgat gctttgatgt
1020
tgggatagca gaacagcatg ctgttacctt tgctgctggt ctagcctgtg aaggcattaa
1080
acctttttgt gcaatctact catctttcat gcagagagct tatgaccagg tggtgcatga
1140
tgtagatttg cagaagctgc cagtgaaatt tgcaatggac agagctgggc tggttggagc
1200
agatggccca acacattgtg gagcttttga tgtcgctttc atggcttgcc ttccaaacat
1260
ggtggtgatg gctcctgctg atgaggctga gctttttcac atggtggcca cagctgctgc
1320
catagatgac aggcccagtt gtttccggta cccaagagga aatggggtgg gtgttgaact
1380
gccaccaggg aacaaaggca ttcctattga ggttggaagg ggccgaatat tgattgaggg
1440
ggagagagtt gcactcttgg gctatggaac agcagtacag agctgtttgg ttgcgtcttc
1500
tttgctggaa caacatggct tacgaataac agtcgcagat gcccgcttct gcaaaccatt
1560
ggaccatgct cttattcgta gcctagcaaa atcacatgaa gttttgatta cagtagaaga
38 028761
agggtcaatt 1680 ggtggttttg ggtctcatgt tgctcagttt ttggccctta atggtcttct
tgatggcaca 1740 acaaagtgga gtcccatggt tcttcctgat cggtacatag accatggagc
gccagcggac 1800 cagttggcca tggcgggtct gacaccatct catattgcag caacagtatt
caatatactt 1846 ggacaaacaa gggaggccct ggagatcatg ttatag
<210> 9
<211> 2151
<212> DNA
<213> Vitis Vinifera
<400> 9 atggctctct 60 gtacgctctc atttcctgcc cattttagcc aggctgctgc ttcaaatcct
cagagactta 120 ctcctcagtg ttcccatttg ttcttggggg tggatttgca gtgccaatcc
cagcaaagga 180 gtaaggccag gaaaaggcca aatggggttt gtgcatcact ttcggatagg
gaggagtatc 240 attcccagag accaccaact cctctcctgg acactatcaa ttatccaatt
cacatgaaaa 300 atctgtctgt caaggagctg aaacaactcg cagatgaact aaggtctgat
gttgtcttca 360 atgtttccaa aactgggggt cacttgggct ccagcctcgg ggttgtggag
ctcactgtgg 420 ctcttcatta tgtcttcaat gcccctcaag acaggatact atgggatgtt
ggtcatcagt 480 cttacccaca caaaattcta actgggagaa gagatcaaat gcataccatg
aggcaaacag 540 atgggttagc gggattcacc aagcgctcgg agagtgaata tgactgcttt
ggaaccggcc 600 acagttctac taccatctca gcaggcttgg gaatggcggt cggccgggat
ctaaaaggaa 660 aaaacaacaa cgtcattgct gtcataggtg atggagccat gactgcaggg
caagcttatg 720 aagcaatgaa caatgctggt tacctggatt ctgacatgat tgttatcctt
aatgacaaca 780 agcaggtttc tttacccact gctactctag atgggcccat accacctgta
ggagctttga 840 gcagtgctct tagtaggtta caatcaaaca gacctcttag agaattacga
gaggttgcca 900 atggcgttac caaacagatt ggcggaccga tgcatgaatt ggctgcaaaa
gttgatgaat 960 atgctcgtgg gatgatcagt ggttctggat caacactttt tgaagagctt
ggactctatt 1020 atataggtcc tgttgatggc cacaacatag atgaccttgt tgccattctc
aaggaggtta 1080 agagtaccaa gacaacaggt ccagttctga tccatgttgt cacagagaaa
ggccgcggat 1140 atccatatgc tgagaaagct gcagataagt accatggagt gaccaagttc
gatcctgcta 1200 ctggaaaaca attcaaatcc agtgctccta ctcagtccta cacaacatat
tttgcagagg 1260 ctttgattgc agaagcagag gtggacaagg atattgttgc aattcatgca
gcaatggggg 1320 gtggaacggg cttgaatctc ttccatcgcc ggttccccac acgatgcttt
gatgttggga 1380 tagcagaaca gcatgctgtt acctttgctg ctggtctagc ctgtgaaggc
attaaacctt 1440 tttgtgcaat ctactcatct ttcatgcaga gagcttatga ccaggtggtg
catgatgtag 1500 atttgcagaa gctgccagtg aaatttgcaa tggacagagc tgggctggtt
ggagcagatg 1560 gcccaacaca ttgtggagct tttgatgtcg ctttcatggc ttgccttcca
aacatggtgg 1620 tgatggctcc tgctgatgag gctgagcttt ttcacatggt ggccacagct
gctgccatag 1680 atgacaggcc cagttgtttc cggtacccaa gaggaaatgg ggtgggtatt
gaactgccac 1740 cagggaacaa aggcattcct attgaggttg gaaggggccg aatattgatt
gagggggaga 1800 gagttgcact cttgggctat ggaacagcag tacagagctg tttggttgcg
tcttctttgc 1860 tggaacaaca tggcttacga ataacagtcg cagatgcccg cttctgcaaa
ccattggacc 1920 atgctcttat tcgtagccta gcaaaatcac atgaagtttt gattacagta
gaagaagggt 1980 caattggtgg ttttgggtct catgttgctc agtttttggc ccttaatggt
cttcttgatg 2040 gcacaacaaa gtggagtccc atggttcttc ctgatcggta catagaccat
39 028761
ggagcgccag cggaccagtt ggccatggcg ggtctgacac catctcatat tgcagcaaca 2100
gtattcaata 2151 tacttggaca aacaagggag gccctggaga tcatgttata g
<210> 10 <211> 2151 <212> DNA <213> Vitis Vinifera
<400> 10 atggctctct 60 gtacgctctc atttcctgcc cattttagcc aggctgctgc ttcaaatcct
cagagactta 120 ctcctcagtg ttcccatttg ttcttggggg tggatttgca gtgccaatcc
cagcaaagga 180 gtaaggccag gaaaaggcca aatggggttt gtgcatcact ttcggatagg
gaggagtatc 240 attcccagag accaccaact cctctcctgg acactatcaa ttatccaatt
cacatgaaaa 300 atctgtctgt caaggagctg aaacaactcg cagatgaact aaggtctgat
gttgtcttca 360 atgtttccaa aactgggggt cacttgggct ccagcctcgg ggttgtggag
ctcactgtgg 420 ctcttcatta tgtcttcaat gcccctcaag acaggatact atgggatgtt
ggtcatcagt 480 cttacccaca caaaattcta actgggagaa gagatcaaat gcataccatg
aggcaaacag 540 atgggttagc gggattcacc aagcgctcgg agagtgaata tgactgcttt
ggaaccggcc 600 acagttctac taccatctca gcaggcttgg gaatggcggt cggccgggat
ctaaaaggaa 660 aaaacaacaa cgtcattgct gtcataggtg atggagccat gactgcaggg
caagcttatg 720 aagcaatgaa caatgctggt tacctggatt ctgacatgat tgttatcctt
aatgacaaca 780 agcaggtttc tttacccact gctactctag atgggcccat accacctgta
ggagctttga 840 gcagtgctct tagtaggtta caatcaaaca gacctcttag agaattacga
gaggttgcca 900 gttgatgaat 960 agggcgttac atgcttgtgg caaacagatt gatgatcagt ggcggaccga ggttctggat tgcatgaatt caacactttt ggctgcaaaa tgaagagctt
ggactctatt 1020 atataggtcc tgttgatggc cacaacatag atgaccttgt tgccattctc
aaggaggtta 1080 agagtaccaa gacaacaggt ccagttctga tccatgttgt cacagagaaa
ggccgcggat 1140 atccatatgc tgagaaagct gcagataagt accatggagt gaccaagttc
gatcctgcta 1200 ctggaaaaca attcaaatcc agtgctccta ctcagtccta cacaacatat
tttgcagagg 1260 ctttgattgc agaagcagag gtggacaagg atattgttgc aattcatgca
gcaatggggg 1320 gtggaacggg cttgaatctc ttccatcgcc ggttccccac acgatgcttt
gatgttggga 1380 tagcagaaca gcatgctgtt acctttgctg ctggtctagc ctgtgaaggc
attaaacctt 1440 tttgtgcaat ctactcatct ttcatgcaga gagcttatga ccaggtggtg
catgatgtag 1500 atttgcagaa gctgccagtg aaatttgcaa tggacagagc tgggctggtt
ggagcagatg 1560 gcccaacaca ttgtggagct tttgatgtcg ctttcatggc ttgccttcca
aacatggtgg 1620 tgatggctcc tgctgatgag gctgagcttt ttcacatggt ggccacagct
gctgccatag 1680 atgacaggcc cagttgtttc cggtacccaa gaggaaatgg ggtgggtgtt
gaactgccac 1740 cagggaacaa aggcattcct attgaggttg gaaggggccg aatattgatt
gagggggaga 1800 gagttgcact cttgggctat ggaacagcag tacagagctg tttggttgcg
tcttctttgc I860 tggaacaaca tggcttacga ataacagtcg cagatgcccg cttctgcaaa
ccattggacc 1920 atgctcttat tcgtagccta gcaaaatcac atgaagtttt gattacagta
gaagaagggt 1980 caattggtgg ttttgggtct catgttgctc agtttttggc ccttaatggt
cttcttgatg 2040 gcacaacaaa gtggagtccc atggttcttc ctgatcggta catagaccat
ggagcgccag 2100 cggaccagtt ggccatggcg ggtctgacac catctcatat tgcagcaaca
40 028761
gtattcaata tacttggaca 2151 aacaagggag gccctggaga tcatgttata g
<210> 11 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 11
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt 60 gctctcattt cc 72 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 ggttccgcgt ggatcaatgg ctctctgtac
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt 57 <210> 13 <211> 1863 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 cactataaca tgatctccag ggcctcc
atgagttttg atattgccaa 60 atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta
cgactgttgc cgaaagagag 120 tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc
gacagcgtga gccgttccag 180 cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc
gtggcgctgc actatgtcta 240 caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat
caggcttatc cgcataaaat 300 tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag
aaaggcggtc tgcacccgtt 360 cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc
gggcattcat caacctccat 420 cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa
ggcaaaaatc gccgcaccgt 480 ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg
tttgaagcga tgaatcacgc 540 gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac
aatgaaatgt cgatttccga 600 aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt
tccggtaagc tttactcttc 660 actgcgcgaa ggcgggaaaa aagttttctc tggcgtgccg
ccaattaaag agctgctcaa 720 acgcaccgaa gaacatatta aaggcatggt agtgcctggc
acgttgtttg aagagctggg 780 ctttaactac atcggcccgg tggacggtca cgatgtgctg
gggcttatca ccacgctaaa 840 gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt cctgcatatc
atgaccaaaa aaggtcgtgg 900 ttatgaaccg gcagaaaaag acccgatcac tttccacgcc
gtgcctaaat ttgatccctc 960 cagcggttgt ttgccgaaaa gtagcggcgg tttgccgagc
tattcaaaaa tctttggcga 1020 ctggttgtgc gaaacggcag cgaaagacaa caagctgatg
gcgattactc cggcgatgcg 1080 tgaaggttcc ggcatggtcg agttttcacg taaattcccg
gatcgctact tcgacgtggc 1140 aattgccgag caacacgcgg tgacctttgc tgcgggtctg
gcgattggtg ggtacaaacc 1200 cattgtcgcg atttactcca ctttcctgca acgcgcctat
gatcaggtgc tgcatgacgt 1260 ggcgattcaa aagcttccgg tcctgttcgc catcgaccgc
gcgggcattg ttggtgctga 1320 cggtcaaacc catcagggtg cttttgatct ctcttacctg
cgctgcatac cggaaatggt 1380 cattatgacc ccgagcgatg aaaacgaatg tcgccagatg
ctctataccg gctatcacta 1440 taacgatggc ccgtcagcgg tgcgctaccc gcgtggcaac
gcggtcggcg tggaactgac 1500 gccgctggaa aaactaccaa ttggcaaagg cattgtgaag
cgtcgtggcg agaaactggc 1560 gatccttaac tttggtacgc tgatgccaga agcggcgaaa
gtcgccgaat cgctgaacgc 1620 cacgctggtc gatatgcgtt ttgtgaaacc gcttgatgaa
- 41 028761
gcgttaattc 1680 tggaaatggc cgccagccat gaagcgctgg tcaccgtaga agaaaacgcc
attatgggcg 1740 gcgcaggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccatcg taaaccagta
cccgtgctga 1800 acattggcct gccggacttc tttattccgc aaggaactca ggaagaaatg
cgcgccgaac I860 tcggcctcga tgccgctggt atggaagcca aaatcaaggc ctggctggca
taa
1863
<210> 14
<211> 2505
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Truncated DXS nucleotide
<220>
<221> misc_feature <222> (653) .. (653)
<223> n=no nucleotide
<400> 14 atgagttttg 60 atattgccaa atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta
cgactgttgc 120 cgaaagagag tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc
gacagcgtga 180 gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc
gtggcgctgc 240 actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat
caggcttatc 300 cgcataaaat tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag
aaaggcggtc 360 tgcacccgtt cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc
gggcattcat 420 caacctccat cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa
ggcaaaaatc 480 gccgcaccgt ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg
tttgaagcga 540 tgaatcacgc gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac
aatgaaatgt 600 cgatttccga aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt
tccggtaagc 660 tttactcttc actgcgcgaa ggcgggaaca aagttttctc tgnattttaa
ttcaataccc 720 gaccctggca ctggtcgact cccccaggag ttacgactgt tgccgaaaga
gagtttaccg 780 aaactctgcg acgaactgcg ccgctattta ctcgacagcg tgagccgttc
cagcgggcac 840 ttcgcctccg ggctgggcac ggtcgaactg accgtggcgc tgcactatgt
ctacaacacc 900 ccgtttgacc aattgatttg ggatgtgggg catcaggctt atccgcataa
aattttgacc 960 ggacgccgcg acaaaatcgg caccatccgt cagaaaggcg gtctgcaccc
gttcccgtgg 1020 cgcggcgaaa gcgaatatga cgtattaagc gtcgggcatt catcaacctc
catcagtgcc 1080 ggaattggta ttgcggttgc tgccgaaaaa gaaggcaaaa atcgccgcac
cgtctgtgtc 1140 attggcgatg gcgcgattac cgcaggcatg gcgtttgaag cgatgaatca
cgcgggcgat 1200 atccgtcctg atatgctggt gattctcaac gacaatgaaa tgtcgatttc
cgaaaatgtc 1260 ggcgcgctca acaaccatct ggcacagctg ctttccggta agctttactc
ttcactgcgc 1320 gaaggcggga acaaagtttt ctctgcgtgc cgccaattaa agagctgctc
aaacgcaccg 1380 aagaacatat taaaggcatg gtagtgcctg gcacgttgtt tgaagagctg
ggctttaact 1440 acatcggccc ggtggacggt cacgatgtgc tggggcttat caccacgcta
aagaacatgc 1500 gcgacctgaa aggcccgcag ttcctgcata tcatgaccaa aaaaggtcgt
ggttatgaac 1560 cggcagaaaa agacccgatc actttccacg ccgtgcctaa atttgatccc
tccagcggtt 1620 gtttgccgaa aagtagcggc ggtttgccga gctattcaaa aatctttggc
gactggttgt 1680 gcgaaacggc agcgaaagac aacaagctga tggcgattac tccggcgatg
cgtgaaggtt 1740 ccggcatggt cgagttttca cgtaaattcc cggatcgcta cttcgacgtg
gcaattgccg agcaacacgc ggtgaccttt gctgcgggtc tggcgattgg tgggtacaaa
1800
42 028761
cccattgtcg I860 cgatttactc cactttcctg caacgcgcct atgatcaggt gctgcatgac
gtggcgattc 1920 aaaagcttcc ggtcctgttc gccatcgacc gcgcgggcat tgttggtgct
gacggtcaaa 1980 cccatcaggg tgcttttgat ctctcttacc tgcgctgcat accggaaatg
gtcattatga 2040 ccccgagcga tgaaaacgaa tgtcgccaga tgctctatac cggctatcac
tataacgatg 2100 gcccgtcagc ggtgcgctac ccgcgtggca acgcggtcgg cgtggaactg
acgccgctgg 2160 aaaaactacc aattggcaaa ggcattgtga agcgtcgtgg cgagaaactg
gcgatcctta 2220 actttggtac gctgatgcca gaagcggcga aagtcgccga atcgctgaac
gccacgctgg 2280 tcgatatgcg ttttgtgaaa ccgcttgatg aagcgttaat tctggaaatg
gccgccagcc 2340 atgaagcgct ggtcaccgta gaagaaaacg ccattatggg cggcgcaggc
agcggcgtga 2400 acgaagtgct gatggcccat cgtaaaccag tacccgtgct gaacattggc
ctgccggact 2460 tctttattcc gcaaggaact caggaagaaa tgcgcgccga actcggcctc
gatgccgctg gtatggaagc caaaatcaag gcctggctgg cataa
2505
<210> 15
<211> 1863
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 15 atgagttttg 60 atattgccaa atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta
cgactgttgc 120 cgaaagagag tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc
gacagcgtga 180 gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc
gtggcgctgc 240 actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat
caggcttatc 300 cgcataaaat tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag
aaaggcggtc 360 tgcacccgtt cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc
gggcattcat 420 caacctccat cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa
ggcaaaaatc 480 gccgcaccgt ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg
tttgaagcga 540 tgaatcacgc gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac
aatgaaatgt 600 cgatttccga aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt
tccggtaagc 660 tttactcttc actgcgcgaa ggcgggaaca aagttttctc tggcgtgccg
ccaattaaag 720 agctgctcaa acgcaccgaa gaacatatta aaggcatggt agtgcctggc
acgttgtttg 780 aagagctggg ctttaactac atcggcccgg tggacggtca cgatgtgctg
gggcttatca 840 ccacgctaaa gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt cctgcatatc
atgaccaaaa 900 aaggtcgtgg ttatgaaccg gcagaaaaag acccgatcac tttccacgcc
gtgcctaaat 960 ttgatccctc cagcggttgt ttgccgaaaa gtagcggcgg tttgccgagc
tattcaaaaa 1020 tctttggcga ctggttgtgc gaaacggcag cgaaagacaa caagctgatg
gcgattactc 1080 cggcgatgcg tgaaggttcc ggcatggtcg agttttcacg taaattcccg
gatcgctact 1140 tcgacgtggc aattgccgag caacacgcgg tgacctttgc tgcgggtctg
gcgattggtg 1200 ggtacaaacc cattgtcgcg atttactcca ctttcctgca acgcgcctat
gatcaggtgc 1260 tgcatgacgt ggcgattcaa aagcttccgg tcctgttcgc catcgaccgc
gcgggcattg 1320 ttggtgctga cggtcaaacc catcagggtg cttttgatct ctcttacctg
cgctgcatac 1380 cggaaatggt cattatgacc ccgagcgatg aaaacgaatg tcgccagatg
ctctataccg 1440 gctatcacta taacgatggc ccgtcagcgg tgcgctaccc gcgtggcaac
gcggtcggcg tggaactgac gccgctggaa aaactaccaa ttggcaaagg cattgtgaag
1500
43 028761
cgtcgtggcg 1560 agaaactggc gatccttaac tttggtacgc tgatgccaga agcggcgaaa
gtcgccgaat 1620 cgctgaacgc cacgctggtc gatatgcgtt ttgtgaaacc gcttgatgaa
gcgttaattc 1680 tggaaatggc cgccagccat gaagcgctgg tcaccgtaga agaaaacgcc
attatgggcg 1740 gcgcaggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccatcg taaaccagta
cccgtgctga 1800 acattggcct gccggacttc tttattccgc aaggaactca ggaagaaatg
cgcgccgaac 1860 tcggcctcga tgccgctggt atggaagcca aaatcaaggc ctggctggca
taa 1863
<210> 16 <211> 1863 <212> DNA <213> Escherichia coli
<400> 16 atgagttttg 60 atattgccaa atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta
cgactgttgc 120 cgaaagagag tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc
gacagcgtga 180 gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc
gtggcgctgc 240 actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat
caggcttatc 300 cgcataaaat tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag
aaaggcggtc 360 tgcacccgtt cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc
gggcattcat 420 caacctccat cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa
ggcaaaaatc 480 gccgcaccgt ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg
tttgaagcga 540 tgaatcacgc gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac
aatgaaatgt 600 cgatttccga aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt
tccggtaagc tttactcttc actgcgcgaa ggcgggaaaa aagttttctc tggcgtgccg
660
ccaattaaag 720 agctgctcaa acgcaccgaa gaacatattt gcggcatggt agtgcctggc
acgttgtttg 780 aagagctggg ctttaactac atcggcccgg tggacggtca cgatgtgctg
gggcttatca 840 ccacgctaaa gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt cctgcatatc
atgaccaaaa 900 aaggtcgtgg ttatgaaccg gcagaaaaag acccgatcac tttccacgcc
gtgcctaaat 960 ttgatccctc cagcggttgt ttgccgaaaa gtagcggcgg tttgccgagc
tattcaaaaa 1020 tctttggcga ctggttgtgc gaaacggcag cgaaagacaa caagctgatg
gcgattactc 1080 cggcgatgcg tgaaggttcc ggcatggtcg agttttcacg taaattcccg
gatcgctact 1140 tcgacgtggc aattgccgag caacacgcgg tgacctttgc tgcgggtctg
gcgattggtg 1200 ggtacaaacc cattgtcgcg atttactcca ctttcctgca acgcgcctat
gatcaggtgc 1260 tgcatgacgt ggcgattcaa aagcttccgg tcctgttcgc catcgaccgc
gcgggcattg 1320 ttggtgctga cggtcaaacc catcagggtg cttttgatct ctcttacctg
cgctgcatac 1380 cggaaatggt cattatgacc ccgagcgatg aaaacgaatg tcgccagatg
ctctataccg 1440 gctatcacta taacgatggc ccgtcagcgg tgcgctaccc gcgtggcaac
gcggtcggcg 1500 tggaactgac gccgctggaa aaactaccaa ttggcaaagg cattgtgaag
cgtcgtggcg 1560 agaaactggc gatccttaac tttggtacgc tgatgccaga agcggcgaaa
gtcgccgaat 1620 cgctgaacgc cacgctggtc gatatgcgtt ttgtgaaacc gcttgatgaa
gcgttaattc 1680 tggaaatggc cgccagccat gaagcgctgg tcaccgtaga agaaaacgcc
attatgggcg 1740 gcgcaggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccatcg taaaccagta
cccgtgctga 1800 acattggcct gccggacttc tttattccgc aaggaactca ggaagaaatg
cgcgccgaac tcggcctcga tgccgctggt atggaagcca aaatcaaggc ctggctggca
1860
44 028761
- 45 028761
Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys lie Pro Glu Met Val lie 435 440 445
Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gin Met Leu Tyr Thr Gly 450 455 460
Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn 465 470 475 480
Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro lie Gly Lys 485 490 495
Gly lie Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala lie Leu Asn Phe Gly 500 505 510
Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr 515 520 525
Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu lie Leu 530 535 540
Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala 545 550 555 560
lie Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His 565 570 575
Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn lie Gly Leu Pro Asp Phe Phe lie 580 585 590
Pro Gin Gly Thr Gin Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala 595 600 605
Ala Gly Met Glu Ala Lys lie Lys Ala Trp Leu Ala 610 615 620
<210> 18
<211> 219
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Truncated DXS polypeptide
<400> 18
Met Ser Phe Asp lie Ala Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Leu Val Asp Ser 15 10 15
Thr Gin Glu Leu Arg Leu Leu Pro Lys Glu Ser Leu Pro Lys Leu Cys
20
25
30
Asp Glu Leu Arg Arg Tyr Leu Leu Asp Ser Val Ser Arg Ser Ser Gly
His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Thr Val Glu Leu Thr Val Ala Leu His
Tyr Val Tyr Asn Thr Pro Phe Asp Gin Leu He Trp Asp Val Gly His
Gin Ala Tyr Pro His Lys lie Leu Thr Gly Arg Arg Asp Lys He Gly
Thr He Arg Gin Lys Gly Gly Leu His Pro Phe Pro Trp Arg Gly Glu 100 105 110
Ser Glu Tyr Asp Val Leu Ser Val Gly His Ser Ser Thr Ser He Ser 115 120 125
Ala Gly He Gly He Ala Val Ala Ala Glu Lys Glu Gly Lys Asn Arg 130 135 140
Arg Thr Val Cys Val He Gly Asp Gly Ala He Thr Ala Gly Met Ala 145 150 155 160
Phe Glu Ala Met Asn His Ala Gly Asp He Arg Pro Asp Met Leu Val 165 170 175
He Leu Asn Asp Asn Glu Met Ser He Ser Glu Asn Val Gly Ala Leu 180 185 190
Asn Asn His Leu Ala Gin Leu Leu Ser Gly Lys Leu Tyr Ser Ser Leu 195 200 205
Arg Glu Gly Gly Asn Lys Val Phe Ser Gly Phe 210 215
<210> 19
<211> 620
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 19
- 46 028761
- 47 028761
- 48 028761
Asp Pro Ser Ser Gly Cys Leu Pro Lys Ser Ser Gly Gly Leu Pro Ser 305 310 315 320
Tyr Ser Lys lie Phe Gly Asp Trp Leu Cys Glu Thr Ala Ala Lys Asp 325 330 335
Asn Lys Leu Met Ala lie Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly Met 340 345 350
Val Glu Phe Ser Arg Lys Phe Pro Asp Arg Tyr Phe Asp Val Ala lie 355 360 365
Ala Glu Gin His Ala Val Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala lie Gly Gly 370 375 380
Tyr Lys Pro lie Val Ala lie Tyr Ser Thr Phe Leu Gin Arg Ala Tyr 385 390 395 400
Asp Gin Val Leu His Asp Val Ala lie Gin Lys Leu Pro Val Leu Phe 405 410 415
Ala lie Asp Arg Ala Gly lie Val Gly Ala Asp Gly Gin Thr His Gin 420 425 430
Gly Ala Phe Asp Leu Ser Tyr Leu Arg Cys lie Pro Glu Met Val lie 435 440 445
Met Thr Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Gin Met Leu Tyr Thr Gly 450 455 460
Tyr His Tyr Asn Asp Gly Pro Ser Ala Val Arg Tyr Pro Arg Gly Asn 465 470 475 480
Ala Val Gly Val Glu Leu Thr Pro Leu Glu Lys Leu Pro lie Gly Lys 485 490 495
Gly lie Val Lys Arg Arg Gly Glu Lys Leu Ala lie Leu Asn Phe Gly 500 505 510
Thr Leu Met Pro Glu Ala Ala Lys Val Ala Glu Ser Leu Asn Ala Thr 515 520 525
Leu Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Glu Ala Leu lie Leu 530 535 540
Glu Met Ala Ala Ser His Glu Ala Leu Val Thr Val Glu Glu Asn Ala 545 550 555 560
lie Met Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Val Leu Met Ala His 565 570 575
Arg Lys Pro Val Pro Val Leu Asn lie Gly Leu Pro Asp Phe Phe lie 580 585 590
Pro Gin Gly Thr Gin Glu Glu Met Arg Ala Glu Leu Gly Leu Asp Ala 595 600 605
Ala Gly Met Glu Ala Lys lie Lys Ala Trp Leu Ala 610 615 620
<210> 21
<211> 626
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Bacterial consensus DXS sequence including Deinococcus radiodurans
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2)
<223> X=S, T or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3)
<223> X=L, F, I or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4)
<223> X=D, E or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5)
<223> X= I, T, S or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6)
<223> X= A, T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X= К or D
49
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X= Y or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10)
<223> X= T or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (12) . . (12)
<223> X= A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13)
<223> X= L or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (14) .. (14)
<223> X= V, A or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)
<223> X= D, E, S or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16) . . (16)
<223> X=S, N, T or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (17) .. (17)
<223> X=T, P or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18)
<223> X=Q, A, E, D or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (19) .. (19)
<223> X=A, E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (21)..(21)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (22) . . (22)
<223> X=L, M, A, S or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (24)..(24)
<223> X=P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25)
<223> X=K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (26) . . (26)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27)
<223> X=S, К, T or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30)
<223> X=K, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32)
<223> X=C, S or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33)
<223> X=D, N or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37)
<223> X=R, Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38)
<223> X=Y, F or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (39)..(39)
<223> X=L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (40)..(40)
<223> X=L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> X=D, T, N, A or R
50
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (42)..(42)
<223> X=S, C or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (43) .. (43)
<223> X=V or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (45)..(45)
<223> X=R or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (46) . . (46)
<223> X=S or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (47) .. (47)
<223> X=S or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (48) .. (48)
<223> X=G or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50)
<223> X=F or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (53)..(53)
<223> X=G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (56) . . (56)
<223> X=T, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (58)..(58)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (59)..(59)
<223> X=L or I
<220>
<221> MI SC_FEATURE <222> (60)..(60) <223> X=T or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (61)..(61) <223> X=V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67)
<223> X=Y or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68) <223> X=N, К or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (69)..(69)
<223> X=T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (71)..(71)
<223> X=F or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73)
<223> X=Q, R, H or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74)
<223> X=L, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75)
<223> X=I, V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (76) . . (76)
<223> X=W or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (84)..(84)
<223> X=P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(94)
<223> X=K, R or Q
51
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (95)..(95)
<223> X=I or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96)
<223> X=G, S, A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97)
<223> X=T, S or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (99)..(99)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (100)..(100)
<223> X=Q or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (101)..(101)
<223> X=K or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (102) .. (102)
<223> X=G, D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104)
<223> X=L, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105)
<223> X=H or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (106)..(106)
<223> X=P or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (108) .. (108)
<223> X=P or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109)
<223> X= W or К <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110)
<223> X= R or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (111) .. (111)
<223> X= G, E, D, A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (114) .. (114)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (115)..(115)
<223> X=Y, F or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (117)..(117)
<223> X=V, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (118) .. (118)
<223> X=L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119)
<223> X=S, N, C or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (123)..(123)
<223> X=S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (127)..(127)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (128) .. (128)
<223> X=S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (129)..(129)
<223> X=A or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (130)..(130)
<223> X=G or A
52
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (131)..(131)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (133) .. (133)
<223> X=I, V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135)
<223> X=V, I, A or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (137) .. (137)
<223> X=A or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (138) .. (138)
<223> X=E, A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (139)..(139)
<223> X=K, R or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (140)..(140)
<223> X=E or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (141)..(141)
<223> X=G, N, D or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (142)..(142)
<223> X=K, Q or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (143)..(143)
<223> X=N, D, Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (144)..(144)
<223> X=R or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (145)..(145)
<223> X=R, К or H <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146)
<223> X=T, A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (147)..(147)
<223> X=V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (148)..(148)
<223> X=C or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (154)..(154)
<223> X=A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (155)..(155)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (157) .. (157)
<223> X=A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> X=F or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> X=E or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (164)..(164)
<223> X=M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (165)..(165)
<223> X=N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (166)..(166) <223> X=H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (167)..(167)
<223> X=A or I
- 53 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (170)..(170)
<223> X=I or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (171)..(171)
<223> X=R, К, H, D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (172) .. (172)
<223> X=P, S, A or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (173) .. (173)
<223> X=D or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (174)..(174)
<223> X=M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (176)..(176)
<223> X=V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (177) .. (177)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (182) .. (182)
<223> X=E or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (191)..(191)
<223> X=A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (192)..(192)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (194)..(194)
<223> X=N or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (195)..(195)
<223> X=H or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (196) .. (196)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (197)..(197)
<223> X=A or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (198)..(198)
<223> X=Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (199) .. (199)
<223> X=L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (200) . . (200)
<223> X=L or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (201) .. (201)
<223> X=S or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (202) . . (202)
<223> X=G or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (204) .. (204)
<223> X=L, T or W
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (205) .. (205)
<223> X=Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (206) . . (206)
<223> X=S, A, T or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (207) . . (207)
<223> X=S, T, R or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (208) . . (208)
<223> X=L or G
54
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (209)..(209)
<223> X=R or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (210)..(210)
<223> X=E or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (211)..(211)
<223> X=G, S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (214)..(214)
<223> X=K or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (215)..(215)
<223> X=V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (216) . . (216)
<223> X=F, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (217)..(217)
<223> X=S, D, T or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (218)..(218)
<223> X=G, N or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (219)..(219)
<223> X=V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (220)..(220)
<223> X=P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (221)..(221)
<223> X=K or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (223)..(223)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (224)..(224)
<223> X=K or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (225)..(225)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (226) . . (226)
<223> X=L or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (227)..(227)
<223> X=L, V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (228)..(228)
<223> X=K, R or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (229)..(229)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (230)..(230)
<223> X=T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (231)..(231)
<223> X=E or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (232)..(232)
<223> X=E or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (233)..(233)
<223> X=H or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (234)..(234)
<223> X=I, L or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (235)..(235)
<223> X=K or R
- 55 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (236)..(236)
<223> X=G or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (237)..(237)
<223> X=M or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (238)..(238)
<223> X=V, M or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (239)..(239)
<223> X=V or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (241)..(241)
<223> X=G, S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (242)..(242)
<223> X=T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (243)..(243)
<223> X=L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (244)..(244)
<223> X=N or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (245)..(245)
<223> X=P or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (247)..(247)
<223> X=E or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (248)..(248)
<223> X=E or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (249)..(249)
<223> X=L or M <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (251)..(251)
<223> X=F or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (252) . . (252)
<223> X=N or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (254)..(254)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (261)..(261)
<223> X=D or Ы
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (263)..(263)
<223> X=L, Μ, H, Q or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (264)..(264)
<223> X=G, T, A, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (266)..(266)
<223> X=I, V, T, S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> X=T, S, N, Q, H, A or W
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (268)..(268)
<223> X=T or L
<221> MISC_FEATURE <222> (270) . . (270)
<223> X=K, R, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (271)..(271)
<223> X=N or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (272) . . (272)
<223> X=M or L
- 56 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (273)..(273)
<223> X=R or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (274) .. (274)
<223> X=D, A, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (276) . . (276)
<223> X=K or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (277) .. (277)
<223> X=G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (279)..(279)
<223> X=Q or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (280) .. (280)
<223> X=F, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (283) .. (283)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (284)..(284)
<223> X=M or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (286) . . (286)
<223> X=T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (289)..(289)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (291)..(291)
<223> X=Y or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (292)..(292)
<223> X=E, A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (293)..(293)
<223> X=P or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (296)..(296)
<223> X=K, Q or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (300)..(300)
<223> X=T, G, S or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (301)..(301)
<223> X=F or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (303)..(303)
<223> X=A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (304)..(304)
<223> X=V or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (305)..(305)
<223> X=P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (309)..(309)
<223> X=P, H or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (310)..(310)
<223> X=S, T, E or A
<220>
<221> misc_feature
<222> (311)..(311)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (313)..(313)
<223> X=C, T, L or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (314)..(314)
<223> X=L or Y
57
028761
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (315) . . (315)
<223> X—P or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (316) . . (316)
<223> X=K or P
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (317) . . (317)
<223> X=S or N
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (318) . . (318)
<223> X=S, Q, A or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (319) .. (319)
<223> X=G, S, E, D or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (320) . . (320)
<223> X=G, S, A, T or Y
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (321) . . (321)
<223> X=A or no amino acid
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (322) . . (322)
<223> X=L, M, Q, R or no amino acid
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (323) . . (323)
<223> X=P or no amino acid
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (324) .. (324)
<223> X=S, G or T
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (325) . . (325)
<223> X=Y, F or W
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (327) . . (327)
<223> X=K or A
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (328) . . (328)
<223> X=I, V or A
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (331) . . (331)
<223> X=D, E, Q or N
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (332) . . (332)
<223> X=W or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (333) . . (333)
<223> X=L or V
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (334) . . (334)
<223> X=C, S, K, Q or T
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (336) . . (336)
<223> X=T, Μ, E or W
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (338) . . (338)
<223> X=A or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (339) . . (339)
<223> X=K, V, H, A, Q or T
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (341) . . (341)
<223> X=N, D, S, T, К or P
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (342) . . (342)
<223> X=K, S or R
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (343) . . (343)
<223> X=L or T
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (344) . . (344)
<223> X=M or F
58
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (345) .. (345)
<223> X=A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (346) . . (346)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (356) . . (356)
<223> X=M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (357) . . (357)
<223> X=V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (358) . . (358)
<223> X=E, R, S, G, Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (361)..(361)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (362)..(362)
<223> X=K, E, D, T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (363)..(363)
<223> X=F, Y or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (365)..(365)
<223> X=D, A, Q, N, E or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (366)..(366)
<223> X=R or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (368) . . (368)
<223> X=F or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (371) . . (371)
<223> X=A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (375)..(375)
<223> X=Q or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (376) . . (376)
<223> X=H or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (377)..(377)
<223> X=A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (378)..(378)
<223> X=V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (380)..(380)
<223> X=F or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (384)..(384)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (386) . . (386)
<223> X=I, V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (387)..(387)
<223> X=V or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (388)..(388)
<223> X=G or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (389)..(389)
<223> X=Y or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (390)..(390)
<223> X=K, H or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (392)..(392)
<223> X=I or V
- 59 028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (407)..(407)
<223> X=V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (408)..(408)
<223> X=L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (411)..(411)
<223> X=V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (414)..(414)
<223> X=Q or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (415)..(415)
<223> X=K, N, S or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (417) . . (417)
<223> X=P or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (419)..(419)
<223> X=L, M or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (421)..(421)
<223> X=A, T or C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (422) . . (422)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (425)..(425)
<223> X=A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (427) . . (427)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (433)..(433)
<223> X=Q or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (436)..(436)
<223> X=Q or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (438) . . (438)
<223> X=A, S or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (442)..(442)
<223> X=S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (443)..(443)
<223> X=Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (444)..(444)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (446)..(446)
<223> X=C or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (447)..(447)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (449)..(449)
<223> X=E, D, N, Q, T or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (450)..(450)
<223> X=M or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (451)..(451)
<223> X=V, I, T, R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (452) .. (452)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (453) .. (453)
<223> X=M or G
60
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (454) .. (454)
<223> X=T, A or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (456) .. (456)
<223> X=S or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (458) .. (458)
<223> X=E or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (459) .. (459)
<223> X=N or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (461)..(461)
<223> X=C or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (463)..(463)
<223> X=Q, L or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (466)..(466)
<223> X=Y, F, H or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (467) .. (467)
<223> X=T or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (468) .. (468)
<223> X=G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (469) .. (469)
<223> X=Y, H or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (470) .. (470)
<223> X=H or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (471)..(471)
<223> X=Y or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (472) .. (472)
<223> X=N, Q, S, E or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (473) .. (473)
<223> X=D, G, Q, K, S, E or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (476)..(476)
<223> X=S, T, С, A, V or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (477) .. (477)
<223> X=A, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (478) .. (478)
<223> X=V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (484)..(484)
<223> X=N, S, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (485)..(485)
<223> X=A, G, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (486)..(486)
<223> X=V, Q, L, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (487) . . (487)
<223> X=G, S or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (488) . . (488)
<223> X=V, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (489)..(489)
<223> X=E, A, T, V, P or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (490)..(490)
<223> X=L, F, S or A
61
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (491)..(491)
<223> X=T, E, Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (492)..(492)
<223> X=P or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (493)..(493)
<223> X=L or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (494)..(494)
<223> X=E, T, Q, A, S, G or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (495)..(495)
<223> X=K, Q, S, M, A, T, E and D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (496)..(496)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (497)..(497)
<223> X=P or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (498)..(498)
<223> X=I, L or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (500)..(500)
<223> X=K or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (501)..(501)
<223> X=G or W
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (502)..(502)
<223> X=I, L, V or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (503)..(503)
<223> X=V, L, I or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (504)..(504)
<223> X=K, R or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (505)..(505)
<223> X=R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (506)..(506)
<223> X=R, H, Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (508)..(508)
<223> X=E, К or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (509)..(509)
<223> X=K, T or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (510)..(510)
<223> X=L, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (511)..(511)
<223> X=A or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (512)..(512)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (514)..(514)
<223> X=N, C or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (515)..(515)
<223> X=F or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (517)..(517)
<223> X=T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (518)..(518)
<223> X=L or A
62
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (519)..(519)
<223> X=M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (520)..(520)
<223> X=P, A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (521)..(521)
<223> X=E, Q or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (523)..(523)
<223> X=A, T, Q, S or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (524)..(524)
<223> X=K, Q, A, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (525)..(525)
<223> X=V, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (527)..(527)
<223> X=E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (528)..(528)
<223> X=S, A, K, N, T or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (529)..(529)
<223> X=L, M or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (530)..(530)
<223> X=P or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (531)..(531)
<223> X=N or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (532)..(532)
<223> X=A or V <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (533)..(533)
<223> X=T or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (534)..(534)
<223> X=L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (536)..(536)
<223> X=D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (537)..(537)
<223> X=M or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (545)..(545)
<223> X=E, D, T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (546)..(546)
<223> X=A, T, E, S or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (547)..(547)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (548)..(548)
<223> X=I, V, L or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (549)..(549)
<223> X=L, M, A, E, Q or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (550)..(550)
<223> X=E, Q or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (551)..(551)
<223> X=M, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (552)..(552)
<223> X=A or G
63
028761
<220>
<221> <222> <223> MI SC FEATURE (553) . . (553) X=A, S, G or Q
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (554) . . (554)
<223> X=S, Q, R, E or к
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (555) . . (555)
<223> X=H or A
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (556) . . (556)
<223> X=E, D, Q, S or R
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (557) . . (557)
<223> X=A, V, S, T or L
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (558) . . (558)
<223> X=L or F
<220>
<221> MI SC FEATURE
<222> (559) . . (559)
<223> X=V or I
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (561) . . (561)
<223> X=V, I or L
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (563) . . (563)
<223> X=E or D
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (564) . . (564)
<223> X=N or G
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (565) . . (565)
<223> X=A or T
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (566) . . (566)
<223> <220> X=V or I
<221> MISC FEATURE
<222> (567) . . (567)
<223> X=M, К or V
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (570) . . (570)
<223> X=A or F
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (572) . . (572)
<223> X=S or G
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (573) . . (573)
<223> X=G or A
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (575) . . (575)
<223> X=N or L
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (577) . . (577)
<223> X=V, L, F, Y or A
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (578) . . (578)
<223> X=L or V
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (579) . . (579)
<223> X=M or N
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (580) . . (580)
<223> X=A, Q or S
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (581) . . (581)
<223> X=H, N, К, E, R or M
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (582) . . (582)
<223> X=R, К or N
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (583) . . (583)
<223> X=K, R, L or I
64
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (584)..(584)
<223> X=P, A, W, G, L or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (585)..(585)
<223> X=V, I or P
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (586)..(586)
<223> X=P, S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (588)..(588)
<223> X=L or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (589)..(589)
<223> X=N or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (590)..(590)
<223> X=I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (592)..(592)
<223> X=L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (593)..(593)
<223> X=P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (595)..(595)
<223> X=F, R, Η, Y, L, E, I, V or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (597)..(597)
<223> X=I, V or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (598)..(598)
<223> X=P, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (599)..(599)
<223> X=Q, P or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (600) . . (600)
<223> X=G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (601) . . (601)
<223> X=T, E or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (602)..(602)
<223> X=Q or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (603) . . (603)
<223> X=E, D or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (604)..(604)
<223> X=E or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (605)..(605)
<223> X=M, A, I, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (606)..(606)
<223> X=R or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (607) ..(607)
<223> X=A, S, Η, T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (608) . . (608)
<223> X=E, D or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (609)..(609)
<223> X=L, I, Y or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (610) . . (610)
<223> X=G, Q or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (611)..(611)
<223> X=L or I
65
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (612) . . (612)
<223> X=D, N or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (613) . . (613)
<223> X=A or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (614)..(614)
<223> X=A, S, N, D, E or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (615) . . (615)
<223> X=G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (616)..(616)
<223> X=M or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (617) . . (617)
<223> X=E, Q, R, К or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (618) . . (618)
<223> X=A, T, Q, R or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (619)..(619)
<223> X=K, R, Q or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (620)..(620)
<223> X=I, V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (621)..(621)
<223> X=K, R, E, T, S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (622) . . (622)
<223> X=A, T, D, R, N, K, Q or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (623) . . (623)
<223> X=W, Y or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (624)..(624)
<223> X=L, Q, M or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (625) . . (625)
<223> X=A, V or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (626)..(626)
<223> X=D or no amino acid
<400> 21
Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Pro Xaa Leu Xaa
Xaa Glu Leu Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 35 40
Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa 45
His Xaa Ala Ser Xaa Leu Gly Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa His
Tyr Val Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Val Gly His
Gin Ala Tyr Xaa His Lys lie Leu Thr Gly Arg Arg Asp Xaa Xaa Xaa
Xaa lie Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa 100 105
Ser Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Xaa Val Gly His 115 120
Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Ala Xaa Ala Xaa Xaa 130 135
Xaa Xaa Xaa Xaa Val lie Gly Asp Gly Xaa 145 150
Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Xaa 165 170
Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 110
Xaa Ser Thr Ser Xaa Xaa 125
Xaa Glx Xaa Xaa Xaa Xaa 140
Xaa Thr Xaa Gly Met Ala 155 160
Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa 175
- 66 028761
- 67 028761
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Bacterial DXS consensus sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3)
<223> X= F, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4)
<223> X= D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (5) . . (5)
<223> X= I, T, S or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13)
<223> X= L or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14)
<223> X= V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15)
<223> X= D, E or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16)
<223> X= S, N or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17)
<223> X= T, P or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18)
<223> X= Q, A, E or D <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (19)..(19)
<223> X= A, E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22)
<223> X= L, M, A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (26) . . (26)
<223> X= E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (27)..(27)
<223> X= S, К or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30)
<223> X= К, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (32)..(32)
<223> X= C or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (33)..(33)
<223> X= D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (37)..(37)
<223> X= R or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (38)..(38)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (41)..(41)
<223> X= D, T, N or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (42)..(42)
<223> X= S or C
68
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (45)..(45)
<223> X= R or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (56) . . (56)
<223> X= T, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63)
<223> X=L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68)
<223> X=N or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (73)..(73)
<223> X= Q, R, H or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (74)..(74)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (94)..(94)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (96)..(96)
<223> X= G, S, A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (97)..(97)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (102) . . (102) <223> X= G, D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104)
<223> X= L or V <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (111)..(111) <223> X= G, D, E or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (114)..(114)
<223> X= E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (115)..(115)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (117)..(117)
<223> X= V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119)
<223> X= S, N or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (131)..(131)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (133) . . (133)
<223> X= I, V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135)
<223> X= V, I or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (138) .. (138)
<223> X= E, A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (139)..(139)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (141)..(141)
<223> X= G, N, D or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (142)..(142)
<223> X= K, Q or L
69
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (143)..(143)
<223> X= N, E, D, Q or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (145)..(145)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (146)..(146)
<223> X= T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (147)..(147)
<223> X= V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (165)..(165)
<223> X= N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (171)..(171)
<223> X= R, К, H, D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (172) .. (172)
<223> X= P, S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (174)..(174)
<223> X= M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (177) .. (177)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (182) .. (182)
<223> X= E or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (191)..(191)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (195)..(195)
<223> X= H or R <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (199)..(199)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (204)..(204)
<223> X= L or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (206)..(206)
<223> X= S, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (207)..(207)
<223> X= S, T or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (211)..(211)
<223> X= G or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (214)..(214)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (215)..(215)
<223> X= V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (216)..(216)
<223> X= F or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217)
<223> X= S, D or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (218)..(218)
<223> X= G, N or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (219)..(219)
<223> X= V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (224)..(224)
<223> X= E or D
70
028761
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (226) ". . (226)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (227) ". . (227)
<223> x= К or R
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (228) ". . (228)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (233) ". . (233)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (237) ". . (237)
<223> X= V or M
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (240) ". . (240)
<223> X= G or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (260) ". . (260)
<223> X= L, Μ, H, Q or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (261) ". . (261)
<223> X= G, T, A, S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (263) ". . (263)
<223> X= I, v, T, s or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (264) ". . (264)
<223> X= T, S, N, Q, , H or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (267) ". . (267)
<223> X= K, R or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (271) ". . (271)
<223> X= D, A, S or E
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (274) '. . (274)
<223> X= G or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (277) '. . (277)
<223> X= F or L
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (280) ". . (280)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (286) ". . (286)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (289) ". . (289)
<223> X= E or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (293) ". . (293)
<223> x= к or Q
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (297) ". . (297)
<223> X= T, G or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (298) ". . (298)
<223> X= F or W
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (306) ". . (306)
<223> X= P, H or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (307) ". . (307)
<223> x= s, T, E or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (308) ". . (308)
<223> x= s or T
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (310) ". . (310)
<223> x= c, T, V, L, E or S
71
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (314) .. (314)
<223> X= S or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (315) .. (315)
<223> X= S, Q, A or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (316)..(316)
<223> X= G, S, E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (317) .. (317)
<223> X= G, S, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (318) .. (318)
<223> X= A or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (319) .. (319)
<223> X= L, M, Q or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (321) .. (321)
<223> X= S, G or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (322) .. (322)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (324) .. (324)
<223> X= К or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (325) .. (325)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (328) .. (328)
<223> X= D, E, Q or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (331)..(331)
<223> X= С, К or Q <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (333)..(333)
<223> X= T, M or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (336)..(336)
<223> X= К, V, H, A or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (338)..(338)
<223> X= N, S, D, T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (339)..(339)
<223> X= K, R or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (343)..(343)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (354)..(354)
<223> X= V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (355)..(355)
<223> X= E, R, S, G or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (358)..(358)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (359)..(359)
<223> X= К, E, D or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (360)..(360)
<223> X= F or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (362)..(362)
<223> X= D, A, Q, N or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (363)..(363)
<223> X= R or Q
72
028761
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (374)..(374)
<223> X= A or S
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (375)..(375)
<223> X= V or A
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (383)..(383)
<223> X= I or V
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (385)..(385)
<223> X= G or D
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (387)..(387)
<223> X= K, R or H
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (389)..(389)
<223> X= I or V
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (404)..(404)
<223> X= V or L
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (405)..(405)
<223> X= I or L
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (408) . . (408)
<223> X= I or V
<220>
<2 21> MISC_FEATURE <222> (412) .. (412)
<223> X= K, N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (416)..(416)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (418) . . (418)
<223> X= A or T <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (419)..(419)
<223> X=I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (422) .. (422)
<223> X=A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (424)..(424)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (435)..(435)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (439)..(439)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (440)..(440)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (441)..(441)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (444)..(444)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (446)..(446)
<223> X= E, D, N, Q or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (448) .. (448)
<223> X= V, I or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (449)..(449)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (451)..(451)
<223> X= T or A
73
028761
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (460) .. (460)
<223> X= Q or L
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (463) . . (463)
<223> X= Y, F or H
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (466) . . (466)
<223> X= Y or H
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (468) . . (468)
<223> X= Y or H
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (469) . . (469)
<223> X= N, Q, S or E
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (470) . . (470)
<223> X= D, G, Q, K, s, . E or no amino acid
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (473)..(473)
<223> X= S, T, C, A or V
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (474) . . (474)
<223> X= A, V or T
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (481) . . (481)
<223> X= N, S, T or A
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (482)..(482)
<223> X= A, G or V
<220> <221> MISC FEATURE
<222> (483)..(483)
<223> X= V, Q, L or T
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (484)..(484)
<223> X= G or S
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (485) . . (485)
<223> X= V, A or T
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (486) . . (486)
<223> X= E, A, T, V, , P or Q
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (487)..(487)
<223> X= L, F or S
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (488) . . (488)
<223> X= T, E or Q
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (491) . . (491)
<223> X= E, T, Q, A, , S or G
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (492)..(492)
<223> X= K, Q, S, M, A, . T or E
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (493)..(493)
<223> X= L or M
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (495) . . (495)
<223> X= I or L
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (499) . . (499)
<223> X= I, L or V
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (500) . . (500)
<223> X= V, L or I
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (501) . . (501)
<223> X= К or R
<220> <221> MI SC FEATURE
<222> (503) . . (503)
<223> X= R, H, Q or E
74
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (505)..(505)
<223> X= E or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (506)..(506)
<223> X= К or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (507)..(507)
<223> X= L, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (509)..(509)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (511)..(511)
<223> X= N or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (516)..(516)
<223> X= M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (517)..(517)
<223> X= P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (518)..(518)
<223> X= E, Q or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (520)..(520)
<223> X= A, T, Q, S or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (521)..(521)
<223> X= K, Q, A, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (522)..(522)
<223> X= V, A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (524)..(524)
<223> X= E or D <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (525)..(525)
<223> X= S, A, K, N or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (526) . . (526)
<223> X= L, M or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (530)..(530)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (541)..(541)
<223> X= E, D, T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (542)..(542)
<223> X= A, T, E, S or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (544)..(544)
<223> X= I, V, L or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (545)..(545)
<223> X= L, M, A or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (546) . . (546)
<223> X= E, Q or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (547)..(547)
<223> X= M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (549)..(549)
<223> X= A, S, G or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (550) .. (550)
<223> X= S, Q, R, E or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (552)..(552)
<223> X= E, D, Q or S
75
028761
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (553)..(553)
<223> X= A, V, S, T or L
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (554)..(554)
<223> X= L or F
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (555)..(555)
<223> X= I or V
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (557)..(557)
<223> X= V, I or L
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (560)..(560)
<223> X= N or G
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (562)..(562)
<223> X= I or V
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (563)..(563)
<223> X= M or К
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (573)..(573)
<223> X= V, L, F or Y
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (574)..(574)
<223> X= L or V
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (576) . . (576)
<223> X= A, Q or S
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (577)..(577)
<223> X= Η, N, K, R or E
<220>
<2 21> MISC_FEATURE
<222> (578)..(578)
<223> X= R or К <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (579) .. (579)
<223> X= K, R, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (580) . . (580)
<223> X= P, A, W, G or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (581) .. (581)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (582) .. (582)
<223> X= P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (586) .. (586)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (589)..(589)
<223> X= P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (591) .. (591)
<223> X= F, R, Η, Y, L, E, I, V or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (593) .. (593)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (594) . . (594)
<223> X= P or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (595) .. (595)
<223> X= Q or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (597) .. (597)
<223> X= T, E or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (599) .. (599)
<223> X= E, D, A or Q
76
028761
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (601)..(601)
<223> X= M, A, I, L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (602) . . (602)
<223> X= R or H
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (603) . . (603)
<223> X= A, S, Η, T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (604)..(604)
<223> X= E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (605)..(605)
<223> X= L, I or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (606)..(606)
<223> X= G, Q or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (608) . . (608)
<223> X= D, N or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (609)..(609)
<223> X= A or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (610) . . (610)
<223> X= A, S, N, D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (612) . . (612)
<223> X= M or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (613) . . (613)
<223> X= E, Q, R, К or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (614)..(614)
<223> X= A, T, Q, R or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (615) . . (615)
<223> X= K, R or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (616) . . (616)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (617) . . (617)
<223> X= K, R, E, T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (618) . . (618)
<223> X= A, T, D, R, N, Q or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (619) . . (619)
<223> X= W or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (620) . . (620)
<223> X= L, Q or M
<400> 22
Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Tyr Pro Thr Leu Ala Xaa Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Leu Arg Xaa Leu Pro Xaa Xaa Xaa Leu Pro Xaa Leu Xaa
Xaa Glu Leu Arg Xaa Xaa Leu Leu Xaa Xaa Val Ser Xaa Ser Ser Gly
His Phe Ala Ser Gly Leu Gly Xaa Val Glu Leu Thr Val Ala Xaa His
Tyr Val Tyr Xaa Thr Pro Phe Asp Xaa Xaa Xaa Trp Asp Val Gly His
Gin Ala Tyr Pro His Lys He Leu Thr Gly Arg Arg Asp Xaa lie Xaa
Xaa He Arg Gin Lys Xaa Gly Xaa His 100 105
Pro Phe Pro Trp Arg Xaa Glu 110
- 77 028761
Ser Xaa Xaa Asp Хаа Leu Хаа Val Gly His Ser Ser Thr Ser lie Ser 115 120 125
Ala Gly Xaa Gly Xaa Ala Xaa Ala Ala Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Arg 130 135 140
Xaa Xaa Xaa Cys Val lie Gly Asp Gly Ala lie Thr Ala Gly Met Ala 145 150 155 160
Phe Glu Ala Met Xaa His Ala Gly Asp lie Xaa Xaa Asp Xaa Leu Val 165 170 175
Xaa Leu Asn Asp Asn Xaa Met Ser lie Ser Glu Asn Val Gly Xaa Leu 180 185 190
Asn Asn Xaa Leu Ala Gin Xaa Leu Ser Gly Lys Xaa Tyr Xaa Xaa Leu 195 200 205
Arg Glu Xaa Gly Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Pro lie Lys Xaa 210 215 220
Leu Xaa Xaa Xaa Thr Glu Glu His Xaa Lys Gly Met Xaa Val Pro Xaa 225 230 235 240
Thr Leu Phe Glu Glu Leu Gly Phe Asn Tyr lie Gly Pro Val Asp Gly 245 250 255
His Asp Val Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr Leu Xaa Asn Met Arg Xaa Leu 260 265 270
Lys Xaa Pro Gin Xaa Leu His Xaa Met Thr Lys Lys Gly Xaa Gly Tyr 275 280 285
Xaa Pro Ala Glu Xaa Asp Pro lie Xaa Xaa His Ala Val Pro Lys Phe 290 295 300
Asp Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Leu Pro Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro 305 310 315 320
Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Phe Gly Xaa Trp Leu Xaa Glu Xaa Ala Ala Xaa 325 330 335
Asp Xaa Xaa Leu Met Ala Xaa Thr Pro Ala Met Arg Glu Gly Ser Gly 340 345 350
Met Xaa Xaa Phe Ser Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Tyr Phe Asp Val Ala 355 360 365
lie Ala Glu Gin His Xaa Xaa Thr Phe Ala Ala Gly Leu Ala Xaa Gly 370 375 380
Xaa Tyr Xaa Pro Xaa Val Ala lie Tyr Ser Thr Phe Leu Gin Arg Ala 385 390 395 400
Tyr Asp Gin Xaa Xaa His Asp Xaa Ala lie Gin Xaa Leu Pro Val Xaa 405 410 415
Phe Xaa Xaa Asp Arg Xaa Gly Xaa Val Gly Ala Asp Gly Gin Thr His 420 425 430
Gin Gly Xaa Phe Asp Leu Xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Pro Xaa Met Xaa 435 440 445
Xaa Met Xaa Pro Ser Asp Glu Asn Glu Cys Arg Xaa Met Leu Xaa Thr 450 455 460
Gly Xaa His Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Xaa Val Arg Tyr Pro Arg Gly 465 470 475 480
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Gly 485 490 495
Lys Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Leu Xaa Phe 500 505 510
Gly Thr Leu Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Asn Ala 515 520 525
Thr Xaa Val Asp Met Arg Phe Val Lys Pro Leu Asp Xaa Xaa Leu Xaa 530 535 540
Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Glu Glu Xaa 545 550 555 560
Ala Xaa Xaa Gly Gly Ala Gly Ser Gly Val Asn Glu Xaa Xaa Met Xaa 565 570 575
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Leu Asn Xaa Gly Leu Xaa Asp Xaa Phe 580 585 590
- 78 028761
- 79 028761
<222> (56) . . (56)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (59) . . (59)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (61) . . (61)
<223> X= N, D or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (62)..(62)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (64)..(64)
<223> X= Q, E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (66)..(66)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (67)..(67)
<223> X= I or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (68)..(68)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (77) . . (77)
<223> X= P, G or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (81) . . (81)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (8 6) . . (86)
<223> X= D, G or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (87) ..(87)
<223> X= Q, К or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89)
<223> X= Η, P, A or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (91)..(91)
<223> X= M, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (93)..(93)
<223> X= Q or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (95)..(95)
<223> X= D, N or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (98)..(98)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (104)..(104)
<223> X= S, G, D or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (108) . . (108) <223> X= Y or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (110)..(110) <223> X= C or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (113)..(113)
<223> X= T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (119)..(119)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (123) . . (123)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
80
028761
<222> (128) . . (128)
<223> X= V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (132) . . (132)
<223> X= L, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (134)..(134)
<223> X= G or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (135)..(135)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (136)..(136)
<223> X= N or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (138) . . (138)
<223> X= N, H, S or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (140)..(140)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (141)..(141)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (148)..(148)
<223> X= M or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (150)..(150)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (152) .. (152)
<223> X= Q or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (154)..(154)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (159)..(159)
<223> X= N or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (161)..(161) <223> X= G or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (162)..(162) <223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (165)..(165)
<223> X= S or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (166)..(166) <223> X= D or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (175)..(175)
<223> X= К or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (182) .. (182) <223> X= A or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (183) .. (183)
<223> X= T, N or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (184)..(184)
<223> X= L or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (185)..(185)
<223> X= D, N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (186)..(186) <223> X= G or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (187) .. (187)
<223> X= P or N
<220>
<221> MISC_FEATURE
81
028761
<222> (188 ) . . (188 )
<223> X= I, S or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (189)..(189)
<223> X= P, D or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (194)..(194)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (195)..(195)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (196)..(196)
<223> X= S, G or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (197)..(197)
<223> X= A, T or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (198)..(198)
<223> X= L or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (199)..(199)
<223> X= S, A or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (200)..(200)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (201)..(201)
<223> X= L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (203)..(203)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (204)..(204)
<223> X= N or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (205)..(205)
<223> X= R, P or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (206)..(206)
<223> X= P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (213)..(213)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (217)..(217)
<223> X= V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (221)..(221)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (222)..(222)
<223> X= G or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (223)..(223)
<223> X= G, A, D or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (224)..(224)
<223> X= P, V or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (225)..(225)
<223> X= M or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (226) . . (226)
<223> X= H or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (227) . . (227)
<223> X= E, Q, К or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (228) . . (228)
<223> X= L or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
- 82 028761
<222> (229)..(229)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (232)..(232)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (234)..(234)
<223> X= E or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (243)..(243)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (244)..(244)
<223> X= G or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (246) . . (246)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (259)..(259)
<223> X= V or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (264) . . (264)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (268)..(268) <223> X= V, L or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (269) . . (269)
<223> X= A, T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (270)..(270)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (272)..(272)
<223> X= K, R or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (273)..(273)
<223> X= E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (275) .. (275)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (276) . . (276)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (277) .. (277)
<223> X= T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (278) .. (278)
<223> X= K, R, H or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (280) .. (280) <223> X= T, V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (285) .. (285)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (288) .. (288) <223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (293) .. (293)
<223> X= R or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (296)..(296)
<223> X= P, L or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (297) .. (297)
<223> X= Y or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (300) . . (300)
<223> X= K, R, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
83
028761
<222> (301)..(301)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (302)..(302)
<223> X= A, D or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (305)..(305)
<223> X= Y or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (309)..(309)
<223> X= T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (314)..(314)
<223> X= A or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (317)..(317)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (319)..(319)
<223> X= F or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (320)..(320)
<223> X= K, Q or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (321)..(321)
<223> X= S, T, G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (322)..(322)
<223> X= S, T or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (323)..(323)
<223> X= A, N, T or P
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (324)..(324)
<223> X= P, E or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (325)..(325)
<223> X= T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (326) . . (326)
<223> X= Q or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (327) .. (327)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (330)..(330)
<223> X= T or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (334) .. (334)
<223> X= E or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (335) .. (335)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (337) . . (337)
<223> X= I, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (338) .. (338)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (341) .. (341)
<223> X= E or К
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (342) .. (342)
<223> X= V, A or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (344) .. (344)
<223> X= К or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (345) .. (345)
<223> X= D, N or R
<220>
<221> MISC FEATURE
84
028761
<222> (346)..(346)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (347)..(347)
<223> X= V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (349)..(349)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (354)..(354)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (360)..(360)
<223> X= N, Y or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (361)..(361)
<223> X= L, M or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (363)..(363)
<223> X= H, Q, S or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (364)..(364)
<223> X= R, К or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (365)..(365)
<223> X= R, К or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (366) . . (366)
<223> X= F or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (368)..(368)
<223> X= T or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (370)..(370)
<223> X= С, T or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (384) .. (384)
<223> X= A or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (392)..(392)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (393)..(393)
<223> X= К or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (397)..(397)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (401)..(401)
<223> X= S or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (403) . . (403)
<223> X= M or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (406)..(406)
<223> X= A or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (410)..(410)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (411)..(411)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (415)..(415)
<223> X= D, S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (418) .. (418)
<223> X= К or N
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (422) . . (422)
<223> X= К or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
85
028761
- 86 028761
<222> (495)..(495)
<223> X= P or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (496)..(496)
<223> X= G, Y, A or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (497)..(497)
<223> X= N or G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (498)..(498)
<223> X= I or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (499)..(499)
<223> X= N, S, К or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (500)..(500)
<223> X= К or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (501)..(501)
<223> X= D or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (502)..(502)
<223> X= L, M or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (505)..(505)
<223> X= I, V or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (507)..(507)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (509)..(509)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (511)..(511)
<223> X= R or К
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (513)..(513)
<223> X= R or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (514)..(514)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (515)..(515)
<223> X= L or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (516)..(516)
<223> X= I, К, V or R
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (517)..(517)
<223> X= E or Q
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (519)..(519)
<223> X= E, D, К or T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (520)..(520)
<223> X= R or D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (522)..(522)
<223> X= A or C
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (524)..(524)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (525)..(525)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (528)..(528)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (529)..(529)
<223> X= A, V or S
<220>
<221> MISC FEATURE
87
028761
<222> <223> (531) X= Q . . (531) or N
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5325 ". . (532)
<223> x= s, N or E
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5335 ". . (533)
<223> x= c or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (534^ ". . (534)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5355 ". . (535)
<223> X= V, . G or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5375 ". . (537)
<223> x= s or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5385 ". . (538)
<223> X= S, . V, A, D or E
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5395 ". . (539)
<223> X= I, . M, L or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5415 ". . (541)
<223> X= E or Q
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5425 ". . (542)
<223> X= Q, . E, R or L
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (5435 ". . (543)
<223> X= H, . R, Q or D
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (544) ". . (544)
<223> X= G or D
<220>
<221> MISC_ FEATURE
<222> (545) ’. . (545)
<223> X= L or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (546) . . (546)
<223> X= R, N or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (547) .. (547)
<223> X= I, V, T or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (550) . . (550)
<223> X= A or I
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (560) . . (560)
<223> X= H, R or T
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (561) . . (561)
<223> X= A, D or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (563) . . (563)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (565) . . (565)
<223> X= S or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (566) . . (566)
<223> X= L or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (568) . . (568)
<223> X= K, R or Q
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (569) . . (569)
<223> X= S or E
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (571) . . (571)
<223> X= E or P
<220>
<221> MISC_ FEATURE
88
028761
<222> (573)..(573)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (574)..(574)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (575)..(575)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (576) . . (576)
<223> X= V or I
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (580)..(580)
<223> X= S, T or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (581)..(581)
<223> X= I or V
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (585)..(585)
<223> X= G or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (586) . . (586)
<223> X= S or A
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (589)..(589)
<223> X= A, V or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (590)..(590)
<223> X= Q or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (593)..(593)
<223> X= A or T
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (595)..(595)
<223> X= N, D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (597)..(597)
<223> X= L or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (601)..(601) <223> X= T, К or G
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (602) . . (602) <223> X= T or L
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (604)..(604)
<223> X= W or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (605)..(605)
<223> X= S or R
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (608) . . (608) <223> X= V, T or C
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (609)..(609)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (612) . . (612) <223> X= R or H
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (613) . . (613)
<223> X= Y or F
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (615) . . (615)
<223> X= D or E
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (618) . . (618) <223> X= A or D
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (619)..(619)
<223> X= P or Y
<220>
<221> MISC_FEATURE
89
028761
<222> <223> (620) X= A, ..(620) S or R
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (623) . (623)
<223> X= L or M
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (624) . (624)
<223> X= A, I or N
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (625) . (625)
<223> X= M, E or L
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (629) . (629)
<223> X= T or M
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (630) . (630)
<223> X= P, A or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (631) . (631)
<223> x= s, Q or G
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (635) . (635)
<223> X= A, S or G
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (636) . (636)
<223> X= T or S
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (637) . (637)
<223> X= V or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (638) . (638)
<223> X= F or L
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (639) . (639)
<223> X= N, T or Q
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (640) ..(640)
<223> X= I, L, M or T
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (641) ". . (641)
<223> X= I or L
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (643) ". . (643)
<223> X= Q, A or R
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (644) ". . (644)
<223> X= T, P, A or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (645) ". . (645)
<223> X= R, К or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (646) ". . (646)
<223> X= E, D or G
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (648) ". . (648)
<223> X= L or A
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (649) ". . (649)
<223> X= E, F, Q or К
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (650) ". . (650)
<223> X= I, V, F, Y or no amino acid
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (651) ". . (651)
<223> X= M, S, A or no amino acid
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (652) ". . (652)
<223> X= L, S, I or no amino acid
<220>
<221> MISC FEATURE
<222> (653) ". . (653)
<223> X= s or no amino acid
<220>
<221> MISC_ FEATURE
90
028761
<222> (654) .. (654)
<223> X= A, N or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (655) .. (655)
<223> X= L, T or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (656)..(656)
<223> X= Q, G or no amino acid
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (657) .. (657)
<223> X= A, L or no amino acid
<400> 23
Thr Pro Leu Leu Asp Thr Xaa Asn Tyr Pro Xaa His Xaa Lys Asn Xaa
Xaa Xaa Xaa Glx Leu Xaa Gin Leu Xaa Xaa Glu Leu Arg Xaa Xaa Xaa
Xaa Xaa Xaa Val Ser Xaa Thr Gly Gly His Leu Xaa Xaa Ser Leu Gly
Val Val Glu Leu Thr Val Ala Xaa His Tyr Xaa Phe Xaa Xaa Pro Xaa
Asp Xaa Xaa Xaa Trp Asp Val Gly His Gin Xaa Tyr Xaa His Lys Tie
Xaa Thr Gly Arg Arg Xaa Xaa Met Xaa Thr Xaa Arg Xaa Thr Xaa Gly
Leu Xaa Gly Phe Thr Lys Arg Xaa Glu Ser Glu Xaa Asp Xaa Phe Gly 100 105 110
Xaa Gly His Ser Ser Thr Xaa lie Ser Ala Xaa Leu Gly Met Ala Xaa 115 120 125
Gly Arg Asp Xaa Lys Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Val Xaa Xaa Val lie Gly 130 135 140
Asp Gly Ala Xaa Thr Xaa Gly Xaa Ala Xaa Glu Ala Met Asn Xaa Ala 145 150 155 160
- 91 028761
Xaa Phe Хаа Gin Arg Хаа Туг Asp Gin Xaa Xaa His Asp Val Xaa Leu 405 410 415
Gin Xaa Leu Pro Val Xaa Phe Ala Met Asp Arg Ala Gly Xaa Val Gly 420 425 430
Ala Asp Gly Xaa Thr His Cys Gly Ala Phe Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Ala 435 440 445
Xaa Leu Pro Xaa Met Xaa Xaa Met Ala Pro Xaa Asx Glu Ala Xaa Leu 450 455 460
Xaa Xaa Met Val Ala Thr Xaa Xaa Ala lie Asp Asp Xaa Pro Ser Cys 465 470 475 480
Phe Xaa Xaa Pro Arg Gly Asn Gly Xaa Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa 485 490 495
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Gly Xaa Pro Xaa Glu Xaa Gly Xaa Gly 500 505 510
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Val Xaa Leu Xaa Xaa Tyr Gly Xaa 515 520 525
Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Leu Glx Xaa Xaa Xaa 530 535 540
Xaa Xaa Xaa Thr Val Xaa Asp Ala Arg Phe Cys Lys Pro Leu Asp Xaa 545 550 555 560
Xaa Leu Xaa Arg Xaa Xaa Ala Xaa Xaa His Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa 565 570 575
Glu Glu Gly Xaa Xaa Gly Gly Phe Xaa Xaa His Val Xaa Xaa Phe Leu 580 585 590
Xaa Leu Xaa Gly Xaa Leu Asp Gly Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Pro Met Xaa 595 600 605
Xaa Pro Asp Xaa Xaa lie Xaa His Gly Xaa Xaa Xaa Asp Gin Xaa Xaa 610 615 620
Xaa Ala Gly Leu Xaa Xaa Xaa His lie Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
625 630 635 640
Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
645 650 655
<210> 24
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR Primer
<400> 24
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ggttccgcgt ggatcaatga gttttgatat
tgccaaatac cc
<210> 25
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> PCR Primer
<400> 25
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt cattatgcca gccaggcctt gattttg
<210> 26 <211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Mutagenic Primer
<400> 26
gcgcgaaggc gggaacaaag ttttctctgg cgtgcc
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Mutagenic Primer
- 92 028761
ggcacgccag agaaaacttt gttcccgcct tcgcgc 36
<210> 28
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Mutagenic Primer
<400> 28
cgcaccgaag aacatatttg cggcatggta gtgcctgg 38
<210> 29
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Mutagenic Primer
<400> 29
ccaggcacta ccatgccgca aatatgttct tcggtgcg 38

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ усиления активности 1-дезокси-О-ксилулозо-5-фосфат синтазы (DXS) в растениях или бактериях для увеличения производства терпенов, включающий стадии:
    а) определение по меньшей мере одного сайта мутации в полипептидной последовательности DXS растения или бактерии путем сравнения её с референсной последовательностью, выбранной из группы,
    состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23;
    б) осуществление мутагенеза по меньшей мере в одном сайте мутации, идентифицированном на стадии (а) в полипептидной последовательности DXS растения или бактерии, при этом указанный сайт мутации выбран из группы, состоящей из
    аминокислотного остатка в позиции 213 или 234 последовательностей SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:
    20 или SEQ ID NO: 22,
    аминокислотного остатка в позиции 213 или 235 последовательности SEQ ID NO: 21, аминокислотного остатка в позиции 284 или 306 последовательностей SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4
    или SEQ ID NO: 6,
    аминокислотного остатка в позиции 215 или 237 последовательности SEQ ID NO: 23,
    где аминокислотный остаток в позициях 213, 284 и 215 заменяют на N или аминокислотный остаток
    в позициях 234, 235, 306 и 237 заменяют на C;
    причем указанный мутантный полипептид обладает активностью DXS, которая выше, чем у исходного DXS растения или бактерии.
  2. 2. Мутантный полипептид растения или бактерии, имеющий повышенную активность DXS по сравнению с DXS дикого типа, полученный способом по п.1.
  3. 3. Мутантный выделенный полипептид, имеющий активность DXS, полученный способом по п.1, который содержит последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 21, в которой аминокислота в положении 213 представляет собой аспарагин и/или аминокислота в положении 234 представляет собой цистеин.
  4. 4. Мутантный выделенный полипептид по п.3, где последовательность, по меньшей мере на 90% идентичная последовательности SEQ ID NO: 21, представляет собой последовательность SEQ ID NO: 22, в которой аминокислота в положении 213 представляет собой аспарагин и/или аминокислота в положении 234 представляет собой цистеин.
  5. 5. Мутантный выделенный полипептид по п.3, где последовательность, по меньшей мере на 90% идентичная последовательности SEQ ID NO: 21, содержит последовательность SEQ ID NO: 19.
  6. 6. Мутантный выделенный полипептид по п.3, где последовательность, по меньшей мере на 90% идентичная последовательности SEQ ID NO: 21, содержит последовательность SEQ ID NO: 20.
  7. 7. Мутантный выделенный полипептид, имеющий активность DXS, полученный способом по п.1, который содержит последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2 или фрагменту последовательности SEQ ID NO: 2, имеющему длину по меньшей мере 300 аминокислот, причем аминокислота в положении 306 SEQ ID NO: 2 представляет собой цистеин и/или аминокислота в положении 284 SEQ ID NO: 2 представляет собой аспарагин.
  8. 8. Мутантный выделенный полипептид по п.7, где последовательность, по меньшей мере на 90% идентичная последовательности SEQ ID NO: 2, содержит последовательность SEQ ID NO: 4.
  9. 9. Мутантный выделенный полипептид по п.7, где последовательность, по меньшей мере на 90% идентичная последовательности SEQ ID NO: 2, содержит последовательность SEQ ID NO: 6.
  10. 10. Изолированный полинуклеотид, включающий последовательность, которая кодирует полипептид по любому из пп.2-9.
  11. 11. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.10.
    - 93 028761
  12. 12. Трансформированная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п.10 или вектор по п.11.
  13. 13. Трансформированная клетка-хозяин по п.12, где указанная трансформированная клетка-хозяин является прокариотической клеткой, выбранной из группы, содержащей клетки эубактерий, архебактерий и цианобактерий.
  14. 14. Трансформированная клетка-хозяин по п.12, где указанная трансформированная клетка-хозяин является эукариотической клеткой, выбранной из группы, содержащей животные, грибковые, дрожжевые и растительные клетки.
  15. 15. Трансгенная бактерия с увеличенными возможностями производства и/или накопления терпенов, содержащая полинуклеотид по п.10 или вектор по п.11.
  16. 16. Трансгенное растение с увеличенными возможностями производства и/или накопления терпенов, содержащее полинуклеотид по п.10 или вектор по п.11.
  17. 17. Способ получения трансгенного растения, содержащего полинуклеотид по п.10 или вектор по п.11, включающий стадии:
    а) трансформация растительной клетки полинуклеотидом по п.10 или вектором по п.11;
    б) отбор трансформированной растительной клетки, которая экспрессирует полипептид, охарактеризованный в любом из пп.2-9; и
    в) выращивание трансгенного растения из указанной трансформированной растительной клетки.
  18. 18. Способ получения фермента, имеющего активность DXS, превышающую активность DXS дикого типа, который увеличивает производство терпенов в растениях, бактериях или дрожжах, включающий в себя следующие этапы:
    а) культивирование трансформированной клетки-хозяина по любому из пп.12-14;
    б) выделение фермента DXS, имеющего активность DXS, превышающую активность DXS дикого
    типа, из клеточного экстракта, суспензии клеток, белковой фракции, кристаллической фракции, культуры клеток, клеточного гомогената, клеточного лизата, супернатанта клеток, клеточного фильтрата или клеточного осадка указанной трансформированной клетки-хозяина.
  19. 19. Полипептид, имеющий повышенную активность DXS по сравнению с активностью DXS дикого типа, полученный способом по п.18.
  20. 20. Способ производства терпенов в клетке-хозяине, включающий следующие этапы: а) культивирование трансформированной клетки-хозяина по любому из пп.12-14 в культуральной
    среде, содержащей источник, по меньшей мере, глицеральдегид-3-фосфата и пирувата, для получения терпенов; и
    б) выделение терпенов из указанной культуральной среды путем экстракции, которая включает хроматографию, экстрагирование и дистилляцию.
    MoDXSl (SEQ ID N°8)
    ATGGCTCTCTGTACGCTCTCATTTCCTGCCCATTTTAGCCAGGCTGCTGCTTCAAATCCTCAGAGACTTACTCCTCAGTGTTC
    CCATTTGTTCTTGGGGGTGGATTTGCAGTGCCAATCCCAGCAAAGGAGTAAGGCCAGGAAAAGGCCAAATGGGGTTTGTGCAT
    CACTTTCGGATAGGGAGGAGTATCATTCCCAGAGACCACCAACTCCTCTCCTGGACACTATCAATTATCCAATTCACATGAAA
    AATCTGTCTGTCAAGGAGCTGAAACAACTCGCAGATGAACTAAGGTCTGATGTTGTCTTCAATGTTTCCAAAACTGGGGGTCA
    CTTGGGCTCCAGCCTCGGGGTTGTGGAGCTCACTGTGGCTCTTCATTATGTCTTCAATGCCCCTCAAGACAGGATACTATGGG
    ATGTTGGTCATCAGTCTTACCCACACAAAATTCTAACTGGGAGAAGAGATCAAATGCATACCATGAGGCAAACAGATGGGTTA
    GCGGGATTCACCAAGCGCTCGGAGAGTGAATATGACTGCTTTGGAACCGGCCACAGTTCTACTACCATCTCAGCAGGCTTGGG
    AATGGCGGTCGGCCGGGATCTAAAAGGAAAAAACAACAACGTCATTGCTGTCATAGGTGATGGAGCCATGACTGCAGGGCAAG
    CTTATGAAGCAATGAACAATGCTGGTTACCTGGATTCTGACATGATTGTTATCCTTAATGACAACAAGCAGGTTTCTTTACCC
    ACTGCTACTCTAGATGGGCCCATACCACCTGTAGGAGCTTTGAGCAGTGCTCTTAGTAGGTTACAATCAAACAGACCTCTTAG
    AGAATTACGAGAGGTTGCCAAGGGCGTTACCAAACAGATTGGCGGACCGATGCATGAATTGGCTGCAAAAGTTGATGAATATG
    CTCGTGGGATGATCAGTGGTTCTGGATCAACACTTTTTGAAGAGCTTGGACTCTATTATATAGGTCCTGTTGATGGCCACAAC
    ATAGATGACCTTGTTGCCATTCTCAAGGAGGTTAAGAGTACCAAGACAACAGGTCCAGTTCTGATCCATGTTGTCACAGAGAA
    AGGCCGCGGATATCCATATGCTGAGAAAGCTGCAGATAAGTACCATGGAGTGACCAAGTTCGATCCTGCTACTGGAAAACAAT
    TCAAATCCAGTGCTCCTACTCAGTCCTACACAACATATTTTGCAGAGGCTTTGATTGCAGAAGCAGAGGTGGACAAGGATATT
    GTTGCAATTCATGCAGCAATGGGGGGTGGAACGGGCTTGAATCTCTTCCATCGCCGGTTCCCCACACGATGCTTTGATGTTGG
    GATAGCAGAACAGCATGCTGTTACCTTTGCTGCTGGTCTAGCCTGTGAAGGCATTAAACCTTTTTGTGCAATCTACTCATCTT
    TCATGCAGAGAGCTTATGACCAGGTGGTGCATGATGTAGATTTGCAGAAGCTGCCAGTGAAATTTGCAATGGACAGAGCTGGG
    CTGGTTGGAGCAGATGGCCCAACACATTGTGGAGCTTTTGATGTCGCTTTCATGGCTTGCCTTCCAAACATGGTGGTGATGGC
    TCCTGCTGATGAGGCTGAGCTTTTTCACATGGTGGCCACAGCTGCTGCCATAGATGACAGGCCCAGTTGTTTCCGGTACCCAA
    GAGGAAATGGGGTGGGTGTTGAACTGCCACCAGGGAACAAAGGCATTCCTATTGAGGTTGGAAGGGGCCGAATATTGATTGAG
    GGGGAGAGAGTTGCACTCTTGGGCTATGGAACAGCAGTACAGAGCTGTTTGGTTGCGTCTTCTTTGCTGGAACAACATGGCTT
    ACGAATAACAGTCGCAGATGCCCGCTTCTGCAAACCATTGGACCATGCTCTTATTCGTAGCCTAGCAAAATCACATGAAGTTT
    TGATTACAGTAGAAGAAGGGTCAATTGGTGGTTTTGGGTCTCATGTTGCTCAGTTTTTGGCCCTTAATGGTCTTCTTGATGGC
    ACAACAAAGTGGAGTCCCATGGTTCTTCCTGATCGGTACATAGACCATGGAGCGCCAGCGGACCAGTTGGCCATGGCGGGTCT
    GACACCATCTCATATTGCAGCAACAGTATTCAATATACTTGGACAAACAAGGGAGGCCCTGGAGATCATGTTATAG
EA201390592A 2010-10-20 2011-10-20 Аллели 1-d-дезоксиксилулозо-5-фосфат синтазы, ответственные за усиленный биосинтез терпенов EA028761B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10013809.8 2000-03-21
EP10013809A EP2444415A1 (en) 2010-10-20 2010-10-20 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis
EP11003842.9 2011-05-10
EP11003842A EP2444416A1 (en) 2010-10-20 2011-05-10 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis
PCT/EP2011/005283 WO2012052171A1 (en) 2010-10-20 2011-10-20 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201390592A1 EA201390592A1 (ru) 2014-01-30
EA028761B1 true EA028761B1 (ru) 2017-12-29

Family

ID=43513606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201390592A EA028761B1 (ru) 2010-10-20 2011-10-20 Аллели 1-d-дезоксиксилулозо-5-фосфат синтазы, ответственные за усиленный биосинтез терпенов

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9556424B2 (ru)
EP (3) EP2444415A1 (ru)
JP (2) JP6327856B2 (ru)
KR (1) KR101878899B1 (ru)
CN (1) CN103429612B (ru)
AU (1) AU2011317859B2 (ru)
BR (1) BR112013009807A2 (ru)
CA (1) CA2815264A1 (ru)
DK (1) DK2630157T3 (ru)
EA (1) EA028761B1 (ru)
UA (1) UA112763C2 (ru)
WO (1) WO2012052171A1 (ru)
ZA (1) ZA201302751B (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2444415A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-25 Genoplante-Valor 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis
KR20150014941A (ko) * 2012-05-16 2015-02-09 글리코스 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 아이소프렌의 생산을 위한 미생물유기체 및 방법
KR20170018051A (ko) 2014-06-13 2017-02-15 데이노브 테르펜 또는 테르페노이드의 생산 방법
WO2016108236A1 (en) * 2014-12-29 2016-07-07 Futuragene Israel Ltd. Nucleic acid constructs, plants comprising same and uses thereof in enhancing plant pest resistance and altering plant monoterpene profile
CN106148295A (zh) * 2015-04-15 2016-11-23 中国科学院微生物研究所 1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合成酶及其编码基因与应用
JP6357186B2 (ja) * 2016-03-31 2018-07-11 Ｊｘｔｇエネルギー株式会社 カロテノイドの製造方法
CA3046436A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Deinove Methods of producing phytoene
CA3084263A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of (6e)-8-hydroxygeraniol by fermentation
EP3728212A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 Zymergen Inc. Nepetalactol oxidoreductases, nepetalactol synthases, and microbes capable of producing nepetalactone
EP3833754A4 (en) * 2018-08-08 2022-06-15 Board of Trustees of Michigan State University ENHANCED TERPENOID PRODUCTION USING ENZYMES ANCHORED TO LIPID DROPLET SURFACE PROTEINS
CN113015807A (zh) * 2018-08-31 2021-06-22 新加坡科技研究局 萜类化合物的生产方法
CN114107549A (zh) * 2021-12-14 2022-03-01 北京市林业果树科学研究院 一种与葡萄果实玫瑰香味相关的kasp分子标记与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999011757A1 (en) * 1997-09-02 1999-03-11 Washington State University Research Foundation NUCLEIC AND AMINO ACID SEQUENCES FOR A NOVEL TRANSKETOLASE FROM $i (MENTHA PIPERITA)
WO2000044912A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Royal Holloway And Bedford New College Manipulating isoprenoid expression
GB2430200A (en) * 2005-09-16 2007-03-21 Bridgestone Corp A gene cluster involved in biosynthesis of isopentenyl diphosphate by the non-mevalonate pathway of Hevea brasiliensis

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19831570A1 (de) * 1998-07-14 2000-01-20 Siemens Ag Biometrischer Sensor und Verfahren zu dessen Herstellung
CN106939323B (zh) * 2005-07-05 2021-07-13 加利福尼亚大学董事会 编码类异戊烯修饰酶的多核苷酸和其使用方法
EP1987147B1 (en) 2006-02-14 2010-07-28 Firmenich S.A. Method for producing terpenes and mep-transformed microorganisms therefore
MY153871A (en) 2008-04-23 2015-03-31 Danisco Us Inc Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
EP2444415A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-25 Genoplante-Valor 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999011757A1 (en) * 1997-09-02 1999-03-11 Washington State University Research Foundation NUCLEIC AND AMINO ACID SEQUENCES FOR A NOVEL TRANSKETOLASE FROM $i (MENTHA PIPERITA)
WO2000044912A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Royal Holloway And Bedford New College Manipulating isoprenoid expression
GB2430200A (en) * 2005-09-16 2007-03-21 Bridgestone Corp A gene cluster involved in biosynthesis of isopentenyl diphosphate by the non-mevalonate pathway of Hevea brasiliensis

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GenBank: CBI26134.3, 08.06.2010, [найдено 25.09.2013]. Найдено из Интернет: <URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi> *
DATABASE GenBank: EFF14228.1, 24.03.2010, [найдено 25.09.2013]. Найдено из Интернет: <URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi> *
ERIC DUCHÊNE, GISÈLE BUTTERLIN, PATRICIA CLAUDEL, VINCENT DUMAS, NATHALIE JAEGLI AND DIDIER MERDINOGLU: "A grapevine (Vitis vinifera L.) deoxy-d-xylulose synthase gene colocates with a major quantitative trait loci for terpenol content", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS ; INTERNATIONAL JOURNAL OF PLANT BREEDING RESEARCH, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 118, no. 3, 1 February 2009 (2009-02-01), Berlin, DE, pages 541 - 552, XP002620521, ISSN: 0040-5752, DOI: 10.1007/s00122-008-0919-8 *
HEIKE PAETZOLD, STEFAN GARMS, STEFAN BARTRAM, JENNY WIECZOREK, EVA-MARIA URÓS-GRACIA, MANUEL RODRÍGUEZ-CONCEPCIÓN, WILHELM BOLAND,: "The Isogene 1-Deoxy-D-Xylulose 5-Phosphate Synthase 2 Controls Isoprenoid Profiles, Precursor Pathway Allocation, and Density of Tomato Trichomes", MOLECULAR PLANT, vol. 3, no. 5, 1 September 2010 (2010-09-01), pages 904 - 916, XP002620524, DOI: 10.1093/mp/ssq032 *
JESÚS MUÑOZ-BERTOMEU, ISABEL ARRILLAGA, ROC ROS, JUAN SEGURA: "Up-regulation of 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase enhances production of essential oils in transgenic spike lavender", PLANT PHYSIOLOGY (ROCKVILLE), vol. 142, no. 3, 1 November 2006 (2006-11-01), pages 890 - 900, XP002620525, DOI: 10.1104/pp.106.086355 *
JURI BATTILANA ; LAURA COSTANTINI ; FRANCESCO EMANUELLI ; FEDERICA SEVINI ; CINZIA SEGALA ; SERGIO MOSER ; RICCARDO VELASCO ; GIUS: "The 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase gene co-localizes with a major QTL affecting monoterpene content in grapevine", THEORETICAL AND APPLIED GENETICS ; INTERNATIONAL JOURNAL OF PLANT BREEDING RESEARCH, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 118, no. 4, 27 November 2008 (2008-11-27), Berlin, DE, pages 653 - 669, XP019698334, ISSN: 1432-2242 *
KUZUYAMA TOMOHISA; TAKAGI MOTOKI; TAKAHASHI SHUNJI; SETO HARUO: "CLONING AND CHARACTERIZATION OF 1-DEOXY-D-XYLULOSE 5-PHOSPHATE SYNTHASE FROM STREPTOMYCES SP. STRAIN CL190, WHICH USES BOTH THE MEVALONATE AND NONMEVALONATE PATHWAYS FOR ISOPENTENYL DIPHOSPHATE BIOSYNTHESIS", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 182, no. 4, 1 February 2000 (2000-02-01), US, pages 891 - 897, XP009081766, ISSN: 0021-9193, DOI: 10.1128/JB.182.4.891-897.2000 *
LANGE, B. MARKUS ET AL: "A family of transketolases that directs isoprenoid biosynthesis via a mevalonate-independent pathway", THE FASEB JOURNAL, FEDERATION OF AMERICAN SOCIETIES FOR EXPERIMENTAL BIOLOGY, US, vol. 95., 1 March 1998 (1998-03-01), US, pages 2100 - 2104., XP002116672, ISSN: 0892-6638 *
OLIVIER JAILLON,JEAN-MARC AURY, BENJAMIN NOEL, ALBERTO POLICRITI, CHRISTIAN CLEPET, ALBERTO CASAGRANDE, NATHALIE CHOISNE, SÉBASTIE: "The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla", NATURE, MACMILLAN JOURNALS LTD., ETC, vol. 449, no. 7161, 27 September 2007 (2007-09-27), pages 463, XP002620523, ISSN: 0028-0836, DOI: 10.1038/nature06148 *
SONG XIANG, GERLINDE USUNOW, GUDRUN LANGE, MARCO BUSCH, LIANG TONG: "Crystal structure of 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase, a crucial enzyme for isoprenoids biosynthesis", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, vol. 282, no. 4, 26 January 2007 (2007-01-26), pages 2676 - 2682, XP002620522, ISSN: 0021-9258, DOI: 10.1074/jbc.M610235200 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103429612A (zh) 2013-12-04
US20130276166A1 (en) 2013-10-17
EP2630157B1 (en) 2018-01-24
KR20140032947A (ko) 2014-03-17
UA112763C2 (uk) 2016-10-25
WO2012052171A1 (en) 2012-04-26
AU2011317859A1 (en) 2013-05-23
EA201390592A1 (ru) 2014-01-30
CA2815264A1 (en) 2012-04-26
AU2011317859B2 (en) 2015-07-16
EP2444416A1 (en) 2012-04-25
JP2014500710A (ja) 2014-01-16
KR101878899B1 (ko) 2018-08-17
JP6327856B2 (ja) 2018-05-23
DK2630157T3 (en) 2018-04-30
EP2630157A1 (en) 2013-08-28
ZA201302751B (en) 2014-09-25
EP2444415A1 (en) 2012-04-25
CN103429612B (zh) 2016-08-10
US9556424B2 (en) 2017-01-31
BR112013009807A2 (pt) 2021-06-29
JP2017060512A (ja) 2017-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9556424B2 (en) 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis
AU763068B2 (en) Nucleic acids encoding (taxus) geranylgeranyl diphosphate synthase, and methods of use
Fujisawa et al. Cloning and characterization of a novel gene that encodes (S)-β-bisabolene synthase from ginger, Zingiber officinale
Lu et al. FaMYB11 promotes the accumulation of volatile esters by regulating FaLOX5 during strawberry (Fragaria× ananassa) ripening
CN113025623B (zh) 一种玫瑰花香调控基因RrTPS1及其应用
Zhao et al. Alcohol dehydrogenases regulated by a MYB44 transcription factor underlie Lauraceae citral biosynthesis
Perassolo et al. Biosynthesis of sesquiterpene lactones in plants and metabolic engineering for their biotechnological production
JP2013013406A (ja) リナロール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
JP6748108B2 (ja) 芳香性化合物の製造
CN113621633A (zh) 一种杧果萜烯合成酶基因tps1及其应用
Tang et al. Cloning and functional analysis of CDS_CCI2: A Tanacetum cinerariaefolium chrysanthemyl diphosphate synthase gene
CN110951788A (zh) 马尾松α-蒎烯合成酶在制备萜烯类化合物及包含萜烯类化合物的产品中的应用
ELSHERBENY et al. MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF TERPENE SYNTHASE 4 (SgTPS4) GENE FROM Salvia guaranitica PLANT
CN116622751A (zh) 一种姜花香茅醇合成酶基因HcTPS38及其应用
CN116555300A (zh) 一种姜荷花萜类合成酶基因CaTPS2及其应用
CN114381473A (zh) 转录因子LcERF19在调控山鸡椒精油合成中的应用
JP5753052B2 (ja) テルピネオール合成酵素をコードするポリヌクレオチドおよびその用途
CN117230030A (zh) 一种生物全合成紫杉醇前体物质巴卡亭iii的方法、生物材料及应用
WO2017110751A1 (ja) テルペン合成酵素をコードするポリヌクレオチド、植物の芳香性の改変方法及びテルペン合成能が高い植物体の選別方法
Ismail Evaluation of genetic and metabolic role of SKIP11 in Arabidopsis thaliana

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU