JP6327856B2 - 向上したテルペン生合成に重要である１−デオキシ−ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ対立遺伝子 - Google Patents

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Description

本発明は、典型的な植物または細菌ＤＸＳタンパク質と比較して向上した１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）活性を有する新しいポリペプチドに関する。このポリペプチドは、細胞中でのテルペンの大規模な蓄積に重要である。
本発明は、このポリペプチドを発現し、かつ典型的なＤＸＳ遺伝子を発現する植物、細菌または酵母と比較して、かなり向上したテルペンの蓄積を可能とする、遺伝子組み換えの植物、細菌または酵母にも関する。
本発明は、このポリペプチドを発現する遺伝子組み換えの植物、細菌または酵母を培養することによるテルペンの製造方法にも関する。
最後に、本発明は、このポリペプチドを発現し、かつクロマゾンに耐性を示す遺伝子組み換えの植物に関する。
イソプレノイド（テルペノイドまたはテルペンとしても知られている）は、自然に発生する天然物の最も大きい族であると考えられており、２９０００を超える個々の化合物がこれまでに同定されている。化学的に、それらは、それらの構造および複雑さにおいて千差万別である。イソプレノイドは、多くの基本的な生物学的機能に関連し、それゆえ、それらは、全生命体の正常な成長および発達のプロセスにとって必須である。例えば、イソプレノイドは、真核性の膜安定剤（ステロール）、動物ホルモンおよび植物ホルモン（ステロイド、レチノイド、ジベレリンおよびアブサイシン酸）、光合成色素（カロテノイドおよびクロロフィルのフィトール側鎖）、および電子輸送担体（メナキノン、プラトキノンおよびユビキノン）を含む。
結果的に、イソプレノイドは、かなり商業的関心のある複雑な天然物の大きくて多様な群である。イソプレノイドは、今日、ほとんど、植物から抽出されまたは化学的に合成され、医薬品（例えば、タキソール、ビサボロール、およびアルテミシニン）、動物補助飼料および食用染料（リコピンおよびβ−カロチンのような種々のカロテノイド）または香料および芳香（例えばメントール、パチュロール、およびノートカトン）として使用される。
イソプレノイドは、それらの含有する炭素数によって、いくつかの群に分類される；注目する主な群は、モノテルペン類（Ｃ１０）、セスキテルペン類（Ｃ１５）、ジテルペン類（Ｃ２０）、およびトリテルペン類（Ｃ３０）である。
全イソプレノイドは、共通の代謝前駆体、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ；Ｃ５）を経て合成される。ＩＰＰはいわゆる「メバロン酸経路」により、メバロン酸からもっぱら合成されることが以前仮定された。しかしながら、更なる最近の調査は、真正細菌、緑藻類、および植物内で、ＩＰＰは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−４−リン酸（ＭＥＰ）経路と呼ばれる異なる経路によっても合成されることを示す。それゆえ、植物は、それぞれ、サイトゾルおよびプラスチド内でＩＰＰの生合成に重要である、メバロン酸およびＭＥＰの両方の経路を有する。
植物のＭＥＰ経路の第１の中間体は、１−デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）であり、グリセルアルデヒド−３−リン酸（Ｇ３Ｐ）およびピルビン酸からのその生合成は、チアミン依存性酵素の１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）によって触媒される。ＤＸＳは、細菌および植物内でのイソプレノイド形成の律速段階を触媒することが示されている。実際、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ：シロイヌナズナ）およびトマト（リコペルシコン・エクスレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））内で、ＤＸＳの過剰発現は、カロテノイドのようなプラスチド由来のイソプレノイドのレベルを増加させる結果となった。これはスパイクラベンダー（ラヴァンデュララティフォリア（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ））のような芳香性植物についても当てはまり、ＤＸＳの過剰発現は、エッセンシャルオイル合成を実質的に増加させる。
テルペノイドは、多くの植物由来の生成物のアロマおよび芳香に含まれ、およびそれら中で、モノテルペノールは、ブドウおよびワインのアロマプロファイルに強く寄与する。バラまたはスズランといわれているフローラル香料は、リナロール、ゲラニオール、ネロール、α−テルピネオールまたはシトロネロールのような分子の存在に関係している。これらの分子の最大濃度は、マスカット群の品種またはゲヴェルツトラミナー種に見られ、これらの品種にとても特徴的なアロマをもたらす。フローラル香料は、そのマスカット群に関係せず、遺伝子型に自然に発生する。
特定のジテルペノイドは、商業的に、特に医薬品部門で有効に使用されている。特にタキサン類、パクリタキセルおよびドセタキセルのジテルペノイドは、乳癌および卵巣癌の治療に実際に使用されている。パクリタキセルは、イチイ（タキサス種）から抽出される天然分子であり、一方で、ドセタキセルは、同じくイチイから抽出されるパクリタキセルの前駆体である１０−デアセチルバッカチン ＩＩＩ（または１０−ＤＡＢ ＩＩＩ）にから誘導される半合成分子である。イチイの多くのパクリタキセルの生合成遺伝子は記載されている。これらの分子は、イチイエキス中の１０−ＤＡＢ ＩＩＩおよびとりわけパクリタキセルは比較的少量のせいで、およびその分子構造の複雑さのため工業的にスケールアップする方法がないせいで、生産するにコストがかかる。
従って、注目したテルペンのより安価な製造方法だけでなく、未だ容易に合成できないテルペン誘導体の製造方法の需要が高い。
伝統的な化学プロセスにより有機分子を製造する化学工業は、次第に微生物細胞工場を利用する製造プロセスに変わっている。グリーンケミストリーへのこの発展の鍵となる要素は、いわゆる「バイオテクノロジープロセス」がより環境にやさしいこと、多くの微生物により製造される化合物は、複雑すぎて有機合成により得にくいこと、および微生物細胞工場では、特定の化合物の限定されない供給を表すこと、である。最近、イソプレノイドは、植物からの抽出または化学合成により大量スケールで製造されている。これらの両方の方法の主な欠点は、収率が低く、高価であることである。第３のオプションはインビトロの酵素変換により、所望のイソプレノイドを製造することであるが、このアプローチは利用可能な前駆体が限られ、それゆえほとんどの場合経済的に実行可能ではない。
イソプレノイド製造のための微生物の代謝工学は、発酵プロセスで安価な炭素源から大量のイソプレノイドの製造をもたらし、これにより、工業的なイソプレノイド製造における現在の問題の多くを解決するかもしれない一方で、天然化合物のイソプレノイド群に見出される大きな多様性のバイオテクノロジーの開発を可能とする。
いくつかのイソプレノイド生成物は、リモネン、カロテノイド、エピセドロール、タキサジエン等を含む遺伝子改変の微生物により製造される。大腸菌内でイソプレノイド産生量を向上させるため、遺伝子ｄｘｓ（ＤＸＰシンターゼをコード化する）、ｄｘｒ（ＤＸＰレダクトイソメラーゼ）およびｉｄｉ（ＩＰＰ異性化酵素）は、過剰発現され、上記のイソプレノイド生成物のいくつかのよい結果を有する（ＭＡＵＲＹら（２００５年）にレビューされている）。大腸菌によるアモルファジエン産生量の更なる増加は、大腸菌のアモルファジエン産生菌中で出芽酵母（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））からメバロン酸経路を発現することによりなされている。いくつかのイソプレノイド化合物は、また出芽酵母中のエピセドロール、出芽酵母およびトルラ酵母中のリコピンおよびβ−カロチンを含む酵母中でも製造される。いくつかの場合、酵母中でイソプレノイド生産量は、ＨＭＧ１（コード化ＨＭＧ−ＣＯＡレダクターゼ）の過剰発現により向上することが示されている（ＭＡＵＲＹら（２００５年）にレビューされている）。
上記されている背景技術にも関らず、テルペンおよびテルペノイドを製造するためのプロセス、および特に、従来から知られている方法におけるより高収率で、より安価かつ短時間で微生物中にテルペンを蓄積する方法の要求がまだある。それゆえ、この要求を満たすテルペンまたはテルペノイドの製造方法を提供することが本発明の目的である。
大量のテルペンを蓄積し、および／または周囲媒質に分泌する微生物を製造することが本発明の目的である。そのような微生物によるテルペンの製造は、好ましく、長時間安定である。
さらに、本発明の目的は、農作物の栄養価を増加する手段として、イソプレノイド成分の純度を高める、または草食動物、害虫または病原体への耐性を増加することにより植物自体の環境適応度を向上させる目的で、向上したイソプレノイド産生量を有する植物へ遺伝子を操作することである。
本発明は、典型的には、ｄｘｓ遺伝子を発現する植物、細菌または酵母と比較して、これらの２つの遺伝子の１つを発現し、かつテルペンの蓄積をかなり向上し得る遺伝子組み換えの植物、細菌または酵母を提供することにより本発明の先行技術の本質的な欠点および他の欠点を解決することを目的とする。
本発明は、以下の工程を含む、植物または細菌の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）活性を向上し、テルペンの産生量を増加する方法に関する：
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３を含む群から選択される参照配列および植物，細菌または酵母の配列との間の配列比較をすることにより植物、細菌または酵母のＤＸＳ活性を有するポリペプチド上の少なくとも１つの変異部位、好ましくは２つの変異部位を決定する工程；
ｂ）少なくとも１つの変異部位、好ましくは２つの変異部位上で変異を進める工程；
ｃ）典型的なＤＸＳと比較して向上したＤＸＳ活性を有するポリペプチドを得る工程。
本明細書の図面は本明細書の部分を形成し、および本発明の特定の態様をさらに説明するために含まれる。本発明は、本明細書にある特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の一以上を参照してよりよく理解されるかもしれない。
ヴィティス・ヴィニフェラ種のマスカット・オットネル（ＭＯ）（ＭＯＤＸＳ１、配列番号８、およびＭＯＤＸＳ２、配列番号９）およびゲヴェルツトラミナー（ＧＷ）（ＧＷＤＸＳ２、配列番号１０）の異なるＤＸＳ対立遺伝子に対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す図である。ＳＮＰに対応する位置は、太字で示される。 図１−１の続きである。 配列番号２に対応する関連のコンセンサス配列を有するＭＯおよびＧＷ中の異なるＤＸＳ対立遺伝子に対応するタンパク質の比較を示す図である。 異なる植物種由来のＤＸＳタンパク質の比較からの結果であるコンセンサス配列（その配列により配列番号１が得られた）を示す図である： 第１行： コンセンサス（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ） 第２行： ＭＯ＿ＤＸＳ１ 第３行： ＭＯ＿ＤＸＳ２ 第４行： ＧＷ＿ＤＸＳ２ 第５行： シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ） 第６行： トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｕｍ） 第７行： ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ） 第８行： ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） 第９行： ラッパスイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ） 第１０行： タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） 第１１行： イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） 図３−１の続きである。 図３−１の続きである。 ブドウ果皮中のテルペノールの含有量（５つの主なテルペノールのプール：ゲラニオール、リナロール、シトロネロール、ネロール、α−テルピネオール）およびマスカットオットネル子孫（１：ＭｏＤＸＳ１；２：ＭｏＤＸＳ２）中のＤＸＳ遺伝子型を示す（２００３年および２００４年）。 ブドウ果皮中のテルペノールの含有量５つの主なテルペノールのプール：ゲラニオール、リナロール、シトロネロール、ネロール、α−テルピネオール）およびゲヴェルツトラミナー子孫（１：ＧｗＤＸＳ１＝ＭｏＤＸＳ１；および２：ＧｗＤＸＳ２）のＤＸＳ遺伝子型を示す図である（２００４年および２００５年）。 ブドウ由来のＤＸＳ対立遺伝子およびバジル由来のゲラニオール シンターゼ（ＧＥＳ）を共発現するタバコの葉で製造されるテルペンのＧＣ−ＭＳ分析を示す図である。Ａ：ＭｏＤＸＳ１およびＧＥＳを共発現するタバコの葉の分析。Ｂ：ＭｏＤＸＳ２およびＧＥＳを共発現するタバコの葉の分析。 タバコの葉の中でのＧＥＳおよびＤＸＳ対立遺伝子の一過性の共発現の後の、植物体のゲラニオール生合成を示す図である。形質転換されていないタバコの葉（コントロール）、ＧＥＳのみを発現する葉およびＧＥＳとＤＸＳ対立遺伝子を共発現する葉が、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に媒介された形質転換の４日後にＧＣ−ＭＳを使用して分析された。各条件で、ゲラニオールの量は９つの独立した実験の平均（±標準誤差）である。 ＭＯＤＸＳ１（配列番号３）、ＭＯＤＸＳ２（配列番号４）、ＤＸＳ活性を有する切断されたＭＯＤＸＳ２（配列番号５）およびＧＷＤＸＳ２（配列番号６）、ＤＸＳ活性を有する切断されたＧＷＤＸＳ２（配列番号７）のアミノ酸配列を示す。 図８−１と同じである。 大腸菌由来の野生型のＤＸＳ遺伝子（Ｅｃｏｌｉ ＤＸＳ）のヌクレオチド配列、ＤＸＳタンパク質の切断された形態をコード化した遺伝子の配列（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｅｃｏｌｉ ＤＸＳ）およびＫ２１３⇒ＮおよびＲ３０６⇒Ｃ変異を持つＤＸＳタンパク質をコード化した遺伝子の配列（それぞれ、Ｅｃｏｌｉ ＤＸＳ−Ｋ２１３ＮおよびＥｃｏｌｉ ＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃ）を示す図である。 図９−１の続きである。 図９−１の続きである。 図９−１の続きである。 大腸菌由来のＤＸＳタンパク質（Ｌｏｉｓら、１９９８年）とマスカットオットネル（ＭＯ）（ＭＯＤＸＳ１、配列番号８、およびＭＯＤＸＳ２、配列番号９）およびゲヴェルツトラミナー（ＧＷ）（ＧＷＤＸＳ２、配列番号１０）と異なるＤＸＳ対立遺伝子に対応するタンパク質の比較を示す図である。ＭＯＤＸＳ２およびＧＷＤＸＳ２でＳＮＰに対応するアミノ酸および大腸菌由来のＤＸＳにおける対応するアミノ酸を太字で示す。 大腸菌系統ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中で発現した組み換えＤＸＳのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。 レーン１：分子量マーカー。 レーン２：プラスミドｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳで形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ。 レーン３：プラスミドｐＨＧＷＡ−ＴｒｕｎｃａｔｅｄＥｃｏｌｉＤＸＳで形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ。 レーン４：プラスミドｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２１３Ｎで形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ。 レーン５：プラスミドｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃで形質転換されたＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ。 ＤＸＳ発現は、２４時間、２８℃で１ｍＭのＩＰＴＧで誘導された。 矢印は、ＤＸＳタンパク質の位置を示し、そのマーカーの分子量が示されている。 下記の異なるＤＸＳ構成物を用いて形質転換された大腸菌の培地中のモノテルペン含有量を表すボックスプロットを示す：野生型ＥｃｏｌｉＤＸＳ、ＴｒｕｎｃａｔｅｄＥｃｏｌｉＤＸＳ、ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２１３Ｎ、ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃ。モノテルペン含有量は、大腸菌培地中に蓄積された２つの主なモノテルペン（ゲラニオールおよび酢酸ゲラニル）の合計を表す。そのデータは、４つの独立した実験結果に対応する。各構成物で、太線は、その中央値を表し、ボックスの上端、下端は四分位の第１および第４の位置でありおよびボックスの外部の棒はその極値を示す。 ＥｃｏｌｉＤＸＳ、ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２１３Ｎ、ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃおよび切断されたＥｃｏｌｉＤＸＳのアミノ酸配列を示す図である。 細菌性ＤＸＳ配列のコンセンサスを示す（保存アミノ酸が示され、ドットは、非保存アミノ酸を表す）。大腸菌由来のＤＸＳタンパク質中のＫ２１３およびＫ２３４に対応するアミノ酸は、影付きである。 デイノコックス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）を含む細菌性ＤＸＳ配列のコンセンサスを示す図である（保存アミノ酸が示され、ドットは、非保存アミノ酸を表す）。 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、シトロバクター種（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エンテロバクター種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、クロノバクター・サカザキ（Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ）、クレブシエラ肺炎菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、仮性結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）、エルウィニア種（Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．）、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｎａｎａｔｉｓ）、ディケヤー・ダダンティイ（Ｄｉｃｋｅｙａ ｄａｄａｎｔｉｉ）、ペクトバクテリウム・アトロセプチカム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）、ゼノラブダス・ネマトフィラ（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ）、ラーネラ種（Ｒａｈｎｅｌｌａ ｓｐ．）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）およびデイノコックス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）由来のＤＸＳタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。 図１６−１の続きである。 図１６−１の続きである。 図１６−１の続きである。 図１６−１の続きである。 図１６−１の続きである。 植物のＤＸＳ配列のコンセンサスを示す図である（保存アミノ酸が示され、ドットは、非保存アミノ酸を表す。）。ヴィニフェラ種（Ｖ． ｖｉｎｉｆｅｒａ）由来のＤＸＳタンパク質中のＫ２８４およびＲ３０６に対応するアミノ酸は、影付きである。 ヴィティスヴィニフェラ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ピヌス・デンシフローラ（Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ）、クラミドモナス・レインハードティ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびドナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）由来のＤＸＳタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。 図１８−１の続きである。 図１８−１の続きである。
第１の本発明の目的は、以下の工程を含む、テルペンの産生量を増加するために植物または細菌の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）活性を向上する方法に関する：
ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３を含む群から選択される参照配列と植物または細菌の配列との配列比較を行うことにより、植物または細菌のＤＸＳ活性を有するポリペプチドにおいて、少なくとも１つ、好ましくは２つの変位部分を決定する工程；
ｂ）少なくとも１つの変位部分、好ましくは２つの変位部分において変位を進行させる工程；
ｃ）典型的なＤＸＳと比較して向上したＤＸＳ活性を有するポリペプチドを得る工程。
変位部分を決定する工程（ａ）は、配列比較を連続して行うことによりなされうる。変位する植物または細菌の配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３を含む群から選択される参照配列とともに最適にアライメントする。
好ましくは、参照配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号１９および配列番号２０を含む群から選択される。
より好ましくは、配列番号４または配列番号６は、植物のポリペプチドの変位部分を決定するために参照配列として使用され、および配列番号１９または配列番号２０は、細菌のポリペプチドの変位部分を決定するために参照配列として使用される。
一例として、ヴィティスヴィニフェラ由来のＤＸＳ中のＫ２８４およびＲ３０６に対応するアミノ酸は、ＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４年）またはＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ、２００４年）のような多配列アライメントコンピュータープログラムを使用して別の生物由来のＤＸＳタンパク質中に確認され得る。
本明細書で使用する場合、用語「ＤＸＳ活性の向上」と「向上したＤＸＳ」は、本発明において、典型的なＤＸＳ遺伝子を発現する宿主細胞と比較して、この組み替えられたＤＸＳにより形質転換された宿主細胞、例えば、植物、細菌または酵母中でのテルペンの産生量および／または蓄積を増加させることを可能とする組み替えられたＤＸＳを意味する。
本明細書で使用する場合、「典型的なＤＸＳ遺伝子」の表現は、高頻度で現れる遺伝子であり、例えば、配列番号８としても知られるＤＸＳ ＭｏＤＸＳ１の野生型である。
本明細書で使用する場合、用語「変異」は、オリジナルの核酸配列の配列での任意の組み替えに対応する。これらの変異は、少数の変異、または多数の変異を含む。少量の変異は、ＤＮＡ中の１以上の余剰ヌクレオチドの点変異、挿入または欠失を含み、ＤＮＡ中の１または少数のヌクレオチドで遺伝子に影響を与える変異である。点変異は、無症状変異、ミスセンス変異およびナンセンス変異であり得る。影響を与える遺伝子重複、欠失、または変異のようなゲノム構造での大量の変異は、ＤＮＡのかねての分離部分を並べて、分離した遺伝子を一緒にして機能的に異なった融合遺伝子を形成する可能性をもたらす。これらの最後の変異は、染色体転座、中間部欠損、染色体逆位およびヘテロ接合性の消失を含む。
好ましくは、本発明の変異は点変異である。点変異は、１つのアミノ酸または数パーセント（典型的には、５％未満、より典型的には、４％未満、２％未満または１％未満）のアミノ酸を置換し、付加しまたは欠失させる個々の置換、欠失または付加である。
本明細書で使用する場合、用語「組み替え部分」は、これまでに記載された変異を受ける１ヌクレオチドまたは複数ヌクレオチドによって表されるポリヌクレオチドの遺伝子座を意味する。
その変異をするための方法は、当業者にとっては周知である。例えば、部位特異的変異誘発は、クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）キット（カルフォルニア州ラホヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）製）を使用してなされうる。部位特異的変異誘発の方法は、ＺｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈにより、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ： ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ”（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１０巻、ｐ６４８７−６５００、１９８２年）に記載されている。
本明細書で使用する場合、「テルペンの産生量を増加する」の表現は、この組み替えられたＤＸＳにより形質転換された宿主細胞、例えば、植物、細菌または酵母中で製造されおよび／または蓄積されるテルペンの量が、典型的なＤＸＳ遺伝子を発現する宿主細胞中で製造されおよび／または蓄積されるテルペンの量より高いことを意味する。
好ましくは、本発明におけるテルペンの産生量は、１０倍増加される。
一例として、大腸菌のＤＸＳ酵素をコード化するポリヌクレオチドに導入されるＫ２３４⇒Ｃの変異は、少なくとも１０倍テルペンの産生量を増加する。
本発明の第２の目的は、本発明の方法により得られるであろう、植物または細菌の典型的なＤＸＳと比較して向上したＤＸＳ活性を有する植物または細菌のポリペプチドに関する。
本発明の第３の目的は、配列番号２１の配列またはそれらの断片と少なくとも９０％同一性を有する配列を含むＤＸＳ活性を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで、配列番号２１の位置２１３のアミノ酸はアスパラギンであり、かつ／または配列番号２１の位置２３４のアミノ酸はシステインである。
配列番号２１は、文献でしばしば特徴付けられているデイノコックス・ラジオデュランスを含む細菌性ＤＸＳ配列のコンセンサスである。
好ましい実施形態では、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号２２の配列またはそれらの断片を有し、ここで、配列番号２２の位置２１３のアミノ酸はアスパラギンであり、および／または配列番号２２の位置２３４のアミノ酸はシステインである。
配列番号２２は、デイノコックス・ラジオデュランスのＤＸＳ配列を包含しないことを除いて、配列番号２１と類似していることを特徴とする細菌性ＤＸＳ配列のコンセンサスである。
より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号１９の配列を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは配列番号２０の配列を含む。
本発明の第４の目的は、配列番号１の配列またはそれらの断片と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むデオキシ−Ｄ−キシルロースシンターゼ（ＤＸＳ）活性を有する単離されたポリペプチドに関し、ここで、配列番号１の位置３１０のアミノ酸はシステインであり、および／または配列番号１の位置２８８のアミノ酸はアスパラギンである。
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、すべての天然に生じるＬ−α−アミノ酸またはそれらの残査を意味する。本発明のアミノ酸は、一文字または三文字記号（Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸；Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン；Ｔｈｒ Ｔ トレオニン；Ｌｅｕ Ｌ ロイシン；Ｓｅｒ Ｓ セリン；Ｔｙｒ Ｙ チロシン；Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸；Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン；Ｐｒｏ Ｐ プロリン；Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン；Ｇｌｙ Ｇ グリシン；Ｌｙｓ Ｋ リジン；Ａｌａ Ａ アラニン；Ａｒｇ Ｒ アルギニン；Ｃｙｓ Ｃ システイン；Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン；Ｖａｌ Ｖ バリン；Ｇｌｎ Ｑ グルタミン；Ｍｅｔ Ｍ メチオニン；Ａｓｎ Ｎ アスパラギン）の何れかで特定される。
天然アミノ酸は、化学的に組み替えられたアミノ酸によって置換されてもよいことも理解されるだろう。典型的には、そのような化学的に組み替えられたアミノ酸は、本発明のポリペプチドの半減期を増加しうる。
本明細書で使用される場合、用語「１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ」（「ＤＸＳ」と略す）は、ピルビン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）が関与し、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を形成するトランスケトラーゼ型縮合を触媒することができる酵素を意味する。その酵素の活性は、Ｌｏｉｓら（１９９８年）によって記載されているように放射標識された基質を使用して簡単に決定され得る。本発明の酵素反応混合物は、最終体積５０μＬ中に５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのチアミン二リン酸、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭの［２−１４Ｃ］ピルビン酸（１５．９ｍＣｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ）、５０ｍＭのピルビン酸、５０ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を含む。３７℃で２時間のインキュベーションの後、その反応は、３分間８０℃で熱することでとめられる。１３，０００ｇ、５分間の遠心分離の後、その上清（２〜５ｍｌ）の１０μＬはＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ製のシリカゲル６０）上に載せる。ラベルされたＤ−１−デオキシキシルロース−５−リン酸は、溶媒としてｎ−プロピルアルコール／酢酸エチル／Ｈ２Ｏ（６：１：３）を使用して［２−１４Ｃ］ピルビン酸から分離されオートラジオグラフィーまたはシンチレーション測定によって定量される。あるいは、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼの蛍光分析は、Ｑｕｅｒｏｌら（２００１年）によって記載されるとおりに使用され得る。
好ましくは、本発明の単離されたポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド配列またはそれらの断片と少なくとも９０％アミノ酸配列の同一性を有する配列を含み、ここで、配列番号２の位置３０６のアミノ酸は、システインであり、および／または配列番号２の位置２８４のアミノ酸は、アスパラギンである。
さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、酵素活性を有し、この活性はポリペプチドの配列番号３と比べて少なくとも５０％優位であり、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも１００％優位である。
より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号４の配列を含む。
より好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号６の配列を含む。
本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配列間の「同一性の割合」は、配列の最良のアライメントで得られ、比較される２つの配列の間での同一のアミノ酸の割合を意味し、この割合は、完全に統計的であり、これらの２つの配列の間での違いは、本発明のアミノ酸配列に無作為に広がる。本明細書で使用する場合、「最良のアライメント」または「最適なアライメント」は、決定される同一性の割合（以下を参照）が最も高いアライメントであることを意味する。２つのアミノ酸配列の配列の比較は、最良のアライメントについて前もって整列されているこれらの配列を比較することにより通常現実化される；この比較は、類似の局部を確認し、および比較するために比較セグメントで現実化される。比較を達成する最良の配列のアライメントは、手作業の他に、ＳＭＩＴＨとＷＡＴＥＲＭＡＮにより開発された全体的な相同性アルゴリズム（Ａｄ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．、第２巻、ｐ４８２、１９８１年）を使用することによって、ＮＥＤＤＬＥＭＡＮとＷＵＮＳＣＨによって開発された局所的な相同性アルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．４８，ｐ：４４３，１９７０）を使用することによって、ＰＥＡＲＳＯＮとＬＩＰＭＡＮによって開発された類似の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、ｐ２４４４、１９８８年）を使用することによって、アルゴリズムを使用するコンピューターソフトウェア（ウィスコンシンジェネティックスソフトウェアパッケージ（米国ウィスコンシン州マディソンサイエンスドライブ５７５のジェネティクス・コンピューター・グループ）中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）を使用することによって、ＭＵＳＣＬＥマルチプルアラインメントアルゴリズム（Ｅｄｇａｒ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｃ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３２巻、ｐ１７９２、２００４年）を使用することによって実現されうる。最良の部分的なアライメントを得るため、当業者は好ましくはＢＬＯＳＵＭ ６２ マトリクス、またはＰＡＭ ３０ マトリクスと一緒にＢＬＡＳＴ ソフトウェアを使用し得る。２つのアミノ酸配列の同一性の割合は、最適に配列されたこれらの２つの配列、を比較することにより決定され、そのアミノ酸配列は、これらの２つの配列の最適のアライメントを得るために本発明の参照配列に対して、付加または欠失を含みうる。同一性の割合は、これらの２つの配列の間の同一性のパーセントを得るために、２つの配列の間の同じ位置の数を決定することにより、比較する位置の総数でこの数量を割り算することにより、および得られた結果を１００倍することにより計算される。
好ましい実施形態によれば、本発明のポリペプチドは、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
本明細書で使用する場合、配列番号１または配列番号２の断片は、少なくとも３００のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４００アミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも５００のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを意味する。
ＤＸＳ活性を有する配列番号１または配列番号２の断片の一例として、当業者は、切断されたＭＯＤＸＳ２のポリペプチドに対応する配列番号５、または切断されたＧＷＤＸＳ２のポリペプチドに対応する配列番号７を引用することができる。
一例として、植物のＤＸＳ配列のコンセンサスは、配列番号２３である。それは、ヴィティス・ヴィニフェラのＤＸＳ配列（ＭＯ＿ＤＸＳ１）、およびシロイヌナズナ、ピヌス・デンシフローラ、クラミドモナス・レインハードティおよびドナリエラ・サリナのＤＸＳ配列を含む。
本発明の第５の目的は、本発明に係るポリペプチドをコード化する単離されたポリヌクレオチドに関する。
本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態、またはＤＮＡの形態であってよく、好ましくはＤＮＡの形態であってよい。
本発明のＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であってよい。
好ましい実施形態によれば、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９（ＭＯＤＸＳ２）、配列番号１０（ＧＷＤＸＳ２）、配列番号１５（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＸＳ−Ｋ２１３Ｎ）および配列番号１６（Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃ）を含む群から選択される配列を含む。
本発明の第６の目的は、本発明に係るポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
そのベクターは、クローニングまたは発現ベクターであり得、好ましくは発現ベクターであり得、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態であってよい。
そのようなベクターは、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、ワクチニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病のようなウイルス性ＤＮＡを含んでいてよい。多くの好適なベクターは、当業者にとって公知であり、市販されている。以下のベクターが例として提供される。細菌性：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン製）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、フェージスクリプト（ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ）、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン製）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア製）。真核性：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（ストラタジーン製）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア製）。しかしながら、任意の他のベクターが、本発明の宿主に複製可能かつ実行可能な限り使用されてもよい。
その発現ベクター中の本発明のポリヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡの合成に向けられるために、適切な発現制御配列（プロモーター）に操作可能に結合される。そのようなプロモーターの代表例として、当業者は、ＣＭＶの即時型のような原核性または真核性プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期のＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉを意図し得る。本発明の発現ベクターは、翻訳開始用のリボソーム結合部位および転写ベクターも含む。本発明のベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでよい。
加えて、本発明の発現ベクターは、真核細胞培養のジヒドロ葉酸還元酵素耐性またはネオマイシン耐性のような、または大腸菌中のテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性のような形質転換宿主細胞の選択用の表現型形質を提供する、好ましくは１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
本明細書で上記されているような適切なポリヌクレオチド配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む本発明のベクターは、宿主にそのポリペプチドを発現することを可能とする形質転換するために用いられてもよい。
一例として、これまでに記載されたポリペプチドをコード化するＤＮＡを高等真核生物によって転写することは、そのベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加されうる。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用エレメントであって、通常、ＤＮＡの転写を増加するためにプロモーターに作用する約１０〜３００ｐｂである。エンハンサーの例は、ＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶ初期プロモーターエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。
本発明の第７の目的は、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む形質転換された宿主細胞に関する。
用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換の」および「形質転換」は、細胞へのＤＮＡの導入を意味する。当該細胞は、「宿主細胞」と呼ばれ、および原核細胞または真核細胞であってもよい。典型的な原核宿主細胞は、大腸菌の種々の系統を含む。典型的な真核性宿主細胞は、トウモロコシ細胞のような植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または動物細胞である。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると認められる。
本発明に係る形質転換された宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。宿主細胞への、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターの導入は、リン酸カルシウムの形質移入、ＤＥＡＥ−デキストランを介在した形質移入、または電気穿孔のような、当業者に周知の方法によってもたらされうる。
好ましい実施形態によれば、本発明に係る形質転換された宿主細胞は、真正細菌細胞、古細菌細胞およびシアノバクテリア細胞を含む群から選択される原核細胞である。
より好ましくは、本発明に係る形質転換された宿主細胞は、原核細胞であり、さらにより好ましくは、大腸菌細胞である。
原核生物は、本発明の初期のクローニング工程の宿主細胞として使用されてもよい。それらは、大量のＤＮＡの迅速な製造に、部位特異的変異誘発に使用される一本鎖のＤＮＡ鋳型の製造に、多くの突然変異体を同時にスクリーニングするために、および生成された突然変異体のＤＮＡ配列を決定をするために特に有用である。好適な原核宿主細胞は、大腸菌Ｋ１２系統９４（ＡＴＣＣ 第３１，４４６）、大腸菌系統Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ 第２７，３２５）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ 第３１，５３７）、および大腸菌Ｂを含む；しかしながらＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９のような大腸菌の他の系統の多く、およびバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような桿菌、他のサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）のような腸内細菌、および種々のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種を含む多くのの他の種および属の原核生物は、すべて、宿主として使用されてもよい。
別の好ましい実施形態によれば、本発明に係る形質転換された宿主細胞は、動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、および植物細胞を含む群から選択される真核細胞である。
好ましくは、本発明の真核細胞は、真菌性微生物であり、より具体的には酵母である。
好適な微生物の包括的でないリストは、以下のものを含む：酵母菌属に属する種（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・バヤナス（Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、サッカロマイセス・エキシグウス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｏｕｓ）、サッカロマイセス・セルバッジ（Ｓ．ｓｅｒｖａｚｚｉ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、およびサッカロマイセス・カステリ（Ｓ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ））、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する種（例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス バールマルキシアヌス（Ｋ ｍａｒｘｉａｎｕｓ ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｏｒｅｎｓ）、クルイベロマイセス・ワルチ（Ｋ．ｗａｌｔｉｉ）、クルイベロマイセス・デルフェンシス（Ｋ．ｄｅｌｐｈｅｎｓｉｓ）、クルイベロマイセス・ノンファメンタス（Ｋ．ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、およびクルイベロマイセス・ヴィッケルハミイ（Ｋ．Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ））、カンジダ属に属する種（例えば、カンジダ・ウチリス（Ｃ． ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・カステリ（Ｃ．ｃａｓｔｅｌｌｉｉ）、およびカンジダ・ヒュミリス（Ｃ．ｈｕｍｉｌｉｓ））、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する種（例えば、チゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚ．ｒｏｕｘｉｉ）、チゴサッカロマイセス・バイリー（Ｚ．ｂａｉｌｉｉ）、チゴサッカロマイセス・フェルメンタチ（Ｚ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、チゴサッカロマイセス・ビスポラス（Ｚ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ）、およびチゴサッカロマイセス・フロレンティナス（Ｚ．ｆｌｏｒｅｎｔｉｎｕｓ））、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する種（例えば、ピキア・スティピディス（Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・ソルビトフィア（Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｈｏｐｈｉｌａ）およびピキア・アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ））、または他の種（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、デバロマイセス・ハンセニィ（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ）、シゾサッカロマイセス ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、トルラスポラ・デルブルッキィ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｕｅｃｋｉｉ）、アッシュビヤ・ゴッシピィ（Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｉｐｉｅ）、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、ペニシリウム クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、リゾプス・オリーゼ （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、およびムコール・サーシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｅｎｅｌｌｏｉｄｅｓ））。
より好ましくは、本発明の真核細胞は、酵母であり、さらにより好ましくは、本発明の微生物は、出芽酵母である。例えば、それは、ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ． Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ、受入番号：ＤＳＭＺ １７９００（２００６年１月２７日）で寄託されている出芽酵母株である。
本発明の目的で、異種の経路は、明確な出発物質から明確な中間段階で化合物を形成する活性を有し、微生物の野生型で存在しない経路である。より好ましくは、この異種の経路は、異種のＤＮＡに由来する経路である。
あるいは、本発明の真核細胞は、植物細胞であり、より好ましくは、ヴィティスヴィニフェラ、タバコ、およびシロイヌナズナの細胞を含む群から選択される植物細胞であり、さらにより好ましくは、その植物細胞は、ヴィティスヴィニフェラ細胞であり、好ましくはヴィティスヴィニフェラ Ｃｖ マスカットオットネルまたはヴィティスヴィニフェラ Ｃｖ ゲヴェルツトラミナー細胞であり、より好ましくはヴィティスヴィニフェラ Ｃｖ ゲヴェルツトラミナー細胞である。
本発明の第８の目的は、これまでに記載されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む遺伝子組み換え細菌に関する。
本発明の第９の目的は、これまでに記載されたポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞を含む遺伝子組み換え植物に関する。
培養された植物の宿主細胞の形質転換は、普通、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）を経てなされる。このようにして、遺伝子組み換え植物は、例えば、本発明のベクター（すなわち１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼをコード化する）および選択可能なマーカー遺伝子（例えば、カナマイシンに対する耐性をコード化しているＫａｎ遺伝子）をＨＯＥＣＫＥＭＡら（Ｎａｔｕｒｅ、第３０３巻、ｐ１７９−１８１、１９８３年）に記載されているようにヘルパーＴｉプラスミドを含むアグロバクテイウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ）に転移することにより、およびＡＮら（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第８１巻、ｐ３０１−３０５、１９８６年）に記載されているように、このアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞を植物の葉の切片、または他の組織もしくは細胞と培養し、形質転換することにより得られうる。しかしながら、細胞にＤＮＡを導入する方法、例えば、ポリブレン（ＫａｗａｉとＮｉｓｈｉｚａｗａ、 Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、第４巻、ｐ１１７２、１９８４年）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔａｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻、ｐ２１６３、１９８０年）、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎら，ＥＭＢＯＪ．、第１巻、ｐ８４１、１９８２年）、および直接、核への微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ、第２２巻、ｐ４７９、１９８０年）のような他の方法が使用されうる。
形質転換の植物カルス（ｃａｌｌｉ）は、例えば、カナマイシン、およびカルス組織および芽誘導のための適切な量のナフタリン酢酸およびベンジルアデニンのような植物ホルモンを含む培地で細胞を成長させることにより、選択可能なマーカーを通して選択されてもよい。成長した植物細胞は、その後、再生され、および得られる植物は当業者にとっては周知である技術を使用して土壌に移植されてもよい。
好ましい実施形態によれば、本発明の遺伝子組み換え植物は、これまでに記載されたようにポリヌクレオチドまたはベクターをそのゲノムに組み込む。
好ましくは、上記植物は、木、野菜、多肉植物および観賞植物を含む群から選択される。
さらに好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、ジメタゾン（ＦＭＣ ５７０２０；２−（２−クロロフェニル）メチル−４，４−ジメチル−３−イソオキサリジノン）とも呼ばれるクロマゾンに耐性を有する。
本明細書で使用する場合、クロマゾンに耐性を有する遺伝子組み換え植物は、１０μＭのクロマゾン存在下で成長する植物に対応する（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ−Ｐａｕｌｅｔ Ｌ，Ｃａｉｒｏ Ａ，Ｂｏｔｅｌｌａ−Ｐａｖｉａ Ｐ，Ｂｅｓｕｍｂｅｓ Ｏ，Ｃａｍｐｏｓ Ｎ，Ｂｏｒｏｎａｔ Ａ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ Ｍ．の「Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｌｕｘ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｄｅｏｘｙｘｙｌｕｌｏｓｅ ５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ．」Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、第６２巻、ｐ６８３−９５、２００６年）。
さらに好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、向上した芳香を有する。
一例として、本発明の遺伝子組み換え植物は、シソ科（例えば、オシマム（Ｏｃｉｍｕｍ）（バジル））、ラベンダー、オレガノ属（オレガノ）、ハッカ属（ミント）、 サルビア（セージ）、ロスメシナス（Ｒｏｓｍｅｃｉｎｕｓ）（ローズマリー）、ジャコウソウ（タイム）、キダチハッカ属およびヤグルマハッカ属）；セリ科（例えば、カルム属（キャラウェイ）、イノンド（ディル）、フェニクラム（Ｆｅｎｉｃｕｌｕｍ）（ウイキョウ）およびダウクス属（ニンジン））；キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）（キク科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ））（例えば、ヨモギ属（タラゴン（Ｔａｒｒａｇｏｎ）、ヤマヨモギ）、およびヨモギキク属（タンジー（Ｔａｎｓｙ）））；ミカン科（例えば、柑橘類植物）；バラ科（例えば、バラ）；フトモモ科（例えば、ユーカリ、コバノブラシノキ属）；イネ科（例えば、オガルカヤ属（シトロネラ））；フウロソウ科（ゼラニウム（Ｇｅｒａｎｉｕｍ））および、モミ属（例えば、カナダバルサム）、ヒマラヤスギ属（ヒマラヤスギ）およびクロベ属およびビャクシン属を含む特定の針葉樹を含む群から選択される。
本発明の第１０の目的は、本発明の遺伝子組み換え植物の任意の世代の子孫であって、これまでに記載されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含む子孫に関する。
その子孫は、植物または種子を形成し得る。
本発明の第１１の目的は、以下の工程を含む、これまでに記載されたとおりの遺伝子組み換え植物の調製方法に関する：
ａ．これまでに記載されたとおりのベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程；
ｂ．これまでに記載されたとおりのポリペプチドを発現する形質転換された植物細胞を選択する工程：および
ｃ．その形質転換された植物細胞から遺伝子組み換え植物を生成させる工程。
形質転換の工程（ａ）は、電気穿孔、形質移入、裸のＤＮＡの取得、原形質体生成、花粉、胚または多能性植物細胞へＤＮＡの直接移転、アグロ細菌媒介形質転換、粒子銃、または微粒子銃のようなこれまでに記載されたとおりの周知の方法によりなされ得る。
選択の工程（ｂ）は、周知の方法でなされ得る。
クロマゾン耐性の遺伝子組み換え植物を、その形質転換した植物細胞から生成する工程（ｃ）は、その形質転換した植物細胞から多能正植物細胞の生成のような周知の方法によりなされ得る。
好ましい実施形態によれば、その方法は、植物の種子を準備するためのものであり、この方法は、以下の工程をさらに含む：
ｄ．その遺伝子組み換え植物から種子を得る工程。
特定の実施形態によれば、本発明の方法は、クロマゾンへの耐性のある遺伝子組み換え植物を得るためである。
好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、Ｋｌｅｅ Ｈ， Ｈｏｒｓｃｈ Ｒ， Ｒｏｇｅｒｓ Ｓ のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｔｓ Ｆｕｒｔｈｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第３８巻、ｐ４６７−４８６、１９８７年およびＰｏｔｒｙｋｕｓ ＩのＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ： Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｕｌｔｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４２巻、ｐ２０５−２２５、１９９１年に記載されているような周知の方法により得られる。
別の特定の実施形態で、本発明の方法は、テルペンの生合成の能力を向上した遺伝子組み換え植物を得るためのものである。向上したテルペンの生合成の能力を有する植物は、遺伝子組み換え植物の野生型と比べて、少なくとも５０％多くの、好ましくは少なくとも７０％多くの、より好ましくは少なくとも１００％多くのテルペンを合成する。
好ましくは、テルペンは、ゲラニオール、リナノール、シトロネロール、ネロールおよびα−テルピネオールに関する。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、酵素活性を有し、配列番号３のポリペプチドと比べて少なくとも５０％優れた、好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは配列番号３と比べて少なくとも１００％優れている。
そのテルペンの生合成の能力を有している植物は、芳香性植物であってよく、その芳香性植物は、例えばメンタ・ピペリタ（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）、ラヴェンデュラ・ラティフォリア（Ｌａｖａｎｄｕｌａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）、またはロスマリヌス・オフィキナリス（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、および薬用植物、例えば、アルテミシア・アヌア（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、タキサス・バッカータ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、（カタランツス・ロセウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、またはリトスペルマム・エリスロリゾン（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）、および価値のあるテルペン化合物を製造する任意の植物種、例えば、リコペルシコン エクスレンタム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、マニホト・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）またはオリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）のような、カルテノイドを合成する植物である。
好ましくは、その遺伝子組み換え植物は、Ｋｌｅｅら（１９８７年）およびＰｏｔｒｙｋｕｓ（１９９１年）に記載されているような周知の方法により選択される。
本発明の第１２の目的は、以下の工程を含む、植物、細菌または酵母中でのテルペンの産生量を増加する向上したＤＸＳ酵素の製造方法に関する：
ａ．これまでに画定されたとおりの形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｂ．植物または細菌中でテルペンの産生量を増加することを可能とする向上したＤＸＳ酵素を得る工程。
好ましくは、向上したＤＸＳ活性を有するポリペプチドは、これまでに記載された方法により得られるだろう。
本発明の第１３の目的は、以下の工程を含む、宿主細胞中でのテルペンの製造方法に関する：
ａ．ＤＸＳ２酵素により、より多いテルペン基質（モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、および／またはポリテルペン）を製造するのに効果的な条件の下、これまでに画定されたようなテルペンを製造するのに効果的な条件の下（例えば、植物、細菌または酵母細胞）、形質転換された宿主細胞を培養する工程であって、より多いテルペン基質の製造が、そのテルペン基質の酵素による組み換えによる、より多くのテルペンの製造をもたらす工程、
ｂ．その宿主細胞からテルペンを得る工程。
テルペンは、飽和または不飽和のイソプレンユニット（Ｃ５）、イソプレンユニット（Ｃ５）に基づく任意に置換された炭化水素、または実質的にイソプレンユニット（Ｃ５）からなるものである。テルペンは、非環状または環状であってもよい。本明細書で使用する場合、テルペンは、テルペン、テルペン誘導体、およびテルペノイドと言われている化合物を含み、前述の化合物の２つの属の１つに含まれてもよくまたは含まれなくてもよい。テルペン誘導体は、例えば、ヒドロキシル化、異性化、酸化還元またはアシル化のような官能基化の１以上の工程を経ている化合物を含む。好ましくは、 本発明の目的で、テルペンは、上記の条件を満たし、かつ／または炭素骨格が、少なくとも一部、しかし、好ましくは全部、ＭＥＰおよび／またはＭＥＶ経路に由来する化合物である。従って、テルペンは、テルペンアルコール、例えば、パチュロール、エピセドロール、クベボール、リナロール、ネロリドール、および例えばスクラレオールなどのジアルコール、のようなＣ１５Ｈ２６ＯおよびＣ１０Ｈ１８Ｏ化合物を含む。 テルペンは、広大なテルペンの属の複数の種の例を挙げるだけでも、ボルニル二リン酸（モノテルペン）およびコパリル二リン酸（ジテルペン）のような二リン酸化合物も含む。
本明細書で使用する場合、「誘導体」は、公知のまたは推定上の化合物から得られ、かつ、その親物質の本質的要素を含む任意の化合物である。
例えば、テルペンは、Ｃ１０、Ｃ１５、Ｃ２０、Ｃ３０、Ｃ４０、Ｃ４５などの炭素骨格を有する化合物である。
従って、用語「テルペン」は、モノ、セスキ、ジ、トリ、テトラおよび／またはポリテルペンを包含する。
好ましくは、本発明のテルペンは、ゲラニオール、リナノール、シトロネロール、ネロールおよびα−テルピネオールを含む。
好ましい実施形態によれば、本発明の微生物は、その微生物の生体重１ｇにつき、少なくとも３０μｇ、より好ましくは少なくとも１００μｇのテルペンの収量を提供する。本発明の微生物のテルペンの収量は、好ましくは実施例２のプロトコルによって確立される。
テルペンは、本発明の細胞に蓄積していてよい。例えば、テルペンは、その細胞質、ミトコンドリア、細胞膜または他の細胞小器官に蓄積されてもよい。多くのテルペンは、親油性の化合物であり、その細胞の細胞膜に蓄積される。
本発明の目的で、用語「培地に蓄積すること」は、２相発酵プロセスの間の溶媒中への蓄積も包含する。
本発明の方法は、テルペンの製造につながる条件の下、本発明の形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む。これらの条件は、当業者に公知である。一般的に、その条件は、適当な媒体、発酵容器、温度、およびｐＨの選択によって調整されてよい。
テルペンを製造するための方法は、２相発酵がなされる場合、その培地から、その細胞からおよび／または有機溶媒からテルペンを単離する工程を含んでいてよい。そのテルペンは、限定されないが、例えば、クロマトグラフィ、抽出および蒸留、を含む当該技術分野で使用される任意の方法により単離されていてよい。
例えば、モノテルペンは、プラスチド中で普通に製造され、およびセスキテルペン類は、サイトゾル中で普通に製造されることは、当該技術分野の当業者に周知である。
植物と対照的に、微生物系は、大規模な遺伝子操作プロジェクトの影響をより受けやすく、多くの異なる組み換えは比較されおよび結び付けられてよい。しかしながら、微生物は、植物と比較していくつかの技術的な欠点があり、それは、異種の遺伝子を発現するときである。
本発明の第１４の目的は、以下の工程を含む、芳香植物の選択方法に関する：
ａ）向上したテルペンの合成および／または植物の生物サンプル中のテルペンの蓄積の分析に従って、ＤＸＳの対立遺伝子変異をもたらすＤＸＳの少なくとも１つの変異を特定する工程、
ｂ）変異を含む植物を選択する工程。
本発明の第１５の目的は、以下の工程を含む、クロマゾンへより耐性のあるＤＸＳ酵素の製造方法に関する：
ａ）これまでに記載されたような形質転換された宿主細胞を培養する工程；
ｂ）その形質転換された宿主細胞の細胞抽出物、細胞懸濁液、タンパク分屑、結晶画分、細胞培養物、細胞ホモジネート、細胞ライゼート、細胞上清、細胞濾液、または細胞ペレットからのクロマゾンへより耐性のあるＤＸＳ酵素を得る工程。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明者によって発見された限り、本発明の実施に良く機能する技術を表しており、従ってその実施に好ましい条件を構成すると考えられうるということが、当業者に理解されるはずである。
１）ヴィティスヴィニフェラ ｃｖ マスカットオットネルおよびゲヴェルツトラミナー由来のＤＸＳ ｃＤＮＡのクローン化
ヴィティスヴィニフェラ ｃｖ マスカットオットネル（ＭＯ）およびゲヴェルツトラミナー（Ｇｗ）由来のＤＸＳ ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅し、クローン化した。これらのクローンの配列は、ＭＯおよびＧｗの両方が、そのＤＸＳ遺伝子座でヘテロ接合であることを明らかとした。ＭＯおよびＧｗは、同一の対立遺伝子で指定されたＭｏＤＸＳ１（図１）を共有する。加えて、ＭｏおよびＧｗは、それぞれＭｏＤＸＳ２およびＧｗＤＸＳ２の対立遺伝子を持つ。ＭｏＤＸＳ２およびＧｗＤＸＳ２の対立遺伝子は、それぞれ、２および１の一塩基多型（ＳＮＰ）の点でＭｏＤＸＳ１と異なり、対応するタンパク質のアミノ酸配列を組み替える（図２）。本発明のＫ２８４⇒ＮおよびＲ３０６⇒Ｃの変異（配列番号２に関連する）は、それぞれＭｏＤＸＳ２およびＧｗＤＸＳ２の特徴を示し、データベースで利用可能な全植物のＤＸＳ配列において保存されるアミノ酸に影響を及ぼす（図３）。さらに、アミノ酸Ｋ２８４およびＲ３０６は、その酵素の活性部位に属し（Ｘｉａｎｇら、２００７年）、ＭｏＤＸＳ１と比較して、Ｋ２８４⇒ＮおよびＲ３０６⇒Ｃの変異はそのＭｏＤＸＳ２およびＧｗＤＸＳ２の対立遺伝子の活性を改質してもよいことを示した。
２）ブドウ果実中のテルペノールの含有量に対するＭｏＤＸＳ２およびＧｗＤＸＳ２対立遺伝子の影響
材料および方法：遊離および結合されたモノテルペノールの固相抽出（ＳＰＥ）による単離
各サンプリングポイントで、テルペノール分析の３つの複製物を作製した。各複製物に、少なくとも２５の果実を使用した。種子を除去しおよび果皮を中果皮から分離した。計量後、果皮を液体窒素下ですりつぶし、次いで４０ｍｇの亜硫酸ナトリウムの添加後、４０ｍＬの水中に懸濁した。１５分間遠心分離（１１４００ｇ、４℃）して得た上清を、ガラスファイバー前置フィルターおよびガラスフィルターに通した。２０μＬの４−ノナノール溶液（１ｇ／Ｌ）を外部標準として加え、主なテルペノールの定量化を可能とした。テルペノールの抽出は、Ｍａｔｅｏら（１９９７年）から適応されていて、メタノールの代わりにエタノールを使用した。その濾液をおよそ１滴／ｓの速度で、前もって５ｍＬのメタノールおよび１５ｍＬの超純水で洗浄した１ｇの相Ｃ１８シリカの結合した非極性ＳＰＥカラム（ＢＯＮＤ ＥＬＵＴ ＪＲ．）を通した。そのサンプルは、その後、２つの同等のサブサンプルに分離し、１つを、遊離およびグリコシド結合したモノテルペノールの分析用に、および遊離のテルペノールの分析用とした。遊離および結合されたモノテルペノールの全画分を、４ｍＬの無水エタノールで溶離した。この全テルペノール抽出物を４０ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、得られた溶液を５０ｍｇのＡＲ２０００糖分解酵素（フランス、スクリンのＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ製）とともに、一晩、３７．５℃でインキュベーションし、グリコシド結合したテルペノールを遊離させた（Ｔａｍｂｏｒｒａら、２００４年）。その遊離されたテルペノールをＣ１８カラム上でＳＰＥにより分離し、３×５ｍＬの水で洗浄した後に４ｍＬのジクロロメタンで溶離した。遊離のテルペノールの分析については、加水分解工程を行わず、テルペノールを水で洗浄した後に直接ジクロロメタンで溶離した。抽出物を、０．５ｇの無水亜硫酸ナトリウムの満たされたパスツールピペット内で乾燥し、緩やかな窒素流動下、５００μＬに濃縮した。２０μＬのｍ−クレゾール（１ｇ／Ｌ）溶液を、内部標準として各サンプルに加えた。サンプルを、−２０℃で保存した後にガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析した。
結果：
実施例２は、ＭＯ（図４）中およびＧＷ（図５）子孫中、ＤＸＳ対立遺伝子の関数としてテルペノールの含有量の結果に示されているように、ＤＸＳ対立遺伝子がブドウ果実中のテルペノールの含有量に大きな影響を与えることを示した。ヘテロ接合のまたはＤＸＳ２ホモ接合の遺伝子型が大量のテルペノールを蓄積するのに対して、ＭｏＤＸＳ１（＝ＧｗＤＸＳ１）ホモ接合の遺伝子型は、テルペノールのレベルが極めて低いこと示した。
３）植物中、ＤＸＳ対立遺伝子の機能的特性解析
ＤＸＳ対立遺伝子活性を特性化するために、本発明者らは、タバコの葉の中の迅速かつ効率的な遺伝子発現を可能とするアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を媒体とするタバコ（ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の一過性の形質転換を用いた（Ｂａｔｏｋｏら、２０００年）。このアプローチは、既にブドウの二次代謝に関連する遺伝子を特性化することに使用され成功した（Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎら、２００８年；Ｈｕｇｕｅｎｅｙら、２００９年）。ＭｏＤＸＳ１、ＭｏＤＸＳ２およびＧｗＤＸＳ２の対立遺伝子は、バジル（スイートバジル）由来の酵素ゲラニオールシンターゼ（ＧＥＳ）をコード化しているｃＤＮＡと一緒に、タバコの葉に発現された（Ｉｉｊｉｍａら、２００４）。ＧＥＳは、この系で、通常、タバコには蓄積されないモノテルペノールであるゲラニオールの生合成に関与しているレポーター遺伝子として使用された。ＤＸＳ活性が植物でのテルペン生合成を制限していると示されているように（Ｅｓｔｅｖｅｚら、２００１年；Ｅｎｆｉｓｓｉら、２００５年）、ＧＥＳ活性により形成されるゲラニオールの量は、ＤＸＰ基質の有効性に直接依存し、それゆえ、タバコの葉のＤＸＳ活性に直接依存した。そして、ＧＥＳおよびＤＸＳ対立遺伝子を共発現するタバコの葉のＧＣ−ＭＳ分析は、植物体でＤＸＳ対立遺伝子活性の精密な比較を可能とした。
材料および方法：
ブドウＤＸＳ ｃＤＮＡを、上流のプライマー５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＴＧＴＡＣＧＣＴＣＴＣＡＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１１）および下流のプライマー５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＡＴＧＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号１２）を使用してＰＣＲにより増幅して、製造業者の説明書に従ってゲートウェイＢＰクロナーゼ（インビトロジェン製）を使用して、ｐＤＯＮＲ２０７ゲートウェイと相性のよいベクター（カルフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン製）にクローン化した。ＤＸＳ ｃＤＮＡを、変異が誘導されないことをかくにんするために配列した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に媒体された一過性発現については、その後、ＤＸＳ ｃＤＮＡをゲートウェイバイナリーベクターｐＭＤＣ３２（ＣｕｒｔｉｓとＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ．、２００３年）に移植した。バジル（スイートバジル）由来のゲラニオールシンターゼｃＤＮＡ（Ｉｉｊｉｍａら，２００４年）を、ゲートウェイ二値ベクターｐＭＤＣ８３（ＣｕｒｔｉｓとＧｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ．、２００３年）にクローン化し、およびＧＦＰ融合タンパク質として発現させた。全構成物を電気穿孔によりアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株Ｃ５８（ｐＭＰ９０）に導入した。ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉は、Ｖｏｉｎｎｅｔら（２００３年）によると、アグロバクター・ツメファシエンス培地（ＯＤ６００ ０．５）に湿潤された。葉の部分を、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の浸潤後９６時間でテルペン含有量を分析した。
そして、タバコの葉からテルペノールの抽出を行った：
各サンプリングポイントで、テルペノール分析の３つの複製物を作製した。計量後、タバコの葉の部分（約１ｇ）を液体窒素下ですり潰し、次いで２ｍＬの超純水に懸濁した。５分間の遠心分離後（４℃で６０００ｇ）、その上清を集め、および２０μＬの４−ノナノール溶液（１ｇ／Ｌ）を外部標準として添加した。その上清を、前もって５ｍＬのメタノールおよび１５ｍＬの超純水で洗浄した、１ｇの相Ｃ１８シリカの結合した非極性ＳＰＥカラム（バリアン製のＢｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｊｒ．）を通した。全テルペノールを、２ｍＬの無水エタノールで溶離した。この全テルペノール抽出物を、２０ｍＬのクエン酸／リン酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、および得られた溶液を２５ｍｇのＡＲ２０００糖分解酵素（フランス、スクリンのＧｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ製）とともに、一晩、３７．５℃でインキュベーションした。遊離されたテルペノールをＣ１８カラム上でＳＰＥにより分離し、３×５ｍＬの水で洗浄した後に４ｍＬのジクロロメタンで溶離した。抽出物を、０．５ｇの無水亜硫酸ナトリウムの満たされたパスツールピペット内で乾燥し、および緩やかな窒素流動下、５００μＬに濃縮した。２０μＬのｍ−クレゾール（１ｇ／Ｌ）溶液を、内部標準として各サンプルに加えた。サンプルをガスクロマトグラフィ（ＧＣ）分析をする前に−２０℃で保存した。
最後に、そのテルペンを、Ｇｅｒｓｔｅｌ ＭＰＳ２ ＸＬサンプラーを備え、かつＡｇｉｌｅｎｔ ５９７５Ｂ ｉｎｅｒｔ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎガスクロマトグラフを使用して、ガスクロマトグラフィおよび質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって分析した。そのガスクロマトグラフに、ＤＢ−ＷＡＸ毛細管カラム（６０ｍ×０．３２ｍｍ ｉ．ｄ．×０．５μｍフィルム厚さ、Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を装着し、ヘリウムをキャリアガス（１ｍｌ／分の一定流量）として使用した。そのＧＣのオーブン温度を初期保持時間なしで、２０℃／分の速度で４５℃から８２℃とし（１分保持）、その後２．７℃／分の速度で８２℃から２３５℃（１５分保持）とプログラムした。そのインジェクターを２５０℃に設定し、およびパルススプリットレスモード（０．５０分間２５ｐｓｉ（約０．１７ＭＰａ））で使用した。そのインターフェース、ＭＳイオン源および四重極の温度は、それぞれ、２７０℃、２３０℃および１５０℃だった。その質量分析計は、電子衝突イオン化モード（ＥＩ、７０ｅＶ）で操作され、その質量は、２９〜３００ａｍｕのｍ／ｚ範囲で解析された。Ａｇｉｌｅｎｔ ＭＳＤケムステーションソフトウェア（Ｇ１７０１ＤＡ、Ｒｅｖ Ｄ．０３．００）を測定器制御とデータ処理のために使用した。質量スペクトルは、Ｗｉｌｅｙライブラリーレファレンススペクトルバンクと比較された。
結果：
アグロバクテリウムに媒体されたＧＥＳだけの一過性発現は、かなりの量のゲラニオールの蓄積をもたらし、ゲラニオールの生合成は、タバコ内の内在的なＤＸＳ活性に依存した（図６、図７）。ＧＥＳおよびＭｏＤＸＳ１の共発現は、向上したＤＸＰ基質の利用可能性のため、ゲラニオール生合成での実質的な増加をもたらした。しかしながら，ＧＥＳとＭｏＤＸＳ２またはＧｗＤＸＳ２との共発現は、平均してタバコの葉の中のゲラニオール蓄積を３倍増加をもたらし（図７）、これは、これらの対立遺伝子は、ＭｏＤＸＳ１と比較して向上したＤＸＳ活性を持つことを示していた。
それゆえ，本発明者らは、ＭＯおよびＧＷ内でのテルペノールの大量の蓄積は、ＭｏＤＸＳ２またはＧｗＤＸＳ２の存在のためであると結論する。Ｋ２８４⇒ＮおよびＲ３０６⇒Ｃ変異は、その酵素の活性部位でアミノ酸に影響を及ぼし、ＭｏＤＸＳ１と比較して向上したＤＸＳ活性を与え、ひいては植物体内へのテルペンの蓄積を増加する原因となる。
以下の実験の目的は、これらの変異の役割が他の源からのＤＸＳ酵素に拡張されうるかどうかを示すことである。モデルとして、本発明者らは、酵素特性が十分に特性付けられている（Ｑｕｅｒｏｌら，２００１年；Ｘｉａｎｇら，２００７年）大腸菌由来のＤＸＳを選択した。
大腸菌およびヴィティスヴィニフェラ由来のＤＸＳタンパク質配列の比較は、ブドウＤＸＳ中のアミノ酸Ｋ２８４およびＲ３０６が、それぞれ大腸菌由来のＤＸＳ中のＫ２１３およびＫ２３４に対応することを示す（図１０）。非植物のＤＸＳの活性に対するＭＯ様およびＧＷ様変異の影響を評価するため、本発明の変異Ｋ２１３⇒ＮおよびＫ２３４⇒Ｃを、大腸菌のＤＸＳタンパク質内に導入した。大腸菌のテルペンの生合成の能力におけるこれらの変異の影響を、その後調査した。
４）大腸菌由来のＤＸＳの遺伝子のクローニングおよび部位特異的変異誘発
材料および方法：
大腸菌由来のＤＸＳ遺伝子（Ｌｏｉｓら，１９９８）を、上流のプライマーＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＡＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣ（配列番号２４）および下流のプライマーＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＣＡＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧ（配列番号２５）を使用してＰＣＲにより増幅して、製造業者の説明書に従ってそのｐＤＯＮＲ２０７ゲートウェイと相性のよいベクター（１以上の遺伝子の迅速なクローン化を可能とする技術。そのエントリーベクターは、ゲンタマイシンへの耐性を与える）（カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン製）に、ＢＰクロナーゼ（クローン由来のＰＣＲ生成物またはＤＮＡ画分のインビトロでの再結合を触媒するタンパク質の混合物）をクローン化した。ＤＸＳ遺伝子は、その後、そのゲートウェイと相性のよい発現ベクターｐＨＧＷＡ（Ｂｕｓｓｏら，２００３年）にＬＲクロナーゼ（エントリークローンとデスティネーションベクターとのインビトロでの再結合を触媒し、発現クローンを生成させる酵素の混合物（インビトロジェン製））を使用して導入し、プラスミドｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳを生成した。このプラスミドは、本発明のＫ２１３⇒ＮおよびＫ２３４⇒Ｃ変異を大腸菌由来のＤＸＳタンパク質に誘導するために、部位特異的変異誘発のために使用された。部位特異的変異誘発は、製造業者の指示に従って、クイックチェンジキット（カルフォルニア州ラホヤのストラタジーン製）を使用して達成された。クイックチェンジキットは、変異原性のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼに基づく。アミノ酸の変化、挿入または欠失を伴った酵素突然変異体を製造するために選択された遺伝子に単点変異または多点変異を誘導するためにデザインされている。
順方向プライマーＧＣＧＣＧＡＡＧＧＣＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＴＴＴＣＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＣ（配列番号２６）および逆方向プライマーＧＧＣＡＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＣＣＧＣＣＴＴＣＧＣＧＣ（配列番号２７）を使用して、Ｋ２１３⇒Ｎ変異を導入し、プラスミドｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２１３Ｎを生成した。
順方向プライマーＣＧＣＡＣＣＧＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＧＣＣＴＧＧ（配列番号２８）および逆方向プライマーＣＣＡＧＧＣＡＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＧＧＴＧＣＧ（配列番号２９）を使用して、Ｋ２３４⇒Ｃ変異を導入して、プラスミドｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃを生成した。
結果：
本発明の部位特異的変異誘発の間、フレームシフトを提供する変異体ＤＸＳ遺伝子を単離した。このフレームシフトは、切断されたＤＸＳタンパク質の合成をもたらし、コントロールとして使用された。この切断されたＤＸＳをコード化するプラスミドを、ｐＨＧＷＡ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ−ＥｃｏｌｉＤＸＳと言う。
５）大腸菌中での野生型Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＸＳタンパク質および変異Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＸＳタンパク質の発現
材料および方法：
ｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ、ｐＨＧＷＡ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ、ｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２１３ＮおよびｐＨＧＷＡ−ＥｃｏｌｉＤＸＳ−Ｋ２３４Ｃのプラスミドを、ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌系統（カルフォルニア州ラホヤのストラタジーン製）に形質転換した。ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌系統は、増加した形質転換効率を提供するコンピテント細胞である。そのコンピテント細胞は、テトラサイクリンおよびクロラムフェニコールに耐性がある。形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）、およびテトラサイクリン（２μｇ／ｍＬ）の存在下、グルコース（１０ｇ／Ｌ）を添加した５０ｍＬのＬＢ培地中、２８℃で培養した。その培養物が０．１のＯＤに達した時、ＤＸＳ発現を、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノヂド（ＩＰＴＧ）で誘導しおよびその培養物を２４時間培養した。
６）大腸菌中でのテルペンの生合成に対するＤＸＳ突然変異体の影響
大腸菌由来のＤＸＳ酵素の活性に対するＭＯ−およびＧＷ様変異（それぞれ、Ｋ２１３⇒ＮおよびＫ２３４⇒Ｃ）の影響を、ＤＸＳ発現の導入後、培地中でテルペンを定量化することにより評価した。
材料および方法：大腸菌培地中でのテルペンの分析
培地中のテルペンを、Ｃｏｅｌｈｏら（２００９年）から適用されている方法を使用して、スターバー抽出法（ＳＢＳＥ）を使用して分析した。ＰＤＭＳコーティングを持つ撹拌棒（０．５ｍｍ×１０ｍｍ；ドイツ、ミュルハイムのゲステル製Ｔｗｉｓｔｅｒ）を、各培地サンプル（１０ｍＬ）に導入した。２０℃、１５０分間、８００ｒｐｍの回転速度で抽出した。その後、上記のゲステルＭＰＳ２ ＸＬサンプラーを備え、かつＡｇｉｌｅｎｔ ５９７５Ｂ質量分析計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を組み合わせたＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎガスクロマトグラフを使用して、ガスクロマトグラフィおよび質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって分析した。
結果：
実施例は、大腸菌由来のＤＸＳに導入される変異が、培地中のモノテルペン含有量に影響することを示す（図１２）。特に、本発明の大腸菌由来のＤＸＳにおける変異Ｋ２３４⇒Ｃは、培地中、テルペンのかなり向上した蓄積をもたらした。それゆえ、本発明者らは、ＤＸＳ活性を改善するために、非植物ＤＸＳ酵素は、ブドウのＤＸＳタンパク質中のＫ２８４およびＲ３０６に対応する位置で組み替えうる、と結論する。そのような改善されたＤＸＳ突然変異体は、注目するイソプレノイドの産生量を向上させるために、微生物の代謝工学のため使用されてもよい。

Claims (12)

  1. 配列番号２１の配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を有し、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）活性を有する細菌性の組み換えポリペプチドであって、配列番号２１で表される配列における位置２３５のアミノ酸がシステインで置換されている組み換えポリペプチド。
  2. 前記ポリペプチドの配列が配列番号２０の配列である、請求項１に記載の組み換えポリペプチド。
  3. 請求項１又は２に記載の組み換えポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
  4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  5. 請求項３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターを含む、形質転換された宿主細胞。
  6. 前記形質転換された宿主細胞が、真正細菌細胞、古細菌細胞およびシアノバクテリア細胞を含む群から選択される原核細胞である、請求項５に記載の形質転換された宿主細胞。
  7. 前記宿主細胞が、動物細胞、真菌細胞および植物細胞を含む群から選択される真核細胞である、請求項５に記載の形質転換された宿主細胞。
  8. 請求項３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のベクターが導入され、かつ前記ポリヌクレオチドが発現される、遺伝子組み換え細菌。
  9. 請求項３に記載のポリヌクレオチド、請求項４に記載のベクター、または請求項５、６または７に記載の宿主細胞が導入され、かつ前記ポリヌクレオチドが発現される、遺伝子組み換え植物。
  10. 以下の工程を含む、遺伝子組み換え植物の調製方法：
    ａ）請求項４に記載のベクターを用いて植物細胞を形質転換する工程；
    ｂ）請求項１又は２に記載の組み換えポリペプチドを発現する形質転換された植物細胞を選択する工程；および
    ｃ）前記形質転換された植物細胞から遺伝子組み換え植物を生成する工程。
  11. 請求項５及び６のいずれか１項に記載の形質転換された宿主細胞を用いる、ＤＸＳ活性を有する組み換えポリペプチドを細菌中で産生する方法。
  12. 以下の工程を含む、宿主細胞中でテルペン類を産生する方法：
    ａ）請求項１又は２に記載の組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって植物又は細菌の宿主細胞を形質転換する工程；
    ｂ）テルペン類を製造するのに効果的な条件下で、前記形質転換された宿主細胞を培養する工程であって、前記形質転換された宿主細胞で産生されるテルペン類の量が、請求項１又は２に記載の組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって形質転換されなかった宿主細胞により同じ条件で産生されるテルペン類の量よりも多い、工程；
    ｃ）前記宿主細胞から前記テルペン類を得る工程。
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