CN103429612B - 导致萜烯生物合成增强的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶等位基因 - Google Patents

导致萜烯生物合成增强的1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸合酶等位基因 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种增强植物或细菌的1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸合酶(DXS)活性以增加细胞中萜烯产生的方法。本发明还涉及可通过该方法得到的增强的DXS序列。本发明还涉及在包含增强的DXS酶的宿主细胞中增加萜烯产生的方法。最后，本发明涉及表达该多肤的转基因细菌或植物。

Description

导致萜烯生物合成增强的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶等位 基因
发明背景
发明领域
本发明涉及与典型植物或细菌的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)蛋白质相比具有增强的DXS活性的新多肽。该多肽导致细胞中萜烯大量积累。
本发明还涉及表达该多肽的转基因植物、细菌或酵母，并且所述转基因植物、细菌或酵母与表达典型DXS基因的植物、细菌或酵母相比能够大大增强萜烯积累。
本发明还涉及通过培养表达该多肽的转基因植物、细菌或酵母来生产萜烯的方法。
最后，本发明涉及表达该多肽并且抵抗异恶草酮的转基因植物。
背景技术
类异戊二烯(也称为萜类或萜烯)被认为是天然存在的最大的天然产物家族，迄今已经鉴定到超过29000种的不同化合物。在化学上，其结构和复杂度上具有相当高的多样性。类异戊二烯涉及许多基本生物学功能，因此其对于所有生物体的正常生长和发育过程是必需的。例如，类异戊二烯包括真核生物膜稳定剂(固醇)、动物和植物激素(类固醇、类视黄醇、赤霉素和脱落酸)、光合作用色素(类胡萝卜素和叶绿素的叶绿醇侧链)和电子传递的载体(甲基萘醌、质体醌和泛醌)。
因此，类异戊二烯是一大组多种多样的具有相当大商业利益的复杂天然产物。现今主要从植物提取或化学合成类异戊二烯以用于作为药物(例如，紫杉醇、没药醇和青蒿素)、动物饲料补充剂和食物色素(多种类胡萝卜素，例如番茄红素和β-胡萝卜素)或调料和香料(例如，薄荷醇、藿香醇和圆柚酮)。
根据类异戊二烯含有的碳的数目将其分组，主要的感兴趣的组是单萜(C10)、倍半萜(C15)、二萜(C20)和三萜(C30)。
所有类异戊二烯通过共同的代谢前体异戊烯基二磷酸(isopentenyldiphosphate，IPP，C5)合成。之前假设IPP仅由甲羟戊酸通过所谓的“甲羟戊酸途径”合成。但是最近研究表明，在真细菌(eubacteria)、绿藻和植物中，IPP还通过不同的途径合成，该途径被称为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途径。因此，植物具有甲羟戊酸和MEP两条途径，其分别负责细胞溶胶和质体中IPP的生物合成。
MEP途径的第一个中间物是1-脱氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxyxylulose-5-phosphate，DXP)，其由甘油醛-3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate，G3P)和丙酮酸在硫胺素依赖性酶1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase，DXS)的催化下生物合成。已经表明在细菌和植物中DXS催化类异戊二烯形成的限速步骤。实际上，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和番茄(Lycopersicon esculentum)中，DXS的过表达导致质体来源的类异戊二烯(如类胡萝卜素)水平提高。在芳香植物如宽叶薰衣草(Lavandula latifolia)中也是这种情况，DXS的过表达导致精油产生的显著增加。
萜类包含在很多植物来源产物的香气和香料中，在这之中，单萜醇对于食用葡萄和葡萄酒的香味有极大贡献。描述为玫瑰或铃兰的花香涉及如香樟醇、香叶醇、橙花醇、α-松油醇或香茅醇等分子的存在。这些分子的最大浓度发现于“麝香葡萄(Muscat)”类的变种或琼瑶浆(Gewurztraminer)中，导致这些变种非常典型的芳香。与麝香葡萄类无关的基因型中自发出现了花香.
现有技术的不足
已在商业上对某些二萜进行了探索，特别是制药业。对于来源于紫杉烷类的二萜紫杉醇和多烯紫杉醇尤其如此，其用于治疗乳腺或卵巢癌。紫杉醇是从紫杉(Taxus sp.)中提取的天然分子，多烯紫杉醇是来源于紫杉醇前体的半合成分子，10-脱乙酰巴卡亭III(或10-DAB III)，也提取自紫杉。紫杉醇的大多数紫杉醇生物合成基因已经被描述。这些分子的生产相对昂贵，这是由于10-DAB III以及特别是紫杉醇(paclitaxel)在紫杉提取物中相对低的丰度以及由于分子结构复杂导致的缺乏可工业化按比例放大的合成方法。
因此，特别需要用于低成本地生产感兴趣的萜烯的方法，以及用于生产尚不能容易合成的萜烯衍生物的方法。
通过常规化学过程生产有机分子的化学工业越来越转向利用微生物细胞工厂的生产过程。这种向绿色化学发展的关键动因是这种所谓的“生物技术工艺”更加环境友好，通过微生物生产的许多化合物过于复杂而无法通过有机合成得到，以及微生物细胞工厂代表了特定化合物的无限制供应。当前，通过从植物提取或通过化学合成大规模生产类异戊二烯。这两种方法的主要缺点是低产率和高成本。第三种选择是通过体外酶转化生产期望的类异戊二烯，但是这种方式受到可用前体的限制，因此大多数情况下在经济上是不可行的。
用于类异戊二烯生产的微生物的代谢工程可使得在发酵过程中从便宜的碳源生产大量类异戊二烯，因此解决了当前工业化生产类异戊二烯的许多问题，同时允许对类异戊二烯的天然化合物类群中存在的巨大多样性进行生物技术上的探索。
已经通过基因工程改造的微生物生产了许多类异戊二烯，包括柠檬烯、类胡萝卜素、柏木脑(epi-cedrol)、紫杉烯等。为了增强大肠杆菌(Escherichia coli)中类异戊二烯的生产，已经过表达基因dxs(编码DXP合酶)、dxr(DXP还原异构酶)和idi(IPP异构酶)，多种上述类异戊二烯的生产具有良好结果(MAURY等，2005中的综述)。通过在大肠杆菌的青蒿素生产菌株中表达来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甲羟戊酸途径，已经实现了大肠杆菌生产青蒿素的进一步提高。还已经在酵母中生产了一些类异戊二烯化合物，包括在酿酒酵母中生产epi-雪松醇，在酿酒酵母和产朊假丝酵母(Candida utilis)中生产番茄红素和β-胡萝卜素。在一些情况下，在酵母中生产的异戊二烯表现为通过过表达HMG1(编码HMG-COA还原酶)来增强(MAURY等，2005中的综述)。
尽管具有以上描述的背景，依然需要生产萜烯和萜类的另一些方法，特别是，以比之前已知的方法更高产量、更低成本和更少时间的方式在微生物中积累萜烯的方法。因此，本发明的一个目的是提供满足该需求的生产萜烯和萜类的方法。
本发明的一个特定目的是产生积累和/或向周围培养基中分泌大量萜烯的微生物。通过这样的微生物生产萜烯优选地随时间的推移是稳定的。
另外，本发明的一个目的是改造得到具有增强的类异戊二烯产生的植物，其目的在于纯化异戊二烯组分以作为增加食用作物的营养价值的方式，或者通过增加对食草动物、昆虫或病原体的抵抗来增强植物自身的健康。
本发明试图通过提供转基因植物、细菌或酵母来克服现有技术中的这些和其他固有缺点，所述转基因植物、细菌或酵母表达这两种基因中的一种并且与表达典型dxs基因的植物、细菌或酵母相比能够极大增加萜烯的积累的。
附图说明
附图构成本说明书的一部分，其被包含以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述可更好地理解本发明。
图1示出了对应于葡萄(V.vinifera)变种奥托奈麝香(Muscat Ottonel，MO)(MODXS1，SEQ ID N°8，和MODXS2，SEQ ID N°9)和琼瑶浆(Gewurztraminer，GW)(SWDXS2，SEQID N°10)中的不同DXS等位基因的cDNA核苷酸序列。对应于SNP的位点用粗体字母表示。
图2示出了对应于MO和GW中不同DXS等位基因的蛋白质和对应于SEQ ID N°2的相关的共有序列的比较。
图3示出了通过比较来源于不同植物物种的DXS蛋白得到的共有序列(通过其得到序列SEQ ID N°1):
第1条线:共有序列
第2条线:Mo_DXS1
第3条线:Mo_DXS2
第4条线:GW_DXS2
第5条线:拟南芥(Arabidopsis thaliana)
第6条线:甜椒(Capsicum annuum)
第7条线:长春花(Catharanthus roseus)
第8条线:大豆(Glycine max)
第9条线:水仙(Narcissus pseudonarcissus)
第10条线:烟草(Nicotiana tabacum)
第11条线:水稻(Oryza sativa)
图4示出了葡萄果皮中的萜烯醇含量(5种主要萜烯醇的汇集物:香叶醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇、α-松油醇)和奥托奈麝香后代中的DXS基因型(2003年和2004年)(1:MoDXS1;2:MoDXS2)。
图5示出了葡萄果皮中的萜烯醇含量(5种主要萜烯醇的汇集物:香叶醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇、α-松油醇)和琼瑶浆后代中的DXS基因型(2004年和2005年)(1:GwDXS1＝MoDXS1;和2:GwDXS2)。
图6示出了共表达来自葡萄的DXS等位基因和来自罗勒的香叶醇合酶(geraniolsynthase，GES)的烟草叶中产生的萜烯的GC-MS分析。A:共表达MoDXS1和GES的烟草叶的分析。B:共表达MoDXS2和GES的烟草叶的分析。
图7示出了烟草叶中，在短暂共表达GES和DXS等位基因之后植物中(in planta)香叶醇的生物合成。农杆菌介导的转化4天后，使用GC-MS分析了未转化烟草叶(对照)、仅表达GES的烟草叶以及共表达GES和DXS的烟草叶。对于每一条件，香叶醇的量是9个独立实验的平均值(±标准误差)。
图8示出了MODXS1(SEQ ID N°3)、MODXS2(SEQ ID N°4)、具有DXS活性的截短的MODXS2(SEQ ID N°5)以及GWDXS2(SEQ ID N°6)、具有DXS活性的截短的GWDXS2(SEQ ID N°7)的氨基酸序列。
图9示出了来自大肠杆菌的野生型DXS基因的核苷酸序列(Ecoli DXS)、编码截短形式的DXS蛋白的基因序列(截短的Ecoli DXS)和编码包含K213→N和R306→C突变的DXS蛋白的基因序列(分别为Ecoli DXS-K213N和Ecoli DXS-K234C)。
图10示出对应于葡萄变种奥托奈麝香(MO)(MODXS1，SEQ ID N°8，和MODXS2，SEQID N°9)和琼瑶浆(GW)(SWDXS2，SEQ ID N°10)中的不同DXS等位基因的蛋白和来自大肠杆菌的DXS蛋白的比较(Lois等，1998)。对应于MODXS2和SWDXS2中的SNP的氨基酸和来自大肠杆菌的DXS中的对应氨基酸用粗体字母表示。
图11示出了大肠杆菌菌株BL21-Gold(DE3)pLysS中表达的重组DXS的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
泳道1:分子量标记
泳道2:用质粒pHGWA-EcoliDXS转化的BL21-Gold(DE3)pLysS
泳道3:用质粒pHGWA-截短的EcoliDXS转化的BL21-Gold(DE3)pLysS
泳道4:用质粒pHGWA-EcoliDXS-K213N转化的BL21-Gold(DE3)pLysS
泳道5:用质粒pHGWA-EcoliDXS-K234C转化的BL21-Gold(DE3)pLysS用1mMIPTG在28℃24小时诱导DXS的表达
箭头表示DXS蛋白的位置和指示标记的分子量。
图12示出了转化有不同DXS构建体的大肠杆菌的培养基中的单萜含量的框状图:野生型EcoliDXS、截短的EcoliDXS、EcoliDXS-K213N、EcoliDXS-K234C。单萜含量表示大肠杆菌培养基中积累的两种主要单萜香叶醇和乙酸香叶酯的总量。数据对应于4个独立实验的结果。对于每一构建体，粗线条表示中值，框的界限是第1和第4四分位数，箱子外的线条表示极值。
图13示出了E.coliDXS、E.coliDXS-K213N、E.coliDXS-K234C和截短的E.coliDXS的氨基酸序列。
图14示出了细菌DXS序列的共有序列(显示了保守氨基酸，点表示非保守氨基酸)。隐藏了对应于来自大肠杆菌的DXS蛋白中的K213和K234的氨基酸。
图15示出了包括耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的细菌DXS序列的共有序列(显示了保守氨基酸，点表示非保守氨基酸)。
图16示出了来自以下物种的DXS蛋白的氨基酸序列:大肠杆菌、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter sp.)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、阪崎肠杆菌(Cronobactersakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、欧文氏菌属物种(Erwiniasp.)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)、Dickeya dadantii、黑胫病菌(Pectobacteriumatrosepticum)、嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)、拉恩氏菌属物种(Rahnellasp.)、气味沙雷氏菌(Serratia odorifera)和耐辐射异常球菌(Deinococcusradiodurans)。
图17示出了植物DXS序列的其有序列(显示了保守氨基酸，点表示非保守氨基酸)。隐藏了对应于来自葡萄的DXS蛋白中的K284和R306的氨基酸。
图18示出了来自葡萄、拟南芥、赤松(Pinus densiflora)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)和盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的DXS蛋白的氨基酸序列
发明详述
本发明的第一目的涉及增强植物或细菌的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)活性以增加萜烯产生的方法，包括以下步骤:
a)通过将参考序列与植物或细菌具有DX5活性的多肽序列进行序列比对确定所述植物或细菌的多肽上的至少一个(优选两个)突变位点，所述参考序列选自包含SEQ ID N°2、SEQ ID N°4、SEQ ID N°6、SEQ ID N°19，SEQ ID N°20、SEQ ID N°21、SEQ ID N°22和SEQID N°23的组;
b)在至少一个突变位点(优选在两个突变位点上)进行突变;
c)得到与典型DXS相比具有增强的DXS活性的多肽。
可通过进行序列比较来实施确定突变位点的步骤(a)。用于突变的植物或细菌的序列可最佳地与选自包含SEQ ID N°2、SEQ ID N°4、SEQ ID N°6、SEQ ID N°19、SEQ ID N°20、SEQ ID N°21、SEQ ID N°22和SEQ ID N°23之组的参考序列进行比对。
优选地，所述参考序列选自包含SEQ ID N°4、SEQ ID N°6、SEQ ID N°19和SEQ IDN°20的组。
更优选地，SEQ ID N°4或SEQ ID N°6用作参考序列以确定针对植物多肽的突变位点，以及SEQ ID N°19或SEQ ID N°20用作参考序列以确定针对细菌多肽的突变位点。
例如，可使用多序列比对计算机程序如ClustalW(Thompson等，1994)或MUSCLE(Edgar，2004)在来自另一种生物的DXS蛋白质中鉴定对应于来自葡萄(Vitis vinifera)的DXS中K284和R306的氨基酸。
本文中使用的术语“DXS活性的增强”和“增强的DXS”指根据本发明的经修饰DXS，其使得在转化了该经修饰DXS的宿主细胞(例如植物、细菌或酵母)中与表达典型DXS基因的宿主细胞相比提高了萜烯产生和/或积累。
本文中使用的表述“典型DXS基因”为以高频率出现的基因，例如DXS的野生型(MoDXS1)，也称为SEQ ID N°8。
本文中使用的术语“突变”对应于原始核酸序列的序列中任何修饰。这些突变包括小规模突变或大规模突变。小规模突变是在一个或几个核苷酸中影响基因的突变，包括DNA中的点突变、一个或更多个额外核苷酸的插入或缺失。点突变可以是沉默、错义和无义突变。基因组结构中的大规模突变(例如基因重复、缺失或突变)的作用是使之前分开的DNA区段并置，有可能使分开的基因集合起来形成功能上不同的融合基因。后一种突变包括染色体易位、中间缺失、染色体倒错和杂合性丧失。
优选地，本突变为点突变。点突变为单个的替换、缺失或添加，其改变、添加或缺失单一的氨基酸或小百分比氨基酸(通常小于5%，更通常小于4%、2%或1%，或者更少)。
本文中使用的术语“突变位点”指由发生如前所述突变的一个或数个核苷酸表示的多核苷酸的基因座。
进行所述突变的方法为本领域技术人员所熟知。例如，可使用QuikChange试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)进行定点突变。
定点突变法也由Zoller&Smith(1982)″Oligonucleotide-directedmutagenesisusing M13-derived vectors:an efficient and general procedure for theproduction of point mutations in any DNA fragment″Nucleic Acids Res.10:6487-6500进行了描述。
本文中使用的表达“增加萜烯产生”意指在转化了该经修饰DXS的宿主细胞(例如植物、细菌或酵母)中产生和/或积累的萜烯的量高于在表达典型DXS基因的宿主细胞中产生和/或积累的萜烯的量。
优选地，根据本发明的萜烯产生增加了十倍。
例如，在编码E.coli的DXS酶的多核苷酸中引入的突变K234→C使得萜烯产生增加了至少十倍。
本发明的第二目的涉及植物或细菌的多肽，其具有与所述植物或细菌的典型DXS相比增强的DXS活性，其可通过本发明的方法获得。
本发明的第三目的涉及具有DXS活性的分离多肽，其包含与序列SEQ ID N°21或其片段具有至少90%同一性的序列，其中在SEQ ID N°21的213位上的氨基酸为天冬酰胺和/或在SEQ ID N°21的234位上的氨基酸为半胱氨酸。
SEQ ID N°21为包括耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的细菌DXS序列的共有序列，常常在文献中对其进行表征。
在一个优选的实施方案中，本发明的分离多肽具有序列SEQ ID N°22或其片段，其中在SEQ ID N°22的213位上的氨基酸为天冬酰胺和/或在SEQ ID N°22的234位上的氨基酸为半胱氨酸。
SEQ ID N°22为细菌DXS序列的共有序列，其特征在于与SEQ ID N°21类似，除了不包含耐辐射异常球菌的DXS序列。
在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽包含序列SEQ ID N°19。
在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽包含序列SEQ ID N°20。
本发明的第四目的涉及具有脱氧-D-木酮糖合酶(DXS)活性的分离多肽，其包含与序列SEQ ID N°1或其片段具有至少90%同一性的序列，其中在SEQ ID N°1的310位上的氨基酸为半胱氨酸和/或在SEQ ID N°1的288位上的氨基酸为天冬酰胺。
本文中使用的术语“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸或其残基。通过单字母或三字母命名来识别氨基酸(Asp D天门冬氨酸;Ile I异亮氨酸;Thr T苏氨酸;Leu L亮氨酸;Ser S丝氨酸;Tyr Y;Glu E谷氨酸;Phe F苯丙氨酸;Pro P脯氨酸;His H组氨酸;Gly G甘氨酸;Lys K赖氨酸;Ala A丙氨酸;Arg R精氨酸;Cys C半胱氨酸;Trp W色氨酸;Val V缬氨酸;Gln Q谷氨酰胺;Met M蛋氨酸;Asn N天冬酰胺)。
还应理解，天然氨基酸还可被替换为经化学修饰氨基酸。通常，这种经化学修饰氨基酸能够增加多肽半衰期。
本文中使用的术语“1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶”(缩写为“DXS”)意指能够催化涉及丙酮酸和甘油醛-3-磷酸(GAP)的转酮酶型缩合以形成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的酶。可使用如Lois等(1998)所述放射性标记底物简单地测定所述酶活性。酶反应混合物由50mMTris-HClpH＝7.5、2.5mMMgCl2、1mM二磷酸硫胺、5mM2-巯基乙醇、0.2mM[2-14C]丙酮酸(15.9mCi/mmol，NEN)、50mM丙酮酸、50mMDL-甘油醛3-磷酸以50μL的终体积组成。在37℃孵育2小时后，通过在80℃加热3分钟来停止反应。在13，000g下离心5分钟后，将10μL上清液(2～5ml)加载至TLC板(硅胶60，Merck)上。通过使用正丙醇/乙酸乙酯/H2O(6∶1∶3)作为溶剂将标记的D-1-脱氧木酮糖5-磷酸与[2-14C]丙酮酸分开，然后通过放射自显影或闪烁计数进行定量。或者，如Querol等(2001)所述，可使用1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶的荧光测定。
优选地，本发明的分离多肽包含与多肽序列SEQ ID N°2或其片段具有至少90%氨基酸序列同一性的序列，其中在SEQ ID N°2的306位上的氨基酸为半胱氨酸和/或在SEQ IDN°2的284位上的氨基酸为天冬酰胺。
还优选地，本发明的多肽具有酶活性，其比多肽SEQ ID N°3高出至少50%，优选地比SEQ ID N°3高出至少70%，以及更优选地高出至少100%。
在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽包含序列SEQ ID N°4。
在一个更优选的实施方案中，本发明的多肽包含序列SEQ ID N°6.
本文中使用的在两个氨基酸序列之间的“同一性百分比”意指在待比较的两个序列之间采用所述序列之最好比对而获得的相同氨基酸的百分比，该百分比纯粹是统计学的，并且这两个序列之间的差异随机地遍布氨基酸序列。本文中使用的“最好比对”或“最佳比对”意指确定的同一性百分比(参见下文)为最高的比对。一般通过比较根据最好比对的之前比对的两个氨基酸序列来实现这些序列之间的序列比较;为了鉴别并比较相似的局部区域，针对比较的片段来实现该比较。除了通过手工方式，通过使用由SMITH和WATERMAN开发的全局同源性算法(Ad.App.Math.，第2卷，第482页，1981)，通过使用由NEDDLEMAN和WUNSCH开发的局部同源性算法(J.Mol.Biol.，第48卷，第443页，1970)，通过使用由PEARSON和LIPMAN开发的相似性的方法(Proc.Natl.Acd.Sci.USA，第85卷，第2444页，1988)，通过使用利用这种算法的计算机软件(在Wisconsin Genetics software Package中的GAP，BESTFIT，BLAST P，BLAST N，FASTA，TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI USA)，通过使用MUSCLE多比对算法(Edgar，Robert C，Nucleic AcidsResearch，第32卷，第1792页，2004)来实现进行比较的最好序列比对。为了得到最好的局部比对，技术人员可优选地使用具有BLOSUM62矩阵或PAM30矩阵的BLAST软件。通过比较最佳比对的两个氨基酸序列来确定这两个序列之间的同一性百分比，为了得到这两个序列之间的最佳比对，氨基酸序列关于参考序列能够包含添加或缺失。通过以下来计算同一性百分比:确定这两个序列之间相同位置的数目，将该数目除以比较位置的总数目，然后将所获得的结果乘以100，以得到这两个序列之间的同一性百分比。
根据一个优选的实施方案，本发明的多肽与氨基酸序列SEQ ID N°1或SEQ ID N°2具有至少95%、优选至少99%和最优选100%的同一性。
本文中使用的SEQ ID N°1或SEQ ID N°2的片段指具有至少300个氨基酸长度、优选具有至少400个氨基酸长度、更优选具有至少500个氨基酸长度的多肽。
例如，具有DXS活性的SEQ ID N°1或SEQ ID N°2的片段，可以是对应于截短的MODXS2多肽的SEQ ID N°5或对应于截短的SWDXS2多肽的SEQ ID N°7。
例如，植物DXS序列的共有序列为SEQ ID N°23。其包含葡萄(Mo_DXSl)的DXS的序列以及拟南芥、赤松、莱茵衣藻和杜氏盐藻的DXS的序列。
本发明的第五目的涉及编码根据本发明的多肽的分离多核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，优选DNA形式。
所述DNA可以是双链或单链。
根据一个优选的实施方案，多核苷酸包含选自包含SEQ ID N°9(MODXS2)、SEQ IDN°10(GWDXS2)、SEQ ID N°15(E.coliDXS-K213N)和SEQ ID N°16(E.coli DXS-K234C)之组的序列。
本发明的第六目的涉及包含根据本发明的多核苷酸的载体。
所述载体可以是克隆或表达载体(优选表达载体)并且可以是例如质粒、粘粒、噬菌粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。
这种载体可包括细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体DNA之组合的载体、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假性狂犬病毒。大量的合适载体为本领域技术人员所知并且可市购。例如提供了下述载体。细菌:pQE70、pQE60、pQE-9(QIAGEN)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(STRATAGENE)、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(PHARMACIA)。真核：pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(STRATAGENE)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(PHARMACIA)。然而，可使用任何其他载体，只要其可在宿主中复制并存活。
将多核苷酸序列(优选在表达载体中的DNA序列)有效地连接至适当的表达控制序列(启动子)以指导mRNA合成。这种启动子的代表性实例可以有原核或真核启动子，例如CMV前早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的LTR以及小鼠金属硫蛋白-I。表达载体还包含翻译起始的核糖体结合位点和转录载体。载体还可包含使得表达增强的适当序列。
另外，表达载体优选地包含一个或更多个可选择标记基因以提供用于选择转化宿主细胞的表性形状，例如对于真核细胞培养而言二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者例如E.coli中的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含如上所述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或控制序列的本发明载体可用于转化适当的宿主以使得该宿主表达该多肽。
例如，可通过将增强子序列插入到载体中来增加较高等真核生物对编码之前所述多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，一般有约10至300pb，其作用于启动子以增加其转录。增强子的实例包括SV40增强子、CMV早期启动子增强子和腺病毒增强子。
本发明的第七目的涉及包含之前描述的多核苷酸或载体的转化宿主细胞。
术语“转化宿主细胞”、“转化的”和“转化”指将DNA引入细胞。所述细胞被称为“宿主细胞”，其可以是原核或真核细胞。典型的原核宿主细胞包括E.coli的各种菌株。典型的真核宿主细胞是植物细胞如玉米细胞、酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞。来自本文中教导，认为适当宿主的选择在本领域技术人员的范围内。
根据本发明的转化宿主细胞为原核或真核细胞。可由本领域技术人员通过熟知的方法影响将之前描述的多核苷酸或载体引入宿主细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔。
根据一个优选的实施方案，根据本发明的转化宿主细胞为选自包含真细菌、古细菌和蓝细菌细胞之组的原核细胞。
更优选地，根据本发明的转化宿主细胞为原核细胞，甚至更优选地为大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。
原核生物也可用作本发明初始克隆步骤的宿主细胞。它们尤其可用于快速产生大量DNA，用于产生定点突变所使用的单链DNA模板，用于同时筛选许多突变体，以及用于对产生的突变体进行DNA测序。合适的原核宿主细胞包括E.coli K12菌株94(ATCC No.31，446)、E.coli菌株W3110(ATCCNo.27,325)、E.coliX1776(ATCCNo.31,537)和E.coliB;然而E.coli的许多其他菌株如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539和原核生物的许多其他种和属包括杆菌(bacilli)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或Serratia marcesans和多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种都可用作宿主。
根据另一个优选的实施方案，根据本发明的转化宿主细胞为选自包含动物、真菌、酵母和植物细胞之组的真核细胞。
优选地，真核细胞为真菌微生物。更优选酵母
合适的微生物的非详尽列表将包括以下:属于酵母属(Saccharomyces)的物种-例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、贝酵母(S.bayanus)、巴氏酵母(S.pastorianus)、奇异酵母(S.paradoxus)、少孢酵母(S.exiguous)、S.servazzi、葡萄汁酵母(S.uvarum)、克鲁弗酵母(S.kluyveri)和S.castellii-;属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的物种-例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、马克斯克鲁维酵母(K.marxianusvar.marxianus)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolorens)、克鲁雄酵母(K.waltii)、德地克鲁维酵母(K.delphensis)、K.nonfermentas和K.wickerhamii-，属于假丝酵母属(Candida)的物种-例如产朊假丝酵母(C.utilis)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、C.castellii和C.humilis-，属于接合酵母属(Zygosaccharomyces)的物种-例如鲁氏酵母(Z.rouxii)、拜耳接合酵母(Z.bailii)、发酵接合酵母(Z.fermentati)、Z.bisporus和Z.florentinus-，属于毕赤酵母属(Pichia)的物种-例如P.stipidis、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、P.sorbithophila和异常毕赤酵母(P.anomala)-，或者其他物种-例如多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、汉森德巴利酵母(Debaromyces hansenii)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、Torulaspora delbueckii、Ashbya gossipie、黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、产黄青霉(Penecillium chrysogenum)、米根霉(Rhizopus oryzae)和Mucorcircenelloides-。
更优选地，真核细胞为酵母，甚至更优选地，微生物为酿酒酵母。例如，酿酒酵母在2006年1月27日储存于DSMZ-Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und ZellkulturenGmbH.Mascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，Germany，登录号：OSMZ17900。
出于本发明的目的，异源性途径是下述途径，该途径通过所限定的中间步骤并且由所限定的起始材料形成化合物的活性不存在于微生物的野生型中。更优选地，异源性途径是衍生自不同物种的DNA的途径。
或者，真核细胞为植物细胞，更优选地植物细胞选自包含葡萄、烟草(Nicotianatabacum)和拟南芥细胞的组，甚至更优选地所述植物细胞为葡萄细胞，优选葡萄栽培变种奥托奈麝香(Vitis vinifera Cv MuscatOttonel)或葡萄栽培变种琼瑶浆(Vitisvinifera Cv Gewurztraminer)细胞，更优选葡萄栽培变种琼瑶浆的细胞。
本发明的第八目的涉及包含之前描述的多核苷酸或载体的转基因细菌。
本发明的第九目的涉及包含之前描述的多核苷酸、载体或宿主细胞的转基因植物。
一般通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumifaciens)完成培养植物宿主细胞的转化。因此，可例如通过以下获得转基因植物:将本发明的载体(即编码1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶)和可选择标记基因(例如，编码卡那霉素抗性的kan基因)转移至包含辅助Ti质粒的根癌农杆菌中，如HOECKEMA等(Nature，303:179-181，1983)所述，然后将根癌农杆菌细胞与待转化的植物叶切片或者其他组织或细胞一起培养，如AN等(Plant Physiology，81:301-305，1986)所述。然而，可使用将DNA引入细胞的其他方法，例如聚凝胺(Kawai和Nishizawa，Mol.Cell.Biol.，4：１172[1984])、原生质体融合(Schaffner，Proc.Natal.Acad.Sci.USA，77:2163[1980])、电穿孔(Neumannet等，EMBOJ.，1:841[1982])和直接显微注射至细胞核中(Capecchi，Cell，22:479[1980])。
可通过可选择标记由在包含例如卡那霉素和适当量植物激素如萘乙酸和苄基腺嘌吟(用于愈伤组织和根诱导)的培养基上培养细胞来选择转化的植物愈伤组织。之后，可使用本领域技术人员熟知的技术使植物细胞再生并将所得植物转移至土地。
根据一个优选的实施方案，本发明的转基因植物已经在基因组中并入了之前所述的多核苷酸或载体。
优选地，所述植物选自包含树、蔬菜、肉质植物(succulent)和观赏植物的组。
仍更优选地，所述转基因植物耐异恶草酮(clomazone)，异恶草酮也称为异恶草酮(dimethazone)(FMC57020;2-(2-氯代苯基)甲基-4，4-二甲基-3-isoxalidinone)。
如本文所使用的，耐异恶草酮的转基因植物对应于在10μM异恶草酮的存在下生长的植物(Carretero-Paulet L、Cairo A、Botella-Pαvíα P、Besumbes O、Campos N、BoronatA、Rodriguez-Concepcion M.(2006)、Enhanced flux through the methylerythritol4-phosphate pathway in Arabidopsis plants overexpressing deoxyxylulose5-phosphate reductoisomerase.Plant Mol Biol62:683-95)。
仍更优选地，所述转基因植物具有增强的香气。
作为实例，所述转基因植物选自包括以下的组:唇形科(例如，罗勒属(罗勒)、薰衣草属(薰衣草)、牛至属(牛至)、薄荷属(薄荷)、鼠尾属(鼠尾草)、迷迭香属(迷迭香)、百里香属(百里香)、香薄荷属和马薄荷属);伞形科(例如，葛缕子属(葛缕子)、莳萝属(莳萝)、茴香属(茴香)和胡萝卜属(胡萝卜));菊科(菊科植物)(例如，艾属(龙蒿、艾灌丛)和艾菊属(艾菊));芸香科(例如，柑橘植物);蔷薇科(例如，玫瑰);桃金娘科(例如，按树、千层树);禾本科(例如，香茅属(香茅));牻牛儿苗科(天竺葵)和某些松柏类，包括冷杉属(例如，加拿大香脂)、雪松属(雪松)和金钟柏属以及刺柏属。
本发明的第十目的涉及本发明的转基因植物的任何代的后代，所述后代包含之前所述的多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞。
所述后代可具有植物或种子的形式。
本发明的第十一目的涉及制备如之前所述的转基因植物的方法，其包括以下步骤:
a.用如之前所述的载体转化植物细胞;
b.选择表达如之前所述之多肽的经转化植物细胞;和
c.由所述经转化植物细胞产生转基因植物。
转化的步骤(a)可通过如之前所述的公知的方法来完成，例如电穿孔、转染、裸DNA摄取、原生质体产生、DNA直接转移入花粉、胚胎或多能植物细胞、农杆菌介导的转化、粒子轰击或微粒轰击。
步骤(b)的选择可通过公知方法来完成。
步骤(c)的由所述转化植物细胞产生耐异恶草酮的转基因植物可通过公知方法(例如，由所述转化植物细胞产生多能植物细胞)来完成。
根据一个优选实施方案，所述方法用于制备植物种子，所述方法还包括以下步骤:
d.从所述转基因植物获得种子。
根据一个特别实施方案，本发明的方法用于获得耐异恶草酮的转基因植物。
优选地，所述转基因植物通过公知的方法来获得，例如描述于Klee H，Horsch R，Rogers S(1987)，Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its FurtherApplications to Plant Biology.Annual Review of Plant Physiology38，467-486和Potrykus I(1991)Gene Transfer to Plants:Assessment of Published Approachesand Results.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology42，205-225中的那些。
根据另一特定实施方案，本发明的方法用于获得具有增强的萜烯生物合成能力的转基因植物。具有增强的萜烯生物合成能力的植物将合成比野生型的所述转基因植物多至少50%的萜烯，优选为至少70%，更优选为至少100%。
优选地，萜烯涉及香叶醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇和α-松油醇。
优选地，本发明的多肽具有比多肽SEQ ID N°3高至少50%，优选为至少70%，并且更优选地比SEQ ID N°3高至少100%的酶活性。
所述具有萜烯生物合成能力的植物可以是芳香植物，例如辣薄荷(Menthapiperita)、宽叶薰衣草(Lavandula latifolia)或迷迭香(Rosmarinus officinalis);和药用植物，例如青蒿(Artemisia annua)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、长春花(Catharanthus roseus)或紫草(Lithospermum erythrothizon)以及产生有价值的萜烯化合物的任何植物种类，例如产生类胡萝卜素的植物，如番茄(Lycopersicon esculentum)、木薯(Manihot esculenta)或稻(Oryza sativa)。
优选地，通过公知方法例如Klee等(1987)和Potrykus(1991)中所述的那些来选择所述转基因植物。
本发明的第十二目的涉及产生增强的DXS酶的方法，增强的DXS酶增加植物、细菌或酵母中的萜烯产生，该方法包括以下步骤:
a.培养如之前所定义的经转化宿主细胞;
b.获得使得增加植物或细菌中的萜烯产生的增强的DXS酶。
优选地，具有增强的DXS活性的多肽可能通过之前所述的方法获得。
本发明的第十三目的涉及在宿主细胞中产生萜烯的方法，其包括以下步骤:
a.在如之前所述有效产生萜烯的条件下(例如，植物、细菌或酵母细胞)、在通过DXS2酶有效产生更多萜烯底物(单萜、二萜、三萜和/或多萜)的条件下培养转化宿主细胞，所述更多萜烯底物的产生导致通过萜烯底物的酶修饰产生更多萜烯。
b.从所述宿主细胞获得所述萜烯。
萜烯是基于异戊二烯单元(C5)或者主要由其构成的饱和的或不饱和的、任选地取代的烃。萜烯可以是无环或环状的。如本文所使用的萜烯包括萜烯、萜烯衍生物以及被称为萜类的化合物(其可以落在或可以不落在两个之前类别的化合物之一)。萜烯衍生物包括已经历功能化的一个或更多个步骤的化合物，例如，功能化包括羟基化、异构化、氧化还原或酰化。优选地，出于本发明的目的，萜烯是满足上述条件的化合物，和/或其碳骨架至少部分但优选全部来自MEP和/或MEV途径的化合物。因此，萜烯包括萜烯醇，例如C15H26O和C10H18O化合物，例如藿香醇(patchoulol)、柏木脑(epi-cedrol)、荜澄茄醇(cubebol)、里哪醇(linalool)、橙花叔醇(nerolidol);和二醇，例如香紫苏醇(sclareol)。萜烯还包括二磷酸化合物，例如冰片基(bornyl)-二磷酸(单萜烯)和柯巴基(copalyl)-二磷酸(二萜烯)，只是提及了广泛类别的萜烯的几种。
如本文所使用的，“衍生物”是从已知化合物或推定化合物获得的任何化合物并且包含母体的必需要素。
例如，萜烯是具有碳骨架C10、C15、C20、C30、C40、C45等的化合物。
因此，术语“萜烯”涵盖单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜和/或多萜。
优选地，所述萜烯包括香叶醇、里哪醇、香茅醇、橙花醇和α-松油醇。
根据一个优选实施方案，本发明的微生物提供了至少30μg、更优选为至少100μg的萜烯/g鲜重微生物的产率。微生物的萜烯产率优选地由实施例2的方案建立。
萜烯可在细胞中积累。例如，它们可在细胞质、线粒体、细胞膜或其它细胞器中积累。许多萜烯是亲脂性化合物，它们在细胞的质膜中积累。
出于本发明的目的，术语“在培养基中积累”还涵盖在两相发酵工艺过程中在溶剂中的积累。
该方法包括在有益于产生所述萜烯的条件下培养转化宿主细胞的步骤。这些条件对于技术人员而言已知的条件。一般而言，可以通过选择适当的介质、发酵容器、温度和pH来调节它们。
用于产生萜烯的方法可包括以下步骤:在进行两相发酵的情况下，从介质、细胞和/或有机溶剂分离萜烯。萜烯可通过用于本领域的任何方法来分离，所述方法包括但不限于色谱、提取和蒸馏。
例如，本领域技术人员而言公知单萜通常在质体中产生，倍半萜通常在细胞溶胶中产生。
与植物相比，微生物系统更易于进行大规模改造项目(其中可以比较和组合许多不同的修饰)。但是，与植物相比，微生物确实具有一些技术缺点，特别是在其表达异源基因时。
本发明的第十四目的涉及选择芳香植物的方法，其包括以下步骤:
a.通过所述植物的生物样品中萜烯合成的增强和/或萜烯积累的分析来鉴定引起DXS等位变异的DXS的至少一个突变，
b.选择包含所述突变的植物。
本发明的第十五目的涉及用于产生更耐异恶草酮的DXS酶的方法，其包括以下步骤:
a.培养如之前所述的转化宿主细胞;b.从所述转化宿主细胞的细胞提取物、细胞悬液、蛋白质级分、晶体级分、细胞培养物、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞过滤物或细胞沉淀获得更耐异恶草酮的DXS酶。
下述实例用于示出本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，在下述实例中公开的技术代表用以实施如由本发明人所发现的本发明的运行良好的技术，并且因此可认为构成用于其实施的优选实施方式。
实施例
1)克隆来自葡萄栽培变种麝香奥托奈和琼瑶浆的DXS cDNA
使用RT-PCR扩增并克隆来自葡萄栽培变种麝香奥托奈(MO)和琼瑶浆(Gw)的DXScDNA。对这些克隆的测序表明，MO和Gw两者在DXS基因座处是杂合的。MO和Gw共有相同的等位基因，称为MoDXS1(图1)。另外，Mo和Gw分别具有MoDXS2和GwDXS2等位基因。MoDXS2和GwDXS2等位基因分别在2和1 SNP中与MoDXS1不同，其修饰对应蛋白质的氨基酸序列(图2)。对于MoDXS2和GwDXS2来说分别为特征性的K284→N和R306→C突变(参照SEQ ID N°2)影响数据库中可得到的所有植物DXS序列中保守的氨基酸(图3)。此外，氨基酸K284和R306属于酶的活性位点(Xiang等，2007)，这表明它们可修饰MoDXS2和GwDXS2等位基因相比于MoDXS1的活性。
2)MoDXS2和GwDXS2等位基因对葡萄果实中萜烯醇含量的影响
材料和方法:通过固相提取(SPE)分离游离和结合的单萜烯醇。
对于每个取样点，进行萜烯醇分析的三次重复。对于每次重复，使用至少25颗果实。除去种子并将外皮与中果皮分离。称重后在液氮下研磨外皮，然后在添加40mg亚硫酸钠后悬于40mL水中。使离心(4℃下11400g)15分钟后得到的上清液通过玻璃纤维预过滤器和玻璃过滤器。添加20微升1g/L的4-壬醇溶液作为外部标准品以允许定量主要的萜烯醇。萜烯醇的提取改进自Mateo等(1997)，使用乙醇代替甲醇。使之前用5mL甲醇和15mL超纯水清洗的滤液通过1g相C18二氧化硅键合的非极性SPE柱(BOND ELUT JR.)，速率为约1滴/秒。然后将样品分为两个相等的子样品，一个用于分析游离的和糖苷结合的单萜烯醇，一个用于分析游离的萜烯醇。用4mL无水乙醇洗脱游离的和结合的单萜烯醇的总级分。将该总萜烯醇提取物稀释于40mL柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH4.5)中并将所得溶液与50mg AR2000糖酵解酶(Gist-Brocades，Seclin，France)在37.5℃下孵育过夜以释放糖苷结合的萜烯醇(Tamborra等.2004)。在C18柱上通过SPE分离释放的萜烯醇并在用3×5mL水冲洗后用4mL二氯甲烷洗脱。对于游离的萜烯醇分析，不进行水解步骤，萜烯醇在用水冲洗后直接用二氯甲烷洗脱。在填充有0.5g无水亚硫酸钠的巴斯德吸管中干燥提取物并在温和的氮气流下浓缩至500μL。将20微升1g/L间甲酚溶液添加到每个样品中作为内部对照。在进行气相(GC)分析之前将样品储存在-20℃。
结果：
实施例2示出DXS等位基因对葡萄果实中萜烯醇含量具有很大影响，如通过作为MO(图4)和GW(图5)后代中DXS等位基因之函数的萜烯醇含量的研究所示。MoDXS1(＝GwDXS1)纯合基因型表现出极其低水平的萜烯醇，而杂合或DXS2纯合基因型累积了大量的萜烯醇。
3)植物中DXS等位基因的功能性表征
为了表征DXS等位基因活性，本发明人使用农杆菌介导的烟草(本氏烟，Nicotianabenthamiana)瞬时转化，其允许在烟草叶中实现快速有效的基因表达(Batoko等，2000)。已使用该方法成功地表征了葡萄次级代谢中所涉及的基因(Schmidlin等，2008;Hugueney等，2009)。MoDXS1、MoDXS2和GwDXS2等位基因与编码罗勒(basilicum，Ocimumbasilicum)(Iijima等人，2004)香叶醇合酶(geraniol synthase，GES)的cDNA一起在烟草叶中表达。在该系统中，GES用作负责生物合成单萜烯醇香叶醇的报告基因，其通常不在烟草中累积。因为已示出DXS活性对于植物中的萜烯生物合成是限制性的(Estevez等，2001;Enfissi等，2005)，所以由GES活性形成的香叶醇的量直接取决于DXP底物可利用度，并因此取决于烟草叶片中的DXS活性。由此，共表达GES和DXS等位基因之烟草叶的GC-MS分析允许精确比较植物中的DXS等位基因活性。
材料和方法：
使用上游引物
5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGGCTCTCTG
TACGCTCTCATTTCC-3′(SEQ ID N°11)和下游引物
5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCACTATAACATGATCTCCAGGGCCTCC-3′
(SEQ ID N°12)通过PCR扩增葡萄DXS cDNA，并且使用Gateway BP克隆酶(clonase)(Invitrogen)根据制造商说明书克隆到pDODR207Gateway相容性载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。对DXS cDNA进行测序以证明没有引入突变。为了农杆菌介导的瞬时表达，随后将DXScDNA转移到GATEWAY双运载体pMDC32(Curtis和Grossniklaus.，2003)中。将来自罗勒的香叶醇合酶cDNA(Iijima等人，2004)克隆到GATEWAY双运载体pMDC83(Curtis和Grossniklaus.，2003)中并表达为GFP融合蛋白。通过电穿孔将所有的构建体引入到土壤农杆菌菌株C58(pMP90)中。根据Voinnet等(2003)用土壤农杆菌培养物(OD6000.5)浸润本氏烟草的叶。在土壤农杆菌浸润96小时后分析叶片区块的萜烯含量。
然后，从烟草叶中提取萜烯醇:
对于每个取样点，进行萜烯醇分析的三次重复实验。称重后，在液氮下研磨烟草叶片区块(约1g)，然后悬于2mL超纯水中。离心(在4℃下6000g)5分钟后，收集上清液并添加20μL1g/L4-壬醇溶液作为外部标准品。使之前用5mL甲醇和15mL超纯水清洗的上清液通过1g相C18二氧化硅键合的非极性SPE柱(Bond Elut Jr，Varian)。用2mL无水乙醇洗脱总萜烯醇。将该总萜烯醇提取物稀释于20mL柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液(pH4.5)中并将所得溶液与25mgAR2000糖酵解酶(Gist-Brocades，Seclin，France)在37.5℃下孵育过夜。在C18柱上通过SPE分离释放的萜烯醇并在用3×5mL水冲洗后用4mL二氯甲烷洗脱。在填充有0.5g无水亚硫酸钠的巴斯德吸管中干燥提取物并在温和的氮气流下浓缩至500μL。将20微升1g/L间甲酚溶液添加到每个样品中作为内部对照。在进行气相(GC)分析之前将样品储存在-20℃。
最后，使用配备有GerstelMPS2XL取样器并与Agilent5975B惰性质谱仪(AgilentTechnologies)偶联的Agilent6890N气相色谱仪通过气相色谱和质谱(GC-MS)分析萜烯。气相色谱仪安装有DB-Wax毛细管柱(60m×0.32mm内径×0.5μm膜厚，J&WScientific)并且将氦气用作载气(1ml/分钟恒流)。GC箱温是程序化的，没有最初的维持时间，以20℃/分钟的速率从45℃至82℃(维持1分钟)，然后以2.7℃/分钟的速率从82℃至235℃(维持15分钟)。注射器设定为250℃并以脉冲不分流模式使用(25psi，0.50分钟)。界面、MS离子源和四极管的温度分别为270℃、230℃和150℃。以电子轰击离子化模式(EI，70eV)运行质谱仪并且在29-300amu的m/z范围中扫描质量。Agilent MSD ChemStation软件(G1701DA，RevD.03.00)用于仪器控制和数据处理。将质谱图与威利文库参照谱图库(Wiley′slibrary referencespectral bank)进行比较。
结果:
农杆菌介导的单独GES瞬时表达导致显著量香叶醇的累积，所述香叶醇的生物合成取决于烟草中的内源性DXS活性(图6，图7)。GES和MoDXS1的共表达由于增强的DXP底物可利用度而导致香叶醇生物合成大量增加。但是，GES和MoDXS2或GwDXS2的共表达导致烟草叶中香叶醇累积平均增加三倍(图7)，表明这些等位基因与MoDXS1相比具有增强的DXS活性。
因此，本发明人推断，MO和GW中萜烯醇的大量累积是由于存在MoDXS2或GwDXS2。与MoDXS1相比，影响酶活性位点中氨基酸的K284→N和R306→C突变赋予了增强的DXS活性，进而成为植物中萜烯累积增加的原因。
以下实验的目的是研究这些突变的作用是否可扩展至其他来源的DXS酶。本发明人选择来自其酶特性被很好地表征的大肠杆菌DXS作为模型(Querol等，2001;Xiang等，2007)。
来自大肠杆菌与葡萄的DXS蛋白质序列的比对表明葡萄DXS中的氨基酸K284和R306分别对应于大肠杆菌DXS中的K213和234(图10)。为了评价MO-和GW-样突变对非植物DXS活性的影响，将突变K213→N和K234→C引入到大肠杆菌DXS的蛋白质中。随后研究了这些突变对大肠杆菌的萜烯生物合成能力的影响。
4)来自大肠杆菌的DXS基因的克隆和定点诱变
材料和方法:
使用上游引物
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTTCCGCGTGGATCAATGAGTTTTG
ATATTGCCAAATACCC(SEQ ID N°24)和下游引物
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCATTATGCCAGCCAGGCCTTGATTTTG(SEQ ID N°25)通过PCR扩增来自大肠杆菌的DXS基因(Lois等，1998)并根据制造商说明书(Invitrogen)使用BP克隆酶(催化PCR产物或克隆的DNA区段在体外重组的蛋白质混合物)克隆到pDONR207Gateway相容性载体中(一种能够快速克隆一个或更多个基因的技术，该入门载体赋予对庆大霉素的抗性)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。随后使用LR克隆酶(催化入门克隆与目的载体(destination vector)在体外重组以产生表达克隆的酶的混合物)(Invitrogen)将DXS基因转移到可与GATEWAY相容性表达载体pHGWA中(Busso等，2003)，产生质粒pHGWA-EcoliDXS。将该质粒用于定点诱变，以将K313→N和K234→C突变引入到大肠杆菌的DXS蛋白质中。使用QuikChange试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA)根据制造商说明书进行定点诱变。QuikChange试剂盒以引物和DNA聚合酶为基础。其是设计用以帮助将单个或多个点突变引入到目的基因中，从而产生具有氨基酸改变、插入或缺失的酶突变体。
正向引物GCGCGAAGGCGGGAACAAAGTTTTCTCTGGCGTGCC(SEQ ID N°26)和反向引物GGCACGCCAGAGAAAACTTTGTTCCCGCCTTCGCGC(SEQ ID N°27)用于引入K213→N突变，产生质粒pHGWA-EcoliDXS-K213N。
正向引物CGCACCGAAGAACATATTTGCGGCATGGTAGTGCCTGG(SEQ ID N°28)和反向引物CCAGGCACTACCATGCCGCAAATATGTTCTTCGGTGCG(SEQ ID N°29)用于引入K234→C突变，产生质粒pHGWA-EcoliDXS-K234C。
结果:
在定点诱变期间，分离具有移框的突变体DXS基因。该移框导致合成截短的DXS蛋白质，其用作对照。编码该截短的DXS的质粒称为pHGWA-截短的EcoliDXS(pHGWA-truncated-EcoliDXS)。
5)在大肠杆菌中表达野生型和突变体大肠杆菌DXS蛋白质
材料和方法:
将pHGWA-EcoliDXS、pHGWA-截短的EcoliDXS，pHGWA-EcoliDXS-K213N和pHGWA-EcoliDXS-K234C质粒转化到BL21-Gold(DE3)pLysS大肠杆菌菌株(Stratagene，La Jolla，CA)中。BL21-Gold(DE3)pLysS大肠杆菌菌株是提供增加转化效率的感受态细胞。它们对四环素和氯霉素具有抗性。在氨苄青霉素(100μg/mL)、氯霉素(25μg/mL)和四环素(2μg/mL)存在下在补加有葡萄糖(10g/L)的50mLLB培养基中在28℃使转化体生长。当培养物达到OD0.1时，用1mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导DXS表达并使培养物生长24小时。
6)DXS突变体对大肠杆菌中萜生物全成的影响
通过对诱导DXS表达后培养基中的萜烯进行定量，评价MO-和GW-样突变(分别是K213→N和KB4→C)对大肠杆菌的DXS酶活性的影响。
材料和方法:分析大肠杆菌培养基中的萜烯
使用改进自Coelho等(2009)的方法，使用搅拌棒吸附提取(stir barsorptiveextraction，SBSE)分析培养基中的萜烯。将具有PDMS涂层的搅拌棒(0.5mm×10mm;Twister;Gerstel，Mullheim，Germany)引入到每个培养基样品(10mL)中。在20℃进行提取150分钟，旋转速度为800rpm。然后如上所述，使用配备有Gerstel MPS2 XL取样器并与Agilent 5975B质谱仪(Agilent Technologies)偶联的Agilent 6890N气相色谱仪通过气相色谱和质谱(GC-MS)分析萜烯。
结果:
实施例示出引入到大肠杆菌之DXS中的突变影响培养基中的单萜烯含量(图5)。特别地，大肠杆菌DXS中的突变K234→C导致培养基中萜烯的累积大大增加。因此，本发明人推断，在对应于葡萄DXS蛋白质中的K284和R306的位置上可对非植物DXS酶进行修饰，从而提高DXS活性。这种改良的DXS突变体可用于微生物的代谢工程，从而增强目的类异戊二烯的产生。

Claims (13)

1.具有DXS活性的突变的分离的多肽，其衍生自与共有序列SEQ ID N°21对应的DXS，所述突变的分离的多肽具有下述两个突变的一个或两个：
SEQ ID N°21第213位的氨基酸被替换为天冬酰胺，
SEQ ID N°21第234位的氨基酸被替换为半胱氨酸，
所述突变的分离的多肽具有与其所衍生自的非突变细菌DXS相比增强的DXS活性，并且
所述突变的分离的多肽之序列与序列SEQ ID NO:21有至少90％的同一性。
2.根据权利要求1所述的突变的分离的多肽，其中所述多肽的序列为SEQ ID N°19。
3.根据权利要求1所述的突变的分离的多肽，其中所述多肽的序列为SEQ ID N°20。
4.分离的多核苷酸，其包含编码根据权利要求1至3中任一项所述多肽的序列。
5.载体，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸。
6.经转化的宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸或根据权利要求5所述的载体。
7.根据权利要求6所述的经转化宿主细胞，其中所述经转化宿主细胞是选自包含真细菌、古细菌和蓝细菌细胞之组的原核细胞。
8.根据权利要求6所述的经转化宿主细胞，其中所述经转化宿主细胞是选自包含动物、真菌和植物细胞之组的真核细胞。
9.转基因细菌，其包含根据权利要求4所述的多核苷酸或根据权利要求5所述的载体。
10.一种制备包含根据权利要求4所述的多核苷酸、根据权利要求5所述的载体或者根据权利要求6至8中任一项所述的宿主细胞的转基因植物的方法，其包括以下步骤：
a.用权利要求5所述的载体转化植物细胞；
b.选择表达如权利要求1至3中任一项所述之突变的分离的多肽的经转化植物细胞；以及
c.由所述经转化植物细胞产生转基因植物。
11.一种产生与野生型DXS相比活性增强的DXS的方法，所述DXS增加细菌的萜烯产生，所述方法包括以下步骤：
a.培养如权利要求6至7中任一项所述的经转化宿主细胞；
b.得到允许增加细菌之萜烯产生的增强的DXS酶。
12.具有与野生型DXS相比增强的DXS活性的多肽，其可通过根据权利要求11所述的方法得到。
13.一种在宿主细胞中产生萜烯的方法，其包括以下步骤：
a.在有效产生所述萜烯的条件下培养如权利要求6至8中任一项所述的转化宿主细胞；
b.由所述宿主细胞得到所述萜烯。
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