CN106574289A - 生产萜烯或类萜烯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种显示增强的2‑C‑甲基‑D‑赤藓糖醇4‑磷酸/1‑脱氧‑D‑木酮糖5‑磷酸(MEP/DXP)途径的重组异常球菌细菌，和其用于生产萜烯或类萜烯化合物的用途。

Description

生产萜烯或类萜烯的方法
发明领域
本发明涉及微生物学领域。更具体地，本发明涉及在经遗传修饰细菌中生产类异戊二烯化合物的领域。
发明背景
类异戊二烯，亦称为萜烯或类萜烯，是极其多样化类别的天然产物。类异戊二烯，其包含单萜烯、倍半萜烯、二萜烯和三萜烯以及类胡萝卜素，是许多工业应用的对象，这是因为它们存在于例如药物、营养制品、矫味剂、芳香剂、化妆品、着色剂和农用化学品中。
尽管类异戊二烯化合物存在极大多样性，但全都自共同的C-5前体，异戊烯基焦磷酸(IPP)生物合成。该前体可通过甲羟戊酸途径(MEV)或通过非-甲羟戊酸途径(或2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(MEP/DXP)途径)合成，导致形成IPP和其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。DMAPP和IPP然后缩合产生香叶基二磷酸(GPP)，其进一步用IPP转换成法呢基二磷酸(FPP)。FPP进一步与IPP缩合以形成香叶基香叶基二磷酸(GGPP)。GPP、FPP和GGPP是单萜烯、倍半萜烯、二萜烯、三萜烯和类胡萝卜素的前体。
目前，类异戊二烯主要从植物中提取，或通过化学合成产生，但遭受低收率和高生产成本。
微生物的代谢工程改造提供了一种用于从廉价的碳源经济化生产大量的类异戊二烯的可选择和有前景的方法。在该方面，通过重组微生物已经生产了许多类异戊二烯。大肠杆菌(E. coli)和酿酒酵母(S. cerevisiae)，可非常容易地对其进行遗传操作，已经经常用作宿主细胞。例如，柠檬烯自表达来自大冷杉(grand fir)的GPP合酶基因和来自绿薄荷的(-)-柠檬烯合酶基因的重组大肠杆菌生产(Carter等2003)，或在表达来自Clarkia breweri的(S)-芳樟醇合酶基因的重组酿酒酵母中获得芳樟醇生产(Herrero等2008)。
尽管将微生物工程改造以生产类异戊二烯已经显示极大的前景，但已经推定类异戊二烯的总量受类异戊二烯前体即IPP和DMAPP的利用度的限制。改造增加的类异戊二烯前体供给因此对增加生产是必需的。然而，观察到复杂的MEP途径的遗传操作可影响细胞生长速度和异戊二烯生产，特别是由于有毒的代谢中间产物例如IPP或DMAPP的积聚(例如Sivy等2011)或由来自细胞的丙酮酸的耗尽引起的对宿主的代谢负荷(Brown等2010)导致。
发明概述
在第一方面，本发明提供了一种过生产类异戊二烯的异常球菌细菌，其中MEP途径经成功地工程改造以增加至IPP和DMAPP的碳流。
因此本发明涉及显示增强的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(MEP/DXP)途径的重组异常球菌细菌，特别是其中选自DXP合酶(DXS)、DXP还原异构酶(DXR)、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH和IPP异构酶活性(IDI)的至少一种酶活性增加的细菌。优选地，所述至少一种酶活性通过选自天然的、同源的或异源的dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、 ispG、ispH和idi基因的至少一个基因的过表达而增加。
优选地，本发明的重组细菌经遗传修饰以增加DXS活性和/或IDI活性。特别是，所述重组细菌可过表达天然的、同源的或异源的idi基因和/或过表达天然的、同源的或异源的dxs基因。
本发明的细菌可进一步显示增加的FPP合酶活性。优选地，这种增加是由于天然的、同源的或异源的ispA基因的过表达导致。
优选地，ipsA基因编码选自以下的多肽：
a) 包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的全部或活性部分的多肽；
b) 具有与SEQ ID NO: 47具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽；
c) 由与SEQ ID NO: 46具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的核苷酸序列编码的多肽；或
d) 由能够在中度/高度严格性、优选地高度或极高度严格性的条件下与(i) SEQ IDNO: 46所示的核酸序列、(ii) 其互补链或(iii) (i)或(ii)的子序列杂交的核酸序列编码的多肽。
优选地，FPP合酶进一步显示二甲基烯丙基转移酶活性和/或香叶基香叶基二磷酸合酶活性，更优选地，二甲基烯丙基转移酶活性和香叶基香叶基二磷酸合酶活性。
本发明的细菌还可进一步包含突变的DXP合酶，其包含在对应于SEQ ID NO:52的位置222的位置上的天冬酰胺和/或在对应于SEQ ID NO:52的位置244的位置上的半胱氨酸，优选地包含在对应于SEQ ID NO: 52的位置244的位置上的半胱氨酸的突变的DXP合酶。特别是，重组异常球菌细菌可表达编码来自抗放射异常球菌的DXP合酶的R244C突变体的基因(SEQ ID NO: 8)、编码来自D. yunweiensis的DXP合酶的R238C突变体的基因(SEQ IDNO: 14)和/或编码来自D. geothermalis的DXP合酶的R241C突变体的基因(SEQ ID NO:56)。优选地，重组异常球菌细菌表达改进的(突变的) DXS酶和过表达天然的、同源的或异源的idi基因。
优选地，本发明的细菌进一步包含编码异源的萜烯合酶的基因。
异源的萜烯合酶可以是单萜烯合酶，其优选地选自香叶醇合酶、3S-芳樟醇合酶、香叶烯合酶、R-芳樟醇合酶、1,8桉油酚合酶、4S-柠檬烯合酶、R-柠檬烯合酶、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(-)-内-葑醇合酶和(-)-α-萜品醇合酶。更优选地，异源的萜烯合酶是香叶醇合酶、桉油酚合酶、柠檬烯合酶或芳樟醇合酶。
异源的萜烯合酶还可以是倍半萜烯合酶，其优选地选自(+)-表-α-红没药醇合酶、吉玛烯A合酶、(E,E)-吉玛烯B合酶、吉玛烯C合酶、(-)-吉玛烯D合酶、瓦伦烯合酶、(3S、6E)-橙花叔醇合酶、表-雪松醇合酶、绿叶醇合酶、檀香萜合酶和δ-杜松烯合酶。更优选地，异源的倍半萜烯合酶是(+)-表-α-红没药醇合酶。
本发明的细菌可进一步显示减少的或抑制的番茄烯β-环化酶活性。
在第二方面，本发明涉及其中FPP合酶活性增加的重组异常球菌细菌。优选地，FPP合酶活性通过天然的、同源的或异源的ispA基因的过表达而增加。优选地，ipsA基因编码选自以下的多肽：
a) 包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的全部或活性部分的多肽；
b) 具有与SEQ ID NO: 47具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽；
c) 由与SEQ ID NO: 46具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的核苷酸序列编码的多肽；或
d) 由能够在中度/高度严格性、优选地高度或极高度严格性条件下与(i) SEQ ID NO:46所示的核酸序列、(ii) 其互补链或(iii) (i)或(ii)的子序列杂交的核酸序列编码的多肽。
优选地，FPP合酶进一步显示二甲基烯丙基转移酶活性和/或香叶基香叶基二磷酸合酶活性、更优选地二甲基烯丙基转移酶活性和香叶基香叶基二磷酸合酶活性。
在第三方面，本发明涉及包含突变的DXP合酶的重组异常球菌细菌，所述突变的DXP合酶包含在对应于SEQ ID NO:52的位置222的位置上的天冬酰胺和/或在对应于SEQ IDNO:52的位置244的位置上的半胱氨酸，优选地包含在对应于SEQ ID NO: 52的位置244的位置上的半胱氨酸的突变的DXP合酶。特别是，重组异常球菌细菌可表达编码来自抗放射异常球菌的DXP合酶的R244C突变体的基因(SEQ ID NO: 8)、编码来自D. yunweiensis的DXP合酶的R238C突变体的基因(SEQ ID NO: 14)和/或编码来自D. geothermalis的DXP合酶的R241C突变体的基因(SEQ ID NO: 56)。
在第四方面，本发明涉及表达编码异源的萜烯合酶、优选地香叶醇合酶或(+)-表-α-红没药醇合酶的基因的重组异常球菌细菌。
在第五方面，本发明涉及其中内源的番茄烯β-环化酶活性减少或受抑制的重组异常球菌细菌。
在进一步的方面，本发明涉及本发明的重组异常球菌细菌用于生产类异戊二烯，优选地单萜烯、二萜烯、三萜烯、倍半萜烯或类胡萝卜素，更优选地倍半萜烯或类胡萝卜素的用途。在一个实施方案中，类异戊二烯是香叶醇、香叶酸和/或番茄烯。在一个具体的实施方案中，类异戊二烯是类胡萝卜素，优选地番茄烯或自番茄烯衍生的另一种类胡萝卜素化合物，特别是deinoxanthine。本发明还涉及生产类异戊二烯的方法，包括(i) 在适合于生产类异戊二烯的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，和任选地(ii) 回收类异戊二烯。优选地，类异戊二烯是单萜烯、二萜烯、三萜烯、倍半萜烯或类胡萝卜素，更优选地倍半萜烯或类胡萝卜素。在一个实施方案中，类异戊二烯选自香叶醇、香叶酸和番茄烯。
在另一方面，本发明涉及本发明的重组异常球菌细菌用于生产香叶基酯的用途。本发明还涉及生产香叶基酯的方法，包括(i) 在适合于生产香叶醇和/或香叶酸的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，(ii) 回收香叶醇和/或香叶酸，和(iii) 将香叶醇和/或香叶酸转换为香叶基酯，和任选地(iv) 回收香叶基酯。优选地，香叶基酯是异丁酸香叶基酯或反式-乙酸香叶基酯。
在另一方面，本发明涉及本发明的重组异常球菌细菌用于生产
二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮的用途。本发明还涉及生产二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮的方法，包括(i) 在适合于生产香叶醇和/或香叶酸的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，(ii) 回收香叶醇和/或香叶酸，和(iii) 将香叶醇和/或香叶酸转化为二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮，和任选地(iv) 回收二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮。
附图简述
图1：24h时包含表达罗勒(Ocimum basilicum) GES的重组D. geothermalis细菌的培养物的提取物的GCMS分析。
图2：48h时包含表达罗勒GES的重组D. geothermalis细菌的培养物的提取物的GCMS分析。
图3：72h时时包含表达罗勒GES的重组D. geothermalis细菌的培养物的提取物的GCMS分析。
图4：商品化香叶醇的保留时间。
图5：商品化香叶酸的保留时间。
图6：D. geothermalis WT、其中crtlm基因被敲除的重组D. geothermalis细菌和番茄烯标准品的丙酮提取物吸光度的差异。
图7：其中crtlm基因被敲除并且具有和没有FPP合酶的过表达的重组D. geothermalis细菌的番茄烯生产。
图8：表达罗勒的GES并且具有和没有FPP合酶的过表达的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图9：表达罗勒的GES和过表达D. yunweiensis DXS、DXR、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH或IDI的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图10：表达罗勒的GES和来自D. yunweiensis的野生型DXS酶或来自D.yunweiensis的突变体R238C的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图11：表达罗勒的GES和来自抗放射异常球菌的野生型DXS酶或突变体R244C的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图12：表达罗勒的GES和D. geothermalis FPPS的K170G突变体的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图13：表达罗勒的GES和突变的DXS和过表达来自D. yunweiensis的DXR、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH或IDI的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图14：表达来自桔色链霉菌(Streptomyces citricolor)的(+)-表-α-红没药醇合酶的重组D. geothermalis细菌的红没药醇生产。野生型细菌不产生红没药醇(数据未显示)。
图15：其中crtlm基因被敲除并且具有和没有来自D. yunweiensis的突变体DXS和IDI过表达的重组D. geothermalis细菌的番茄烯(类胡萝卜素)生产。
图16：表达Phyla dulcis或鹰嘴豆(Cicer arietinum)的GES并且具有和没有内源的FPP合酶的过表达的重组D. geothermalis细菌的香叶醇生产。
图17：通过测量350 nm和600 nm之间的吸光度并根据野生型细菌和过表达FPPS的细菌的细胞干重(DCW)将所述吸光度归一化而获得的deinoxanthin的光谱。灰色光谱对应于deinoxanthin标准品(自耐放射异常球菌(D. radiodurans)提取的纯化的deinoxanthin)。
图18：野生型D. geothermalis细菌和过表达内源的FPPS的D. geothermalis细菌的培养物的图片。
图19：表达来自带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)的1,8桉叶素合酶基因的重组D. geothermalis细菌的桉油酚生产。桉油酚由箭头指示。野生型细菌不产生桉叶素(数据未显示)。
图20：表达来自Mentha longifolia的柠檬烯合酶基因的重组D. geothermalis细菌的柠檬烯生产。柠檬烯由箭头指示。野生型细菌不产生柠檬烯(数据未显示)。
图21：表达紫苏(Perilla frutescens)的芳樟醇合酶的重组D. geothermalis细菌的芳樟醇生产(mg/L)。野生型细菌不产生芳樟醇(数据未显示)。
发明详述
如所指示的，本发明涉及经遗传修饰以显示改进的类异戊二烯生产的异常球菌细菌。
具体而言，本申请显示异常球菌细菌的MEP途径可经工程改造以增加至IPP和DMAPP的碳流。事实上，本发明人鉴定了几种限速酶，并表明这些酶可经遗传改造或过表达。他们观察到在这些重组细菌中类异戊二烯生产显著增加。
此外，发明人在本文中证实，在异常球菌细菌中类异戊二烯的生产可经控制以促进目的化合物的生产和/或积聚。在该方面，他们鉴定和过表达了FPP合酶，并表明这种过表达促进具有超过10个C原子的类异戊二烯(例如二萜烯、三萜烯、倍半萜烯和类胡萝卜素)的生产，对单萜烯不利。他们还表明，内源的番茄烯β-环化酶的失活诱导番茄烯的过量产生。
最后，本申请还证实，异常球菌细菌，特别是上文描述的重组异常球菌细菌，通过异源的萜烯合酶的表达可有效地用于产生异源的类异戊二烯化合物。
定义
在本发明的背景中，术语“异常球菌”包括异常球菌的野生型菌株或异常球菌的天然变体菌株，例如，通过加速进化、诱变、通过DNA-改组技术获得的菌株，或通过插入真核、原核和/或合成的核酸获得的重组菌株。异常球菌细菌可指异常球菌属的任何细菌，例如但不限于D. geothermalis、D. cellulolysiticus、耐放射异常球菌、解蛋白异常球菌(D.proteolyticus)、抗放射异常球菌、嗜放射异常球菌(D. radiophilus)、D. grandis、 D.indicus、D. frigens、D. saxicola、D. maricopensis、D. marmoris、D. deserti、 D.murrayi、D. aerius、D. aerolatus、D. aerophilus、D. aetherius、D. alpinitundrae、 D. altitudinis、D. antarticus、D. apachensis、D. aquaticus、D. aquatilis、 D.aquiradiocola、D. aquivivus、D. caeni、D. citri、D. claudionis、D. daejeonensis、 D. depolymerans、D. enclensis、D. ficus、D. gobiensis、D. guangriensis、 D.guilhemensis、D. hohokamensis、D. hopiensis、D. humi、D. misasensis、 D.navajonensis、D. papagonensis、D. peraridilitoris、D. phoenicis、D. pimensis、 D.piscis、D. puniceus、D. radiomollis、D. radioresistens、D. radiotolerans、 D.reticulitermitis、D. roseus、D. sahariens、D. soli、D. sonorensis、D. swuensis、 D. wulumuqiensis、D. xibeiensis、D. xinjiangensis、D. yavapaiensis或 D.yunweiensis细菌，或其任何组合。优选地，术语“异常球菌”是指D. geothermalis、抗放射异常球菌、D. yunweiensi和D. murrayi。在一些实施方案中，术语“异常球菌”是指嗜常温异常球菌细菌，优选地选自D. grandis、耐放射异常球菌、抗放射异常球菌、 D.yunweiensis和D. aquaticus。在一些其它的实施方案中，术语“异常球菌”是指嗜热异常球菌细菌，优选地选自D. geothermalis、D. murrayi和D. maricopensis。在优选的实施方案中，术语“异常球菌”是指D. geothermalis、D. murrayi、D. maricopensis、D. grandis、耐放射异常球菌、抗放射异常球菌、D. yunweiensis和D. aquaticus。更优选地，术语“异常球菌”是指D. geothermalis。
术语"重组细菌"或“经遗传修饰的细菌”是指在自然界中未发现和由于遗传元件的缺失、插入或修饰导致包含修饰的基因组的细菌。"重组核酸"因此是指经工程改造和因而在野生型细菌中未发现的核酸。
术语“基因”是指编码蛋白的任何核酸。术语基因包括DNA例如cDNA或gDNA，以及RNA。基因可首先通过例如，重组、酶和/或化学技术制备，随后在宿主细胞或体外系统中复制。基因通常包含编码所需蛋白的开放读码框。基因可包含另外的序列，例如转录终止子或信号肽。
术语“表达盒”表示包含编码区，即基因和调节区，即包含一个或多个可操作连接的控制序列的核酸构建体。优选地，控制序列对于异常球菌宿主细胞是合适的。
本文使用的术语"表达载体"是指包含表达盒的DNA或RNA分子。优选地，表达载体是线性或环状双链DNA分子。
术语"可操作连接的"是指其中控制序列以控制序列指导编码序列的表达的方式相对于编码序列位于合适的位置上的配置。
术语"控制序列"是指基因表达所必需的核酸序列。控制序列可以是天然的、同源的或异源的。本领域技术人员众所周知和目前使用的控制序列将是优选的。这样的控制序列包括但不限于，前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。优选地，控制序列包括启动子和转录终止子。
本文使用的术语“天然的”是指来自未修饰的异常球菌细菌或来自相同物种的异常球菌细菌的遗传元件或蛋白。术语“同源的”是指来自并非重组异常球菌细菌的另一物种的异常球菌细菌的遗传元件或蛋白。术语“异源的”是指来自非异常球菌来源，例如其它细菌、微生物、植物、病毒等的遗传元件或蛋白。术语“天然的”、“同源的”或“异源的”可以指野生型或突变的遗传元件或蛋白。在一些实施方案中，这些术语是指在本发明的重组细菌中引入或表达之前通过例如诱变被修饰，例如以改进编码的蛋白的一个或数个特征(例如增强的活性、稳定性等)的遗传元件。
本文使用的术语“过表达”、“增强的表达”和“增加的表达”可互换使用和是指与未修饰的细菌例如野生型细菌或未经遗传修饰的相应的细菌相比，基因或酶的表达增加以增强MEP/DXP途径。增加的酶表达通常通过增加编码所述酶的基因的表达来获得。在其中基因或酶并非天然存在于本发明的细菌中，即同源的或异源的基因或酶的实施方案中，术语“过表达”和“表达”可互换使用。
本文使用的术语“MEP途径”、“MEP/DXP途径”、“非-甲羟戊酸途径”或“2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸途径”是指导致自丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸缩合成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)而形成IPP和DMAPP的生物合成途径。该途径包括以下酶：1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(EC 2.2.1.7)、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(EC1.1.1.267)、2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶(EC 2.7.7.60)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(EC 2.7.1.148)、2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(EC4.6.1.12)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(EC 1.17.7.1)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(EC 1.17.1.2)和异戊烯基-二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)。
术语"类异戊二烯"、"类异戊二烯化合物"、"萜烯"、"萜烯化合物"、"类萜烯"和"类萜烯化合物"在本文中可互换使用，和是指能够自IPP衍生的任何化合物。类异戊二烯中存在的C原子数通常可被5整除(例如，C5、C10、C15、C20、C25、C30和C40)。不规则的类异戊二烯和多萜烯已有报道，并且也包括在"类异戊二烯"的定义中。类异戊二烯化合物包括但不限于，单萜烯、二萜烯、三萜烯、倍半萜烯和类胡萝卜素。
术语萜烯合酶包括能够自一种或多种前体，特别是自香叶基二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)、香叶基香叶基二磷酸(GGPP)和两种或更多种这些前体的任何组合合成类异戊二烯化合物，例如单萜烯、倍半萜烯、二萜烯、三萜烯或类胡萝卜素的酶、复合物和/或酶组。这样的萜烯合酶的实例包括但不限于，单萜烯合酶、二萜烯合酶和倍半萜烯合酶。
词语"焦磷酸"在本文可与"二磷酸"互换使用。
术语“DXS”、“DXP合酶”或“DXPS”是指由dxs基因编码的酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(EC 2.2.1.7)，其催化丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸缩合成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(DXP)。基因产物的名称“DXP合酶”、“DXS”或“DXPS”在本申请中可互换使用。DXP合酶活性可通过使用如描述于Lois等(1998)的放射性标记的底物，或技术人员已知的任何其它方法测定。
术语"DXP还原异构酶"或"IspC"或“DXR”是指由dxr或ispC基因编码的酶1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(EC 1.1.1.267)，其催化DXP同时还原和异构化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)。基因名称dxr或ispC在本申请中可互换使用。基因产物的名称DXP还原异构酶或IspC在本申请中可互换使用。
术语"MCT"或"IspD"或“CMS”是指由ispD基因编码的酶2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶(EC 2.7.7.60)，其催化自CTP (胞苷三磷酸)和2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸(MEP)形成4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(亦称为4-(胞苷5'-磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME))。基因产物的名称MCT、CMS或IspD在本申请中可互换使用。
术语"CMK"或"IspE"是指由ispE基因编码的酶4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶，亦称为4-(胞苷5'-磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(EC 2.7.1.148)，其催化4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME)经ATP-依赖性磷酸化为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸(亦称为4-(胞苷5'-磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2-磷酸(CDP-MEP)。基因产物的名称CMK或IspE在本申请中可互换使用。
术语"IspF"、“MECDP-合酶”、“MECPP-合酶”或“MECPS”或“MCS”是指由ispF基因编码的酶2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶(EC 4.6.1.12)，其催化4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇2-磷酸(CDP-MEP)转化为2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸(ME-CPP或cMEPP)，同时相应释放胞苷5-一磷酸(CMP)。基因产物的名称IspF、MECDP-合酶、MECPP-合酶、MCS或MECPS在本申请中可互换使用。
术语"IspG"或“HDS”是指由ispG基因编码的酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶(EC 1.17.7.1)，其参与2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸(cMEPP)转化为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸(HMBPP)。
术语""IspH"或“IDS”是指由ispH基因编码的酶4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶，亦称为羟基甲基丁烯基焦磷酸还原酶(EC 1.17.1.2)，其转化1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸(HMBPP)为异戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。
术语"IDI"、“IPP异构酶”或“异戊烯基焦磷酸异构酶”是指由fni或idi基因编码的酶异戊烯基-二磷酸δ-异构酶(EC 5.3.3.2)，其催化高烯丙基底物异戊烯基(IPP)经1,3-烯丙基重排为其烯丙基异构体，二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。基因名称fni或idi在本申请中可互换使用。
术语"甲羟戊酸途径"或"MEV途径"在本文用于指转化乙酰基-CoA为IPP的生物合成途径。甲羟戊酸途径包含催化以下步骤的酶：(a) 通过乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶(EC2.3.1.9)的作用将两分子的乙酰基-CoA缩合成乙酰乙酰基-CoA；(b) 通过羟基甲基戊二酰基-CoA合酶(EC 2.3.3.10)的作用，将乙酰乙酰基-CoA与乙酰基-CoA缩合，形成羟基甲基戊二酰基-辅酶A (HMG-CoA)；(c) 通过羟基甲基戊二酰基-CoA还原酶(NADPH) (EC1.1.1.34)的作用，将HMG-CoA转化为甲羟戊酸；(d) 通过甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)的作用将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸5-磷酸；(e) 通过磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)的作用，将甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸；和(f) 通过二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC4.1.1.33)的作用，将甲羟戊酸5-焦磷酸转化为异戊烯基焦磷酸。
术语"IspA"、“FDPS”、“FPPS”或“FPP合酶”是指由ispA基因编码的酶法呢基二磷酸合酶(EC 2.5.1.10、2.5.1.1)，其催化异戊烯基焦磷酸(IPP)与烯丙基焦磷酸、二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和然后与得到的香叶基焦磷酸(GPP)连续缩合成最终产物法呢基焦磷酸(FPP)。任选地，和在优选的实施方案中，该酶还可显示香叶基香叶基二磷酸合酶活性(2.5.1.29)。基因产物的名称IspA、FDPS、FPPS或FPP合酶在本申请中可互换使用。
术语“异戊二烯合酶”是指催化自二甲基烯丙基二磷酸(EC 4.2.3.27)形成异戊二烯的酶。
根据生物体，上文鉴定的酶和编码基因的名称可不同。然而，为清楚的目的，在本说明书中，这些术语独立于酶或基因的来源而使用。
本文使用的术语酶的“活性”是指其功能，和在本发明的背景中是指被所述酶催化的反应。酶活性可通过技术人员已知的任何方法测量。
本文使用的术语酶的“增加的活性”或“增强的活性”或“改进的活性”是指酶的增加的特异性催化活性、增加的底物特异性、增加的蛋白或RNA稳定性和/或增加的胞内浓度。优选地，增加的活性是通过过表达编码所述酶的基因获得的酶的增加的胞内浓度。
本文使用的术语“脱辅基类胡萝卜素(apocarotenoid)”是指通过由类胡萝卜素裂解加双氧酶(CCD)催化的氧化裂解自类胡萝卜素衍生的有机化合物。一些脱辅基类胡萝卜素是在可食用植物中颜色、风味和香味的必需和有价值组分。脱辅基类胡萝卜素的实例包括但不限于β-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、香叶基丙酮、假紫罗兰酮和β-大马烯酮。
本文使用的术语“序列同一性”或“同一性”是指在自两个多肽序列的对齐的位置上匹配(相同的氨基酸残基)的数量(%)。序列同一性通过当对齐使得重叠和同一性最大，同时使序列空位最少时比较序列来确定。具体而言，序列同一性可根据两个序列的长度，使用许多数学整体或局部比对算法的任一种确定。类似长度的序列优选地使用整体比对算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch，1970)比对，其最理想地在整个长度上比对序列，而明显不同长度的序列优选地使用局部比对算法比对(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman，1981)或Altschul算法(Altschul等，1997; Altschul等，2005))。为确定百分比氨基酸序列同一性的目的的比对可以在本领域技术范围内的各种方式进行，例如使用在互联网网站例如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/)上可得的公众可得的计算机软件。为测量比对，本领域技术人员可确定合适的参数，包括为在所比较的序列的整个长度上实现最大比对而需要的任何算法。为此目的，%氨基酸序列同一性值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle产生的值，其使用Needleman-Wunsch算法产生两个序列的最佳整体比对，其中所有搜索参数被设定为默认值，即评分矩阵 = BLOSUM62，空位空缺= 10，空位延伸= 0.5，末端空位罚分= 错误，末端空位空缺= 10和末端空位延伸= 0.5。
MEP途径的遗传工程改造
在参与MEP途径的酶中，本发明人鉴定了限速酶和表明它们的过表达导致类异戊二烯生产的显著增加。
因此，在第一方面，本发明涉及显示增强的2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸/1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸(MEP/DXP)途径的重组异常球菌细菌，即与未修饰的异常球菌细菌相比，经遗传修饰以具有增加的至IPP和DMAPP的碳流的异常球菌细菌。
在本发明的重组异常球菌细菌中，与未修饰的细菌相比，选自DXS、DXR、IspD、IspE、IspF、IspG、IspH和IPP异构酶的至少一种酶的活性增加。优选地，至少两种、三种、四种、五种、六种或七种这些活性增加。更优选地，所有这些活性增加。
这些酶的活性可由于它们的编码基因的过表达而增加。因此，在一个实施方案中选自dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi基因的至少一个基因过表达。优选地，至少两个、三个、四个、五个、六个或七个这些基因过表达。更优选地，所有这些基因过表达。
为了增加基因的表达，技术人员可使用任何已知的技术，例如增加细菌中的基因拷贝数，使用包括高水平基因表达的启动子即强启动子，使用稳定相应的信使RNA或修饰核糖体结合位点(RBS)序列和它们周围的序列的元件。
在一个实施方案中，过表达通过增加细菌中的基因拷贝数而获得。一个或数个拷贝的基因可通过本领域技术人员已知的重组方法引入至基因组，包括基因置换。优选地，包含基因的表达盒整合至基因组。
或者，基因可被包含带有目的基因的表达盒的表达载体，优选地质粒携带。表达载体可以1-5、20、100或500个拷贝存在于细菌中，这取决于复制起点的性质。
在另一个实施方案中，基因的过表达通过使用包括高水平的基因表达的启动子获得。例如，内源基因的启动子可被更强的启动子，即诱导更高水平的表达的启动子置换。适合用于本发明的启动子是技术人员已知的，和可以是组成型或诱导型的，和天然的、同源的或异源的。
可用于本发明的表达盒包含选自dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi基因的至少一个基因，其与指导所述基因表达的一个或多个控制序列(通常包含转录启动子和转录终止子)可操作连接。优选地，各表达盒仅包含与一个或多个控制序列可操作连接的一个基因。在该情况下，如果数个基因过表达，则使用数个表达盒，其各自包含仅一个基因。或者，可用于本发明的表达盒可包含操纵子，其包含(i) 选自dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、 ispG、ispH和idi基因的至少两个基因，或(ii) 选自dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH 和idi基因的至少一个基因和至少另一个基因，例如编码萜烯合酶或FPP合酶的基因。
控制序列可包括被宿主细胞识别的启动子。启动子包含介导酶表达的转录控制序列。启动子可以是在异常球菌细菌中显示转录活性的任何多核苷酸。启动子可以是天然的、同源的或异源的启动子。优选的启动子是天然的或同源的。在该方面，已经研究了各种启动子，并用于在异常球菌细菌中的基因表达。合适的启动子的实例包括来自翻译延伸因子Tu基因tufA (DR0309)和tufB (DR2050)的PtufA和PtufB启动子、位于pI3的resU基因的启动子、groESL操纵子的启动子区PgroESL (Lecointe等2004; Meima等2001)，或所述启动子的衍生物。优选地，启动子是强的组成型启动子。
控制序列还可以是转录终止子，其被异常球菌细菌识别以终止转录。终止子与基因的3'-端可操作连接。在异常球菌细菌中有功能的任何终止子可用于本发明，例如Lecointe等(2004)中描述的终止子term116。
任选地，表达盒还可包含允许容易筛选重组细菌的可选择标记。通常，可选择标记是编码抗生素抗性或赋予自养作用的基因。
在一个具体的实施方案中，本发明的重组异常球菌细菌包含：包含与强组成型启动子可操作连接的dxs基因的表达盒；包含与强组成型启动子可操作连接的dxr基因的表达盒；包含与强组成型启动子可操作连接的ispD基因的表达盒；包含与强组成型启动子可操作连接的ispE基因的表达盒；包含与强组成型启动子可操作连接的ispF基因的表达盒；包含与强组成型启动子可操作连接的ispG基因的表达盒；包含与强组成型启动子可操作连接的ispH基因的表达盒；和/或包含与强组成型启动子可操作连接的idi基因的表达盒。
这些表达盒可整合至细菌的基因组和/或可以附加体形式保持在表达载体中。优选地，表达盒整合至细菌的基因组。本发明的细菌可过表达(i) dxs (a)、dxr (b)、ispD (c)、ispE (d)、ispF (e)、ispG (f)、ispH (g)或idi (h)基因；(ii) 两个基因的以下组合之一：a、b ; a、c ; a、d ; a、e ; a、f ; a、g ; a、h ; b、c ; b、d ; b、e ; b、f ; b、g ;b、h ; c、d ; c、e ; c、f ; c、g ; c、h ; d、e ; d、f ; d、g ; d、h ; e、f ; e、g ; e、h ;f、g ; f、h和g、h ；(iii) 三个基因的以下组合之一：a、b、c; a、b、d; a、b、e; a、b、f; a、b、g; a、b、h; a、c、d; a、c、e; a、c、f; a、c、g; a、c、h; a、d、e; a、d、f; a、d、g; a、d、h; a、e、f; a、e、g; a、e、h; a、f、g; a、f、h; a、g、h; b、c、d; b、c、e; b、c、f; b、c、g; b、c、h; b、d、e; b、d、f; b、d、g; b、d、h; b、e、f; b、e、g; b、e、h; b、f、g; b、f、h; b、g、h; c、d、e; c、d、f; c、d、g; c、d、h; c、e、f; c、e、g; c、e、h; c、f、g; c、f、h; c、g、h; d、e、f; d、e、g; d、e、h; d、f、g; d、f、h; d、g、h; e、f、g; e、f、h; e、g、h;和f、g、h；(iv) 四个基因的以下组合之一：a、b、c、d; a、b、c、e; a、b、c、f; a、b、c、g; a、b、c、h; a、b、d、e; a、b、d、f; a、b、d、g; a、b、d、h; a、b、e、f; a、b、e、g; a、b、e、h; a、b、f、g; a、b、f、h; a、b、g、h; a、c、d、e; a、c、d、f; a、c、d、g; a、c、d、h; a、c、e、f; a、c、e、g; a、c、e、h; a、c、f、g; a、c、f、h; a、c、g、h; a、d、e、f; a、d、e、g; a、d、e、h; a、d、f、g; a、d、f、h; a、d、g、h; a、e、f、g; a、e、f、h; a、e、g、h; a、f、g、h; b、c、d、e; b、c、d、f; b、c、d、g; b、c、d、h; b、c、e、f; b、c、e、g; b、c、e、h; b、c、f、g; b、c、f、h; b、c、g、h; b、d、e、f; b、d、e、g; b、d、e、h; b、d、f、g; b、d、f、h; b、d、g、h; b、e、f、g; b、e、f、h; b、e、g、h; b、f、g、h; c、d、e、f; c、d、e、g; c、d、e、h; c、d、f、g; c、d、f、h; c、d、g、h; c、e、f、g; c、e、f、h; c、e、g、h; c、f、g、h; d、e、f、g; d、e、f、h; d、e、g、h; d、f、g、h;和e、f、g、h; (v) 五个基因的以下组合之一：a、b、c、d、e; a、b、c、d、f; a、b、c、d、g; a、b、c、d、h; a、b、c、e、f; a、b、c、e、g; a、b、c、e、h; a、b、c、f、g; a、b、c、f、h; a、b、c、g、h; a、b、d、e、f; a、b、d、e、g; a、b、d、e、h; a、b、d、f、g; a、b、d、f、h; a、b、d、g、h; a、b、e、f、g; a、b、e、f、h; a、b、e、g、h; a、b、f、g、h; a、c、d、e、f; a、c、d、e、g; a、c、d、e、h; a、c、d、f、g; a、c、d、f、h; a、c、d、g、h; a、c、e、f、g; a、c、e、f、h; a、c、e、g、h; a、c、f、g、h; a、d、e、f、g; a、d、e、f、h; a、d、e、g、h; a、d、f、g、h; a、e、f、g、h; b、c、d、e、f; b、c、d、e、g; b、c、d、e、h; b、c、d、f、g; b、c、d、f、h; b、c、d、g、h; b、c、e、f、g; b、c、e、f、h; b、c、e、g、h; b、c、f、g、h; b、d、e、f、g; b、d、e、f、h; b、d、e、g、h; b、d、f、g、h; b、e、f、g、h; c、d、e、f、g; c、d、e、f、h; c、d、e、g、h; c、d、f、g、h; c、e、f、g、h;和d、e、f、g、h; (vi) 六个基因的以下组合之一：a、b、c、d、e、f; a、b、c、d、e、g; a、b、c、d、e、h; a、b、c、d、f、g; a、b、c、d、f、h; a、b、c、d、g、h; a、b、c、e、f、g; a、b、c、e、f、h; a、b、c、e、g、h; a、b、c、f、g、h; a、b、d、e、f、g; a、b、d、e、f、h; a、b、d、e、g、h; a、b、d、f、g、h; a、b、e、f、g、h; a、c、d、e、f、g; a、c、d、e、f、h; a、c、d、e、g、h; a、c、d、f、g、h; a、c、e、f、g、h; a、d、e、f、g、h; b、c、d、e、f、g; b、c、d、e、f、h; b、c、d、e、g、h; b、c、d、f、g、h; b、c、e、f、g、h; b、d、e、f、g、h;和c、d、e、f、g、h; (vii) 七个基因的以下组合之一：a、b、c、d、e、f、g; a、b、c、d、e、f、h; a、b、c、d、e、g、h; a、b、c、d、f、g、h;a、b、c、e、f、g、h; a、b、d、e、f、g、h; a、c、d、e、f、g、h;和b、c、d、e、f、g、h，或(viii) 八个基因的组合。
在一个实施方案中，细菌过表达至少ispG基因和任选地dxs、dxr、ispD、ispE、 ispF、ispH和idi基因的一个或数个。
过表达的基因可以是天然的、同源的或异源的基因。
dxs基因可以是编码1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶的任何基因，优选地细菌基因。
在一个优选的实施方案中，dxs基因来自异常球菌细菌。具体而言，dxs基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 1; UniProt登记号: Q1IZP0)、D. yunweiensis (SEQID NO: 3)、D. apachensis (NCBI登记号: WP_01958600.1)、D. phoenicis (GenBank:EYB66726.1; NCBI登记号: WP_034360373.1; UniProt登记号: A0A016QL59)、D. deserti(NCBI登记号: WP_012692944.1; GenBank: ACO45821.1; UniProt登记号: C1D1U7)、D. aquatilis (NCBI登记号: WP_026298749.1或WP_019009670.1)、D. wulumuqiensis (WP_017869298.1)、耐放射异常球菌(UniProt登记号: Q9RUB5; NCBI登记号: WP_010888114.1)、D. gobiensis (NCBI登记号: WP_014684923.1; GenBank: AFD25440.1;UniProt登记号: H8GUB6)、D. sp. 2009 (WP_022801808.1)、D. maricopensis (NCBI登记号: WP_013557350.1; UniProt登记号: E8U9V6)、D. peraridilitoris (NCBI登记号:WP_015234295.1; UniProt登记号: K9ZXR0)、D. proteolyticus (NCBI登记号: WP_013614954.1; UniProt登记号: F0RNL9)、抗放射异常球菌(编码SEQ ID NO: 52所示的蛋白的序列; SEQ ID NO: 59)、D.murrayi (NCBI登记号: WP_027461316.1)、D. swuensis(UniProt登记号: A0A0A7KK27 ; NCBI登记号: WP_039686512.1)、D. solis (NCBI登记号: WP_046842902.1)和D. ficus (NCBI登记号: WP_027461725.1)的dxs基因。优选地，dxs基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. apachensis、D. phoenicis、D. deserti、D. aquatilis、D. wulumuqiensis、耐放射异常球菌、D. gobiensis、D. sp.2009、D. maricopensis、D. peraridilitoris、D. proteolyticus和抗放射异常球菌的dxs基因。更优选地，dxs基因来自D. geothermalis、D. yunweiensis或抗放射异常球菌，和甚至更优选地来自D. yunweiensis或抗放射异常球菌。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ ID NO: 2、4或52的多肽、更优选地与SEQ ID NO: 2或4的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
dxr基因可以是编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶的任何基因，优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，dxr基因来自异常球菌细菌。具体而言，dxr基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 34; UniProt登记号: Q1IZJ1)、D. yunweiensis (SEQID NO: 36)、D. apachensis (NCBI登记号: WP_019584825.1)、D. gobiensis (NCBI登记号: WP_014685255.1; UniProt登记号: H8GWW6)、D. phoenicis (UniProt登记号:A0A016QKH6; GenBank: EYB66645.1)、耐放射异常球菌(NCBI登记号: WP_10888147.1;UniProt登记号: Q9RU84)、D. wulumuqiensis (NCBI登记号: WP_017869266.1)、D. deserti (NCBI登记号: WP_012693383.1; UniProt登记号: C1CVP3)、D. sp. 2009 (WP_022802132.1)、D. aquatilis (WP_019009458.1)、D. maricopensis (NCBI登记号: WP_013557781.1; UniProt登记号: E8UB38)、D. proteolyticus (NCBI登记号: WP_013614140.1; UniProt登记号: F0RJQ5)、D. peraridilitoris (NCBI登记号: WP_015237162.1; UniProt登记号: L0A5Z1)、D. swuensis (UniProt登记号: A0A0A7KF77;GenBank: AIZ44760.1)、D. solis (WP_046842669.1)、D. marmoris (WP_029481040.1)、D. ficus (WP_027462584.1)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 61)和D. murrayi (WP_027460916.1)的dxr基因。优选地，dxr基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. apachensis、D. gobiensis、D. phoenicis、耐放射异常球菌、D. wulumuqiensis、D. deserti、D. sp. 2009、D. aquatilis、D. maricopensis、D. proteolyticus和D. peraridilitoris的dxr基因。更优选地，dxr基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ ID NO: 35或37的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%、序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
ispD基因可以是编码2-C-甲基-D-赤藓糖醇4-磷酸胞苷酰转移酶的任何基因，优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，ispD基因来自异常球菌细菌。具体而言，ispD基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 17; UniProt登记号: Q1J200)、D. yunweiensis (SEQ ID NO: 19)、D. apachensis (NCBI登记号: WP_019587161.1)、D. phoenicis (EYB69514.1; UniProt登记号: A0A016QUR2)、D. deserti (WP_012691946.1;UniProt登记号: C1CXL7)、D. wulumuqiensis (WP_017871568.1)、耐放射异常球菌(WP_010889228.1; UniProt登记号: Q9RR90)、D. sp. 2009 (WP_022800717.1)、D. peraridilitoris (WP_015236716.1; UniProt登记号: L0A4P7)、D. aquatilis (WP_019010949.1或WP_026298972.1)、D. maricopensis (WP_013556207.1; UniProt登记号:E8U6L3)、D. proteolyticus (WP_013615367.1或WP_041222801.1; GenBank:ADY26759.1; UniProt登记号: F0RKP7)、D. gobiensis (WP_014686200.1; GenBank:AFD26720.1; UniProt登记号: H8GV45)、D. marmoris (WP_029480451.1)、D. soli(AKH17101.1)、D. swuensis (UniProt登记号: A0A0A7KL82)、D. misasensis (WP_034344339.1)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 63)和D. murrayi (GenBank: ACO44823.1;WP_027460458.1)的ispD基因。优选地，ispD基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. apachensis、D. phoenicis、D. deserti、D. wulumuqiensis、耐放射异常球菌、D. sp. 2009、D. peraridilitoris、D. aquatilis、D. maricopensis、D. proteolyticus和D. gobiensis的ispD基因。更优选地，ispD基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ ID NO: 18或20的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
ispE基因可以是编码4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶的任何基因、优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，ispE基因来自异常球菌细菌。具体而言，ispE基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 38; UniProt登记号: Q1J201; NCBI登记号:WP_011529330.1)、D. yunweiensis (SEQ ID NO: 40)、D. phoenicis (NCBI登记号:EYB69513.1; UniProt登记号: A0A016QTX2)、D. apachensis (WP_019587162.1)、D. aquatilis (WP_019009083.1)、D. maricopensis (WP_013556206.1; UniProt登记号:E8U6L2; GenBank: ADV66701.1)、D. deserti (WP_012691947.1; UniProt登记号:C1CXL8)、D. sp. 2009 (WP_022800716.1)、D. proteolyticus (WP_013615364.1;UniProt登记号: F0RKH7)、D. wulumuqiensis (WP_017871569.1) D. peraridilitoris(WP_015236715.1或WP_022800716.1; UniProt登记号: L0A3E0)、D. gobiensis (WP_014686199.1; UniProt登记号: H8GV44)、耐放射异常球菌(WP_10889229.1; UniProt登记号: Q9RR89)、D. swuensis (A0A0A7KGN1; GenBank: AIZ45322.1)、D. soli(AKH17102.1)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 65)和D. marmoris (WP_029480453.1)的ispE基因。优选地，ispE基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. phoenicis、D. apachensis、D. aquatilis、D. maricopensis、D. deserti、D. sp. 2009、D. proteolyticus、D. wulumuqiensis、D. peraridilitoris、D. gobiensis和耐放射异常球菌的ispE基因。更优选地，ispE基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ ID NO: 39或41的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
ispF基因可以是编码2-C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶的任何基因、优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，ispF基因来自异常球菌细菌。具体而言，ispF基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 21; UniProt登记号: Q1J2A8; WP_011529223.1)、D. yunweiensis (SEQ ID NO: 23)、D. phoenicis (NCBI登记号:EYB69383.1、WP_034353365.1; UniProt登记号: A0A016QTI4)、D. apachensis (WP_019587119.1)、D. sp. 2009 (WP_022800431.1)、D. wulumuqiensis (WP_017871252.1)、D. maricopensis (WP_013558001.1; UniProt登记号: E8UBQ8)、D. deserti (WP_012692194.1; UniProt登记号: C1CZ33)、D. aquatilis (WP_019009115.1)、耐放射异常球菌(WP_010886876.1 UniProt登记号: Q9RXS6)、D. proteolyticus (WP_013615320.1;UniProt登记号: F0RKD3)、D. gobiensis (WP_014686259.1; UniProt登记号: H8GVA4)、D. peraridilitoris (WP_015234905.1)、D. swuensis (A0A0A7KKV6)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 67)和D. murrayi (WP_027461473.1)的ispF基因。优选地，ispF基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. phoenicis、D. apachensis、D. sp. 2009、D. wulumuqiensis、D. maricopensis、D. deserti、D. aquatilis、耐放射异常球菌、D. proteolyticus、D. gobiensis和D. peraridilitoris的ispF基因。更优选地，ispF基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ ID NO: 22或24的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
ispG基因可以是编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸合酶的任何基因，优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，ispG基因来自异常球菌细菌。具体而言，ispG基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 25)、D. yunweiensis (SEQ ID NO: 27)、D. apachensis (NCBI登记号: WP_019584739.1或WP_040382265.1)、D. phoenicis(EYB67750.1)、D. aquatilis (WP_019008200.1)、D. sp. 2009 (WP_022801633.1)、D. gobiensis (WP_014684632.1)、耐放射异常球菌(WP_010887031.1)、D. wulumuqiensis(WP_017871942.1)、D. deserti (WP_012693251.1)、D. proteolyticus (WP_013615171.1)、D. maricopensis (WP_013556907.1; EYB67750.1)、D. peraridilitoris(WP_015237094.1)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 69)和D. murrayi (WP_027460867.1)的ispG基因。优选地，ispG基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. apachensis、D. phoenicis、D. aquatilis、D. sp. 2009、D. gobiensis、耐放射异常球菌、D. wulumuqiensis、D. deserti、D. proteolyticus、D. maricopensis和D. peraridilitoris 的ispG基因。更优选地，ispG基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ ID NO: 26或28的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
ispH基因可以是编码4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶的任何基因、优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，ispH基因来自异常球菌细菌。具体而言，ispH基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 42)、D. yunweiensis (SEQ ID NO: 44)、D. phoenicis (NCBI登记号: EYB6823.1; WP_034356434.1)、D. apachensis (WP_019585890.1)、D. sp. 2009 (WP_022801928.1)、D. gobiensis (WP_014685178.1)、D. aquatilis (WP_019007893.1)、耐放射异常球菌(WP_10888795.1)、D. deserti (WP_012693059.1;GenBank: ACO45936.1)、D. peraridilitoris (WP_015236935.1)、D. proteolyticus (WP_013614360.1)、D. maricopensis (WP_013557691.1)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 71)和D. wulumuqiensis (WP_017869851.1)的ispH基因。优选地，ispH基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. apachensis、D. phoenicis、D. aquatilis、D. sp. 2009、D. gobiensis、耐放射异常球菌、D. wulumuqiensis、D. deserti、D. proteolyticus、D. maricopensis和D. peraridilitoris的ispH基因。更优选地，ispH基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ IDNO: 43或45的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
idi基因可以是编码异戊烯基-二磷酸δ-异构酶的任何基因、优选地细菌基因。在一个优选的实施方案中，idi基因来自异常球菌细菌。具体而言，idi基因可选自来自D. geothermalis (SEQ ID NO: 29)、D. yunweiensis (SEQ ID NO: 31)、D. apachensis(NCBI登记号: WP_019585561.1)、D. phoenicis (EYB67918.1)、D. aquatilis (WP_019010639.1或WP_040380849.1)、D. sp. 2009 (WP_022802239.1)、D. deserti (WP_012692934.1)、耐放射异常球菌(Q9RVE2.3)、D. maricopensis (WP_013556085.1) D. wulumuqiensis (WP_017870894.1)、D. gobiensis (WP_014685602.1或WP_043802116.1)、抗放射异常球菌(SEQ ID NO: 73)和D. peraridilitoris (WP_015236653.1)的idi基因。优选地，idi基因选自来自D. geothermalis、D. yunweiensis、D. apachensis、D. phoenicis、D. aquatilis、D. sp. 2009、D. gobiensis、耐放射异常球菌、D. wulumuqiensis、D. deserti、D. maricopensis和D. peraridilitoris的idi基因。更优选地，idi基因来自D. yunweiensis。可使用与由所述基因编码的任何多肽、优选地与SEQ IDNO: 30或32的多肽具有至少70、优选地80%、更优选地90%序列同一性的任何多肽(优选地来自异常球菌细菌)。
在一个优选的实施方案中，所述细菌过表达DXS和IDI编码基因。 优选地，过表达的DXS是下文描述的改进的DXS酶。
改进的MEP酶
本发明使用的dxs、drx、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi基因还可编码改进的酶，即与野生型酶的氨基酸序列相比在其序列中具有至少一个突变的酶，所述突变导致其活性增加。这样的改进的酶可按照技术人员已知的任何技术获得。特别是，改进的DXP合酶、更特别是改进的异常球菌DXP合酶，可按照专利申请WO 2012/052171中公开的技术获得。
因此，在一个实施方案中，重组异常球菌细菌包含编码改进的DXP合酶、优选地改进的异常球菌DXP合酶的dxs基因，其通过突变DXP合酶以获得在对应于SEQ ID NO: 52的位置222的位置上(或者在对应于SEQ ID NO: 4的位置216的位置上或在对应于SEQ ID NO: 2的位置219的位置上)的天冬酰胺和/或在对应于SEQ ID NO: 52的位置244的位置上(或者在对应于SEQ ID NO: 4的位置238的位置上或在对应于SEQ ID NO: 2的位置241的位置上)的半胱氨酸而实现。优选地，重组异常球菌细菌包含编码改进的DXP合酶的dxs基因，其通过突变DXP合酶以获得在对应于SEQ ID NO: 52的位置244的位置上(或者在对应于SEQ IDNO: 4的位置238的位置上或在对应于SEQ ID NO: 2的位置241的位置上)的半胱氨酸而实现。
鉴定对应于位置222或244的残基的方法是技术人员众所周知的，和详细描述于专利申请WO 2012/052171中。具体而言，这些残基可使用序列比对计算机程序例如ClustalW、MUSCLE或使用Needleman和Wunsch算法的程序鉴定。
在一个优选的实施方案中，重组异常球菌细菌包含编码来自抗放射异常球菌的改进的DXP合酶的基因，其具有以下置换：K222N (SEQ ID NO: 6)、R244C (SEQ ID NO: 8)或K222N/R244C (SEQ ID NO: 10)。编码这些酶的基因的序列分别在SEQ ID NO: 5、7和9中提供。更优选地，重组异常球菌细菌包含编码来自抗放射异常球菌的DXP合酶的R244C突变体(SEQ ID NO: 8)的基因。
在另一个优选的实施方案中，重组异常球菌细菌包含编码来自D. yunweiensis的改进的DXP合酶的基因，其具有以下置换：K216N (SEQ ID NO: 12)、R238C (SEQ ID NO:14)或K216N/R238C (SEQ ID NO: 16)。编码这些酶的基因的序列分别在SEQ ID NO: 11、13和15中提供。更优选地，重组异常球菌细菌包含编码来自D. yunweiensis的DXP合酶的R238C突变体(SEQ ID NO: 14)的基因。
在进一步优选的实施方案中，重组异常球菌细菌包含编码来自D. geothermalis的改进的DXP合酶的基因(SEQ ID NO: 2)，其具有以下置换：K219N (SEQ ID NO: 54)、R241C (SEQ ID NO: 56)或K219N/R241C (SEQ ID NO: 58)。更优选地，重组异常球菌细菌包含编码来自D. geothermalis的DXP合酶的R241C突变体的基因。
编码改进的DXP合酶的基因可在重组细菌中过表达。优选地，该基因在组成型或诱导型启动子的控制下，更优选地在强组成型启动子的控制下整合至细菌的基因组。该基因可替换内源的dxs基因或可整合至另一位置，以增加dxs基因的拷贝数。
因此，在另一方面，本发明还涉及包含改进的(或突变的) DXP合酶、优选地改进的异常球菌DXP合酶的重组异常球菌细菌，其包含在对应于SEQ ID NO:52的位置222的位置上的天冬酰胺和/或在对应于SEQ ID NO:52的位置244的位置上的半胱氨酸。优选地，重组异常球菌细菌包含改进的(或突变的) DXP合酶，其包含在对应于SEQ ID NO:52的位置244的位置上的半胱氨酸。相应的位置可通过技术人员使用总所周知的比对算法容易地鉴定。具体而言，改进的DXP合酶可以是上文公开的任何改进的DXS。
任选地，选自dxs、dxr、ispD、ispE、ispF、ispG、ispH和idi的至少一个基因被过表达。优选地，至少IDI编码基因被过表达。更优选地，至少一个dxs基因和一个idi基因被过表达。
本文描述的对于本发明的其它方面的所有实施方案也包括在本方面中。特别是，重组异常球菌细菌可进一步显示(i) 上文描述的增强的MEP途径，(ii) 异源的MEV途径，(iii) FPP合酶活性增加，(iv) 番茄烯β-环化酶的失活，和/或(v) 本文所述的异源的萜烯或异戊二烯合酶的表达。
异源的MEV途径
在另一方面，本发明的重组异常球菌细菌包含异源的MEV途径，即表达编码羟基甲基戊二酰基-CoA合酶(EC 2.3.3.10)、羟基甲基戊二酰基-CoA还原酶(NADPH) (EC 1.1.1.34)、甲羟戊酸激酶(EC 2.7.1.36)、磷酸甲羟戊酸激酶(EC 2.7.4.2)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(EC 4.1.1.33)的异源的基因。
优选地，异源的基因编码来自植物、细菌或酵母，更优选地来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酶。在一个具体的实施方案中，重组异常球菌细菌包含编码酿酒酵母羟基甲基戊二酰基-CoA合酶(Uniprot/Swissprot: P54839)、羟基甲基戊二酰基-CoA还原酶(NADPH) (Uniprot/Swissprot: P12683)、甲羟戊酸激酶(Genbank: NP_013935.1)、磷酸甲羟戊酸激酶(Genbank: NP_013947.1)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(Genbank: CAA66158.1)的基因。
异常球菌细菌显示内源的乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶活性。然而，在一些实施方案中，重组异常球菌细菌可进一步包含编码乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶的异源的基因。该基因可替换内源基因或可整合至另一位置，以增加该基因的拷贝数。该异源的基因可来自植物、细菌或酵母。在一个优选的实施方案中，重组异常球菌细菌进一步包含编码酿酒酵母乙酰基-CoA C-乙酰基转移酶(Genbank: NP_015297.1)的基因。
本文描述的对于本发明的其它方面的所有实施方案也包括在本方面中。特别是，重组异常球菌细菌可进一步显示(i) 上文描述的增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，(ii) FPP合酶活性增加，(iii) 番茄烯β-环化酶的失活和/或(iv) 本文描述的异源的萜烯或异戊二烯合酶的表达。
异源的萜烯合酶
本申请还证实了异常球菌细菌，特别是上文描述的重组异常球菌细菌，通过异源的萜烯合酶的表达可有效用于产生异源的类异戊二烯化合物。因此，在进一步的方面，本发明涉及包含编码异源的萜烯合酶的基因的重组异常球菌细菌。
本文描述的对于本发明的其它方面的所有实施方案也包括在本方面中。特别是，重组异常球菌细菌可进一步显示(i) 上文描述的增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，(ii) 异源的MEV途径，(iii) FPP合酶活性的增加，(iv) 番茄烯β-环化酶的失活，和/或(v) 本文描述的异源的异戊二烯合酶的表达。
优选地，异源的萜烯合酶选自单萜烯合酶、二萜烯合酶、三萜烯合酶和倍半萜烯合酶，更优选地选自单萜烯和倍半萜烯合酶。重组异常球菌细菌可表达一种或数种异源的萜烯合酶，特别是一种或数种单萜烯合酶和/或一种或数种倍半萜烯合酶。
各异源的萜烯合酶优选地自上文描述的表达盒表达，其包含编码所述酶的基因并整合至细菌的基因组。优选地，基因在组成型启动子、更优选地强组成型启动子的控制下。
异源的单萜烯合酶
在一个具体的实施方案中，本发明的重组细菌是通过异源的单萜烯合酶的表达经修饰以产生单萜烯或单类萜烯的异常球菌细菌。可在本发明的重组异常球菌细菌中表达的单萜烯合酶的实例包括但不限于，香叶醇合酶(EC 3.1.7.3)、芳樟醇合酶例如3S-芳樟醇合酶(EC 4.2.3.25)和R-芳樟醇合酶(EC 4.2.3.26)、1,8-桉叶素合酶(EC 4.2.3.108)、香叶烯合酶(EC 4.2.3.15)、4S-柠檬烯合酶(EC 4.2.3.16)、R-柠檬烯合酶(EC 4.2.3.20)、α-蒎烯合酶(EC 4.2.3.119)、β-蒎烯合酶(EC 4.2.3.120)、(-)-内-葑醇合酶(EC 4.2.3.10)和(-)-α-萜品醇合酶(EC 4.2.3.111)和其任何组合。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的香叶醇合酶，即催化自香叶基二磷酸形成香叶醇的酶的基因。异源的香叶醇合酶的实例包括但不限于，来自罗勒(SEQ ID NO: 49; GenBank登记号: AAR11765；Zhou等2013; Liu等2013; Lijima等2004)、缬草(Valeriana officinalis) (AHE41084；Dong等2013)、Lippia dulcis (Dong等2013)、Perilla citriodora (AAY88965 ; Sugiura等2011)、紫苏(ABB30218 ; Sharkey等2005)、Perilla setoyensis (ACN42010.1)、Cinnamomum tenuipilum (CAD29734)、Phyla dulcis(ADK62524.1)、油橄榄(Olea europaea) (AFI47926.1)、葡萄(Vitis vinifera)(ADR74217)、鹰嘴豆 (XP_004487383.1)、Picrorhiza kurrooa (AHX97739.1)、Citrus jambhiri (BAM29049.1)、Cinnamomum tenuipile (CAD29734.2; Yang等2005)和长春花(Catharanthus roseus) (AFD64744.1)的香叶醇合酶。可使用显示香叶醇合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的香叶醇合酶选自来自罗勒、缬草、Phyla dulcis、油橄榄、葡萄、鹰嘴豆和长春花的香叶醇合酶。更优选地，异源的香叶醇合酶是罗勒(SEQ ID NO: 49)、鹰嘴豆或Phyla dulcis的香叶醇合酶。甚至更优选地，香叶醇合酶是罗勒的香叶醇合酶。编码该香叶醇合酶的基因的核苷酸序列可以是SEQ ID NO: 48所示的序列。
任选地，包含编码异源的香叶醇合酶的基因的重组细菌进一步包含催化香叶醇还原为香茅醇(EC 1.6.99.1)的香叶醇还原酶。异源的香叶醇还原酶的实例包括但不限于，来自酿酒酵母的老黄酶2 (OYE2) (Q03558.3)和来自植物橡胶树(Hevea brasiliensis)的同源物，一种12-氧代植二烯酸还原酶(OPR)，HbOPR (DQ004685.1)。
在另一实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的芳樟醇合酶的基因。芳樟醇合酶可以是3S-芳樟醇合酶，即催化自香叶基二磷酸形成S-芳樟醇的酶，或R-芳樟醇合酶，即催化自香叶基二磷酸形成R-芳樟醇的酶。异源的芳樟醇合酶的实例包括但不限于，来自带小棒链霉菌(Nakano等2011)、LemonMyrtle (Sugiura等2011)、Perillacitriodora(GenBank登记号 AHY39266.1; Sugiura等2011)、Myzuscitrate (Sugiura等2011)、Clarkiabreweri (AAD19838; AAD19840; AAC49395；Rico等2010; Herreo等2008;Dudareva等1996; Pichersky等1995)、Clarkiaconcinna (AAD19839)、薰衣草(Lavandula angustivolia) (ABB73045.1; Landmann等2007)、葡萄 (Martin等2010)、Arabidopsis lyrata亚种lyrata (EFH62782.1; XP_002886523.1)、水稻(Oryza sativa) (EU596453)、Cereus peruvianus (Sitrit等2004)、Mentha citrata (AAL99381; Crowell等2002)、黄 花蒿(Artemisia annua) (AAF13357; AAF13356; Jia等1999)、罗勒(AAV63789; Lijima等2004)、拟南芥(Arabidopsis thaliana) (AAO85533; Chen等2003)、Fragaria ananassa(CAD57081; CAD57106; Aharoni等2004)、Medicago truncatula (XP_003593502.1)、Antirrhinum majus (ABR24418)、番茄(Lycopersicon esculentum) (AAX69063)、挪威云 杉(Picea abies) (AAS47693)、Perilla frutescens var. hirtella (ACN42011;Masumoto等2010)、芫荽(Coriandrum sativum) (AHC54051; Galata等2014)、Cinnamomum osmophloeum (AFQ20812.1)、可可树(Theobroma cacao) (EOY20311.1)、Morus notabilis (EXC23176.1)和咖啡树(Coffea Arabica) (Del Terra等2013)的芳樟醇合酶。可使用显示芳樟醇合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的芳樟醇合酶选自来自Clarkiaconcinna、Medicago truncatula、Perilla frutescens var. hirtella、芫荽、薰衣草、Clarkiabreweri、Cinnamomum osmophloeum、可 可树、Morus notabilis和咖啡树的芳樟醇合酶。更优选地，异源的芳樟醇合酶是紫苏或 Clarkiabreweri的芳樟醇合酶，甚至更优选地是紫苏的芳樟醇合酶。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的香叶烯合酶，即催化自香叶基二磷酸形成香叶烯的酶的基因。异源的香叶烯合酶的实例包括但不限于，来自Abies grandis (GenBank登记号: AAB71084)、Antirrhinum majus (AAO41727; AAO41726)、拟南 芥 (NP_189209; AAG09310)、番茄 (AAX69064)、罗勒(AAV63791)、紫苏 (AAF76186)、挪威 云杉(AAS47696)、Morus notabilis (EXB97316.1)、Medicago truncatula (AES67305.1)和Quercus ilex (CAC41012)的香叶烯合酶。可使用显示香叶烯合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的芳樟醇合酶选自来自Abies grandis、Picea abies、Morus notabilis和Medicago truncatula的香叶烯合酶。
在另一实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的柠檬烯合酶的基因。柠檬烯合酶可以是4S-柠檬烯合酶，即催化自香叶基二磷酸形成(-)-S-柠檬烯的酶，或R-柠檬烯合酶，即催化自香叶基二磷酸形成(+)-R-柠檬烯的酶。异源的柠檬烯合酶的实例包括但不限于，来自绿薄荷(Mentha spicata) (GenBank登记号: AAC37366)、Menthalongifolia(AAD50304.1)、Abies grandis (AAB70907; AAF61455)、藿香(Agastache rugosa)(AAL17636)、大麻(Cannabis sativa) (ABI21837)、柠檬(Citrus limon) (AAM53944;AAM53946)、Citrus unshiu (BAD27256; BAD27257)、薰衣草 (ABB73044)、紫苏(AAG31438)、挪威云杉(AAS47694)、Picea sitchensis (ABA86248)和Schizonepeta tenuifolia (AAG01140)的柠檬烯合酶。可使用显示柠檬烯合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的柠檬烯合酶来自绿薄荷或Menthalongifolia、优选地Menthalongifolia。
在另一实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的桉叶素合酶的基因。异源的桉叶素合酶的实例包括但不限于，来自带小棒链霉菌(GenBank: EDY47508.1; Nakano等2011)、Solanum lycopersicum (GenBank: AEM05857.1)、Rosmarinus officinalis(GenBank: AFZ41794.1)、Salvia fruticosa (ABH07677.1)和拟南芥(AEE77075.1;AEE77074.1)的桉叶素合酶。可使用显示桉油酚合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的桉油酚合酶来自带小棒链霉菌。
任选地，包含异源的柠檬烯合酶的本发明的重组细菌可进一步包含属于以下途径的一种或数种另外的酶：转化(i) S-柠檬烯为(-)-香芹酮；(ii) S-柠檬烯为薄荷酮、薄荷醇、新薄荷醇或异薄荷酮；或(iii) R-柠檬烯为(+)香芹酮。因此，在一个具体的实施方案中，重组异常球菌细菌表达异源的柠檬烯合酶和一种或数种另外的异源的酶，其选自(i)(S)-柠檬烯6-单加氧酶(EC 1.14.13.48)和香苇醇脱氢酶(EC1.1.1.243)；(ii) (S)-柠檬烯3-单加氧酶(EC1.14.13.47)、异胡椒烯醇脱氢酶(EC 1.1.1.223)、(-)-异胡椒烯酮还原酶(EC1.3.1.82)、(+)-顺式-异胡薄荷酮异构酶、(+)-胡薄荷酮还原酶(EC 1.3.1.81)、(-)-薄荷醇脱氢酶(EC 1.1.1.207)和(+)-新薄荷醇脱氢酶(EC 1.1.1.208)；和(iii) (R)-柠檬烯6-单加氧酶(EC 1.14.13.80)和(+)-反式-香苇醇脱氢酶(EC 1.1.1.243)。
在另一实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的蒎烯合酶的基因。蒎烯合酶可以是α-蒎烯合酶，即催化自香叶基二磷酸形成α-蒎烯的酶，或β-蒎烯合酶，即催化自香叶基二磷酸形成β-蒎烯的酶。异源的蒎烯合酶的实例包括但不限于，来自Abies grandis(GenBank登记号: AAB71085)、黄花蒿 (AAK58723)、大麻 (ABI21838)、柠檬(AAM53945)、Citrus unshiu (BAD27260)、Fragaria vesca (CAD57092)、挪威云杉(AAS47692)、Picea sitchensis (AAP72020)和Pseudotsuga menziesii (AAX07267)的蒎烯合酶。可使用显示蒎烯合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的蒎烯合酶来自黄花蒿。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的(-)-内-葑醇合酶，即催化自香叶基二磷酸形成葑醇的酶的基因。异源的(-)-内-葑醇合酶的实例包括但不限于，来自罗勒(GenBank登记号: AAV63790)的(-)-内-葑醇合酶。可使用显示内-葑醇合酶活性并与该酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的该酶的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的(-)-α-萜品醇合酶，即催化自香叶基二磷酸形成α-萜品醇的酶的基因。异源的(-)-α-萜品醇合酶的实例包括但不限于，来自葡萄 (GenBank登记号: AAS79351; AAS79352)、玉米(Zea mays) (AAL59230;ABR09292)、Santalum album (ACF24767)、Pinus tadea (AAO61227)和Magnolia grandiflora (ACC66282)的(-)-α-萜品醇合酶。可使用显示α-萜品醇合酶活性并与该酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的该酶的变体。在一个具体的实施方案中，(-)-α-萜品醇合酶来自葡萄。
异源的倍半萜烯合酶
在另一实施方案中，本发明的重组细菌是通过异源的倍半萜烯合酶的表达经修饰以产生倍半类萜烯的异常球菌细菌。可在本发明的重组异常球菌细菌中表达的倍半萜烯合酶的实例包括但不限于，(+)-表-α-红没药醇合酶(EC 4.2.3.138)、吉玛烯A合酶(EC4.2.3.23)、(E,E)-吉玛烯B合酶(EC 4.2.3.71)、吉玛烯C合酶(EC 4.2.3.60)、(-)-吉玛烯D合酶(EC 4.2.3.75)、瓦伦烯合酶(EC 4.2.3.73)、(3S、6E)-橙花叔醇合酶(EC 4.2.3.48)、表-雪松醇合酶(EC 4.2.3.39)、绿叶醇合酶(EC 4.2.3.70)、檀香萜合酶(EC 4.2.3.50)和δ-杜松烯合酶(EC 4.2.3.13)。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的(+)-表-α-红没药醇合酶，即催化自(2E,6E)-法呢基二磷酸形成(+)-表-α-红没药醇的酶的基因。(+)-表-α-红没药醇合酶的实例包括但不限于，来自桔色链霉菌(GenBank登记号: BAL14867.1; Nakano等2011)和Phyla dulcis (Attia等2012)的(+)-表-α-红没药醇合酶。可使用显示(+)-表-α-红没药醇合酶活性并与该酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的该酶的变体。在一个具体的实施方案中，(+)-表-α-红没药醇合酶来自桔色链霉菌。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的吉玛烯A合酶，即催化法呢基二磷酸(FPP)环化为倍半萜烯吉玛烯A的酶的基因。异源的吉玛烯A合酶的实例包括但不限于，来自黄花蒿 (GenBank登记号: ABE03980)、Cichorium intybus (AAM21658;AAM21659)、Ixeris dentate (AAL92481)、lactuca sativa (AAM11626); AAM11627)、Pogostemon cablin (AAS86321)和Solidago Canadensis (CAC36896)的吉玛烯A合酶。可使用显示吉玛烯A合酶活性并与该酶具有至少80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的该酶的变体。在一个具体的实施方案中，吉玛烯A合酶选自黄花蒿和Solidago Canadensis。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的吉玛烯B合酶，即催化法呢基二磷酸(FPP)环化为倍半萜烯吉玛烯B的酶的基因。异源的吉玛烯B合酶的实例包括但不限于，来自Lycopersicon hirsutum (GenBank登记号: AAG41891)的吉玛烯B合酶。可使用显示吉玛烯B合酶活性并与该酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的该酶的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的吉玛烯C合酶，即催化法呢基二磷酸(FPP)环化为倍半萜烯吉玛烯C的酶的基因。异源的吉玛烯C合酶的实例包括但不限于，来自番茄 (GenBank登记号: AAC39432)的吉玛烯C合酶。可使用显示吉玛烯B合酶活性并与该酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的该酶的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的吉玛烯D合酶，即催化法呢基二磷酸(FPP)环化为倍半萜烯吉玛烯D的酶的基因。异源的吉玛烯D合酶的实例包括但不限于，来自Lycopersicon hirsutum (GenBank登记号: AAG41892)、罗勒(AAV63786)、Pogostemon cablin (AAS86320、AAS86322)、Populus trichocarpa x Populus deltoides(AAR99061)、Solidago Canadensis (AAR31144，AAR31145)、葡萄 (AAS66357)和姜(Zingiber officinale) (AAX40665)的吉玛烯D合酶。可使用显示吉玛烯D合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的瓦伦烯合酶，即催化自法呢基二磷酸(FPP)形成瓦伦烯的酶的基因。异源的瓦伦烯合酶的实例包括但不限于，来自葡 萄 (UniProt登记号 Q6Q3H2)和甜橙(Citrus sinensis) (Q71MJ3)的瓦伦烯合酶。可使用显示瓦伦烯合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的绿叶醇合酶，即催化自法呢基二磷酸(FPP)形成绿叶醇的酶的基因。异源的绿叶醇合酶的实例包括但不限于，来自Pogostemon cablin (UniProt登记号 Q49SP3)的绿叶醇合酶，其产生另外的倍半萜烯产物，包括α-和β-绿叶烯、α-布藜烯、塞瑟尔烯、刺蕊草醇和α-愈创木烯(guiaene)。可使用显示绿叶醇合酶活性并与该酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的表-雪松醇合酶，即催化自法呢基二磷酸或香叶基二磷酸形成8-表-雪松醇的酶的基因。异源的表-雪松醇合酶的实例包括但不限于，来自黄花蒿(Genbank登记号: AAF80333、CAC08805)的表-雪松醇合酶。可使用显示表-雪松醇合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的(3S、6E)-橙花叔醇合酶，即转化法呢基二磷酸为橙花叔醇的酶的基因。异源的橙花叔醇合酶的实例包括但不限于，来自Selaginella moellendorffii (Uniprot登记号D8RNZ9)、Populus trichocarpa(F8TWD1)、Medicago truncatula (Q5UB06)、Fragaria x ananassa (P0CV94)和玉米(Zea mays) (Degenhardt和Gershenzon，2000)的橙花叔醇合酶。可使用显示橙花叔醇合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的橙花叔醇合酶选自Fragaria x ananassa。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码异源的檀香萜合酶，即催化自法呢基二磷酸形成α-檀香萜、β-檀香萜、表-β-檀香萜、内-β-佛手柑油烯和/或外-α-佛手柑油烯的酶的基因。异源的檀香萜合酶的实例包括但不限于，来自Solanum habrochaites (Uniprot: B8XA41)、Santalum spicatum (Uniprot: E3W202)、Santalum austrocaledonicum (Uniprot: E3W203)、Santalum spicatum (Uniprot: E3W204)的檀香萜合酶。可使用显示檀香萜合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。
在一个实施方案中，本发明的重组细菌包含编码δ-杜松烯合酶，即催化反式,反式-法呢基二磷酸(FPP)环化为(+)-δ杜松烯的酶的基因。异源的δ-杜松烯合酶的实例包括但不限于，来自Gossypium hirsutum (GenBank登记号: AAF74977，AAC12784)、Gossypium arboretum (GenBank登记号 CAA65289，Uniprot Q39761)和Helianthus annuus (Q4U3F6)的δ-杜松烯合酶。可使用显示δ-杜松烯合酶活性并与任何这些酶具有至少70%、80%、优选地90%序列同一性的任何多肽，特别是具有增加的催化活性、底物特异性和/或稳定性的这些酶的变体。在一个具体的实施方案中，异源的δ-杜松烯合酶选自Gossypium arboretum。
异源的异戊二烯合酶
在另一方面，本发明还涉及包含编码异源的异戊二烯合酶的基因的重组异常球菌细菌。
本文描述的对于本发明的其它方面的所有实施方案也包括在本方面中。特别是，重组异常球菌细菌可进一步显示(i) 上文描述的增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，(ii) 异源的MEV途径，(iii) FPP合酶活性增加，(iv) 番茄烯β-环化酶的失活，和/或(v) 本文描述的异源的萜烯合酶的表达。
在一个优选的实施方案中，包含编码异源的异戊二烯合酶的基因的重组异常球菌细菌过表达选自dxs、dxr、ispD、ispE、ispF和ispG的至少一个基因，优选地过表达dxs、dxr、 ispD、ispE、ispF和ispG基因。
异源的异戊二烯合酶可以是催化自二甲基烯丙基二磷酸形成异戊二烯的任何酶。异戊二烯合酶的实例包括但不限于，来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) (Hess等2013)、白杨(Populus alba) (Lv等 2013; Yang等 2012; Uniprot: Q50L36)、山杨(Populus tremuloides)(Uniprot: Q7XAS7)、Pueraria montana (Whited等2010; Miller等2001; Sharkey等2005)和欧洲栎(Quercus robur) (Lehning等1999)的异戊二烯合酶。
法呢基二磷酸合酶
此外，本发明人证实，在异常球菌细菌中生产类异戊二烯可经控制以促进目的化合物的生产和/或积聚。在该方面，发明人鉴定了显示法呢基二磷酸合酶活性(EC 2.5.1.10)、二甲基烯丙基转移酶活性(EC 2.5.1.1)和香叶基香叶基二磷酸合酶活性(EC 2.5.1.29)的Deinococcus geothermalis的酶，并观察到该酶的过表达促进具有超过10个C原子的类异戊二烯，例如二萜烯、三萜烯、倍半萜烯和类胡萝卜素的生产，对单萜烯不利。
因此，在进一步的方面，本发明涉及具有法呢基二磷酸合酶活性的分离的多肽，所述多肽选自
a) 包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的全部或活性部分的多肽；
b) 具有与SEQ ID NO: 47具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性、优选地与SEQ ID NO: 47具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽；
c) 由与SEQ ID NO: 46具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性、优选地与SEQ ID NO: 46具有至少70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的核苷酸序列编码的多肽；或
d) 由能够在中度/高度严格性、优选地高度或极高度严格性条件下与(i) SEQ ID NO:46所示的核酸序列、(ii) 其互补链或(iii) (i)或(ii)的子序列杂交的核酸序列编码的多肽。
优选地，本发明的多肽进一步显示二甲基烯丙基转移酶(EC 2.5.1.1)和/或香叶基香叶基二磷酸合酶(EC 2.5.1.29)活性，更优选地二甲基烯丙基转移酶和香叶基香叶基二磷酸合酶活性。
用于测定核苷酸探针与同源的DNA或RNA序列之间杂交的合适实验条件包括在5×SSC (氯化钠/柠檬酸钠)中预浸泡包含待杂交的DNA片段或RNA的滤膜10分钟，和在5×SSC、5×Denhardt's溶液、0.5% SDS和100 μg/ml的变性超声处理的鲑鱼精DNA溶液中将滤膜预杂交，接着在约45°C在包含10 ng/ml浓度的随机引发的32P-dCTP-标记的(比活>1×109cpm/μg)探针的相同溶液中杂交12小时(Feinberg和Vogelstein，1983)。对于各种严格性条件，然后在2×SSC、0.5% SDS和至少55° C下(低严格性)，更优选地至少60° C (中度严格性)、还更优选地至少65° C (中度/高度严格性)、甚至更优选地至少70° C (高度严格性)和甚至更优选地至少75° C (极高度严格性)，将滤膜洗涤两次达30分钟。
本发明还涉及编码本发明的多肽的核酸。所述核酸可以是DNA (cDNA或gDNA)、RNA或两者的混合物。其可以呈单链形式，或呈双链形式或两者的混合物。其可包含修饰的核苷酸，其包含例如修饰的键、修饰的嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的糖。其可通过本领域技术人员已知的任何方法制备，包括化学合成、重组和诱变。本发明的核酸可根据本发明的多肽的序列而推知，并且根据核酸应在其中转录的宿主细胞可改变密码子使用。这些步骤可按照本领域技术人员众所周知的方法进行，和其中的一些方法描述于参考手册Sambrook等(Sambrook等2001)。
本发明还涉及包含编码本发明的多肽的核酸的表达盒，所述核酸与一个或多个控制序列可操作连接，所述控制序列指导所述核酸在合适的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下表达。
控制序列可包括被宿主细胞识别的启动子。启动子包含转录控制序列，其介导酶的表达。启动子可以是在异常球菌细菌中显示转录活性的任何多核苷酸，特别是野生型、突变的、简并的或合成的启动子。启动子可以是天然的、同源的或异源的启动子。优选的启动子是天然的或同源的。在该方面，各种启动子已经在异常球菌细菌中研究和用于基因表达。合适的启动子的实例包括来自翻译延伸因子Tu基因tufA (DR0309)和tufB (DR2050)的PtufA和PtufB启动子、位于pI3中的resU基因的启动子、groESL操纵子的启动子区PgroESL(Lecointe等2004; Meima等2001)，或所述启动子的衍生物。
控制序列还可以是转录终止子，其被异常球菌细菌识别以终止转录。终止子与基因的3'-端可操作连接。在异常球菌细菌中有功能的任何终止子可用于本发明(Lecointe等2004)。
任选地，表达盒还可包含允许容易筛选重组细菌的可选择标记。通常，可选择标记是编码抗生素抗性或赋予自养作用的基因。
本发明还涉及包含本发明的核酸或表达盒的表达载体。所述表达载体可用于转化宿主细胞，优选地异常球菌宿主细胞，并且使得能够在所述细胞中表达本发明的核酸。载体的选择通常取决于载体与载体将引入的宿主细胞的相容性。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可包含用于确保自我复制的任何工具。或者，载体可以是当引入宿主细胞时整合至基因组并与其所整合的染色体一起复制的载体。
载体优选地包含一个或多个可选择标记，其允许容易筛选包含所述载体的宿主细胞。可选择标记是其产物提供杀菌或病毒抗性、重金属抗性、原养型至营养缺陷型等的基因。
载体优选地包含允许将载体整合至宿主细胞的基因组或载体在细胞中不依赖于基因组而自主复制的元件。当至宿主细胞基因组的整合发生时，将序列整合至基因组可依赖于同源的或非-同源的重组。在一个方面，载体可包含用于指导在精确的位置上同源重组整合至宿主细胞的基因组的另外的多核苷酸。这些另外的多核苷酸可以是与在宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。另一方面，载体可以通过非-同源重组整合至宿主细胞的基因组。
对于自主复制，载体可进一步包含使载体能够在目的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中发挥功能的介导自主复制的任何质粒复制因子。术语"复制起点"或"质粒复制因子"意指使质粒或载体能够体内复制的多核苷酸。
按照需要在其中表达的宿主细胞选择这些元件的方法是本领域技术人员众所周知的。载体可通过本领域技术人员众所周知的经典分子生物学技术构建。
本发明进一步涉及本发明的核酸、表达盒或表达载体在转化、转染或转导细胞、优选地异常球菌细菌中的用途。本发明还涉及包含本发明的核酸、表达盒或表达载体的宿主细胞，优选地异常球菌细菌。
宿主细胞可以瞬时或稳定的方式转化、转染或转导。本发明的表达盒或载体引入至宿主细胞，使得表达盒或载体作为染色体整合体或作为之前所述的自主复制的染色体外载体保持。术语"宿主细胞"还包括亲本宿主细胞的任何子代，其由于在复制期间发生的突变而与亲本宿主细胞不相同。
本发明的核酸、表达盒或表达载体可通过本领域技术人员已知的任何方法引入至宿主细胞，所述方法例如电穿孔、接合、转导、感受态细胞转化、原生质体转化、原生质体融合、生物弹道"基因枪"转化、PEG-介导的转化、脂质-辅助的转化或转染、化学介导的转染、醋酸锂介导的转化、脂质体介导的转化。
任选地，超过1个拷贝的本发明的核酸、表达盒或载体可插入至宿主细胞。
如上所述，本发明人观察到FPP合酶的过表达促进具有超过10个C原子的类异戊二烯的生产，例如二萜烯、三萜烯、倍半萜烯和类胡萝卜素，不利于单萜烯。
因此，本发明还涉及其中FPP合酶活性增加的重组异常球菌细菌。优选地，FPP合酶活性通过天然的、同源的或异源的编码FPP合酶的基因、即ispA基因的过表达而增加。基因过表达可如上所述获得。
过表达的FPP合酶可以是任何异源的FPP合酶。异源的FPP合酶的实例包括但不限于，来自酿酒酵母(Uniprot Q12051)或来自大肠杆菌(Uniprot P22939)的FPP合酶。在一个具体的实施方案中，本发明的重组细菌表达来自大肠杆菌的FPP合酶。
在一个优选的实施方案中，过表达的FPP合酶来自异常球菌细菌。特别是，过表达的FPP合酶是上文所述和具有法呢基二磷酸合酶活性，优选地法呢基二磷酸合酶、二甲基烯丙基转移酶和香叶基香叶基二磷酸合酶活性的本发明的多肽。优选地，过表达的FPP合酶是来自D. geothermalis的FPP合酶，特别是具有SEQ ID NO: 47所示的氨基酸序列的全部或部分的FPP合酶。
或者，法呢基二磷酸合酶、二甲基烯丙基转移酶和香叶基香叶基二磷酸合酶活性可通过分开的多肽实现，和增加的活性可起因于分开的编码基因的过表达。
本发明人还表明，SEQ ID NO: 47所示的FPP合酶中置换K170G诱导重新定向碳流至GPP，因此至单萜烯的生产。事实上，FPPS中的K170G突变允许GPP释放，用于单萜烯生物合成(Blanchard和Karst，1993; Fischer等2011)。因此，当需要单萜烯例如香叶醇的生产时，内源的FPP合酶可被K170G突变体替换。在本文件中，以下术语用于命名置换：K170G表示SEQID NO: 47的位置170的氨基酸残基(赖氨酸，K)改变为甘氨酸(G)。
因此，本发明还涉及其中对应于SEQ ID NO: 47的位置170的位置的赖氨酸残基被甘氨酸置换(技术人员使用众所周知的比对算法可容易地鉴定相应的位置)的本发明的多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述核酸的表达盒或载体和表达所述突变的FPP合酶的重组异常球菌细菌。优选地，所述重组细菌还表达异源的萜烯合酶，优选地单萜烯合酶。该重组优选地用于生产单萜烯。
本文描述的对于本发明的其它方面的所有实施方案也包括在本方面中。特别是，重组异常球菌细菌可进一步显示(i) 上文所述的增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶；(ii) 异源的MEV途径；(iii) 番茄烯β-环化酶的失活；和/或(iv) 本文描述的异源的萜烯或异戊二烯合酶的表达。
内源的番茄烯β-环化酶的失活
本发明人还表明，内源的番茄烯β-环化酶的失活诱导番茄烯的过表达/积聚。
因此，在另一方面，本发明涉及其中内源的番茄烯β-环化酶活性被降低或抑制的重组异常球菌细菌。
番茄烯β-环化酶(EC 5.5.1.19)催化自番茄烯通过中间体γ-胡萝卜素至β-胡萝卜素的反应。番茄烯β-环化酶的实例包括但不限于，具有SEQ ID NO 51所示氨基酸序列的D. geothermalis的番茄烯β-环化酶、D. phoenicis (Genbank登记号: EYB66908)、D. apachensis (WP_019585057)、D. aquatilis (WP_019008078)、D. gobiensis (WP_014685779)、D. wulumuqiensis (WP_017870547)、D. maricopensis (WP_013556733)和耐放射异常球菌(WP_010887447)的番茄烯β-环化酶。
编码番茄烯β-环化酶的基因还可根据与编码D. geothermalis的番茄烯β-环化酶的核酸(SEQ ID NO: 50)的同源性容易地鉴定。
番茄烯β-环化酶活性可使用技术人员已知的任何方法而被降低或抑制。优选地，编码番茄烯β-环化酶的基因通过技术人员已知的任何方法而失活，例如通过缺失全部或部分的该基因，通过引入诱导移码的无义密码子、表达盒、基因或突变。在一个优选的实施方案中，编码番茄烯β-环化酶的基因被缺失。
在一个具体的实施方案中，编码八氢番茄红素合酶(EC 2.5.1.32)和八氢番茄红素去饱和酶(EC 1.3.99.28)的基因被过表达，以增加番茄烯生产。基因可以是天然的、同源的或异源的基因，优选地天然的或同源的基因。
在另一个具体的实施方案中，具有降低的或抑制的番茄烯β-环化酶活性并任选地过表达编码八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的基因的重组细菌进一步包含编码异源的催化自番茄烯形成脱辅基类胡萝卜素的类胡萝卜素裂解加双氧酶(CCD)的基因。
在另一个具体的实施方案中，具有降低的或抑制的番茄烯β-环化酶活性并任选地过表达编码八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的基因的重组细菌进一步包含编码异源的催化自番茄烯形成δ-胡萝卜素的番茄烯ε环化酶(EC 5.5.1.18)的基因，和任选地编码异源的催化自δ-胡萝卜素形成脱辅基类胡萝卜素的类胡萝卜素裂解加双氧酶(CCD)的基因。
类胡萝卜素裂解加双氧酶包括但不限于，公开于Auldridge等(2006)的论文的CCD，例如来自拟南芥、Rubus idaeus和玉米(Zea mais)的CCD。
本文描述的对于本发明的其它方面的所有实施方案也包括在本方面中。特别是，重组异常球菌细菌可进一步显示(i) FPP合酶活性的增加和(ii) 如上所述的增强的MEP途径，任选地具有如上所述的改进的DXP合酶；(iii) 异源的MEV途径和/或(iv) 如上所述的异源的萜烯或异戊二烯合酶的表达。
生产类异戊二烯化合物的方法
在进一步的方面，本发明涉及上文所述的重组异常球菌细菌用于生产萜烯或类萜烯化合物的用途。本发明还涉及生产萜烯或类萜烯的方法，包括(i) 在适合于生产萜烯或类萜烯的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌；和任选地(ii) 回收萜烯或类萜烯。
萜烯或类萜烯化合物可以是由上文所述的重组异常球菌细菌生产的任何萜烯或类萜烯化合物。
在一个实施方案中，本发明的重组异常球菌细菌用于生产具有超过10个C原子的类异戊二烯，例如类胡萝卜素化合物(C40)。具体而言，本发明涉及生产类胡萝卜素化合物的方法，包括(i) 在适合于生产类胡萝卜素化合物的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌；和任选地(ii) 回收类胡萝卜素化合物。类胡萝卜素化合物可以是番茄烯或自番茄烯衍生的任何其它类胡萝卜素化合物，优选地deinoxanthine。在一个具体的实施方案中，重组异常球菌细菌过表达FPP合酶，优选地异常球菌FPP合酶和更优选地上文描述的本发明的FPP合酶。
在一个实施方案中，重组异常球菌细菌包含上文描述的异源的萜烯合酶，和可生产选自以下的萜烯或类萜烯化合物：香叶醇、(+)-芳樟醇、(-)-芳樟醇、S-柠檬烯、R-柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、葑醇、萜品醇、(-)-香芹酮、(+)-(S)-香芹酮、薄荷酮、异薄荷酮、薄荷醇、新薄荷醇、(S,E)-橙花叔醇、8-表-雪松醇、红没药醇、吉玛烯A、吉玛烯B、吉玛烯C、吉玛烯D、瓦伦烯、绿叶醇、檀香萜和δ-杜松烯。
所述方法可进一步包括转化萜烯或类萜烯为萜烯衍生物，例如获自香叶烯的香叶烯醇和二氢香叶烯基乙酸酯；获自葑醇的葑基和冰片衍生物；获自瓦伦烯或(-)-β-蒎烯的努特卡酮；获自芳樟醇的沉香基和熏衣草基酯，例如沉香基甲酸酯、沉香基乙酸酯、沉香基丙酸酯、沉香基丁酸酯、沉香基异丁酸酯和熏衣草基乙酸酯；获自香茅醇的香茅基和二氢香叶烯基酯，例如香茅基甲酸酯、香茅基乙酸酯、香茅基丙酸酯、香茅基异丁酸酯、香茅基异戊酸酯、香茅基惕各酸酯、香茅酸腈(或香茅腈)；获自香叶醇的香叶基酯，例如香叶基甲酸酯、香叶基乙酸酯、香叶基丙酸酯、异丁酸香叶基酯、橙花基乙酸酯、甲基香叶酸酯(或香叶酸甲基酯)和香叶酸腈(或香叶腈)。优选地，萜烯衍生物是萜烯酯，更优选地是香叶基酯。
用于自萜烯或类萜烯获得萜烯衍生物的方法是技术人员众所周知的。例如，这样的方法公开于Common Fragrance and Flavor Materials: Preparation, Propertiesand Uses, 第5版. H. Surburg和J. Panten，John Wiley & Sons，2006。
适合于生产萜烯或类萜烯的条件可由技术人员根据用于本发明的异常球菌细菌容易地确定。具体而言，碳源可选自C5糖，例如木糖和阿拉伯糖；C6糖例如葡萄糖、纤维二糖、蔗糖和淀粉。当异常球菌细菌显示纤维素水解或木聚糖水解活性时，可使用更复杂的碳源，例如纤维素或木质素纤维素生物质。温度条件也可根据嗜温或嗜热异常球菌细菌的使用而改变。
在另一方面，本发明还涉及生产萜烯衍生物、特别是上文所述的萜烯衍生物的方法，包括(i) 在适合于生产萜烯或类萜烯的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，和任选地回收所述萜烯或类萜烯；和(iii) 转化所述萜烯或类萜烯为萜烯衍生物；和任选地(iv) 回收萜烯衍生物。步骤(iii)可以是化学或酶促转化。
优选地，萜烯或类萜烯是香叶醇和/或香叶酸，和萜烯衍生物是香叶基酯。
本发明人发现，未修饰的异常球菌细菌能够转化香叶醇为香叶醛和香叶酸。因此，在一个具体的方面，本发明涉及本发明的重组异常球菌细菌用于生产香叶醇、香叶醛和/或香叶酸的用途。本发明还涉及生产香叶醇、香叶醛和/或香叶酸的方法，包括(i) 在适合于生产香叶醇、香叶醛和/或香叶酸的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，和任选地(ii)回收香叶醇、香叶醛和/或香叶酸。
优选地，重组异常球菌细菌包含编码异源的香叶醇合酶的基因，和任选地显示增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，和/或上文所述的异源的MEV途径。
在另一方面，本发明还涉及生产香叶醛和/或香叶酸的方法，包括(i) 使异常球菌细菌、优选地本发明的重组异常球菌细菌或其提取物与香叶醇接触，和任选地(ii) 回收香叶醛和/或香叶酸。
在另一个具体的方面，本发明涉及本发明的重组异常球菌细菌用于生产香叶基酯的用途。本发明还涉及生产香叶基酯的方法，包括(i) 在适合于生产香叶醇、香叶醛和/或香叶酸的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，任选地(ii) 回收香叶醇、香叶醛和/或香叶酸，和(iii) 转化香叶醇、香叶醛和/或香叶酸为香叶基酯，和任选地(iv) 回收香叶基酯。步骤(iii)可以是化学或酶促转化。
优选地，重组异常球菌细菌包含编码异源的香叶醇合酶的基因，任选地显示增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，和/或上文所述的异源的MEV途径。
优选地，香叶基酯是甲基香叶酸酯、香叶基甲酸酯、香叶基乙酸酯、香叶基丙酸酯、异丁酸香叶基酯、反式-香叶基乙酸酯或橙花基乙酸酯。这些酯可自香叶醇、香叶醛和/或香叶酸通过技术人员已知的任何方法生产。
在另一方面，本发明涉及本发明的重组异常球菌细菌在生产脱辅基类胡萝卜素中的用途。优选地，脱辅基类胡萝卜素选自二氢大马酮、大马烯酮和紫罗兰酮。二氢大马酮、大马烯酮和紫罗兰酮的实例包括但不限于，β-大马烯酮、反式- β-大马烯酮、γ-二氢大马酮、α-二氢大马酮、反式- α-二氢大马酮、顺式- α-二氢大马酮、顺式-β-二氢大马酮、反式-β-二氢大马酮、δ-二氢大马酮、反式,反式-δ-二氢大马酮、反式-(2,4,4-三甲基-2-环己烯基)-2-丁烯酮、1-(2,4,4-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮、1-(2,4,4-三甲基-1-环己烯基)-2-丁烯酮、1-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-2-丁烯-1-酮、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮和假-紫罗兰酮。
因此，本发明涉及生产脱辅基类胡萝卜素，即二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮的方法，包括(i) 在适合于生产香叶醇、香叶醛和/或香叶酸的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，任选地(ii) 回收香叶醇、香叶醛和/或香叶酸，和(iii) 转化香叶醇、香叶醛和/或香叶酸为所述脱辅基类胡萝卜素，和任选地(iv) 回收所述脱辅基类胡萝卜素。
香叶醇、香叶醛和/或香叶酸转化为二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮可包括香叶醇、香叶醛和/或香叶酸经中间体转化为香叶基酯，优选地甲基香叶酸酯。
优选地，重组异常球菌细菌包含编码异源的香叶醇合酶的基因，任选地显示增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，和/或上文所述的异源的MEV途径。用于转化香叶醇、香叶醛和/或香叶酸为二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮的方法是技术人员众所周知的。
本发明还涉及生产脱辅基类胡萝卜素的方法，包括(i) 在适合于生产所述脱辅基类胡萝卜素的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，和任选地(ii) 回收所述脱辅基类胡萝卜素。
优选地，重组异常球菌细菌是上文所述的重组体，其中编码番茄烯β-环化酶的基因被失活，和进一步包含编码异源的类胡萝卜素裂解加双氧酶(CCD)的基因。该重组体可进一步包含编码异源的番茄烯ε环化酶的基因。任选地，编码八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的基因也可过表达。重组异常球菌细菌可进一步显示增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，和/或异源的MEV途径和/或上述FPP合酶的过表达。
本发明还涉及生产脱辅基类胡萝卜素，即二氢大马酮、大马烯酮和/或紫罗兰酮的方法，包括(i) 在适合于生产β-胡萝卜素的条件下培养本发明的重组异常球菌细菌，(ii)回收β-胡萝卜素，和(iii) 转化β-胡萝卜素为所述脱辅基类胡萝卜素，和任选地(iv) 回收所述脱辅基类胡萝卜素。
将β-胡萝卜素转化为所述脱辅基类胡萝卜素例如二氢大马酮、大马烯酮、假紫罗兰酮和/或紫罗兰酮可以是化学或酶促转化，和是技术人员众所周知的。
优选地，重组异常球菌细菌是上文所述的重组体，其显示增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，和/或异源的MEV途径，和/或FPP合酶的过表达。任选地，编码八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的基因也可被过表达。
本发明还涉及生产脱辅基类胡萝卜素的方法，包括(i) 在适合于生产番茄烯、α-、β-和/或γ-胡萝卜素的条件下培养权利要求13的重组异常球菌细菌，(ii) 任选地回收番茄烯、α-、β-和/或γ-胡萝卜素，和(iii) 化学或酶促转化番茄烯、α-、β-和/或γ-胡萝卜素为脱辅基类胡萝卜素，和任选地(iv) 回收脱辅基类胡萝卜素。
优选地，重组异常球菌细菌是上文描述的重组体、特别是包含编码异源的CDD的基因的重组体。重组体可进一步显示增强的MEP途径，任选地具有改进的DXP合酶，和/或异源的MEV途径，和/或FPP合酶的过表达。任选地，编码八氢番茄红素合酶和八氢番茄红素去饱和酶的基因也可被过表达。
本发明的其它方面和优势在以下实施例中进行描述，其应被视为说明性而非限制性的。
实施例
实施例1：香叶醇和香叶酸的生产
Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产香叶醇和香叶酸。来自罗勒的编码香叶醇合酶(GES)的异源基因插入至染色体中，替换磷酸转乙酰酶(pta)基因。GES基因的表达在强组成型启动子的控制下。
为了制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的包含2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在37°C和250 rpm培养过夜。然后将对数生长期的种液以0.4的600 nm起始光密度(OD600)接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在37°C和250 rpm培养过夜。
来自以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ; Na2SO4 < 10 mM ; Acidecitrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O< 10 mM ; ZnCl2 < 50 mg/L ;FeSO4.7H2O<50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L; CoCl2.6H2O< 50 mg/L ;H3BO3< 5 mg/L ; MES< 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ; 葡萄糖< 30 g/L (166mM)的对数生长期的用于香叶醇生产的培养在37°C和250 rpm下进行48 h。
在培养24H后，产生香叶醇(滴度：2.01 mg/L ; 1.5 mg/g DCW (细胞干重) ; 0.6mg/g的葡萄糖) (图1)。在培养48H后，产生香叶醇(滴度：3.9 mg/L ; 0.5 mg/g DCW; 0.3mg/g的葡萄糖)和检出香叶酸(图2)。在培养72H后，很少的香叶醇残留，并存在香叶酸的主峰(图3)。通过混合0.5mL的乙酸乙酯和1 mL的培养物进行提取，和通过离心分离。乙酸乙酯相通过GC–质谱法(GC–MS)进行分析。
因此，香叶醇的生产在质谱仪GC上鉴定和定量。气相色谱使用配备有质谱仪作为检测器的GC-MS [Agilent 7890A/5975，柱: 0.25 mm × 30 m，0.25 μm (HP-5MS ultrainert)]进行。GCMS分析在电子碰撞(EI)模式(70 eV)下进行。以脉冲无分裂模式(50 psi，对于直至0.75min)注射1 µL的提取物。扫描范围涵盖50–250 m/z。使用Xcalibur系统处理数据。使用NIST库进行鉴定。使用与上述相同的方法构建香叶醇的标准曲线(图4)。
香叶酸的生产在高压液相色谱上鉴定和定量。HPLC使用Agilent C18 poroshell柱(EC-C18) 4.6*150mm-2.7um和移动相乙腈/水(0.1%甲酸)进行。注射10 µL的提取物。使用与上述相同的方法构建香叶酸的标准曲线(图5)。
实施例2：番茄烯的生产
Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产番茄烯。野生型细菌包含用于通过MEP途径合成番茄烯的相关的基因。生产番茄烯的重组D. geothermalis通过破坏一部分的类胡萝卜素途径而获得，即番茄烯β-环化酶(EC 5.5.1.19) (crtlm)基因被敲除。得到的构建体通过测序检查。
为制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的含有2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在37°C和250 rpm下培养过夜。然后以0.4的600nm初始光密度(OD600)将来自对数生长期的种液接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在37°C或45°C和250 rpm下培养过夜。
来自以10的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ; Na2SO4 < 10 mM ; Acidecitrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O < 10 mM ; ZnCl2 < 50 mg/L ;FeSO4.7H2O <50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L; CoCl2.6H2O< 50 mg/L; H3BO3 < 5 mg/L ; MES < 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ; 葡萄糖< 30 g/L(166 mM)的对数生长期的用于番茄烯生产的培养在37°C或45°C和250 rpm下进行48 h。
在培养24h后，番茄烯生产菌株的OD600为31。番茄烯以滴度4.2 mg/L、收率0.5mg/g DCW (细胞干重)和0.3 mg/g的葡萄糖生产。将1 mL的培养物离心和番茄烯提取通过混合0.9 mL的丙酮和沉淀物进行。丙酮相通过OD 472 nm吸光度进行分析(图6)。最后，番茄烯浓度通过稀释番茄烯标准品测定。
实施例3：FPP合酶的过表达
在强组成型启动子的控制下，将来自Deinococcus geothermalis的法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因(SEQ ID NO: 46)插入表达实施例1的罗勒的GES的重组D. geothermalis和生产实施例2的番茄烯的重组D. geothermalis的基因组。得到的构建体通过测序检查。
为制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的含有2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在37°C和250 rpm下培养过夜。然后以0.4的600nm初始光密度(OD600)将来自对数生长期的种子接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在37°C和250 rpm下培养过夜。
来自以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ; Na2SO4 < 10 mM ; Acidecitrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O< 10 mM ; ZnCl2 < 50 mg/L ;FeSO4.7H2O<50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L; CoCl2.6H2O< 50 mg/L ;H3BO3 < 5 mg/L ; MES< 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ; 葡萄糖< 30 g/L (166mM)的对数生长期的用于香叶醇生产的培养在37°C或45°C和250 rpm下进行24H和48 h。
用于番茄烯生产的培养按照与上述相同的方案进行。不同之处在于600 nm初始光密度(OD600)为10。
本发明人观察到，FPP合酶的过表达导致番茄烯生产显著增加(图7)。相反地，香叶醇生产显著降低(图8)。
实施例4：MEP酶的过表达
在强组成型启动子的控制下，将来自Deinococcus yunweiensis的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)基因(SEQ ID NO: 3)、1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸还原异构酶(DXR)基因(SEQID NO: 36)、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷酰转移酶(IspD)基因(SEQ ID NO: 19)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)基因(SEQ ID NO: 40)、2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)基因(SEQ ID NO: 23)、(E)-4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸合酶(IspG)基因(SEQ ID NO: 27)、4-羟基-3-甲基丁-2-烯基二磷酸还原酶(IspH)基因(SEQ ID NO: 44)或4-羟基-3-甲基丁-2-烯基-二磷酸还原酶(IDI)基因(SEQ ID NO: 31)插入至表达实施例1所述的罗勒的GES的重组D. geothermalis细菌的染色体。得到的构建体通过测序检查。
为制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的含有2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在37°C和250 rpm下培养过夜。然后将来自对数生长期的种子以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在37°C和250 rpm下培养过夜。
来自以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ; Na2SO4 < 10 mM ; Acidecitrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O< 10 mM ; ZnCl2 < 50 mg/L ;FeSO4.7H2O<50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L; CoCl2.6H2O< 50 mg/L ;H3BO3 < 5 mg/L ; MES< 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ; 葡萄糖< 30 g/L (166mM)的对数生长期的用于香叶醇生产的培养在37°C和250 rpm下进行48 h。
本发明人观察到，至少一种MEP酶的过表达导致本文用作类异戊二烯生产的标记物的香叶醇生产的显著增加(图9)。
实施例5：来自Deinococcus yunweiensis的改进的DXS酶
在强组成型启动子的控制下将来自Deinococcus yunweiensis的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)基因(SEQ ID NO:3)插入至表达实施例1所述的罗勒的GES的重组D. geothermalis细菌的染色体，替换内源的dxs基因。进行定点诱变以获得R238C突变体(SEQID NO: 13和14)。得到的构建体通过测序检查。
为制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的含有2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在37°C和250 rpm下培养过夜。然后将来自对数生长期的种子以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在37°C和250 rpm下培养过夜。
来自以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ; Na2SO4 < 10 mM ; Acidecitrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O< 10 mM ; ZnCl2 < 50 mg/L ;FeSO4.7H2O<50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L; CoCl2.6H2O< 50 mg/L ;H3BO3 < 5 mg/L ; MES< 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ; 葡萄糖< 30 g/L (166mM)的对数生长期的用于香叶醇生产的培养在37°C和250 rpm下进行48 h。
如图10所示，通过引入突变R238C改进DXS导致本文用作类异戊二烯生产的标记物的香叶醇生产的显著增加。
实施例6：改进的来自抗放射异常球菌的DXS酶
在强组成型启动子的控制下，将来自抗放射异常球菌的编码1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶(DXS)的基因(SEQ ID NO: 52)或编码所述酶的R244C突变体的基因(SEQ ID NO: 8)插入至表达实施例1所述的罗勒的GES的重组D. geothermalis细菌的染色体，替换内源的dxs基因。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于香叶醇生产的培养按实施例5所述进行。
如图11所示，通过引入突变R244C改进来自抗放射异常球菌的DXS导致本文用作类异戊二烯生产的标记物的香叶醇生产显著增加。
实施例7：D. geothermalis法呢基焦磷酸合酶的K170G突变体
将D. geothermalis法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因或编码通过定点诱变获得的所述酶的K170G突变体的基因插入至表达实施例1所述的罗勒的GES的重组D. geothermalis细菌的染色体，替换编码FPPS的内源基因。野生型和突变形式的D. geothermalis FPPS基因在组成型启动子的控制下。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于香叶醇生产的培养按实施例5所述进行。
如图12所示，D. geothermalis FPPS的突变K170G导致重新定向碳流通过GPP和香叶醇生产的显著增加。
实施例8：MEP酶的过表达与改进的DXS酶组合
在组成型启动子的控制下将编码Deinococcus yunweinensis的DXS酶的R238C突变体的基因插入至染色体，替换表达实施例1的罗勒的GES的重组D. geothermalis的淀粉酶(amy)基因。编码D. geothermalis法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因的K170G突变体的基因也插入至染色体，替换内源的ispA基因。FDPS基因的过表达在组成型启动子的控制下。得到的构建体通过测序检查。
来自Deinococcus yunweiensis的以下MEP途径基因各自在表达D. geothermalisFDPS (K170G突变体)和D. yunweiensis DXS (R238C突变体)的D. geothermalis菌株中在强组成型启动子的控制下表达：dxr基因(SEQ ID NO : 36)、ispD基因(SEQ ID NO : 19)、ispE基因(SEQ ID NO : 40)、ispF基因(SEQ ID NO : 23)、ispG基因(SEQ ID NO : 27)和idi基因(SEQ ID NO : 31)。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于香叶醇生产的培养如实施例5所述进行。
如图13所示，与其它组合相比，突变的DXS和IDI的过表达导致香叶醇生产的显著增加。
实施例9：红没药醇的生产
Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产红没药醇。将来自桔色链霉菌的编码(+)-表-α-红没药醇合酶的异源基因插入至染色体，替换磷酸转乙酰酶(pta)基因。表-α-红没药醇合酶基因的表达在组成型启动子的控制下。
为制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的含有2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在37°C和250 rpm下培养过夜。然后将来自对数生长期的种子以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在37°C和250 rpm下培养过夜。来自以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ;Na2SO4 < 10 mM ; Acide citrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O< 10 mM; ZnCl2 < 50 mg/L ; FeSO4.7H2O<50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L;CoCl2.6H2O< 50 mg/L ; H3BO3 < 5 mg/L ; MES< 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ;葡萄糖< 30 g/L (166 mM)的对数生长期的用于红没药醇生产的培养在37°C和250 rpm下进行48 h。
按实施例1对于香叶醇所述，红没药醇的生产在质谱仪GC上鉴定和定量。
如图14所示，来自桔色链霉菌的红没药醇合酶在D. geothermalis中的表达导致红没药醇生产(3.6 mg/L)。
实施例10：改进的番茄烯生产
按之前实施例2所述，Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产番茄烯。在组成型启动子的控制下将编码D. yunweinensis的DXS酶的R238C突变体的基因和编码D. yunweinensis的IDI的基因引入至菌株D. geothermalis crtlm-的染色体。种子培养和用于番茄烯生产的培养按实施例2所述进行。
如图15所示，当菌株D. geothermalis crtlm-过表达IDI和突变体DXS时，番茄烯生产高两倍。
实施例11：D. geothermalis中不同来源的GES的表达
按实施例1所述，通过将来自Phyla dulcis或鹰嘴豆的编码香叶醇合酶(GES)的异源基因插入染色体，替换磷酸转乙酰酶(pta)基因，Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造。GES基因的表达在强组成型启动子的控制下。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于香叶醇生产的培养按实施例1所述进行。
如图16所示，Phyla dulcis或鹰嘴豆的GES的表达也导致香叶醇的生产。
实施例12：类胡萝卜素生产
在强启动子控制下，将包含来自Deinococcus geothermalis的法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因(SEQ ID NO: 46)的表达盒插入至D. geothermalis菌株的基因组。得到的构建体通过测序检查。
为制备种子培养物，挑选单个菌落接种25 ml的含有2%葡萄糖作为主要碳源的CMG2%培养基(蛋白胨2 g/L ; 酵母提取物5 g/L ; 葡萄糖55 mM (20 g/L) ; MOPS酸40mM ; NH4Cl 20 mM ; NaOH 10 mM ; KOH 10 mM ; CaCl2.2H2O 0,5 µM ; Na2SO4.10H2O0.276 mM ; MgCl2.6H2O 0.528 mM ; (NH4)6(Mo7)O24.4H2O 3 nM ; H3BO3 0.4 µM ;CoCl2.6H2O 30 nM ; CuSO4.5H2O 10 nM ; MnCl2 0.25 µM ; ZnSO4.7H2O 10 nM ; D-生物素1 µg/L ; 烟酸(尼克酸) 1 µg/L ; B6维生素1 µg/L ; B1维生素; FeCl3 20 µM ; 柠檬酸钠.2H2O 20 µM ; K2HPO4 5,7 mM)，和在45°C和250 rpm下培养过夜。然后将来自对数生长期的种子以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的相同的新鲜培养基。该第二种子培养物在45°C和250 rpm下培养过夜。
来自以0.4的600 nm初始光密度(OD600)接种至25 ml的矿物质确定培养基(NH4)2SO4 < 100 mM ; NaH2PO4.H2O< 10 mM; KCl < 10 mM ; Na2SO4 < 10 mM ; Acidecitrique < 30 mM; MgCl2.6H2O< 10 mM ; CaCl2.2H2O < 10 mM ; ZnCl2 < 50 mg/L ;FeSO4.7H2O <50 mg/L ; MnCl2.4H2O<50 mg/L; CuSO4 < 50 mg/L; CoCl2.6H2O< 50 mg/L; H3BO3 < 5 mg/L ; MES < 200 mM ; (NH4)6Mo7O24.4H2O < 0,5 mM ; 葡萄糖< 30 g/L(166 mM)的对数生长期的用于类胡萝卜素生产的培养在45°C和250 rpm下进行48 h。
将25 mL的培养物离心，并且类胡萝卜素提取通过混合25 mL的乙醇与沉淀物进行。Deinoxanthin的光谱通过测量350nm和600nm之间的吸光度获得，并通过细胞干重(DCW)归一化(图17)，灰色谱对应于deinoxanthin标准品(自耐放射异常球菌提取的纯化的deinoxanthin)。
如图17和18所示，与野生型菌株(WT)相比，D. geothermalis的内源法呢基焦磷酸合酶(FPPS)的过表达导致deinoxanthin生产显著增加2倍。与野生型菌株相比，该增加的deinoxanthin生产与过表达FPPS的D. geothermalis的较深的粉色相关(图18)。
实施例13：桉油酚的生产
Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产桉叶素。将来自带小棒链霉菌的编码1,8桉叶素合酶(CnsA)的异源基因插入至染色体，替换磷酸转乙酰酶(pta)基因。1,8桉叶素合酶基因的表达在组成型启动子的控制下。将D. geothermalis法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因的K170G突变体插入至染色体，替换内源的fdps。FDPS基因的过表达在组成型启动子的控制下。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于桉叶素生产的培养按实施例1所述进行。在生长24H或48H后，1 mL的培养物通过0.5 mL的乙酸乙酯提取。有机相通过GCMS分析。按实施例1对于香叶醇所述，桉叶素的生产在质谱仪GC上鉴定和定量。
如图19所示，1,8桉叶素合酶的插入导致重组D. geothermalis生产桉叶素。
实施例14：柠檬烯的生产
Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产柠檬烯。来自Mentha longifolia的编码柠檬烯合酶(LS; GenBank: AAD50304.1)基因的异源基因。将与GFP融合的M. longifolia LS cDNA插入至染色体，替换磷酸转乙酰酶(pta)基因。LS基因的过表达在组成型启动子的控制下。将D. geothermalis法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因的K170G突变体插入至染色体，替换内源的fdps。FDPS基因的过表达在组成型启动子的控制下。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于柠檬烯生产的培养按实施例1所述进行。在生长24H或48H后，1 mL的培养物通过0.5 mL的乙酸乙酯提取。有机相通过GCMS分析。按实施例1对于香叶醇所述，柠檬烯的生产在质谱仪GC上鉴定和定量。
如图20所示，柠檬烯合酶的插入导致通过重组D. geothermalis生产柠檬烯。
实施例15：芳樟醇的生产
Deinococcus geothermalis菌株经遗传工程改造以生产芳樟醇。来自紫苏的编码芳樟醇合酶(LIS)基因的异源基因。将与GFP融合的LIS cDNA插入至染色体，替换磷酸转乙酰酶(pta)基因。LIS基因的过表达在组成型启动子的控制下。将D. geothermalis法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因的K170G突变体插入至染色体，替换内源的fdps。FDPS基因的过表达在组成型启动子的控制下。得到的构建体通过测序检查。种子培养和用于芳樟醇生产的培养按实施例1所述进行。按实施例1对于香叶醇所述，芳樟醇的生产在质谱仪GC上鉴定和定量。
如图21所示，芳樟醇合酶的插入导致通过重组D. geothermalis生产芳樟醇。
参考文献
Attia等 Arch Biochem Biophys. 2012 Nov 1;527(1):37-44
Blanchard和Karst, Gene. 1993 Mar 30;125(2):185-9.
Brown等J. Bacteriol. 2010 vol. 192、no 9，2424-2433
Carter等Phytochemistry，2003，64:425-433
Degenhardt和Gershenzon. Planta. 2000 Apr;210(5):815-22.
Del Terra等 Phytochemistry. 2013 May;89:6-14.
Herrero等 Metab Eng 2008，10:78-86
Lecointe等2004. Mol Microbiol 53: 1721–1730.
Lois等 PNAS，USA 1998;95:2105-2110.
Martin等 BMC Plant Biol. 2010 Oct 21;10:226.
Meima等 2001. J Bacteriol 183: 3169–3175.
Sivy等 Biosci Biotechnol Biochem. 2011;75(12):2376-83
Aharoni等2004. The Plant cell，16(11)，pp.3110–31.
Chen等2003. The Plant Cell，15(2)，pp.481–494.
Crowell等2002. Archives of biochemistry and biophysics，405(1)，pp.112–21.
Dong等2013. Metabolic engineering，20C，pp.198–211.
Dudareva等1996. The Plant cell，8(7)，pp.1137–48.
Feinberg和Vogelstein，1983，Anal. Biochem. 132:6-13
Fischer等2011. Biotechnology and Bioengineering，Vol. 108，No. 8，pp.1883-1892.
Galata等Phytochemistry 102，64-73 (2014)
Herrero等2008. Metabolic engineering，10(2)，pp.78–86.
Hess等2013. PloS one，8(6)，p.e66104.
Iijima等2004. Plant physiology，136(3)，pp.3724–36.
Iijima等2004. Plant. 134(January)，pp.370–379.
Jia等1999. Archives of biochemistry and biophysics，372(1)，pp.143–9.
Landmann等2007. Archives of biochemistry and biophysics，465(2)，pp.417–29.
Lehning等1999. Plant, Cell & Environment. Volume 22, Issue 5, 第495–504页
Liu, J.等2013. Journal of biotechnology，168(4)，pp.446–451.
Lv等2013. Applied microbiology and biotechnology，97(6)，pp.2357–65.
Masumoto等Phytochemistry 71 (10)，1068-1075 (2010)
Miller等2001. Planta，213(3)，pp.483–487.
Nakano等2011. ChemBioChem，12(16)，pp.2403–7.
Nakano等ChemBioChem 2011，12，1988 – 1991
Nakano等2011. Chembiochem. Oct 17;12(15):2271-5.
Pichersky等1995. Archives of biochemistry and biophysics，316(2)，pp.803–807..
Rico等2010. Applied and environmental microbiology，76(19)，pp.6449–54.
Sharkey等2005. Plant Physiol. 137(2)，pp.700–12.
Sitrit等2004. Plant Science，167(6)，pp.1257–1262.
Sugiura等2011. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry，75(7)，pp.1245–1248.
Whited等Ind Biotechnol 2010;6:152–63.
Yang等2012. Bioresource Technology，104(C)，pp.642–647.
Yang等2012. PloS one，7(4)，p.e33509.
Yang等2005. Phytochemistry，66(3)，pp.285–93.
Zhou等2013. Journal of biotechnology，169，pp.42–50.

Claims (22)

1. 生产萜烯或类萜烯的方法，包括(i) 在适合于生产萜烯或类萜烯的条件下培养经遗传修饰以增加1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)活性和/或异戊烯基焦磷酸酶异构酶(IPP异构酶)活性的重组异常球菌(Deinococcus)细菌，和任选地(ii) 回收萜烯或类萜烯。
2.权利要求1的方法，其中所述重组异常球菌细菌过表达天然的、同源的或异源的idi基因。
3.权利要求1或2的方法，其中所述重组异常球菌细菌过表达天然的、同源的或异源的dxs基因。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述重组异常球菌细菌表达改进的DXS酶。
5. 权利要求4的方法，其中所述改进的DXS酶是在对应于SEQ ID NO: 52的位置244的位置上包含半胱氨酸的突变体DXS。
6. 权利要求4的方法，其中所述重组异常球菌细菌表达编码来自抗放射异常球菌(D. radiopugnans)的DXP合酶的R244C突变体的基因(SEQ ID NO: 8)、编码来自D. yunweiensis的DXP合酶的R238C突变体的基因(SEQ ID NO: 14)或编码来自D. geothermalis的DXP合酶的R241C突变体的基因(SEQ ID NO: 56)。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述重组异常球菌细菌表达改进的DXS酶和过表达天然的、同源的或异源的idi基因。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述重组异常球菌细菌过表达天然的、同源的或异源的编码FPP合酶的基因。
9.权利要求8的方法，其中所述编码FPP合酶的基因编码选自以下的多肽：
a) 包含SEQ ID NO: 47的氨基酸序列的全部或活性部分的多肽；
b) 具有与SEQ ID NO: 47具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的氨基酸序列的多肽；
c) 由与SEQ ID NO: 46具有至少60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性的核苷酸序列编码的多肽；或
d) 由能够在中度/高度严格性、优选地高度或极高度严格性的条件下与(i) SEQ IDNO: 46所示的核酸序列、(ii) 其互补链或(iii) (i)或(ii)的子序列杂交的核酸序列编码的多肽。
10.权利要求8或9的方法，其中所述FPP合酶进一步显示二甲基烯丙基转移酶活性和/或香叶基香叶基二磷酸合酶活性。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中在所述重组异常球菌细菌中选自天然的、同源的或异源的dxr、ispD、ispE、ispF、ispG和ispH基因的至少一个基因被过表达。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述重组异常球菌细菌进一步包含编码异源的萜烯合酶的基因。
13.权利要求12的方法，其中所述异源的萜烯合酶选自单萜烯合酶、二萜烯合酶、三萜烯合酶和倍半萜烯合酶。
14.权利要求12或13的方法，其中所述异源的萜烯合酶是单萜烯合酶，优选地香叶醇合酶、桉叶素合酶、柠檬烯合酶或芳樟醇合酶。
15.权利要求12或13的方法，其中所述异源的萜烯合酶是倍半萜烯合酶，优选地(+)-表-α-红没药醇合酶。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中在所述重组异常球菌细菌中编码番茄烯β-环化酶的基因被失活。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述萜烯或类萜烯选自单萜烯、二萜烯、三萜烯、倍半萜烯和类胡萝卜素。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述萜烯或类萜烯是倍半萜烯。
19.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述萜烯或类萜烯是类胡萝卜素。
20.权利要求19的方法，其中所述类胡萝卜素是番茄烯或自番茄烯衍生的任何其它类胡萝卜素化合物。
21.权利要求19或20的方法，其中所述类胡萝卜素是deinoxanthine。
22.权利要求1-16的任一项中定义的重组异常球菌细菌。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937431A (zh) * 2017-10-28 2018-04-20 国际竹藤中心 一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法
CN109913380A (zh) * 2019-03-25 2019-06-21 南京工业大学 生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
CN111411101A (zh) * 2020-05-15 2020-07-14 扬州大学 芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体及芳樟醇生产工程菌
CN113249282A (zh) * 2021-04-23 2021-08-13 大连大学 一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3259359B1 (en) 2015-02-16 2020-11-18 Deinove L-arabinose assimilation pathway and uses thereof
JP6357186B2 (ja) * 2016-03-31 2018-07-11 Ｊｘｔｇエネルギー株式会社 カロテノイドの製造方法
KR102636395B1 (ko) * 2016-06-10 2024-02-13 경상국립대학교산학협력단 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법
CA3046436A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 Deinove Methods of producing phytoene
JP7330888B2 (ja) 2017-01-26 2023-08-22 マナス バイオ インコーポレイテッド テルペノイド産物を微生物生産するための代謝工学
GB201701548D0 (en) 2017-01-31 2017-03-15 Univ Manchester Process for producing monoterpenes
EP3577212A4 (en) * 2017-02-03 2020-12-16 Manus Bio, Inc. METABOLIC ENGINEERING FOR THE MICROBIAL MANUFACTURING OF TERPENOID PRODUCTS
CA3084263A1 (en) 2017-12-07 2019-06-13 Zymergen Inc. Engineered biosynthetic pathways for production of (6e)-8-hydroxygeraniol by fermentation
EP3728212A1 (en) 2017-12-21 2020-10-28 Zymergen Inc. Nepetalactol oxidoreductases, nepetalactol synthases, and microbes capable of producing nepetalactone
CN116875518A (zh) * 2018-07-06 2023-10-13 科罗拉多州立大学董事会法人团体 用于构建和检测生物活性剂的基因编码系统
EP3792353A1 (en) 2019-09-13 2021-03-17 CRAG - Centre de Recerca en Agrigenomica CSIC-IRTA-UB-UAB Artificial chromoplast biogenesis
WO2021151891A1 (en) 2020-01-27 2021-08-05 Deinove Novel phytoene desaturase variants to produce neurosporene and/or zeta-carotene
KR102214150B1 (ko) * 2020-09-04 2021-02-08 주식회사 라비오 데이노잔틴 발효추출물의 제조방법 및 데이노잔틴 발효추출물을 포함하는 화장료 조성물
WO2023060351A1 (en) * 2021-10-13 2023-04-20 The University Of Western Ontario Genetic engineering with deinococcus radiodurans
WO2024011263A2 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Cibus Us Llc Producing sesquiterpenes and other terpenes using plant-based biomasses

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004056975A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Increasing carotenoid production in bacteria via chromosomal integration
WO2005079183A2 (en) * 2003-06-04 2005-09-01 E.I. Dupont De Nemours And Company Method for production of c30-aldehyde carotenoids
US7659097B2 (en) * 2006-05-26 2010-02-09 Amyris Biotechnologies, Inc. Production of isoprenoids
WO2012052171A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Genoplante-Valor 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1947172B1 (en) * 1999-07-27 2012-12-19 Food Industry Research and Development Institute Engineering of metabolic control
KR101420889B1 (ko) 2006-05-26 2014-07-17 아미리스 인코퍼레이티드 생물 유기 화합물을 제조하기 위한 장치

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004056975A2 (en) * 2002-12-19 2004-07-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Increasing carotenoid production in bacteria via chromosomal integration
WO2005079183A2 (en) * 2003-06-04 2005-09-01 E.I. Dupont De Nemours And Company Method for production of c30-aldehyde carotenoids
US7659097B2 (en) * 2006-05-26 2010-02-09 Amyris Biotechnologies, Inc. Production of isoprenoids
WO2012052171A1 (en) * 2010-10-20 2012-04-26 Genoplante-Valor 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase alleles responsible for enhanced terpene biosynthesis

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BING TIAN ET AL.,: "Carotenoid 3,4-desaturase is involved in carotenoid biosynthesis in the radioresistant bacterium Deinococcus radiodurans", 《MICROBIOLOGY》 *
BING TIAN ET AL.,: "Carotenoid biosynthesis in extremophilic Deinococcus-Thermus bacteria", 《CELL PRESS》 *
C LIU ET AL.,: "Identification and characterization of the geranylgeranyl diphosphate synthase in Deinococcus radiodurans", 《APPLIED MICROBIOLOGY》 *
FLORENCE BOUVIER ET AL.,: "Biogenesis, molecular regulation and function of plant isoprenoids", 《PROGRESS IN LIPID RESEARCH》 *
JUNFENG XUE ET AL.,: "Enhancing Isoprene Production by Genetic Modification of the 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphate Pathway in Bacillus subtilis", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
黄璐琦: "《分子生药学》", 30 September 2006, 北京大学医学出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107937431A (zh) * 2017-10-28 2018-04-20 国际竹藤中心 一种提高酿酒酵母合成芳樟醇能力的方法
CN109913380A (zh) * 2019-03-25 2019-06-21 南京工业大学 生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
CN109913380B (zh) * 2019-03-25 2021-12-10 南京工业大学 生产(-)-α-红没药醇的重组解脂耶氏酵母菌及其构建方法和应用
CN111411101A (zh) * 2020-05-15 2020-07-14 扬州大学 芳樟醇合成酶突变体、重组表达载体及芳樟醇生产工程菌
CN113249282A (zh) * 2021-04-23 2021-08-13 大连大学 一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途
CN113249282B (zh) * 2021-04-23 2023-06-20 大连大学 一种产β-榄香烯重组菌及其构建方法和用途

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