CZ308933B6 - Houba Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta - Google Patents
Houba Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308933B6 CZ308933B6 CZ2019474A CZ2019474A CZ308933B6 CZ 308933 B6 CZ308933 B6 CZ 308933B6 CZ 2019474 A CZ2019474 A CZ 2019474A CZ 2019474 A CZ2019474 A CZ 2019474A CZ 308933 B6 CZ308933 B6 CZ 308933B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- ogfp
- purpurea
- seq
- fungus
- Prior art date
Links
- 241000221751 Claviceps purpurea Species 0.000 title claims abstract description 82
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 title claims abstract description 43
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102200061168 rs150338273 Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 101150025236 dmaW gene Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims abstract description 20
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 108020002120 tryptophan dimethylallyltransferase Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 108010037870 Anthranilate Synthase Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims description 24
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 7
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 6
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 6
- 101800000778 Cytochrome b-c1 complex subunit 9 Proteins 0.000 claims description 4
- 102400000011 Cytochrome b-c1 complex subunit 9 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 101150073906 gpdA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150095733 gpsA gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 32
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 23
- OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N ergotamine Chemical compound C([C@H]1C(=O)N2CCC[C@H]2[C@]2(O)O[C@@](C(N21)=O)(C)NC(=O)[C@H]1CN([C@H]2C(C3=CC=CC4=NC=C([C]34)C2)=C1)C)C1=CC=CC=C1 OFKDAAIKGIBASY-VFGNJEKYSA-N 0.000 description 22
- 229960004943 ergotamine Drugs 0.000 description 22
- XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N ergotaminine Natural products C1=C(C=2C=CC=C3NC=C(C=23)C2)C2N(C)CC1C(=O)NC(C(N12)=O)(C)OC1(O)C1CCCN1C(=O)C2CC1=CC=CC=C1 XCGSFFUVFURLIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 17
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 description 16
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 15
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 14
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 13
- 229950001817 alpha-ergocryptine Drugs 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 11
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- YDOTUXAWKBPQJW-UHFFFAOYSA-N alpha-Ergocryptinine Natural products C1=CC(C=2C(N(C)CC(C=2)C(=O)NC2(C(=O)N3C(C(N4CCCC4C3(O)O2)=O)CC(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 YDOTUXAWKBPQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- YDOTUXAWKBPQJW-NSLWYYNWSA-N alpha-ergocryptine Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@]2(C(=O)N3[C@H](C(N4CCC[C@H]4[C@]3(O)O2)=O)CC(C)C)C(C)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 YDOTUXAWKBPQJW-NSLWYYNWSA-N 0.000 description 10
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 10
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 9
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 102220125682 rs767205402 Human genes 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- -1 tryptophan amino acid Chemical class 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 5
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- ZAGRKAFMISFKIO-QMTHXVAHSA-N lysergic acid Chemical class C1=CC(C2=C[C@H](CN([C@@H]2C2)C)C(O)=O)=C3C2=CNC3=C1 ZAGRKAFMISFKIO-QMTHXVAHSA-N 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N prenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150044170 trpE gene Proteins 0.000 description 4
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- ZHJGWYRLJUCMRT-UHFFFAOYSA-N 5-[6-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]benzimidazol-1-yl]-3-[1-[2-(trifluoromethyl)phenyl]ethoxy]thiophene-2-carboxamide Chemical compound C=1C=CC=C(C(F)(F)F)C=1C(C)OC(=C(S1)C(N)=O)C=C1N(C1=C2)C=NC1=CC=C2CN1CCN(C)CC1 ZHJGWYRLJUCMRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XJOOMMHNYOJWCZ-UHFFFAOYSA-N Agroclavine Natural products C1=CC(C2C=C(C)CN(C2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 XJOOMMHNYOJWCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710163102 D-lysergyl-peptide-synthetase subunit 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SAHHMCVYMGARBT-UHFFFAOYSA-N Isochanoclavine I Natural products C1=CC(C(C(NC)C2)C=C(C)CO)=C3C2=CNC3=C1 SAHHMCVYMGARBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 3
- 101100408135 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) phnA gene Proteins 0.000 description 3
- UPKBEIIDYOMDQW-UKRRQHHQSA-N agroclavine Chemical compound C1=CC=C2[C@H]3C=C(C)CN(C)[C@@H]3CC3=CN=C1[C]32 UPKBEIIDYOMDQW-UKRRQHHQSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O RZLVQBNCHSJZPX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001589551 Claviceps purpurea 20.1 Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 101710163092 D-lysergyl-peptide-synthetase subunit 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100033189 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Human genes 0.000 description 2
- 101710101225 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Proteins 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZAGRKAFMISFKIO-UHFFFAOYSA-N Isolysergic acid Natural products C1=CC(C2=CC(CN(C2C2)C)C(O)=O)=C3C2=CNC3=C1 ZAGRKAFMISFKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 229940033655 asparagine monohydrate Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- SAHHMCVYMGARBT-HEESEWQSSA-N chanoclavine-I Chemical compound C1=CC([C@H]([C@H](NC)C2)\C=C(/C)CO)=C3C2=CNC3=C1 SAHHMCVYMGARBT-HEESEWQSSA-N 0.000 description 2
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N dimethyl-(4,5,6,7-tetrabromo-1h-benzoimidazol-2-yl)-amine Chemical compound BrC1=C(Br)C(Br)=C2NC(N(C)C)=NC2=C1Br SLPJGDQJLTYWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150072807 lpsA2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 2
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N (-)-chorismic acid Natural products OC1C=CC(C(O)=O)=CC1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- RBMGJIZCEWRQES-DKWTVANSSA-N (2s)-2,4-diamino-4-oxobutanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O RBMGJIZCEWRQES-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;hydrate Chemical compound O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 101710163103 D-lysergyl-peptide-synthetase subunit 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N Ergometrine Natural products C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N 0.000 description 1
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 241000221775 Hypocreales Species 0.000 description 1
- 101150031639 IV gene Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910013594 LiOAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N Lysergic acid propanolamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 102000004722 NADPH Oxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010002998 NADPH Oxidases Proteins 0.000 description 1
- 101710198130 NADPH-cytochrome P450 reductase Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010019477 S-adenosyl-L-methionine-dependent N-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043977 Tetraspanins Human genes 0.000 description 1
- 108700031126 Tetraspanins Proteins 0.000 description 1
- 241000223260 Trichoderma harzianum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N chorismic acid Chemical compound O[C@@H]1C=CC(C(O)=O)=C[C@H]1OC(=C)C(O)=O WTFXTQVDAKGDEY-HTQZYQBOSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 101150076310 easH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- IAOSEBXZNXDPEE-UKRRQHHQSA-N elymoclavine Chemical compound C1=CC=C2[C@H]3C=C(CO)CN(C)[C@@H]3CC3=CN=C1[C]32 IAOSEBXZNXDPEE-UKRRQHHQSA-N 0.000 description 1
- DAVNRFCJMIONPO-UHFFFAOYSA-N elymoclavine Natural products C1=CC(C2C=C(CO)CN(C2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 DAVNRFCJMIONPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960001405 ergometrine Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 108010007464 lysergyl peptide synthetase Proteins 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- SLCVBVWXLSEKPL-UHFFFAOYSA-N neopentyl glycol Chemical compound OCC(C)(C)CO SLCVBVWXLSEKPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010000785 non-ribosomal peptide synthase Proteins 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008659 phytopathology Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001415 potassium malate Substances 0.000 description 1
- 235000011033 potassium malate Nutrition 0.000 description 1
- SVICABYXKQIXBM-UHFFFAOYSA-L potassium malate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O SVICABYXKQIXBM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012808 pre-inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000007268 rho GTP-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010033674 rho GTP-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
- C12Y401/03027—Anthranilate synthase (4.1.3.27)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
- C12P17/183—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing an indolo[4,3-F,G]quinoleine nucleus, e.g. compound containing the lysergic acid nucleus as well as the dimeric ergot nucleus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
- C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
- C12Y205/01034—4-Dimethylallyltryptophan synthase (2.5.1.34)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje houbu Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, která obsahuje v genomu vloženou nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň jeden gen vybraný z genu trpES76L kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L, a genu dmaW kódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu, přičemž vložený gen je pod kontrolou konstitutivního promotoru. Dále je popsán způsob přípravy takové houby, a expresní kazeta pro použití při tomto způsobu.
Description
Houba Clavicepspurpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta
Oblast techniky
Vynález se týká geneticky upravené houby Claviceps purpurea, která je široce používaná ve farmaceutickém průmyslu jako produkční mikroorganimus pro svou schopnost produkovat námelové alkaloidy, a způsobu genetické úpravy této houby.
Dosavadní stav techniky
Claviceps purpurea, vřeckovýtrusná houba z řádu Hypocreales, patří mezi nej známěj ší producenty námelových alkaloidů. Tyto alkaloidy, deriváty kyseliny D-lysergové, jsou široce využívány ve farmakologickém průmyslu. Využití těchto látek v lékařství je dáno jejich strukturní podobností s neurotransmitery adrenalinem, noradrenalinem a serotoninem, přičemž alkaloidy interagují s receptory pro tyto neurotransmitery. V současnosti jsou námelové alkaloidy využívány především v porodnictví, k léčbě bolestí hlavy a nemocí souvisejících s prolaktinem. V neposlední řadě našly námelové alkaloidy využití též při léčbě Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby.
Produkce námelových alkaloidů pro účely farmaceutického průmyslu je rovnoměrně rozdělena mezi polní produkci a produkci v submerzních kulturách. Kmeny C. purpurea schopné produkce námelových alkaloidů v submerzních kulturách či houby schopné vyšší produkce alkaloidů in planta byly od 60. let 20. stol, získávány UV mutagenezí, chemickou mutagenezí pomocí ethylmethansulfonátu (EMS) nebo N-mcthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidinii (NTG) (Brauer KL, Robbers JE. (1987), Applied and Environmental Microbiology, 53( 1), 70-73), působením kyseliny dusité (Stmadová K., Kybal J. (1976), Planta Medica, 30, 395-398) či ozářením rentgenovými nebo gamma paprsky. Tímto způsobem byl získán i kmen Pl C. purpurea odvozený od kmene 1029 (Keller U. (1983), Applied and Environmental Mcrobiology, 46, 580-584). V tomto kmeni C. purpurea byl navíc poprvé identifikován klastr genů pro biosyntézu námelových alkaloidů (tzv. EAS klastr) (Tudzynski P, Hólter K, Correia T, Amtz C, Grammel N, Keller U. (1999), Molecular and General Genetics MGG, 261(\). 133-141). Tento klastr obsahuje celkem 13 genů, přičemž první gen biosyntézy označený jako dmaW kóduje dimethylallyltryptofan synthetasu (DMATS, EC: 2.5.1.34), která katalyzuje prenylaci Z-tryptofanu dimethylallyldifosfátem (DMAPP) za vzniku 4-y.y-di methylal lyltryptofanu (DMAT). Protože se jedná o klíčový enzym katalyzující první reakci biosyntézy námelových alkaloidů, podléhá tento enzym regulaci, je aktivován tryptofanem. Kromě aktivace DMATS aminokyselina tryptofan též zpětnovazebně inhibuje klíčový enzym vlastní biosyntézy anthranilát synthasu (EC: 4.1.3.27), která katalyzuje přeměnu chorismátu na anthranilát v přítomnosti amoniaku (Krupinski VM., Robbers JE, Floss HG. (1976), Journal of Bacteriology, 125(1), 158-165). Druhým krokem biosyntézy námelových alkaloidů je methylace DMAT za vzniku JV-methyl-dimethylallytryptofanu (MeDMAT). Tento krok je katalýzo ván 4-dimethylallyltryptofan Λ'-m ethyl t ran sfc rasou, která je kódována genem EasF. Následně dochází ke tvorbě chanoklavinu-I, přičemž reakce je katalyzována chanoklavin-Isynthasou, která je kódována genem EasE. Tato reakce je též katalyzována katalasou, která je kódována genem EasC. Chanoklavin-I je dále oxidován na chanoklavin-I-aldehyd, reakce je katalyzována chanoklavin-I-dehydrogenasou, která je kódována genem EasD. Poté následuje isomerace dvojné vazby chanoklavin-I-aldehydu za vzniku isoklavin-I-aldehydu. Tato reakce je katalyzována chanoklavin-I-aldehyd oxidoreduktasou, která je kódována genem EasA. IsoklavinI-aldehyd je redukován na agroklavin za katalýzy agroklavin synthasou, která je kódována genem EasG. Následuje oxidace agroklavinu na elymoklavin a jeho následná oxidace na kyselinu lysergovou. Tyto reakce jsou katalyzovány NADPH-dependentní cytochrom P450 monooxygenasou, která je kódována genem CloA. Klastr pro biosyntézu ergopeptinů je u C. purpurea tvořen čtyřmi geny IpsAl, lpsA2, IpsB a IpsC, které kódují neribozomální peptidové synthetasy. Gen IpsAl kóduje trimodulámí lysergyl peptidovou synthetasu LPS1. Tento enzym má
-1 CZ 308933 B6 podobnou funkci jako enzym LPS4, který je kódován genem lpsA2. Odlišnost těchto enzymů spočívá nejspíše pouze ve schopnosti vázat různé aminokyseliny, které jsou součástí ergopeptinů. Gen IpsB kóduje monomodulámí enzym LPS2, který aktivuje řetězec kyseliny D-lysergové. Po aktivaci kyseliny D-lysergové enzymem LPS2 je kyselina přenesena na LPS1, který obsahuje tři domény pro vazbu tří aminokyselin. Po jejich navázání dochází ke vzniku peptidového laktamu, jehož následná cyklizace je katalyzována dioxygenasou, která je kódována genem easH. Gen IpsC kóduje monomodulámí synthetasu LPS3, která společně s LPS2 katalyzuje biosyntézu ergonovinu (Florea S., Panaccione D. G., Schardl C. L. (2017), Phytopathology, 107(5), 504-518).
Metoda genetické transformace C. purpurea využívající polyethyleglykol byla poprvé použita v roce 1989 (van Engelenburg F, Smit R, Goosen T, van den Broek H, Tudzynski P. (1989), Applied Microbiology and Biotechnology, 30, 364-370). V případě genů zapojených do biosyntézy námelových alkaloidů byli touto metodou získáni deleční mutanti AEasE C. purpurea Pia následní komplementanti SEasE C. purpurea Pl exprimující EasE-gfp (Lorenz N., Olšovská J., Sulc M., Tudzynski P. (2010), Applied and Environmental Mikrobiology, 76(6), 1822-1830) a deleční mutanti AlpsAl v Aku70 C. purpurea Pl (Haarmann T., Lorenz N., Tudzynski P. (2008), Fungal Genetics and Biology, ^5(1), 35-44).
V roce 2012 byly za použití metody kvasinkového rekombinačního klonování připraveny vektory obsahující trpC promotor A. nidulans a gen kódující ogfp (egfp kodon optimalizovaný pro expresi v houbě Botrytis cinerea) (Schumacher J. (2012), Fungal Genetics and Biology, 49,483-497). Tyto vektory byly dále použity na transformaci C. purpurea pro účely lokalizace či nadexprese vybraných genů. Jednalo se o nadexpresi regulační podjednotky NADPH oxidasového komplexu CpNoxR, katalytické podjednotky CpNoxl, funkční podjednotky CpNox2 a tetraspaninu CpPlsl (Schůrmann J., Buttermann D., Herrmann A., Giesbert S., Tudzynski P. (2013), Molecular PlantMicrobe Interactions, 26(10), 1151-1164) či nadexpresi Rho GTPas CpRac a CpCdc42, GEF faktorů CpCdc24 a CpDockl80, GTPasového efektoru CpSte20 či proteinu CpBeml (Herrmann A, Tillmann BA, Schůrmann J, Bólker M, Tudzynski P. (2014), Eukaryotic Cell, EC-00332). Tyto vektory byly také použity například pro nadexpresi a lokalizaci tRNA-IPT (Hinsch J., Galuszka P., Tudzynski P. (2016), New Phytologist, 211(3), 980-992) a ZmCkxl v C. purpurea 20.1 (Kind S., Hinsch J., Vrabka J., Hradilová M., Majeská-Cudejková M., Tudzynski P., Galuszka P. (2018), Current Genetics, 64(6), 1303-1319).
Kmen Pl není jediným kmenem C. purpurea, který produkuje námelové alkaloidy (konkrétně ergotamin a ergotaminin, α-ergokryptin a α-ergokryptinin) v submerzní kultuře, tuto vlastnost mají také například kmen 275 FI produkující ergotamin (Arcamone F., Cassinenelli G., Femiřni G., Penco S., Pennella P., Pol C. (1970), Canadian Journal of Microbiology, 76(10), 923-931) nebo kmen 59 (Křen V., Pažoutová S., Sedmera P., Rylko V., Řeháček Z. (1986), FEMS Microbiology Letters, 37(1), 31-34). Další rozvoj techniky významně podpořilo získání sekvence genomu C. purpurea kmene 20.1 (Schardl CL et al. (2013), PLoS Genetics, 9(2), el003323).
Úkolem předkládaného vynálezu je zvýšit produkci námelových alkaloidů houbami C. purpurea reprodukovatelným postupem.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje geneticky upravené transformanty houby Claviceps purpurea pro zvýšenou produkci námelových alkaloidů, které obsahují v genomu vloženou nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň jeden gen vybraný z genu (trpE) kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L, a genu dmaWkódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu, přičemž vložený gen je pod kontrolou konstitutivního promotoru. Manipulací genů pro biosyntézu aminokyseliny tryptofanu a jeho následnou přeměnu na klíčový meziprodukt biosyntézy námelových alkaloidů dochází k výraznému zvýšení produkce těchto alkaloidů v modifikované houbě, což umožní jejich efektivnější a ekonomičtější produkci.
- 2 CZ 308933 B6
U houby Claviceps purpurea se vložením genu kódujícího klíčový enzym pro produkci aminokyseliny tryptofanu anthranilát synthasu s mutací S76L, pod konstitutivní promotor, odblokuje zpětnovazebná inhibice biosyntézy této aminokyseliny, čímž se posílí biosyntetická dráha vedoucí k produkci námelových alkaloidů. Biosyntéza námelových alkaloidů se také zvýší vložením genu pro přeměnu tryptofanu na dimethylallyltryptofan, klíčový meziprodukt biosyntézy námelových alkaloidů, pod konstitutivní promotor. Takto geneticky upravené mikroorganismy jsou vhodné pro uplatnění při výrobě námelových alkaloidů pro farmaceutický průmyslový sektor.
Gen kódující anthranilát synthasu (TrpE) s mutací S76L, tj. gen nesoucí mutaci kodónu aminokyseliny šeřinu (kodón AGC) v pozici 76 na kodón leucinu (kodón CTC) má sekvenci SEQ ID NO. 1.
Gen kódující dimethylallytryptofan synthetasu (DmaW) má sekvenci SEQ ID NO. 2.
Oba dva uvedené geny jsou geny pocházející z houby Claviceps purpurea, případně upravené vnesením mutace, a vložené do genomu houby Claviceps purpurea pod kontrolu konstitutivního promotoru. Výsledný mikroorganismus tedy nese své původní geny trpE a dmaW, a zároveň nese genetickou transformací vnesený uvedený alespoň jeden gen pod kontrolou konstitutivního promotoru.
Vložená nukleotidová sekvence dále obsahuje terminátor (například Gluc terminátor) a může obsahovat kodon-optimalizovaný gen ogfp kódující zelený fluorescenční protein pro expresi v Botrytis cinerea.
V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že množství námelových alkaloidů v submerzní kultuře, myceliu i médiu transformovaného Claviceps purpurea podle předkládaného vynálezu je významně vyšší než množství námelových alkaloidů v nemodifikovaném kmenu Claviceps purpurea.
Vložené nukleotidové sekvence jsou řízeny konstitutivním promotorem. Zvláště výhodnými konstitutivními promotory jsou OliC promotor jaderného genu kódujícího podjednotku 9 mitochondriální ATP synthetasy nebo gpdA promotor genu kódujícího glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu, oba z Aspergillus nidulans.
V jednom výhodném provedení jsou geneticky upravené transformanty houby Claviceps purpurea pro zvýšenou produkci námelových alkaloidů podle předkládaného vynálezu vybrány ze skupiny zahrnující kmeny označené v příkladech jako OE TrpE S76L 4, OE ogfp dmaW 8, a uložené v České sbírce mikroorganismů (CCM) pod názvem a označením kmene „Claviceps purpurea PN s vloženým genem TrpE s mutací S76L (Cp TrpE SL)“, resp. „Claviceps purpurea PN s vloženým genem ogfp-dmaW (Cp dmaW)“.
Předmětem vynálezu je také způsob přípravy geneticky upravených transformantů houby Claviceps purpurea, při němž se připraví expresní kazeta obsahující nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň jeden gen vybraný z genu kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L, a genu dmaW kódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu, přičemž tento gen je pod kontrolou konstitutivního promotoru, a terminátor, popřípadě také kodon-optimalizovaný gen ogfp kódující zelený fluorescenční protein pro expresi v Botrytis cinerea, a tato expresní kazeta se vloží do genomu houby Claviceps purpurea.
Expresní kazeta může být připravena například kvasinkovou rekombinací.
S výhodou se expresní kazeta vloží pomocí metody transformace protoplastů.
-3CZ 308933 B6
Předmětem vynálezu je dále expresní kazeta, která obsahuje konstitutivní promotor, alespoň jeden gen vybraný z genu kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L, a genu dmaW kódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu, a terminátor. Promotorem je s výhodou OliC promotor jaderného genu kódující podjednotku 9 mitochondriální ATP synthetasy z Aspergillus nidulans nebo gpdA promotor genu kódujícího glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu z Aspergillus nidulans. Terminátorem je s výhodou Gluc terminátor.
Expresní kazeta může volitelně dále jako kódující sekvenci obsahovat kodon-optimalizovaný gen ogfp kódující zelený fluorescenční protein pro expresi v Botrytis cinerea, který slouží jako Nkoncová fúzní doména cílového enzymu.
V jednom výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: OliC promotor: TrpE57“:: Gluc terminátor a má sekvenci SEQ ID NO. 3.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: OliC promotor:.ogfp-dmaW::Gluc terminátor a má sekvenci SEQ ID NO. 4.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití uvedených expresních kazet pro přípravu houby Claviceps purpurea jako produkčního mikroorganismu pro výrobu námelových alkaloidů.
Nukleotidová sekvence genu trpE kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L (1840 bp, SEQ ID NO. 1)
ATGGCGAGCCCGGTAAGTACTGCATGCGCCCCTCTGGCCGAATTGGCCCTCTTCCCG GCGCGGCGCAGTAGGAATAGCCTCCAAAAAGACACAAAGCCTGACTCTTGAGAATC GCGAATCCAAAAAAACACAGCAGGCCATCGTCCCTACGCTCGAGACCGTGCGATCC ATCATTGCGAAACCCCCCGTCGGATCCGCCAAAAAAGCCACCCTCGTGCCCGTATAC CGCCAAATCTCCTCGGACCTCATCACCCCCTCGGCGGCCTACCTCAAAATCTCAGCC GCCTCCTCCTCCGACTACTCCTTCCTCTTCGAGTCCGCCGCCACAGAGCAAGTCGGCC GGTATCTCTTCGTAGGCGCCGGCCCGCGCAAAGTCCTCGCCACCGGACCAGGCTACG GCCCCGAAACAGACCCCCTTCCCGCACTGGAAGCAGAACTAGCTCAACATGTCGTCG CGCATGTGCCAGGTCTCCAGCTGCCTCCTCTTACCGGCGGCGCAATCGGCTACGTGG GCTACGACTGCGTACGGTACTTTGAGCCCAAGACCGCGCGGCCCATGAAAGATGTCC TACAAATCCCAGAATCACTCTTCATGCTCTTCGACACAATTGTCGCGTTTGATCGCTT CTACGGCATCATCAAGGTCATCAGCTACGTGGCCGTTCCGGAAGACGACGGTACCAC CAGCCTAGAAGAGGCCTACGAAAAAGCCGAGCGCGCAATCCACCAACTCGTCCAGG TCCTCAACTCAACAGAGATTGACCTCCCGACCCAAGACCCCATCCAGCTCGGCCACG AAGCCACCTCGAATATCGGCCAAGCGGGCTACGAGGCCCACGTGACCAAACTCAAG GAGCACATCGTCAAGGGGGATATCTTCCAGTGTGTGCCCTCGCAGCGGTTTGCGCGC CCGACGAGTCTGCACCCGTTCAATATCTACAGGCATCTCCGGACGGTGAATCCCTCG CCGTACCTCTTTTATGTGAATTGCAAGGATTTCCAGATTGTAGGTGCCTCGCCTGAAT TGCTCGTCAAGTCCGAGGCCGGGCGTATCATCACGCATCCCATTGCTGGGACAGTCA AGCGCGGCAGCACACCCGAGGAGGACCAGCGCTTGGCGGATGAGCTGAGTAGTTCG CTCAAGGACCGCGCGGAGCATGTCATGCTTGTTGATTTGGCTCGGAATGACATCAAC CGCGTAGGGGACCCGTATTCCGTCCGCGTGGACCGCCTTATGGTCGTGGAGAAGTTT AGCCATGTCCAGCATCTTGTTTCGCAGGTCTCAGGGGTGCTGCGGCCGGATAAGACG CGCTTTGATGCGTTTCGATCGGTTTTCCCCGCGGGGACGGTCTCGGGAGCGCCCAAG GTGCGGGCGATGGAACTGATTGCCGAGTTGGAGAAGGAGAAGAGGGGGGTGTATGC TGGCGCGGTGGGCTACTTTGGGTATGGGAGCCAGGATGAGAATGGGGGCGCTGTGG AGGGGGCTATGGATACGTGTATTGCGTTGAGGACGATGTTGGTCAAGGACGGGGTG GCGTATTTGCAGGCAGGTTCGTACAGATCTTGGTTGAGCCAAGGATTCCCCCCCCTCT CTTCCCCTTTTCTTGCTGTCACGTTACGCATTTCTATGCACGGTACGCACTCCTGAGA GAAAATACAGTTTGCTAACACTTCCCCCCCCTTTTTTTTTGCTTTCGATTTAGGAGGC GGAATTGTGTTTGATTCAGACGAATACGATGAGTGGATCGAGACGATCAACAAGCTC
-4CZ 308933 B6
GGCAGCAACATGACGTGCATCAAGTCAGCAGAGGAGATGTATTACCAGCAGCAGCA AAACGAGAAAACCACATAG
Nukleotidová sekvence genu dmaW kódujícího dimethylallyltryptofan synthasu (1466 bp, SEQ ID NO. 2)
ATGTCGACCGCAAAGGACCCAGGAAACGGTGTGTACGAAATTTTGAGTCTGATTTTT GATTTCCCCAGCAATGAACAGCGACTATGGTGGCACAGTACCGCGCCTATGTTTGCG GCGATGCTTGACAATGCCGGCTACAATATCCACGACCAATACCGGCATCTGGGCATT TTCAAGAAGCACATTATCCCTTTTCTTGGTGTCTATCCAACAAAAGACAAGGAAAGA TGGCTCAGCATCCTCACCAGATGTGGCCTTCCTTTGGAATTGAGCTTGAATTGTACCG ACTCTGTTGTTCGATATACATACGAGCCCATCAATGAAGTGACGGGGACGGAGAAA GATCCGTTCAATACATTGGCAATTATGGCAAGTGTCCAAAAACTTGCACAGATTCAA GCGGGTATCGACTTGGAGTGGTTTAGTTACTTCAAAGATGAGCTGACGCTGGACGAA TCGGAATCGGCCACACTTCAAAGTAATGAGCTGGTCAAGGAGCAGATAAAGACGCA GAACAAGTTGGCCTTGGATCTCAAAGAAAGCCAGTTCGCGCTCAAAGTTTACTTCTA TCCGCATCTTAAATCGATCGCGACCGGCAAATCCACACACGATCTCATCTTCGACTC TGTGTTCAAACTGTCGCAGAAGCATGACAGCATACAGCCCGCGTTCCAGGTATTGTG CGACTATGTTTCGCGGCGAAATCATTCCGCAGAATCAGACCAACACATAGCCCTACA TGCGCGACTCTTGTCATGCGATTTGATCGATCCCGCCAAGTCTCGCGTCAAGATATAC CTGCTGGAGAAGACGGTCTCGTTGTCCGTGATGGAAGATCTGTGGACGCTGGGCGGC CAACGAGTCGACGCATCCACCATGGACGGCCTTGACATGCTTCGCGAGCTCTGGAGC CTGCTAAAAGTTCCCACTGGCCACTTGGAGTATCCAAAAGGGTATCTGGAATTGGGA GAAATTCCGAACGAGCAGCTCCCATCCATGGCCAACTATACACTGCACCACAACAAC CCCATGCCTGAGCCCCAGGTGTATTTCACGGTTTTCGGCATGAATGACGCCGAAATC AGCAATGCTTTGACCATCTTCTTCCAACGTCACGGATTTGACGACATGGCGAAAAAG TACCGAGTCTTTCTTCAGGATTCATAGTGAGTGCTCCGAGCCCGATCGATAGGCAAC AGGTGTCTAACAATTAGCCCCCTTTCTCCTACAGCCCGTATCATGACTTTGAGTCATT GAACTACCTCCACGCATATATCTCATTCTCTTACCGTCGAAACAAGCCGTATTTGAGC GTATATTTGCATACGTTTGAGACTGGTCGTTGGCCCGTTGGTGAGTCTACCGAACTTT ATCAACATGGGCTCCGCAAGCTGAACAATTTCCTAGTTGCCGACAGCCCAATTTCTTT CGACGCCTACCGGCGCTGTGACCTCTCAACGAAGTAG
SEQ ID NO. 3
Pozice jednotlivých funkčních úseků
OliC promotor - 1-845 bp trpE S76L - 846 - 2685 bp
Gluc terminátor - 2686-3185 bp
TGCAGCTGTGGAGCCGCATTCCCGATTCGGGCCGGATTGGTCAAGATTTGCGTCCGA GGTGCCGTCTATCATTCTAGCTTGCGGTCCTGGGCTTGTGACTGGTCGCGAGCTGCCA CTAAGCGGGGCAGTACCATTTTATCGGACCCATCCAGCTATGGGACCCACTCGCAAA TTTTTACATCATTTTCTTTTTGCTCAGTAACGGCCACCTTTTGTAAAGCGTAACCAGC AAACAAATTGCAATTGGCCCGTAGCAAGGTAGTCAGGGCTTATCGTGATGGAGGAG AAGGCTATATCAGCCTCAAAAATATGTTGCCAGCTGGCGGAAGCCCGGAAGGTAAG TGGATTCTTCGCCGTGGCTGGAGCAACCGGTGGATTCCAGCGTCTCCGACTTGGACT GAGCAATTCAGCGTCACGGATTCACGATAGACAGCTCAGACCGCTCCACGGCTGGC GGCATTATTGGTTAACCCGGAAACTCAGTCTCCTTGGCCCCGTCCCGAAGGGACCCG ACTTACCAGGCTGGGAAAGCCAGGGATAGAATACACTGTACGGGCTTCGTACGGGA GGTTCGGCGTAGGGTTGTTCCCAAGTTTTACACACCCCCCAAGACAGCTAGCGCACG AAAGACGCGGAGGGTTTGGTGAAAAAAGGGCGAAAATTAAGCGGGAGACGTATTTA
-5CZ 308933 B6
GGTGCTAGGGCCGGTCTCCTCCCCATTTTTCTTCGGTTCCCTTTCTCTCCTGGAAGACT TTCTCTCTCTCTTCTTCTCTTCTTCCATCCTCAGTCCATCTTCCTTTCCCATCATCCATC TCCTCACCCCCATCTCAACTCCATCACATCACAATCGATCCAACCATGGCGAGCCCG GTAAGTACTGCATGCGCCCCTCTGGCCGAATTGGCCCTCTTCCCGGCGCGGCGCAGT AGGAATAGCCTCCAAAAAGACACAAAGCCTGACTCTTGAGAATCGCGAATCCAAAA AAACACAGCAGGCCATCGTCCCTACGCTCGAGACCGTGCGATCCATCATTGCGAAAC CCCCCGTCGGATCCGCCAAAAAAGCCACCCTCGTGCCCGTATACCGCCAAATCTCCT CGGACCTCATCACCCCCTCGGCGGCCTACCTCAAAATCTCAGCCGCCTCCTCCTCCG ACTACTCCTTCCTCTTCGAGTCCGCCGCCACAGAGCAAGTCGGCCGGTATCTCTTCGT AGGCGCCGGCCCGCGCAAAGTCCTCGCCACCGGACCAGGCTACGGCCCCGAAACAG ACCCCCTTCCCGCACTGGAAGCAGAACTAGCTCAACATGTCGTCGCGCATGTGCCAG GTCTCCAGCTGCCTCCTCTTACCGGCGGCGCAATCGGCTACGTGGGCTACGACTGCG TACGGTACTTTGAGCCCAAGACCGCGCGGCCCATGAAAGATGTCCTACAAATCCCAG AATCACTCTTCATGCTCTTCGACACAATTGTCGCGTTTGATCGCTTCTACGGCATCAT CAAGGTCATCAGCTACGTGGCCGTTCCGGAAGACGACGGTACCACCAGCCTAGAAG AGGCCTACGAAAAAGCCGAGCGCGCAATCCACCAACTCGTCCAGGTCCTCAACTCA ACAGAGATTGACCTCCCGACCCAAGACCCCATCCAGCTCGGCCACGAAGCCACCTCG AATATCGGCCAAGCGGGCTACGAGGCCCACGTGACCAAACTCAAGGAGCACATCGT CAAGGGGGATATCTTCCAGTGTGTGCCCTCGCAGCGGTTTGCGCGCCCGACGAGTCT GCACCCGTTCAATATCTACAGGCATCTCCGGACGGTGAATCCCTCGCCGTACCTCTTT TATGTGAATTGCAAGGATTTCCAGATTGTAGGTGCCTCGCCTGAATTGCTCGTCAAGT CCGAGGCCGGGCGTATCATCACGCATCCCATTGCTGGGACAGTCAAGCGCGGCAGC ACACCCGAGGAGGACCAGCGCTTGGCGGATGAGCTGAGTAGTTCGCTCAAGGACCG CGCGGAGCATGTCATGCTTGTTGATTTGGCTCGGAATGACATCAACCGCGTAGGGGA CCCGTATTCCGTCCGCGTGGACCGCCTTATGGTCGTGGAGAAGTTTAGCCATGTCCA GCATCTTGTTTCGCAGGTCTCAGGGGTGCTGCGGCCGGATAAGACGCGCTTTGATGC GTTTCGATCGGTTTTCCCCGCGGGGACGGTCTCGGGAGCGCCCAAGGTGCGGGCGAT GGAACTGATTGCCGAGTTGGAGAAGGAGAAGAGGGGGGTGTATGCTGGCGCGGTGG GCTACTTTGGGTATGGGAGCCAGGATGAGAATGGGGGCGCTGTGGAGGGGGCTATG GATACGTGTATTGCGTTGAGGACGATGTTGGTCAAGGACGGGGTGGCGTATTTGCAG GCAGGTTCGTACAGATCTTGGTTGAGCCAAGGATTCCCCCCCCTCTCTTCCCCTTTTC TTGCTGTCACGTTACGCATTTCTATGCACGGTACGCACTCCTGAGAGAAAATACAGT TTGCTAACACTTCCCCCCCCTTTTTTTTTGCTTTCGATTTAGGAGGCGGAATTGTGTTT GATTCAGACGAATACGATGAGTGGATCGAGACGATCAACAAGCTCGGCAGCAACAT GACGTGCATCAAGTCAGCAGAGGAGATGTATTACCAGCAGCAGCAAAACGAGAAAA CCACATAGCGTATGTAGATAAGATGTATGATTAGGGGTTGAGGGGAAGGATTATGG CTGAGGAAGTGGTTTCTGATTCGTCTTGTACATAAGTATTAGCATGGACCCTTGTGGA GGTATTTGCTCAAAGGGGGTGTTTTAGCGGAAGACAAAAGAGGGCGGAATTAAATC TCAATCCGTTTTCAACTTTGAAAATCTTGATCCAACATTGTGATTCCATGTATTTGTG CAACCAAGTTTTTCATCATTGATTCTGCTGTAATGTGAACAAACTACAAGTAGGAGG ACATTTGTTTAAAGTTTTCAGCTCACGTGGTATTGTGGCCTGACAGGAGCACAAACG CCGTTTTTGAGAAAACGAAAGTTTGGAATTGACCATCCACAACCACATGCGTTTCCT ATGATACACCTCATGTGGCGTTACCATATGATATTCGGTTTCATATCTAGGCAAAGA GGAGAACATCATACGTACATCTGATTTGACAACCCCTTCCCCCCAACAAGAT
SEQ ID NO. 4
Pozice jednotlivých funkčních úseků
OliC promotor - 1-845 bp ogfp bez stop kodonu - 846 - 1622 bp dmaW- 1623 - 3088 bp
-6CZ 308933 B6
Glue terminátor - 3089-3588 bp
TGCAGCTGTGGAGCCGCATTCCCGATTCGGGCCGGATTGGTCAAGATTTGCGTCCGA GGTGCCGTCTATCATTCTAGCTTGCGGTCCTGGGCTTGTGACTGGTCGCGAGCTGCCA CTAAGCGGGGCAGTACCATTTTATCGGACCCATCCAGCTATGGGACCCACTCGCAAA TTTTTACATCATTTTCTTTTTGCTCAGTAACGGCCACCTTTTGTAAAGCGTAACCAGC AAACAAATTGCAATTGGCCCGTAGCAAGGTAGTCAGGGCTTATCGTGATGGAGGAG AAGGCTATATCAGCCTCAAAAATATGTTGCCAGCTGGCGGAAGCCCGGAAGGTAAG TGGATTCTTCGCCGTGGCTGGAGCAACCGGTGGATTCCAGCGTCTCCGACTTGGACT GAGCAATTCAGCGTCACGGATTCACGATAGACAGCTCAGACCGCTCCACGGCTGGC GGCATTATTGGTTAACCCGGAAACTCAGTCTCCTTGGCCCCGTCCCGAAGGGACCCG ACTTACCAGGCTGGGAAAGCCAGGGATAGAATACACTGTACGGGCTTCGTACGGGA GGTTCGGCGTAGGGTTGTTCCCAAGTTTTACACACCCCCCAAGACAGCTAGCGCACG AAAGACGCGGAGGGTTTGGTGAAAAAAGGGCGAAAATTAAGCGGGAGACGTATTTA GGTGCTAGGGCCGGTCTCCTCCCCATTTTTCTTCGGTTCCCTTTCTCTCCTGGAAGACT TTCTCTCTCTCTTCTTCTCTTCTTCCATCCTCAGTCCATCTTCCTTTCCCATCATCCATC TCCTCACCCCCATCTCAACTCCATCACATCACAATCGATCCAACCATGGTTTCCAAGG GTGAGGTAAGTAATCCCGTGCAATGTCCCAAGACTCTTCTCTAATACTTCTACCAGG AGCTTTTCACTGGCGTCGTTCCAATCTTGGTCGAACTCGATGGTGACGTCAATGGCCA TAAGTTCTCAGTCAGCGGAGAGGGTGAGGGAGACGCTACATATGGTAAATTGACTCT TAAGTTCATCTGCACCACAGGTAAATTGCCTGTACCTTGGCCTACACTCGTCACCACC CTCACCTACGGAGTTCAATGCTTTTCCCGTTACCCAGATCACATGAAACAACATGAC TTTTTCAAGTCTGCAATGCCAGAGGGATATGTCCAAGAGAGAACAATCTTCTTTAAG GATGACGGAAATTATAAGACTCGTGCCGAGGTTAAGTTCGAGGGTGATACTCTCGTC AACCGTATTGAGTTGAAGGGCATCGATTTCAAGGAAGACGGAAATATCCTCGGCCAT AAGCTTGAATACAACTACAACAGTCACAACGTTTATATCATGGCCGACAAGCAAAA AAATGGAATCAAGGTCAACTTCAAAATCAGACACAACATTGAGGATGGCTCTGTTCA ATTGGCAGATCACTACCAACAGAATACTCCAATTGGTGATGGTCCAGTCTTGCTCCC AGATAACCATTACCTCTCCACTCAATCTGCTCTTTCAAAGGACCCTAACGAAAAGCG TGACCACATGGTTCTTCTCGAATTTGTCACAGCAGCCGGAATTACCTTGGGAATGGA TGAACTTTACAAAGCGGCCGCTATGTCGACCGCAAAGGACCCAGGAAACGGTGTGT ACGAAATTTTGAGTCTGATTTTTGATTTCCCCAGCAATGAACAGCGACTATGGTGGC ACAGTACCGCGCCTATGTTTGCGGCGATGCTTGACAATGCCGGCTACAATATCCACG ACCAATACCGGCATCTGGGCATTTTCAAGAAGCACATTATCCCTTTTCTTGGTGTCTA TCCAACAAAAGACAAGGAAAGATGGCTCAGCATCCTCACCAGATGTGGCCTTCCTTT GGAATTGAGCTTGAATTGTACCGACTCTGTTGTTCGATATACATACGAGCCCATCAA TGAAGTGACGGGGACGGAGAAAGATCCGTTCAATACATTGGCAATTATGGCAAGTG TCCAAAAACTTGCACAGATTCAAGCGGGTATCGACTTGGAGTGGTTTAGTTACTTCA AAGATGAGCTGACGCTGGACGAATCGGAATCGGCCACACTTCAAAGTAATGAGCTG GTCAAGGAGCAGATAAAGACGCAGAACAAGTTGGCCTTGGATCTCAAAGAAAGCCA GTTCGCGCTCAAAGTTTACTTCTATCCGCATCTTAAATCGATCGCGACCGGCAAATCC ACACACGATCTCATCTTCGACTCTGTGTTCAAACTGTCGCAGAAGCATGACAGCATA CAGCCCGCGTTCCAGGTATTGTGCGACTATGTTTCGCGGCGAAATCATTCCGCAGAA TCAGACCAACACATAGCCCTACATGCGCGACTCTTGTCATGCGATTTGATCGATCCC GCCAAGTCTCGCGTCAAGATATACCTGCTGGAGAAGACGGTCTCGTTGTCCGTGATG GAAGATCTGTGGACGCTGGGCGGCCAACGAGTCGACGCATCCACCATGGACGGCCT TGACATGCTTCGCGAGCTCTGGAGCCTGCTAAAAGTTCCCACTGGCCACTTGGAGTA TCCAAAAGGGTATCTGGAATTGGGAGAAATTCCGAACGAGCAGCTCCCATCCATGGC CAACTATACACTGCACCACAACAACCCCATGCCTGAGCCCCAGGTGTATTTCACGGT TTTCGGCATGAATGACGCCGAAATCAGCAATGCTTTGACCATCTTCTTCCAACGTCAC GGATTTGACGACATGGCGAAAAAGTACCGAGTCTTTCTTCAGGATTCATAGTGAGTG CTCCGAGCCCGATCGATAGGCAACAGGTGTCTAACAATTAGCCCCCTTTCTCCTACA GCCCGTATCATGACTTTGAGTCATTGAACTACCTCCACGCATATATCTCATTCTCTTA CCGTCGAAACAAGCCGTATTTGAGCGTATATTTGCATACGTTTGAGACTGGTCGTTG GCCCGTTGGTGAGTCTACCGAACTTTATCAACATGGGCTCCGCAAGCTGAACAATTT
-7 CZ 308933 B6
CCTAGTTGCCGACAGCCCAATTTCTTTCGACGCCTACCGGCGCTGTGACCTCTCAACG AAGTAGCGTATGTAGATAAGATGTATGATTAGGGGTTGAGGGGAAGGATTATGGCT GAGGAAGTGGTTTCTGATTCGTCTTGTACATAAGTATTAGCATGGACCCTTGTGGAG GTATTTGCTCAAAGGGGGTGTTTTAGCGGAAGACAAAAGAGGGCGGAATTAAATCT CAATCCGTTTTCAACTTTGAAAATCTTGATCCAACATTGTGATTCCATGTATTTGTGC AACCAAGTTTTTCATCATTGATTCTGCTGTAATGTGAACAAACTACAAGTAGGAGGA CATTTGTTTAAAGTTTTCAGCTCACGTGGTATTGTGGCCTGACAGGAGCACAAACGC CGTTTTTGAGAAAACGAAAGTTTGGAATTGACCATCCACAACCACATGCGTTTCCTA TGATACACCTCATGTGGCGTTACCATATGATATTCGGTTTCATATCTAGGCAAAGAG GAGAACATCATACGTACATCTGATTTGACAACCCCTTCCCCCCAACAAGAT
Objasnění výkresů
Obr. 1: Schéma přípravy expresních vektorů pomocí kvasinkového rekombinačního klonování. VektorpNDH-OGG obsahující ogfp (A), klonování mutované verze TrpE (amplifikace genu TrpE z genomové DNA ve dvou částech, hvězdičkou je znázorněna poloha mutace) do pNDH-OGG s vyštěpeným ogfp (B), klonování dmaW (naN-konci DMATS fuze s ogfp) do pNDH-OGG (C). 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea.
Obr. 2: PCR detekce transgenů v geneticky modifikovaných houbách C. purpurea (kmenPl) exprimujících mutovanou verzi TrpE (TrpES76L) pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC). Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Černé šipky znázorňují primery nasedající na promotor OliC a terminátor GluC, mezi kterými se nachází vložený gen. Šedé šipky znázorňují primery nasedající do čtecího rámce hph genu, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A). Detekce části promotoru Olic, genu a části terminátoru GluC. Velikost amplikonu 2353 bp (B). Detekce hph genu. Velikost amplikonu 366 bp (C). M: marker molekulových hmotností, 3, 4, 12: nezávislí transformanti C. purpurea s integrovaným transgenem, PK: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen), NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby).
Obr. 3: PCR detekce transgenů v geneticky modifikované houbě C. purpurea (kmenPl) exprimující ogfp pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC). Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Černé šipky znázorňují primery nasedající na promotor OliC a terminátor GluC, mezi kterými se nachází vložený gen. Šedé šipky znázorňují primery nasedající do čtecího rámce hph genu, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A). Detekce části promotoru Olic, genu a části terminátoru GluC. Velikost amplikonu 1292 bp (B). Detekce hph genu. Velikost amplikonu 366 bp (C). M: marker molekulových hmotností, 1: transformant C. purpurea s integrovaným transgenem, PK: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen), NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby).
Obr. 4: PCR detekce transgenů v geneticky modifikovaných houbách C. purpurea (kmenPl) exprimujících dmaWfúzované s ogfp (ogfp-dmaW) pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC). Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Černé šipky znázorňují primery nasedající na promotor OliC a terminátor GluC, mezi kterými se nachází vložený gen. Šedé šipky znázorňují primery nasedající do čtecího rámce hph genu, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A).
Detekce části promotoru Olic, genu a části terminátoru GluC. Velikost amplikonu 3098 bp (B). Detekce hph genu. Velikost amplikonu 366 bp (C). M: marker molekulových hmotností, 7, 8, 13: nezávislí transformanti C. purpurea s integrovaným transgenem, PK: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen), NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby).
-8CZ 308933 B6
Obr. 5: RT-PCR detekce transgenů v geneticky modifikovaných houbách C. purpurea (kmen Pl) exprimujících mutovanou verzi TrpE (TrpE S76L) nebo dmaWfúzované s ogfp (ogfp-dmaW) a volné ogfp pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC). Detekce hph genu. Velikost amplikonu 366 bp (A). Detekce y-aktinu. Velikost amplikonu 636 bp (Β). M: marker molekulových hmotností, NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby), 4, 12: nezávislí transformanti C. purpurea exprimující mutovanou verzi TrpE S76L\ 1: transformant C. purpurea exprimující ogfp', 8, 13: nezávislí transformanti C. purpurea Pl exprimující dmaWs ogfp.
Obr. 6: PCR detekce transgenů v myceliích WT a geneticky modifikovaných hub C. purpurea (kmen Pl) exprimujících mutovanou verzi TrpE (TrpE S76L) pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC) po 10ti denní inkubaci v T25N indukčním médiu. Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Černé šipky znázorňují primery nasedající na promotor OliC a terminátor GluC, mezi kterými se nachází vložený gen, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A). Detekce části promotoru Olic, genu a části terminátoru GluC. Velikost amplikonu 2353 bp (Β). M: marker molekulových hmotností, 4, 12: : nezávislí transformanti C. purpurea exprimující mutovanou verzi TrpES76L , PK: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen - mutovsanou verzi TrpE s™). NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby), A-F: 6 biologických replikátů.
Obr. 7: PCR detekce transgenů v myceliích WT a geneticky modifikovaných hub C. purpurea (kmen Pl) exprimujících mutovanou verzi TrpE (TrpE S76L) pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC) po 10ti denní inkubaci v T25N indukčním médiu. Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Šedé šipky znázorňují primery nasedající do čtecího rámce hph genu, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A). Detekce hph genu. Velikost amplikonu 366 bp (Β). M: marker molekulových hmotností; 4, 12: : nezávislí transformanti C. purpurea exprimující mutovanou verzi TrpES76L , PK: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen - mutovsanou verzi TrpE S76L NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby), A-F: 6 biologických replikátů.
Obr. 8: PCR detekce transgenů v myceliích WT a geneticky modifikovaných hub C. purpurea (kmen Pl) exprimujících ogfp nebo dmaW fúzované s ogfp (ogfp-dmaW) pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC) po 14ti denní inkubaci v T25N indukčním médiu. Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Černé šipky znázorňují primery nasedající na promotor OliC a terminátor GluC, mezi kterými se nachází vložený gen, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A). Detekce části promotoru Olic, genu a části terminátoru GluC. Velikost amplikonu 1292 bp nebo 3098 bp (Β). M: marker molekulových hmotností, 1: transformant C. purpurea exprimující ogfp', 7,8, 13: : nezávislí transformanti C. purpurea exprimující ogfp-dmaW, PK1: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí ogfp), PK2: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen - dmaW s ogfp), NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby), A-F: 6 biologických replikátů.
Obr. 9: PCR detekce transgenů v myceliích WT a geneticky modifikovaných hub C. purpurea (kmen Pl) exprimujících ogfp nebo dmaW fúzované s ogfp (ogfp-dmaW) pod kontrolou konstitutivního OliC promotoru (PoliC) po 14ti denní inkubaci v T25N indukčním médiu. Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna pomocí šipek. Šedé šipky znázorňují primery nasedající do čtecího rámce hph genu, 3': 3'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea, 5': 5'flank nitrát reduktasy Botrytis cinerea (A). Detekce hph genu. Velikost amplikonu 366 bp (Β). M: marker molekulových hmotností, 1: transformant C. purpurea exprimující ogfp, 7, 8, 13: : nezávislí transformanti C. purpurea exprimující ogfp-dmaW, PK1: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí ogfp), PK2: pozitivní kontrola (plazmidová DNA nesoucí transgen - dmaW s ogfp), NK: negativní kontrola (gDNA kontrolní WT houby), A-F: 6 biologických replikátů.
-9CZ 308933 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Příprava geneticky modifikovaných hub
1. Příprava expresních vektorů
Byly připraveny dva expresní vektory (SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 3): první vektor obsahoval gen dma IV. který kóduje dimethylallyltryptofan synthasu, DMATS (EnsemblFungi: CPUR 04076, SEQ ID NO. 2/ další vektor obsahoval mutovanou verzi genu TrpE (Trppf76L) pro anthranilát synthasu (EnsemblFungi: CPUR 05013, SEQ ID NO. 1). Oba výše zmíněné geny byly umístěny pod kontrolu konstitutivního OliC promotoru jaderného genu Aspergillus nidulans kódujícího podjednotku 9 mitochondriální ATP synthetasy. V případě genu rimalFbylo naN-konci DMATS ponecháno ogfp tj. kodon optimalizované egfp pro expresi v Botrytis cinerea (Leroch M, Memke D, Koppenhoefer D, Schneider P, Mosbach A, Doehlmann G, Hahn M. (2011), Applied and Environmental Microbiology 77.9 (2011): 2887-2897).
Oba výše zmíněné expresní vektory byly připraveny kvasinkovým rekombinačním klonováním (Obr. 1) (Colot HV, Park G, Turner GE, Ringelberg C, Crew CM, Litvinkova L, Weiss RL, Borkowich KA, Dunlap JC. (2006), Proc Natl Acad Sci USA 103:10352-10357) za použití vektoru pNDH-OGG (Schumacher J (2012), Fungal Genetics and Biology, 49(6), 483-497). Sekvence genů dmaW a TrpE byly amplifikovány z genomové DNA Claviceps purpurea, kmene 20.1 pomocí Phusion High-Fidelity DNA polymerázy (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). V případě genu TrpE s mutací S76L byla sekvence tohoto genu amplifikována ve dvou krocích, přičemž do sekvence použitých primerů byla vnesena požadovaná mutace.
Sekvence primerů použitých na amplifikaci genu dmaW s přesahem na ogfp a s přesahem na terminátor Gluc
- GAACTTTACAAAGCGGCCGCTATGTCGACCGCAAAGGACCCAGGAAAC - 3 (SEQ ID NO. 5)
- GTGACCTCTCAACGAAGTAGCGTATGTAGATAAGATGTATGATTAGG - 3' (SEQ ID NO. 6).
Sekvence primerů použitých na amplifikaci genu TrpE s mutací S76L - část 1 s přesahem na promotor OliC a s požadovanou mutací
- CCATCACATCACAATCGATCCAACCATGGCGAGCCCGGTAAGTACTGC - 3 (SEQ ID NO. 7)
- TACGAAGAGATACCGGCCGACTTGCTCTGTGGCGGCGGACTCGAA - 3 (SEQ ID NO. 8).
Sekvence primerů použitých na amplifikaci genu TrpE s mutací S76L - část 2 s požadovanou mutací a přesahem na terminátor GluC
- CACAGAGCAAGTCGGCCGGTATCTCTTCGTAGGC - 3' (SEQ ID NO. 9)
- CATACATCTTATCTACATACGCTATGTGGTTTTCTCGTTTTGCTGCTGCTG GTA- 3 (SEQ ID NO. 10).
V případě klonování mutované verze TrpE S76L byl vektor pNDH-OGG štěpen restrikčními endonukleázami Notl aNeol (New England Biolabs), v případě klonování genu rimalFbyl vektor pNDH-OGG štěpen restrikční endonukleázou Notl (New England Biolabs).
-10CZ 308933 B6
Získané DNA fragmenty byly transformovány do uracil auxotrofhího kmene Saccharomyces cerevisiae (kmen FGSC 9721, Fungal Genetics Stock Center, Manhattan, USA). Transformace byla provedena dle Winston F, Dollard C, Ricupero-Hovasse SU. (1995), Yeast, 11(Y), 53-55. V mikrozkumavce byly smíchány 50% PEG 3350, 1M LiOAc, naštěpený vektorpNDH-OGG a PCR fragment amplifikovaný z gDNA C. purpurea 20.1. K této směsi byly přidány buňky S. cerevisiae FGSC 9721, které byly předem promyty sterilní vodou a 100 mM octanem lithným, ve kterém byly následně i re suspendovány. Jako pozitivní kontrola sloužila mikrozkumavka, do které byl pipetován nenaštěpený vektor pNDH-OGG, v případě negativní kontroly byl do mikrozkumavky pipeto ván pouze naštěpený vektor bez DNA amplikonu. Do takto připravených mikrozkumavek byla přidána denaturovaná DNA ze spermií lososa (Sigma-Aldrich). Takto připravená směs byla inkubována při 30 °C, poté při 42 °C a následně byla rozetřena na misky s SD agarem bez uracilu (20 g D-glukosa monohydrát, 6,7 g kvasinkové dusíkaté báze bez aminokyselin, 0,77 g směsi aminokyselin a výživových látek bez uracilu, doplněno do 1 1 destilovanou vodou, pH upraveno na 5,8, autoklávováno 20 min při 120 °C). Po třech dnech inkubace při 28 °C byly narostlé kolonie S. cerevisiae FGSC 9721 z agaru setřeny a pomocí QIAprep Spin Miniprep kitu (Qiagen, Hilden, Německo) z nich byla izolována plazmidová DNA, která byla následně použita na transformaci bakterií Escherichia coli (kmen TOP 10) (New England Biolabs). K buňkám E. coli TOP 10 v mikrozkumavce byla pipetována plazmidová DNA. Po inkubaci na ledu byl buňkám udělen teplotní šok při 42 °C a směs byla opět přenesena na led. Poté bylo ke směsi přidáno SOC médium (20 g tryptonu, 5 g kvasinkového extraktu a 0,5 g chloridu sodného bylo rozpuštěno v 950 ml destilované vody. Poté bylo do roztoku přidáno 10 ml 250 mM chloridu draselného, pH upraveno na 7,0 a doplněno destilovanou vodou do 1 1. Po autoklávování 20 min při 120 °C bylo do roztoku přidáno 20 ml IM D-glukosy a 5 ml 2M chloridu hořečnatého) a po Ih inkubaci při 37 °C byly buňky E. coli TOP 10 rozetřeny na misky s LB agarem (9,5 g chlorid sodný, 15,5 g LB Broth, 15 g agar, doplněno do 1 1 destilovanou vodou, pH upraveno na 7,2, autoklávováno 20 min při 120 °C) aAmpicilinem (Sigma-Aldrich) o finální koncentraci 100 pg/ml. Misky byly inkubovány do dalšího dne při 37 °C. Poté byla z narostlých kolonií E. coli TOP 10 izolována pomocí QIAprep Spin Miniprep kitu (Qiagen) plazmidová DNA. Výsledné konstrukty byly ověřeny pomocí restrikční analýzy a komerční sekvenace (SEQme, Dobříš, Česká republika).
2. Transformace Claviceps purpurea a následná selekce získaných hub
Na transformaci protoplastů C. purpurea (kmen Pl) (Tudzynski P, Hólter K, Correia T, Amtz C, Grammel N, Keller U. (1999), Molecular and General Genetics MGG, 261(Y), 133-141) byla použita připravená plazmidová DNA a též vektor pNDH-OGG obsahující volné ogfp. Před transformací byly vektory linearizovány restrikční endonukleázou Pstl (New England Biolabs), restrikční směsi byly přečištěny pomocí NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kitu (MACHEREYNAGEL GmbH and Co. KG, Berlín, Německo). Takto připravené vektory byly transformovány do C. purpurea (kmen Pl), která produkuje v submerzní kultuře ergotamin, ergotaminin, α-ergokryptin a α-ergokryptinin (Haarmann T, Lorenz N, Tudzynski P. (2008), Fungal Genetics and Biology, 45(1), 35-4). Transformace protoplastů C. purpurea (kmen Pl) probíhala následujícím postupem. Po 3 dnech byla kultura C. purpurea Piv BII médiu (100 g sacharóza, 5 g pepton, 5 g Λ-asparagin monohydrát, 1 g dihydrogenfosforečnan draselný, 0,5 g síran hořečnatý heptahydrát, 0,01 g síran železnatý heptahydrát, doplněno do 1 1 destilovanou vodou, pH upraveno na 5,8, autoklávováno 20 min při 120 °C) centrifugována a poté byla promyta SmaC pufrem (123,88 g sorbitol, 5,88 chlorid vápenatý, doplněno do 800 ml 0,2 M malátem draselným, autoklávováno 20 min při 120 °C). Kmyceliu byl přidán protoplastizační roztok (100 mg lyzační enzym z Trichoderma harzianum ve 20 ml SmaC pufiru, sterilizováno přes filtr s velikostí pórů 0,22 pm). Po 2h inkubaci při 28 °C byla směs filtrována přes Nytexovou membránu (Fluka, Německo). Filtrát byl centrifugován a 2x promyt STC pufrem (154,84 g sorbitol, 1,22 g Tris, 7,36 g chlorid vápenatý, doplněno do 1 1 destilovanou vodou, pH upraveno na 7,5, autoklávováno 20 min při 120 °C), ve kterém byl pelet následně resuspendován. Ve zkumavce byla smíchána přečištěná linearizovaná plazmidová DNA, STC pufir a protoplasty C. purpurea PL Po 20min inkubaci byl do zkumavky přidán PEG 6000, po další 5min inkubaci byl přidán STC pufir.
-11 CZ 308933 B6
Do první Petriho misky byl nalit transformační BII agar (200 g sacharóza, 5 g pepton, 5 g L-asparagin monohydrát, 1 g hydrogenfosforečnan draselný, 0,5 g síran hořečnatý heptahydrát, doplněno do 1 1 destilovanou vodou, pH upraveno na 8,0, autoklávováno 20 min při 120 °C) a protoplasty C. purpurea Pl (pro kontrolu protoplastizace). Do druhé misky byl nalit transformační BII agar a transformační směs (pro kontrolu transformace), do zbylých misek pak transformační BII agar a transformační směs; tyto misky byly po 24 h přelity BII transformačním agarem s Hygromycínem gold (InvivoGen, San Diego, Kalifornie, USA) tak, aby finální koncentrace antibiotika v médiu byla 200 pg/ml. Jako marker pro selekci transgenních hub byl tedy použit gen rezistence k hygromycinu (hph), který je součástí vektoru pNDH-OGG. Houby narostlé po transformaci byly přeneseny na nové BII médium obsahující Hygromycín ve finální koncentraci 200 pg/ml. Houby byly kultivovány ve tmě při 26 °C.
3. Izolace genomové DNA, detekce transgenu pomocí PCR analýzy
Z mycelií transformantů C. purpurea (kmen Pl) byla izolována genomová DNA (Cenis JL. (1992), Nucleic Acids Res 20:2380). K lyofilizovaným myceliím transformantů C. purpurea Pl v mikrozkumavce byl přidán lyzační pufir (4,84 g Tris, 2,92 g chlorid sodný, 1,86 g EDTA, 1 g SDS, doplněno do 200 ml destilovanou vodou, pH upraveno na 8,5), po 15min inkubaci byl ke směsi přidán 5 mol.l1 octan draselný. Po 20min inkubaci při -20 °C byly vzorky centrifugovány, supernatant byl smíchán s isopropanolem. Po 45min inkubaci při -20 °C byly vzorky centrifugovány a pelet byl promyt 70% ethanolem (-20 °C). Pelet byl vysušen a resuspendován v beznukleázové (nuclease-free) vodě.
Integrace transgenu byla ověřena na genomové úrovni metodou PCR s použitím GoTaq G2 Flexi DNA polymerázy (Promega corporation, Madison, Wisconsin, USA) a využitím dvou sad primerů. U každého předpokládaného transformanta byla ověřována přítomnost hph genu, který je součástí vektoru pNDH-OGG (5-GAATTCAGCGAGAGCCTGAC-3 (SEQ ID NO. 11) a 5 -ACATTGTTGGAGCCGAAATC-3' (SEQ ID NO. 12)) a přítomnost transgenu (5-CCCGGAAACTCAGTCTCCTT-3' (SEQ ID NO. 13) a 5 - GTCTTCCGCTAAAACACCCC-3' (SEQ ID NO. 14)). Jako negativní kontrola byla použita genomová DNA z WT C. purpurea (kmen Pl), jako pozitivní kontroly byly použity připravené plazmidové DNA s jednotlivými geny (obr. 2 až 4).
Vybrané získané transformanty s nejvyššími aktivitami byly uloženy v České sbírce mikroorganismů, CCM:
OE TrpE S76L 4 = CCM8984 (Cp TrpE SL)
OE ogfp-dmaW8 = CCM8983 (Cp dma IV)
4. Izolace homokaryotických kultur C. purpurea
Homokaryotické kultury hub C. purpurea (kmen Pl) byly získány metodou sekání špiček hyf. Houby byly po dobu 1 týdne pěstovány na Mantle agaru (100 g sacharóza, 10 g Z-asparagin monohydrát, 1 g dusičnan vápenatý tetrahydrát, 0,25 g dihydrogenfosforečnan draselný, 0,25 g síran hořečnatý heptahydrát, 0,033 g síran železnatý heptahydrát, 0,027 g síran zinečnatý heptahydrát, 0,01 g /.-cystein. 0,1 g kvasinkový extrakt, 20 g agar, doplněno do 1 1 destilovanou vodou, pH upraveno na 5,2, autoklávováno 20 min při 112 °C), a poté byly pod stereomikroskopem řezány špičky hyf za dichotomálním větvením, špičky hyf byly přeneseny na nový Mantle agar. Tento postup byl opakován třikrát.
Ze všech získaných homokarotických kultur C. purpurea byla izolována genomová DNA a pomocí metody PCR byla znovu ověřena přítomnost transgenu a hph genu.
-12 CZ 308933 B6
Příklad 2: Studium exprese transgenní DNA
RNA z transformantů a WT (divokého typu) C. purpurea (kmen Pl) byla izolována pomocí RNAqueous kitu (Thermo Fischer Scientific, Walthan, MA, USA). Takto získaná RNA byla ošetřena DNAsou (Thermo Fischer Scientific) a poté přesrážena UiCl (Thermo Fischer Scientific). Následně proběhl přepis do cDNA pomocí reverzní transkriptázy RevertAid H Minus M-MUUV (Thermo Fischer Scietific). RT-PCR byla provedena pomocí GoTaq G2 Flexi DNA polymerázy (Promega corporation), byly použity dvě sady primerů. Jedna sada primerů byla použita na amplifikaci hph genu (5-GAATTCAGCGAGAGCCTGAC-3' (SEQ ID NO. 11) a 5 - ACATTGTTGGAGCCGAAATC-3' (SEQ ID NO. 12)), druhá na amplifikaci genu kódujícího y-aktin, který sloužil jako endogenní kontrola (EnsemblFungi: CPUR 01270, 5 - CGCTCTCGTCATCGACAAT-3' (SEQ ID NO. 15) a 5 - ATTTCACGCTCGGCAGTAGT3' (SEQ ID NO. 16)) (obr. 5).
Příklad 3: Měření obsahu námelových alkaloidů v submerzních kulturách hub C. purpurea Pl
1. Příprava vzorků
Transformanti C. purpurea (kmen Pl) byli společně s WT C. purpurea (kmen Pl) kultivováni po dobu 3 týdnů na Mantle agaru. Poté byla každá houba očkována do 6ti 250 ml Erlenmayerových baněk s 50 ml tekutého preinokulačního InoCN média (100 g sacharóza, 10 g kyselina citrónová monohydrát, 0,12 g chlorid draselný, 0,5 g dihydrogenfosforečnan draselný, 0,5 g síran hořečnatý heptahydrát, 1 g dusičnan vápenatý tetrahydrát, 0,075 g amid kyseliny nikotinové, 0,006 g síran zinečnatý heptahydrát, 0,007 g síran železnatý heptahydrát, pH upraveno pomocí 10% NH4OH na 5,2, doplněno destilovanou vodou na 11, autoklávováno 15 min při 105 °C).). Po 5 dnech inkubace ve tmě při 26 °C a na třepačce (200 ot./min) byly kultury centrifůgovány po dobu 5 min (4700 ot./min, 22 °C). Ke každému myceliu byla v závislosti na jeho hmostnosti přidána sterilní voda (k 6,97 g mycelia bylo přidáno 40 ml vody). Pomocí ručního mixéru (BangCo, Brno, Česká republika) byla kultura homogenizována a 2 ml získané biomasy byly pipetovány do 250ml Erlenmayerovy baňky obsahující 50 ml indukčního T25N média (300 g sacharóza, 15 g kyselina citrónová monohydrát, 0,12 g chlorid draselný, 0,5 g dihydrogenfosforečnan draselný, 0,5 g síran hořečnatý heptahydrát, 1 g dusičnan vápenatý tetrahydrát, 0,075 g amidu kyseliny nikotinové, 0,006 g síran zinečnatý heptahydrát, 0,007 g síran železnatý heptahydrát, pH upraveno pomocí 10% NH4OH na 5,2, doplněno destilovanou vodou na 1 1, autoklávováno 20 min při 115 °C). Kultury C. purpurea exprimující Trp!·:'™ byly společně s WT inkubovány po dobu 10 dní ve tmě při 26 °C na třepačce (200 ot./min), kultury exprimující ogfp-dmaW a volné ogfp byly společně s WT kultivovány po dobu 14 dní ve tmě při 26 °C na třepačce (200 ot./min).
Po kultivaci byly kultury filtrovány přes Miracloth membránu (Merck, Darmstadt, Německo), pro další analýzy byla použita média i mycelia. U médií byl změřen jejich objem, mycelia byla lyofilizována po dobu 48 h v lyofilizátoru SCANVAC (Trigon-plus, Říčany u Prahy, Česká republika).
2. Detekce transgenu pomocí PCR analýzy
Ze získaných lyofilizovaných mycelií byla opět izolována genomová DNA a pomocí metody PCR byla ve vzorcích ověřena přítomnost transgenu a hph genu (viz příklad 1, bod 3., detekce transgenu pomocí PCR analýzy) (obr. 6 až 9).
3. Extrakce námelových alkaloidů z médií ml T25N indukčního média z kultivace WT a transformantů C. purpurea (kmen Pl) byly smíchány se 2 ml vody, vzorky byly pipetovány na kolonky SPE Catridges Octadecyl Cl8/18% (Applied Separations, Allentown, PA, USA), které byly aktivovány 5 ml acetonitrilu a následně
-13 CZ 308933 B6 ml vody. Po promytí kolonek 5 ml vody, byly námelové alkaloidy eluovány 3 ml směsí uhličitanu amonného a acetonitrilu v poměru 1:4. Eluát byl odpařen za vakua při 37 °C v SPD SpeedVac přístroji (Thermo elektron, Waltham, MA, USA), získaný odparek byl rozpuštěn v 1 ml 80% methanolu. Následně byl vzorek filtrován přes kolonky Costar SpinX 22 pm (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Na UHPLC bylo analyzováno 5 pl této směsi.
4. Extrakce námelových alkaloidů z mycelií
150 mg lyofilizovaného mycelia z kultivace WT a transformantů C. purpurea (kmen Pl) bylo extrahováno 1 ml směsi acetonu a 4% kyseliny vinné v poměru 1:1. Po inkubaci na třepačce přes noc při pokojové teplotě byla směs centrifůgována po dobu 10 min (14 000 ot./min, 22 °C), supernatant byl odpařen za vakua při 37 °C v SPD SpeedVac přístroji, získaný odparek byl rozpuštěn v 500 pl 80% methanolu. Následně byl vzorek filtrován přes kolonky Costar SpinX 22 pm (Sigma-Aldrich). Na UHPLC bylo analyzováno 5 pl této směsi.
5. Stanovení obsahu námelových alkaloidů
Připravené vzorky byly analyzovány pomocí UHPLC (ultra vysoce účinná kapalinová chromatografie) s využitím systému Nexera (Shimadzu, Praha, Česká republika), který byl vybaven Cl8 kolonou s obrácenou fází (Zorbax RRHD Eclipse Plus 1,8 pm, 2,1 mm X 150 mm, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Mobilní fáze A obsahovala 0,15% (w/w) kyselinu octovou (pH = 4,4) aacetonitril v poměru 4:1, mobilní fáze B obsahovala acetonitril a vodu v poměru 4:1. Ve vzorcích byly stanovovány následující námelové alkaloidy: ergotamin, ergotaminin, α-ergokryptin a α-ergokryptinin (metodika: Čudejková MM, Vojta P, Valík J, Galuszka P. (2016), New Biotechnology, 33(5), 743-754, 2016). Monitoring byl proveden při 317 nm. Koncentrace alkaloidů byla odečtena z plochy píků za použití Lab Solution softwaru (Shimadzu). Koncentrace jednotlivých alkaloidů byla přepočítána na 1 mg lyofilizovaného mycelia a 1 ml T25N indukčního média.
Ze získaných dat byly pomocí Grubbsova testu vyloučeny odlehlé hodnoty, získaná data byla podrobena testu Kruskal-Wallis ANOVA s Bonferroniho korekcí (Statistika 12 software).
V tab. 1 je shrnuto průměrné množství námelových alkaloidů v 1 mg lyofilizovaného mycelia (WT, OE ogfp, OE ogfpdmaW 8, OE ogfpdmaW 13). Z tabulky jasně vyplývá, že v případě transformantů exprimujících jen ogfp nedošlo oproti WT (divokému typu) C. purpurea P1 k žádné změně. Na druhou stranu transformanti exprimující dmaWfúzované s ogfp jednoznačně vykazují zvýšené hladiny jak ergotaminu, tak ergotamininu. U transformanta č. 13 došlo ještě k signifikantnímu nárůstu alpha-ergokryptininu.
V tab. 2 je shrnuto průměrné množství námelových alkaloidů v 1 ml T25N indukčního média (WT, OE gfp, OE gfpdmaW 8, OE gfpdmaW 13). Z tabulky jednoznačně vyplývá, že v případě transformantů exprimuj ících ogfp opět nedošlo k žádné změně vůči WT C. purpurea P1. Na druhou stranu transformanti exprimující dmaW fúzované s ogfp vykazují signifikantně zvýšené hladiny všech stanovovaných alkaloidů, tedy ergotaminu, ergotamininu, α-ergokryptinu a aergokryptininu.
V tab. 3 je shrnuto průměrné množství námelových alkaloidů v 1 mg lyofilizovaného mycelia (WT, OE TrpES76L 4, OE TrpES76L 12). Signifikantní nárůst všech stanovovaných alkaloidů (ergotaminu, ergotamininu, α-ergokryptinu a α-ergokryptininu) byl zaznamenán pouze v případě transformanta č. 4.
V tab. 4 je shrnuto průměrné množství námelových alkaloidů v 1 ml T25N indukčního média (WT, OE TrpES76L 4, OE TrpES76L 12). Z tabulky jasně vyplývá, že v případě obou transformantů došlo ke zvýšení hladin ergotaminu i ergotamininu, u transformanta č. 4 došlo i ke zvýšení aergokryptinu a a-ergokryptininu.
-14CZ 308933 B6
Tab. 1: Průměrné množství námelových alkaloidů (ergotamin, ergotaminin, a-ergokryptin, α-ergokryptinin) v myceliích WT a transformantů C. purpurea (kmen Pl) exprimujících ogfp (OE ogfp) a dmaWfúzované s ogfp (OE ogfp-dmaW 8, OE ogfp-dmaW 13). Množství alkaloidů bylo přepočteno na 1 mg lyofilizovaného mycelia v kultuře po 14ti dnech kultivace ± směrodatná chyba. Hodnoty pochází ze 6 biologických replikátů. Data byla analyzována pomocí testu Kruskal-Wallis ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01.
| Průměrné množství alkaloidů v myceliu (ng/mg) | ||||
| ergotamin | ergotaminin | a-ergokryptin | a-ergokryptinin | |
| WT | 442,25 ± 20,45 | 125,14 ± 8,84 | 56,01 ±4,51 | 14,35 ± 1,88 |
| OEogfp | 489,83 ± 38,03 | 129,60 ± 8,56 | 54,01 ± 8,43 | 12,53 ± 1,96 |
| OE ogfp dmaW8 | 1278,63 ± 142,90 ** | 364,27 ± 50,50 * | 136,59 ± 16,59 | 30,38 ±3,74 |
| OEogfp dmaW 13 | 1076,39 ± 87,35 * | 335,66 ±32,21 * | 142,19 ±23,04 | 46,31 ±9,16 * |
Tab 2: Průměrné množství námelových alkaloidů (ergotamin, ergotaminin, a-ergokryptin, α-ergokryptinin) v médiích WT a transformantů C. purpurea (kmen Pl) exprimujících ogfp (OE ogfp) a dmaWfúzované s ogfp (OE ogfp-dmaW 8, OE ogfp-dmaW 13). Množství alkaloidů bylo přepočteno na 1 ml média v kultuře po 14ti dnech kultivace ± směrodatná chyba. Hodnoty pochází ze 6 biologických replikátů. Data byla analyzována pomocí testu Kruskal-Wallis ANOVA: * p < 0,05, ** p<0,01.
| Průměrné množství alka oidů v médiu (ug/ml) | ||||
| ergotamin | ergotaminin | «-ergokryptin | «-ergokryptinin | |
| WT | 64,84 ±6,37 | 23,49 ±2,35 | 6,27 ± 0,79 | 1,66 ±0,20 |
| OEogfp | 75,36 ±6,15 | 25,89 ±2,13 | 7,43 ± ,089 | 1,84 ±0,21 |
| OE ogfp dmaW8 | 238,62 ±25,77 ** | 93,46 ±9,40 ** | 22,72 ± 2,52 * | 9,14 ±0,82 ** |
| OEogfp dmaW 13 | 167,24 ± 19,85 * | 65,57 ± 8,18 * | 21,78 ±4,01 * | 7,76 ± 1,46 * |
Tab 3: Průměrné množství námelových alkaloidů (ergotamin, ergotaminin, a-ergokryptin, α-ergokryptinin) v myceliích WT a transformantů C. purpurea (kmen Pl) exprimujících mutovanou verzi TrpE (OE TrpE S76L 4, OE TrpE S76L12). Množství alkaloidů bylo přepočteno na 1 mg lyofilizovaného mycelia v kultuře po 10ti dnech kultivace ± směrodatná chyba. Hodnoty pochází ze 6 biologických replikátů. Data byla analyzována pomocí testu Kruskal-Wallis ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
| Průměrné množství alkaloidů v myceliu (ng/mg) | ||||
| ergotamin | ergotaminin | «-ergokryptin | «-ergokryptinin | |
| WT | 314,50 ±7,05 | 65,86 ±4,79 | 44,43 ± 5,49 | 8,10 ± 1,16 |
| OE TrpE S76L 4 | 1681,29 ± 150,35 $ $ $ | 450,85 ± 47,73 $ $ $ | 291,00 ±27,84 $ $ $ | 73,64 ± 10,06 *** |
| OE TrpE S76L 12 | 977,35 ± 103,06 | 281,40 ±49,59 | 161,76 ±45,08 | 33,15 ±5,42 |
Tab 4: Průměrné množství námelových alkaloidů (ergotamin, ergotaminin, a-ergokryptin, α-ergokryptinin) v médiích WT a transformantů C. purpurea (kmen Pl) exprimujících mutovanou verzi TrpE (OE TrpES76L 4, OE TrpE S76L 12). Množství alkaloidů bylo přepočteno Iml média v kultuře po 10ti dnech kultivace ± směrodatná chyba. Hodnoty pochází ze 6 biologických replikátů. Data byla analyzována pomocí testu Kruskal-Wallis ANOVA: * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
-15 CZ 308933 B6
| Průměrné množství alkaloidů v médiu (pg/ml) | ||||
| ergotamin | ergotaminin | «-ergokryptin | «-ergokryptinin | |
| WT | 42,20 ±3,10 | 12,17 + 0,96 | 5,85 + 0,80 | 1,79 + 0,30 |
| OE TrpE S76L 4 | 287,78 + 59,09 ** | 110,05 + 22,84 ** | 50,05 + 6,28 *** | 16,84 + 3,61 *** |
| OE TrpE S76L 12 | 166,84+ 15,40 * | 61,37 + 5,36 * | 18,85+ 1,78 | 6,55 ± 0,44 |
Claims (11)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Houba Claviceps purpurea pro produkci námelových alkaloidů, vyznačená tím, že obsahuje v genomu vloženou nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň jeden gen vybraný z genu irplf™ majícího sekvenci SEQ ID NO. 1 a kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L, a genu dmaW majícího sekvenci SEQ ID NO. 2 a kódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu, přičemž vložený gen je pod kontrolou konstitutivního promotoru.
- 2. Houba podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačená tím, že dále obsahuje kodonoptimalizovaný gen ogfp kódující zelený fluorescenční protein pro expresi v Botrytis cinerea.
- 3. Houba podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačená tím, že konstitutivním promotorem je OliC promotor jaderného genu kódujícího podjednotku 9 mitochondriální ATP synthetasy z Aspergillus nidulans nebo nebo gpdA promotor genu kódujícího glyceraldehyd-3fosfát dehydrogenasu z Aspergillus nidulans.
- 4. Houba Claviceps purpurea podle nároku 1, s vloženou sekvencí SEQ ID NO. 2 a s vloženým kodon-optimalizovaným genem ogfp, uložená v České sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 8983, která produkuje námelové alkaloidy.
- 5. Houba Claviceps purpurea podle nároku 1, s vloženou sekvencí SEQ ID NO. 1, uložená v České sbírce mikroorganismů pod číslem CCM 8984, která produkuje námelové alkaloidy.
- 6. Způsob přípravy houby Claviceps purpurea podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačený tím, že se připraví expresní kazeta obsahující nukleotidovou sekvenci obsahující alespoň jeden gen vybraný z genu kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L a majícího sekvenci_SEQ ID NO. 1, a genu dmaWkódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu a majícího sekvenci SEQ ID NO. 2, přičemž uvedený alespoň jeden gen je pod kontrolou konstitutivního promotoru, a terminátor, popřípadě také kodon-optimalizovaný gen ogfp kódující zelený fluorescenční protein pro expresi v Botrytis cinerea, a tato expresní kazeta se vloží do genomu houby Claviceps purpurea.
- 7. Způsob podle nároku 6, vyznačený tím, že se expresní kazeta připraví metodou kvasinkové rekombinace, a následně se expresní kazeta vloží metodou transformace protoplastů.
- 8. Expresní kazeta ke způsobu podle nároku 6 nebo 7, vyznačená tím, že obsahuje konstitutivní promotor, alespoň jeden gen vybraný z genu kódujícího anthranilát synthasu s mutací S76L a majícího sekvenci SEQ ID NO. 1, a genu dmaW kódujícího dimethylallyltryptofan synthetasu a majícího sekvenci SEQ ID NO. 2, a terminátor, popřípadě také kodon-optimalizovaný gen ogfp kódující zelený fluorescenční protein pro expresi v Botrytis cinerea.
- 9. Expresní kazeta podle nároku 8, vyznačená tím, že má sekvenci SEQ ID NO. 3 nebo SEQ ID NO. 4.
- 10. Použití expresní kazety podle nároku 8 nebo 9 pro přípravu houby Claviceps purpurea podle nároku 1.
- 11. Použití houby Claviceps purpurea podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 jako produkčního mikroorganismu pro výrobu námelových alkaloidů.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019474A CZ308933B6 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Houba Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta |
| PCT/CZ2020/050049 WO2021013277A2 (en) | 2019-07-19 | 2020-07-07 | Fungus claviceps purpurea with increased ergot alkaloid production, method of preparation thereof, expression cassette |
| EP20743053.9A EP3999640A2 (en) | 2019-07-19 | 2020-07-07 | Fungus claviceps purpurea with increased ergot alkaloid production, method of preparation thereof, expression cassette |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2019474A CZ308933B6 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Houba Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2019474A3 CZ2019474A3 (cs) | 2021-01-27 |
| CZ308933B6 true CZ308933B6 (cs) | 2021-09-15 |
Family
ID=74188275
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2019474A CZ308933B6 (cs) | 2019-07-19 | 2019-07-19 | Houba Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3999640A2 (cs) |
| CZ (1) | CZ308933B6 (cs) |
| WO (1) | WO2021013277A2 (cs) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113652443B (zh) * | 2021-08-05 | 2023-06-06 | 中国科学院微生物研究所 | 菌株及其发酵生产麦角生物碱的应用 |
| CN116024107B (zh) * | 2022-08-04 | 2023-10-03 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种产麦角酸的工程菌及其构建方法与应用 |
| CN115895916B (zh) * | 2022-08-04 | 2023-09-22 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种积累麦角新碱的菌株及其构建方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014030096A2 (en) * | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Basf Se | Genes and processes for the production of clavine-type alkaloids |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1970442B1 (en) * | 2002-05-03 | 2017-01-18 | Monsanto Technology LLC | Transgenic high tryptophan plants |
-
2019
- 2019-07-19 CZ CZ2019474A patent/CZ308933B6/cs not_active IP Right Cessation
-
2020
- 2020-07-07 WO PCT/CZ2020/050049 patent/WO2021013277A2/en not_active Ceased
- 2020-07-07 EP EP20743053.9A patent/EP3999640A2/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014030096A2 (en) * | 2012-08-22 | 2014-02-27 | Basf Se | Genes and processes for the production of clavine-type alkaloids |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| COYLE C. M. et al.: „An ergot alkaloid biosynthesis gene and clustered hypothetical genes from Aspergillus fumigatus," Applied and Environmental Microbiology, vol. 71, no. 6, 2005, str. 3112 - 3118, ISSN 0099-2240 * |
| DIDEK-BRUMEC M. et al.: „Activation of ergot alkaloid biosynthesis in prototrophic isolates by Claviceps purpurea protoplast fusion," Journal of Biotechnology, vol. 20, no. 3, 1991, str. 271 - 278, ISSN 0168-1656 * |
| GOETZ K. E. et al.: „Ergot cluster-encoded catalase is required for systhesis of chanoclavine I in Aspergillus fumigatus," Current Genetics, vol. 57, no. 3, 2011, str. 201 - 211, ISSN 0172-8083 * |
| LORENZ N. et al.: „Alkaloid cluster gene ccsA of the ergot fungus Claviceps purpurea encodes chanoclavine I synthase, a flavin adenine dinucleotide-containing oxidoreductase mediating the transformation of N-methyl-dimethylallyltryptophan to chanoclavine I," Applied and Environmental Microbiology, vol. 76, no. 6, 2010, str. 1822 - 1830, ISSN 0099-2240 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021013277A2 (en) | 2021-01-28 |
| EP3999640A2 (en) | 2022-05-25 |
| CZ2019474A3 (cs) | 2021-01-27 |
| WO2021013277A3 (en) | 2021-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113366009B (zh) | 用于生物合成大麻素的双向多酶支架 | |
| Xu et al. | Enhancement of ganoderic acid accumulation by overexpression of an N-terminally truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase gene in the basidiomycete Ganoderma lucidum | |
| KR101444090B1 (ko) | 이소프레노이드 변형 효소를 코드화하는 폴리뉴클레오티드및 그것의 사용방법 | |
| CN104736696B (zh) | 用于产生棒麦角素型生物碱的基因和方法 | |
| Lorenz et al. | Alkaloid cluster gene ccsA of the ergot fungus Claviceps purpurea encodes chanoclavine I synthase, a flavin adenine dinucleotide-containing oxidoreductase mediating the transformation of N-methyl-dimethylallyltryptophan to chanoclavine I | |
| US10370689B2 (en) | Production of lysergic acid by genetic modification of a fungus | |
| CZ308933B6 (cs) | Houba Claviceps purpurea se zvýšenou produkcí námelových alkaloidů, způsob její přípravy, expresní kazeta | |
| CN111699247A (zh) | 通过发酵产生(6e)-8-羟基香叶醇的经改造的生物合成途径 | |
| JP7550408B2 (ja) | イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 | |
| US20200255877A1 (en) | Microbial production of nicotinamide riboside | |
| JP7210577B2 (ja) | セレノネインの製造方法 | |
| Sato et al. | Overexpression and repression of the tyrosinase gene in Lentinula edodes using the pChG vector | |
| EP2155879B1 (en) | Synthesis of mycophenolic acid (mpa) | |
| Chen et al. | An efficient genetic transformation system for Chinese medicine fungus Tolypocladium ophioglossoides | |
| CN112980760A (zh) | 一种用于生产麦角硫因的基因工程菌株及其构建方法以及应用 | |
| CN118931863A (zh) | 非特异性过加氧酶突变体及其应用 | |
| Chen et al. | The development of an efficient RNAi system based on Agrobacterium-mediated transformation approach for studying functional genomics in medical fungus Wolfiporia cocos | |
| CN114085784B (zh) | 一种高表达细胞色素p450的重组酵母及其应用 | |
| US20130145496A1 (en) | Flavin enzyme having flavonol 8-hydroxylase activity and use thereof | |
| EP2308983A1 (en) | Cytochrome P450 from Rhizopus oryzae and uses thereof | |
| JP2019103400A (ja) | イソプレノイドの製造方法並びにそのためのタンパク質、遺伝子及び形質転換体 | |
| WO2024256755A1 (en) | Process to produce anthraquinone pigments and dyes | |
| CN120330273A (zh) | 9-羟基喜树碱合成酶及合成9-羟基喜树碱的方法 | |
| TW201536813A (zh) | 融合多胜肽、編碼此融合多胜肽之核酸分子、含此核酸分子之載體或細胞以及藉由此細胞產生衣康酸的方法 | |
| JP2023007916A (ja) | ピリドキサールリン酸を含有する酵母菌体の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20240719 |