CN104611383A - 重组生物体3 - 羟基丙酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
重组生物体3-羟基丙酸的制备方法,在细菌宿主中的甘油的生产3-羟基丙酸（3-HP）进行说明。3-HP是一个有用的聚合材料的生产原料。两种酶的基因工程细菌宿主是足以使生产的3-HP。一个酶是一种甘油脱水酶，另一种是乙醛脱氢酶。允许创建的重组微生物宿主，其能够从甘油或葡萄糖为起始原料合成3-HP。甘油或葡萄糖转化，然后转换为3-HP。此过程需要所谓的DHAB从肺炎克雷伯菌的基因，其编码的酶甘油脱水四个不同的醛脱氢酶基因中的任一项的转换3-HPA3-HP。四醛脱氢酶基因从细菌大肠杆菌，ALDH2的人类，从酿酒酵母，大肠杆菌aldBALD4阿尔达。酵母基因出现，以得到最佳的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种重组生物体3 - 羟基丙酸的制备方法。
发明背景
基因工程技术，允许转移的物种和许可证之间的遗传性状，特别是从一个物种转移酶给他人。这些技术已达到商业化的具有高附加值的产品，如药品。的基因工程技术中是同样适用的和成本有效的时，适用于基因和酶可用于进行基本的化工原料。
还存在于细菌肺炎克雷伯菌，它有能力从甘油生物生产3 - 羟基丙甲代谢途径。原生微生物的能力，从甘油生产1,3 - 丙二醇，以及。商业利益正在探索生产1,3 - 丙二醇，甘油或葡萄糖，重组已设计，以表达必要的酶，用于生产1,3 - 丙二醇从其他生物的生物体。
3 - 羟基丙酸是一个3个碳原子的有机分子。这种分子的IUPAC命名的名称是3 - 羟基丙酸。它也被称为3 - 羟基丙酸甲酯。beta. hydroxpropionic的酸，beta. - 羟基丙酸甲酯，3 - 羟基丙酸，3 - 羟基丙，羟基丙酸，乳酸乙烯，beta.-乳酸和2 deoxyglceric酸。 3-HP中的应用包括制造可吸收的假体装置和外科手术缝合线，β-内酰胺的掺入，制备丙烯酸，形成的trifluromethylated醇或二醇，的polyhydroxyalkonates，和乳酸的共聚物，具有。3-HP现在普遍用于商业用途所产生的有机化工合成。3-HP的生产及销售的这些方法相对昂贵，并且将使用它的单体的聚合物的制造生产成本高昂。正如下面所讨论的，一些生物是已知的生产3-HP。然而，尚未提供一个目录，从这些生物体的基因，从而合成3-HP使用的酶本身负责的本机主机产生它不存在于该分子的合成能力。
3-HP在除了其商业实用程序，它被发现在许多生物过程，包括许多天然存在的生物聚合物。聚（3 - 羟基丁酸酯）（PHB）的微生物的聚酯，含有羟基的单体称为polyhydroxyalkonates酯（PHAs）是最丰富的部件。
PHA的含有3-HP发表的研究大部分集中在两个细菌来源：青枯雷尔氏杆菌（“产碱eutrophus”）和假单胞菌oleovorans的。氧产碱杆菌和假单胞菌oleovorans能够生长在无氮培养基中的3 - 羟基丙酸，1,5 - 戊二醇或1,7 - 庚二醇。当3-HP是主要的羟基酸，聚（3 - 羟基丁酸酯 - 共-3 - 羟基丙酸）加入到生长培养基含有7％（摩尔）3 - 羟基丙酸的形成。这些细胞也存储的3％，3 - 羟基丙酸的聚（3 - 丁酸酯 - 共-3 - 羟基丙酸）。
重组系统已被用于创建PHA的。氧产碱杆菌无论从设计，以表达PHA合成酶的大肠杆菌菌株生产聚（3 - 羟基丙酸）当喂1,3 - 丙二醇。在细菌的途径，甘油转化为1,3 - 丙二醇，甘油脱水酶，催化转化甘油3 - 羟基丙醛和水。这种酶已经被发现在一个包括柠檬酸杆菌属，克雷伯氏菌属，乳杆菌属，梭状芽孢杆菌菌株的细菌数。在1,3 - 丙二醇的通路的第二酶1,3 - 丙二醇氧化还原酶（EC 1.1.202）降低 1,3 - 丙二醇中的NADH依赖性反应。甘油，1,3 - 丙二醇的转化率的途径已在大肠杆菌中表达。 Tong等，应用与环境微生物学57（12）3541-3546。用于生产1,3 - 丙二醇的基因进行了克隆从肺炎克雷伯菌的DHA的调节子。甘油甘油促进被运送到细胞中，和然后由一个辅酶依赖B.sub.12的脱水转化成3 - 羟基丙醛。大肠杆菌缺乏一个土生土长的调节因子，因此大肠杆菌不能有氧增长甘油没有外源电子受体，如硝酸盐或富马酸。
醛脱氢酶的酶催化的醛氧化成羧酸。在各种各样的生物体，例如，非特异性醛脱氢酶的编码基因已被确定，ALDH2从智人，ALD4从酿酒酵母，和来自大肠杆菌的ALDA aldB。分类的这些酶的辅因子的使用，需要要么AND.sup。+或NADP.sup的。+和一些将使用任一辅因子。挑出在这里提及的基因能够作用于若干不同的醛，很可能，它们可以是能够氧化3 - 羟基丙醛，3 - 羟基丙酸。
发明内容
本发明的目的是，允许创建的重组微生物宿主，其能够从甘油或葡萄糖为起始原料合成3-HP。甘油或葡萄糖转化，然后转换为3-HP。此过程需要所谓的DHAB从肺炎克雷伯菌的基因，其编码的酶甘油脱水四个不同的醛脱氢酶基因中的任一项的转换3-HPA 3-HP。四醛脱氢酶基因从细菌大肠杆菌，ALDH2的人类，从酿酒酵母，大肠杆菌aldB ALD4阿尔达。酵母基因出现，以得到最佳的效果。
本发明的一个目的是提供一种编码甘油脱水酶和所需的3 - 羟基丙酸的生产从甘油醛脱氢酶的基因构建。
这也是本发明的一个目的是提供一种方法，用于从甘油生产3 - 羟基丙酸。
本发明的其它特征和优点将是显而易见的优选实施例从下面的描述和从权利要求书中。
具体实施方式
据透露，在这里，它可以引入到细菌宿主基因编码两种酶，从而赋予该主机的能力，以产生3-HP从甘油。这两个必要的酶甘油脱氢酶和乙醛脱氢酶。这里报道，这两种酶是必需的，足以使合适的宿主的菌株，如大肠杆菌菌株主管，从甘油中，以3-HP。一个示例性的编码甘油脱水酶的基因是已知的，DHAB肺炎克雷伯菌，基因的测序和呈现的方便使用。几个示例性的醛脱氢酶是已知的，在这里，它们的序列。从这些信息中，就变成实际甘油转换成3-HP的能力，以商业上合理的方式赋予细菌宿主。
这是看不出来的工作完成之前这里描述的，这两个不同的酶，可以制造在一个共同的主机产生的能力，使3-HP。有许多已知的醛脱氢酶基因，已知有不同的底物特异性和效率的酶。没有证据，这里所描述的工作之前，，醛脱氢酶工作上的（3-HPA）衬底上创建3-HP。如果没有这些知识，没有预测3-HP生产下面描述的研究的有效性的数据。一个额外的不确定性来自中间体醛，3-HPA，是有毒的到许多细菌宿主，宿主的存活依赖于酶的生产和转化的醛中间体无毒3的相对速率的事实 - HP。
在这里生产的3-HP实现所需的一个困难，从非本地主机的核糖体结合位点往往是无效的，并导致蛋白生产差，而且许多非本土发起人往往不转录和酒吧高蛋白表达。然而，本发明还认识到，非天然启动子，被称为是非常活跃的，是通过添加一个小的分子表达的途径无关的诱导通常是一个非常有效的方式来表达和调节表达的酶的水平宿主（如大肠杆菌）。为了实现高层次的调控基因表达质粒的构建置于trc启动子的调控下，从甘油生产3 - 羟基丙酸，所有必要的外源基因表达。trc启动子，高效，原产于大肠杆菌，IPTG此外诱导。
本说明书中描述了一种从甘油3 - 羟基丙酸的生产中使用的遗传构建。遗传构建包括示例性的DNA序列，编码甘油脱水酶和醛脱氢酶编码的DNA序列的表达的。甘油脱水酶的表达所必需的示例性序列的一组统称为“DHAB。醛脱氢酶的表达所必需的序列的一组包括四个不同的基因，被证明是有效的任何一个。
生产3 - 羟基丙酸
在下面所描述的工作，3 - 羟基丙酸，甘油在大肠杆菌中生产所需的酶，trc启动子，通过加入IPTG诱导的非天然启动子的调控下表达。 DHAB肺炎克雷伯氏菌的基因所编码的，该甘油脱水酶，醛脱氢酶，使用任何一个的四个不同的基因，ALD4从酿酒酵母中，从大肠杆菌或从大肠杆菌ALDA 的表达，这些基因编码甘油脱水酶和编码醛脱氢酶的基因的任何一个的时间是足以使构建体生产3-HP的发酵介质时以甘油。DHAB基因在所有的这些结构中，从所使用的醛脱氢酶的编码基因的下游，这两个基因的表达由trc启动子的调控。这样的顺序，但是，并不需要一个结构上和使用上的多个构造一族的顺序是可能的。
在最小的遗传构建根据这里所给出的数据，唯一的遗传元件，这将是必要的本的DHAB的结构基因编码一种蛋白质，它有效地催化氧化3 - 羟基丙酸，3 - 羟基丙醛的醛脱氢酶基因和非天然启动子序列的选择，得到最适合其构建的过程中要使用的上下文中不同的诱导控制。构造中是否保留或增加从其他的DNA序列，外源的DNA片段，将不一定是有效的3-HP合成由宿主生物体是不利的，但就没有必要了。必定受到前面翻译的每个序列编码感兴趣的蛋白质的信使RNA，使核糖体翻译的核糖体结合位点，在选定的主机功能。也将是必要的紧下游的终止子序列的每一个翻译单元在一些生物体，特别是在真核细胞。该构造可以是自主复制的序列的一部分，如质粒或噬菌体载体中，或可以整合到宿主的基因组中。
通过使用限制性内切酶的结构基因和合适的启动子（次）可被分离，通过聚合酶链反应（PCR），由相应的寡核苷酸的化学合成的，或者通过本领域技术人员显而易见的其他方法，在本技术领域和分子生物学。子（S）将来自其他生物的基因组DNA或人工基因结构含有发起人。将合适的启动子片段连接到几种可能的安排中任一项的结构基因的上游构建体。
所表示的醛脱氢酶有：向3 - 羟基丙醛的高比活性，是非常稳定的，在主机中的表示方法;容易过度表达在选定的主机不能抑制不论是由底物的反应所必需的或形成的产品通过反应;，完全活跃最有利的生产3 - 羟基丙酸的发酵条件下，可以使用任一NAD.sup。+或NADP.sup。
一种可能的方式是真正的操纵子，其中启动子是用来直接在一个方向上的所有必要的开放阅读框（ORF）的转录。然后整个消息中包含一个信使RNA。的操纵子的优点是，它是比较容易构造，由于只有一个启动子是必要的，这是它是相对简单，以取代与其他启动子的启动子，如果这将是可取的购买，保证这两个基因根据相同的调控。操纵子的方案的主要缺点是，不能独立地变化的两个基因的表达水平。如果发现的基因，以获得最佳的3 - 羟基丙酸合成，应在不同的高度来表示，在大多数情况下，操纵子不能被用于实现这一。
另一种可能的方式是多启动方案。与相同或不同的管理行为，两个或两个以上的启动子，可以使用直接的基因的转录。例如，一个启动子，可以使用直接DHAB和适当的醛脱氢酶的编码基因的直接转录的转录。因为基因在理论上可以被转录和翻译分开，大量的多个启动子的组合是可能的。此外，这将是最可取的，以防止启动子彼此干扰。这可以实现，或者通过将两个启动子的构??建体，例如到，他们直接转录在相反的方向，或者通过各独立的转录单元的下游插入转录终止子序列。的多个启动子的构建体的主要优点是，它允许尽可能多的不同的单元的独立调节所需的，这可能是重要的。缺点是，这将是更难以建立，更难以修改以后，更难以有效调节，因为多个发酵条件的变化，还需要引进，还有可能使发酵的性能稍差预见的。
在任一构造中，启动子序列（s），用于在选定的宿主有机体中应该是功能，优选提供足够的包括甘油，3 - 羟基丙酸途径，以使构造充分的活性，在该主机上的基因的转录。也会影响子序列3-HP通路，使甘油3-HP生产的发酵条件下充分活跃的基因的转录调控，最好将诱导，这样表达基因可以纳入或排除一定的代理或条件，发酵调制。
一个可能的例子，使用这样的构造如下：一个促进剂，它由一种廉价的化学（诱导剂），向培养基中加入诱导，可以控制DHAB基因与适当的醛脱氢酶的编码基因的转录。直到他们累计到预定电平，将被允许在缺乏诱导剂的情况下生长的细胞。诱导剂添加到发酵，将作出改变代谢与营养变化以及介质。然后将这些细胞可利用3-HP生产（和额外的生物质生产，如果需要的话）提供了在基板（次）。细胞后可不再使用基体产生3-HP，发酵停止，3-HP回收。
基因序列
表达甘油脱水酶和合适的醛脱氢酶，从甘油3 - 羟基丙酸的生产所必需的两种酶，它是必需的DNA序列，含有的甘油脱水酶，醛脱氢酶编码序列与至少一个启动子序列相结合（最好的非本地子虽然一些本地的启动子活性，可能存在的）。在下面的例子中描述的示例性的施工方法。，以确保使本说明书中，这些酶的基因的编码区的全部序列的是这里。序列1，3，5和7本不同的本地醛脱氢酶基因的基因组序列。
这些编码序列中的每一个可以被用来做适当的酶在异源宿主中的表达的基因构建。在这样的宿主中的基因表达的基因构建体，它设想将被加入的酶的编码序列的异源启动子，但它需要的是，启动子是有效的，其中的基因是主机得以表达。还可以设想，设想从这里提出的天然DNA编码序列，在DNA序列中的显着变化是可能的。如众所周知，由于遗传密码的简并性，在本领域中，许多不同的DNA序列可以编码相同的蛋白质的表达。所以，当指定编码的蛋白质的DNA序列的本文档中使用的语言，它旨在包含可用于表达该蛋白质的任何DNA序列，即使这里介绍的不同的基因组序列。还可以设想，此处指定的蛋白质的氨基酸序列的保守的变化，可以在不脱离本发明的。特别是，在蛋白质序列中的一个或多个氨基酸的缺失，添加和替换的几乎总是可以不改变蛋白质的功能的情况下作出。当一种蛋白质的名称被起诉在这里，它的目的是同样适用于这两种氨基酸序列的微小的变化，并在天然蛋白质序列的等位基因变异，如发生于命名的物种，以及其他密切相关的物种。
这可能是许多上述的DNA序列可以被截断，并且仍然表达的蛋白质具有相同的酶学性质。能够明白，本领域技术人员在现有技术中的分子生物学轻微缺失，添加和突变可能不会改变指定的碱基对序列的属性;指定的碱基对序列的碱基许多可能不是必需的，其独特的功能。改变的序列或序列，以确定是否有足够的同源性的碱基对与所指定的相同的功能，如简单地创建候选突变，删除或修改，创建的基因构建，包括修改过的序列与启动子和终止序列。该基因构建体可能被测试，如下面所述，对于从甘油生产3-HP。
某些DNA引物，使用下面描述的实验中使用的基因组DNA序列的分离或克隆。虽然这里介绍的是足以使建设纳入这里确定的基因的表达质粒，以冗余启用使用这些基因的序列信息，可被用来隔离从它们原来的主机的基因的引物如下所述。
替代醛脱氢酶和甘油脱水酶
从甘油生产3 - 羟基丙酸的途径中的应用，可以使用其它合适的醛脱氢酶。在这个通路的醛脱氢酶需要保持稳定的功能，容易地表示在主机给出，向3 - 羟基丙醛具有足够高的活性，以使其能够使3-HP。本发明的知识，使有关修订可能。一个程序，可以采取定向进化选择合适的醛脱氢酶，或者他们可以从本地源收回，配合适当的甘油脱水活性的基因编码，编码这些酶的基因，然后进行任何结构的一部分这里设想从甘油生产3 - 羟基丙酸。
进行类似的酶的改进方案可以包括，例如，定向进化作为一个起点，使用DHAB基因的肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶是优异的效率和稳定性在本发明中使用的形式取得的其它变体。另外，酶催化相同的反应可以从其他生物体中分离，肺炎克雷伯氏菌的甘油脱水酶代替使用。这样的酶可能是特别有用的，在替代的主机，其特征在于，它们可以更容易地表达，最适合于构建体的生长和3-HP的生产和回收的发酵条件下更稳定和更高效。
Claims (6)
1.重组生物体3 - 羟基丙酸的制备方法，包括以下步骤：提供在发酵罐中的重组微生物，它带有一个的遗传构建表达DHAB基因的肺炎克雷伯氏菌，和醛脱氢酶的基因，这是能够催化生产3 - 羟基丙酸，甘油，提供了一个源的重组微生物，甘油或葡萄糖，发酵的微生物的条件下，这会导致在发酵罐中的溶液中的3 - 羟基丙酸的积累。
2.根据权利要求1所述，其特征在于，包括在其遗传基因材料肺炎克雷伯菌和醛脱氢酶的基因，如主机能够从甘油生产3 - 羟基丙酸国外DHAB基因的重组大肠杆菌宿主。
3.根据权利要求1所述，其特征在于，重组大肠杆菌宿主包括在其可继承的遗传物质，DHAB基因的肺炎克雷伯菌和ALD4基因等酵母菌，主机是能够从甘油生产3 - 羟基。
4.根据权利要求1所述，其特征在于，甲细菌宿主在其可继承的遗传物质包括DHAB肺炎克雷伯菌和醛脱氢酶基因的表达，编码一个基因工程，使得细菌宿主是能够变换甘油3 - 羟基丙酸。
5.根据权利要求1所述，其特征在于，甲细菌宿主，包括在其可继承的遗传物质的甘油脱水酶编码的遗传施工中，其中的氨基酸序列选自SEQ利和NO：10，11，12和13，和醛脱氢酶，使得细菌宿主是能够转换甘油醛脱氢酶，其特征在于，所述选自选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的3 - 羟基丙酸。
6.根据权利要求1所述，其特征在于，甲细菌宿主，它包括在其可继承的遗传物质的甘油脱水酶的表达，其中的选自序列的IDS NO：10，11，12和13，和醛脱氢酶的氨基酸序列中，一个基因结构编码等细菌宿主能够将甘油醛脱氢酶基因，其特征在于，所述的3 - 羟基丙酸的ALDH2 ALDA4的，阿尔达和aldB组成的组中选择。
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