CN103582703A

CN103582703A - 一种用于控制丁二醇生产的发酵方法

Info

Publication number: CN103582703A
Application number: CN201280026205.6A
Authority: CN
Inventors: S·D·辛普森; C·科利特; C·D·米哈尔西; J·J·科诺利; G·W·沃特斯
Original assignee: Lanzatech New Zealand Ltd
Current assignee: Lanzatech NZ Inc
Priority date: 2011-03-31
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2014-02-12
Also published as: US8673603B2; US20120252082A1; TWI537389B; WO2012131627A1; TW201243055A

Abstract

用于改善2,3-丁二醇发酵的效率的方法。更具体地，增加一种或多种一氧化碳营养产乙酸细菌对含一氧化碳或含一氧化碳和氢气的底物厌氧发酵的丁二醇生产率的方法。所述方法包括供应氢气耗尽的底物以增加丁二醇生产率。所述方法包括以至少5g/L/天的容积生产率生产丁二醇。

Description

一种用于控制丁二醇生产的发酵方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年3月31日提交的序号为61/470,172的美国申请的优先权，该美国申请以引用的方式全文纳入本文。

技术领域

本发明涉及通过微生物发酵含一氧化碳或含一氧化碳和氢气的底物生产2,3-丁二醇。

背景技术

用于运输的生物燃料是有吸引力的汽油替代品，并且作为低浓度掺和物迅速进入燃料市场。源自天然植物来源的生物燃料比源自化石来源的那些（例如汽油）在环境方面更加可持续，它们的使用使因燃料燃烧而释放到大气中的所谓化石二氧化碳（CO₂）气体的水平下降。此外，生物燃料可在许多地理区域局部产生，并且可起到减少对进口化石能源的依赖的作用。适于用作生物燃料的醇包括乙醇、丁醇和2,3-丁二醇。

乙醇正迅速地成为全球主要的富含氢的液体运输燃料。2002年全球的乙醇消耗量估计为108亿加仑。由于欧洲、日本、美国和一些发展中国家对乙醇的兴趣增加，燃料乙醇工业的全球市场也预计会在未来急剧增长。

丁二醇，包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和2,3-丁二醇，相对于乙醇可被认为具有许多种优势。与乙醇相似，丁二醇可被直接用作汽车燃料添加物。丁二醇还可被相对容易地转化成许多其他具有潜在更高价值和/或更高能量的产物。例如，2,3-丁二醇可在两步法中被容易地转变成可用作航空燃料的八碳二聚体。

2,3-丁二醇的多能性源于其双官能团骨架，即2个羟基位于邻近的碳原子上，使该分子很容易地转化成例如丁二烯、保泰松（butadione）、3-羟基-2-丁酮、甲基乙基甲酮等。这些化合物被用作基础分子制造多种工业生产的化学制品。

此外，2,3-丁二醇可被用作内燃机的燃料。它在若干方面更类似于汽油，而不是乙醇。随着对生产和应用环境可持续燃料的兴趣的增强，对生产2,3-丁二醇（经常称作生物丁醇）的生物学过程的兴趣也增加了。

2,3-丁二醇可通过对含碳水化合物的原料进行微生物发酵来生产（Syu MJ,Appl Microbiol Biotechnol55:10-18(2001),OJn et al.,Chinese J Chem Eng14(1):132-136(2006)）。2,3-丁二醇还可通过对来自作物（例如甜菜、玉米、小麦和甘蔗）的生物质进行微生物发酵生产。然而，这些碳水化合物原料的成本受其作为人类食物或动物饲料的价值的影响，并且种植产淀粉或蔗糖的作物用于生产2,3-丁二醇并非在所有地理区域都是经济可持续的。因此，有动力开发将更低成本的和/或更丰富的碳源转化成2,3-丁二醇的技术。

一氧化碳（CO）是有机材料（例如煤或石油及石油衍生产品）不完全燃烧的主要副产品。虽然含碳前体完全燃烧产生仅有的终产物CO2和水，但是一些工业过程需要升高的温度，相对于CO2更有利于积累一氧化碳。一个实例是需要高温以生成所需钢材质量的钢铁工业。例如，据报道，澳大利亚的钢铁工业每年产生并释放入大气超500000吨的CO。

此外，CO也是合成气的主要组分，其中各种量的CO和H2通过对含碳燃料进行气化而产生。例如，合成气可通过分馏废弃木头和木材的有机生物质来生产，以产生用于生产燃料和更复杂的化学制品的前体。

CO释放入大气可产生显著的环境影响。另外，可能需要支付排放税，这会增加工厂的成本。因为CO是富含反应能的分子，其可被用作生产多种化学制品的前体化合物。然而，这种有价值的原料尚未被用于生产2,3-丁二醇。

本发明的目的是提供一种方法，其至少一定程度上克服了上述缺点或至少向公众提供一种有用的选择。

发明内容

在本发明的第一大方面中，提供了一种增加通过微生物发酵含CO和H2的底物的丁二醇生产效率的方法。在具体的实施方案中，本发明提供了一种控制通过微生物发酵生产丁二醇的方法，所述方法包括：

i)提供含CO和H2的底物；和

ii)在含一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生丁二醇；以及一种或多种副产物；

其中步骤(ii)中的丁醇生产率受步骤(i)中所述底物的组成的影响。

在一个实施方案中，所述一种或多种副产物是是一种或多种醇和/或一种或多种酸。

在一个实施方案中，所述一种或多种副产物是乙醇。

在一个实施方案中，所述一种或多种副产物是乙酸。

在一个实施方案中，步骤(i)的所述底物的H₂组成会影响所述丁二醇生产率。

在本发明的一个实施方案中，提供具有高H₂浓度的底物可降低2,3-丁二醇生产率。

在本发明的一个实施方案中，提供了一种通过微生物发酵增加丁二醇生产率的方法，所述方法包括：

(i)提供H₂耗尽的含CO底物；

(ii)在含有一种或多种一氧化碳营养产乙酸细菌的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以产生丁二醇。

在一个实施方案中，所述底物包含少于20体积%的H₂、少于15体积%的H₂、少于10体积%的H₂、少于5体积%的H₂或少于2体积%的H₂。

在一个实施方案中，具体的H₂摄取量为少于1000mmol/L/天、少于500mmol/L/天、少于300mmol/L/天、少于200mmol/L/天或少于100mmol/L/天。

在一个实施方案中，2,3-丁二醇生产率为至少20g/L/天、至少25g/L/天、至少30g/L/天、至少35g/L/天、至少40g/L/天或至少45g/L/天。

在一个实施方案中，发酵液中所述2,3-丁二醇的浓度为至少2g/L、至少4g/L、至少6g/L、至少8g/L或至少10g/L。

在本发明的另一个实施方案中，提供了一种降低通过微生物发酵的丁二醇生产率的方法，所述方法包括：

(i)提供富含H₂的底物；

(ii)在含有一种或多种微生物的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物。

在一个实施方案中，所述底物包括至少20体积%的H₂、至少25体积%的H₂、至少30体积%的H₂、至少35体积%的H₂、至少40体积%的H₂、至少45体积%的H₂或约50体积%的H₂。

在一个实施方案中，具体的H₂摄取量为至少2500mmol/L/天、至少3000mmol/L/天、至少3500mmol/L/天、至少4000mmol/L/天、至少4500mmol/L/天或至少5000mmol/L/天。

在一个实施方案中，2,3-丁二醇生产率为少于15g/L/天、少于10g/L/天、少于5g/L/天、少于3g/L/天或少于1g/L/天。

在一个实施方案中，所述发酵液中2,3-丁二醇的浓度为少于2g/L或少于1g/L或约0g/L。

在本发明第二大方面中，提供了一种通过微生物发酵生产一种或多种产物的方法，所述方法至少包括以下步骤：

(a)提供含一氧化碳或含一氧化碳和氢气的底物；和

(b)在含有一种或多种一氧化碳营养产乙酸细菌的培养物的生物反应器中，厌氧发酵所述底物以生产2,3-丁二醇和一种或多种副产物；

其中2,3-丁二醇生产率的增加与所述发酵罐中提供的细胞的年龄相关。

在一个实施方案中，所述一种或多种副产物为一种或多种醇和/或一种或多种酸。

在一个实施方案中，所述一种或多种副产物为乙醇。

在一个实施方案中，所述一种或多种副产物为乙酸。

在本发明的一个实施方案中，通过使用细胞再循环部件来增加所述生物反应器中细胞的平均年龄。本领域技术人员应理解细胞再循环部件可包括但不限于细胞再循环膜或盘叠式离心分离机。

在一个实施方案中，当所述生物反应器中细胞的平均年龄增加时，2,3-丁二醇生产率增加。

在本发明的一个实施方案中，当所述反应器中细胞的平均年龄较短时，2,3-丁二醇生产率被抑制。

虽然本发明在广义上如上文所限定，但本发明并不限于此，还包括以下描述提供实施例所属的实施方案。

附图说明

现将参照附图更详细地描述本发明，其中：

图1的曲线图示出在高氢气摄取量的情况下生物反应器中2,3-丁二醇浓度的降低。

图2的曲线图证明在低氢气摄取量的情况下生物反应器中2,3-丁二醇浓度的增加。

图3的曲线图示出在高氢气摄取量的情况下生物反应器中2,3-丁二醇生产的速率降低。

图4的曲线图证明在低氢气摄取量的情况下生物反应器中2,3-丁二醇产生的速率增加。

图5的曲线图证明氢气摄取量的增加与2,3-丁二醇浓度的相应降低。

图6的曲线图示出在42天内氢气摄取量与2,3-丁二醇浓度之间的相关性。

图7的曲线图示出双反应器系统的第一反应器中2,3-丁二醇与细胞年龄之间的相关性。

图8的曲线图示出在不同的细胞年龄下双反应器系统的第二反应器中2,3-丁二醇的浓度和容积生产率。

具体实施方式

以下是以一般形式给出的对本发明的描述，包括其优选的实施方案。进一步在下文标题“实施例”下给出的公开内容——提供了支持本发明的实验数据、本发明的方面的具体实例和实施本发明的工具——中举例说明本发明。

本文使用的“丁二醇”是指所述二醇的所有结构同分异构体，包括1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇和2,3-丁二醇及其立体异构体。术语“2,3-丁二醇”应解释为包括所述化合物的所有对映体形式和非对映体形式，包括（R,R）、（S,S）和内消旋形式、外消旋形式、部分立体异构纯形式或基本立体异构纯形式。

术语“生物反应器”包括由一个或多个容器和/或塔或管道排列组成的发酵装置，其包括连续搅拌釜反应器（CSTR）、固定化细胞反应器（ICR）、滴流床反应器（TBR）、鼓泡塔、气升式发酵罐、静态混合器或者适合气体-液体接触的其他容器或其他装置。在一些实施方案中，所述生物反应器可包括第一生长反应器和第二发酵反应器。因此，当提到加入底物到生物反应器或发酵反应中时，如果合适，应该理解为加入到这些反应器之一或两者中。

术语“底物”和类似术语应理解为包括，例如，其中一氧化碳和/或氢气可被一个或多个细菌菌株用于生长和/或发酵任何底物。

“含一氧化碳的气态底物”或“至少含CO的气态底物”包括含某一水平的一氧化碳的任何气体。所述气态底物通常会含有大比例的CO，优选至少约10体积%至约95体积%的CO。

“含氢气的气态底物”包括含有某一水平的氢气的任何气体。

当与发酵过程关联使用时，术语“增加效率”、“效率增加”及其类似术语，包括，但不限于，增加以下的一个或多个：催化所述发酵的微生物的生长速率、在提高的丁二醇浓度下生长速率和/或产物生产速率、消耗每体积底物产生的所需产物的体积、所需产物的生产速率或生产水平以及产生的所需产物与所述发酵的其他副产物相比的相对比例。

“丁二醇生产率”或“丁二醇生产的速率”是丁二醇的容积生产率。在连续系统中，容积生产率被计算为稳定状态丁二醇浓度与液体滞留时间的比率。在分批系统中，容积生产率被计算为丁二醇浓度和在分批系统中产生所述浓度所需的时间。容积生产率被记录为g/L/天。

除非上下文另有需要，本文使用的词组“发酵”、“发酵过程”或“发酵反应”及类似词语，意图涵盖所述过程的生长阶段和产物生物合成阶段。

氢气耗尽的底物

发明人令人惊讶地表明通过自产乙醇梭菌（Clostridiumautoentanogenum）的微生物发酵生产2,3-丁二醇。尤其是，发明人已确定可通过某些因素控制2,3-丁二醇的生产。根据本发明的一个方面，发明人已经证明了可通过控制所述气态底物的氢气组成增加或降低所产生的2,3-丁二醇的量。根据本发明的第二个方面，发明人已经证明了所述生物反应器中微生物细胞的年龄和微生物培养的生长阶段会影响通过所述细胞产生的2,3-丁二醇的量。

已经表明，可通过提供H2耗尽的底物来增加2,3-丁二醇生产率。发明人已经证明，当所述底物中氢气的量有限时，2,3-丁二醇生产率增加。发明人确定了，当所述气态底物的氢气组成为少于20体积%、少于15体积%、少于10体积%、少于5体积%或少于2体积%时，2,3-丁二醇的产生增加。

还确定了2,3-丁二醇生产率和所述细菌培养物的氢气摄取量之间的相关性。具体地，已经表明，当H₂摄取量少于1000mmol/L/天、少于500mmol/L/天、少于300mmol/L/天、少于200mmol/L/天或少于l00mmol/L/天时，2,3-丁二醇生产率增加。

发明人已经证明，当氢气摄取量有限时，2,3-丁二醇生产率为至少15g/L/天、至少20g/L/天、至少25g/L/天、至少30g/L/天、至少35g/L/天、至少40g/L/天或至少45g/L/天。在一个实施方案中，发酵液中2,3-丁二醇的浓度为至少2g/L、至少4g/L、至少6g/L、至少8g/L或至少10g/L。

富含氢气的底物

相应地，已经表明，增加所述气态底物的H₂组成对2,3-丁二醇生产率有负面影响。在一个实施方案中，2,3-丁二醇生产率为少于10g/L/天、少于5g/L/天、少于3g/L/天或少于1g/L/天。在一个实施方案中，所述发酵液中2,3-丁二醇的浓度为少于2g/L或少于1g/L或约0g/L。

利用具有增加的氢气组成的底物进行的发酵显示出2,3-丁二醇生产率降低。具有高于25体积%的H₂、或高于30体积%的H₂、或高于40体积%的H₂、或高于45体积%的H₂、或高于50体积%的H₂的氢气组成的底物对所述培养物的容积生产率有抑制效应。

具体的H₂摄取量增加同样影响2,3-丁二醇生产率。在其中氢气摄取量为至少2500mmol/L/天、至少3000mmol/L/天、至少3500mmol/L/天、至少4000mmol/L/天、至少4500mmol/L/天或至少5000mmol/L/天的培养物中，2,3-丁二醇生产率比在氢气摄取量更低的培养物中低。

在本发明的第二方面中，已经证明当所述细菌培养物的生长已经基本停止时，2,3-丁二醇生产率增加。发明人已经令人吃惊地表明，培养物中所述细胞的年龄对所述细胞的容积生产率有影响。少于80小时的细胞的2,3-丁二醇容积生产率明显地低于更老的细胞的容积生产率。在平均细胞年龄高于90小时、或高于100小时或高于110小时的细胞培养物中，2,3-丁二醇生产率改善。在一个实施方案中，2,3-丁二醇生产率高于6g/L/天、高于8g/L/天、高于10g/L/天、高于12g/L/天、高于14g/L/天或高于16g/L/天。

在本发明的一个实施方案中，当所述生物反应器中的细胞的平均年龄较低时，2,3-丁二醇生产率较低。在本发明的一个实施方案中，当所述生物反应器中的细胞的平均年龄少于80小时、或少于60小时、或少于40小时、少于30小时、少于20小时或少于10小时时，2,3-丁二醇生产率较低。在一个实施方案中，2,3-丁二醇生产率少于4g/L/天、少于3g/L/天、少于2g/L/天或少于1g/L/天。

此外，在具有较老细胞群的培养物中，2,3-丁二醇:乙醇的比率改善。在发酵过程中，已经表明，该比率随着培养物变老而改善，有利于2,3-丁二醇生产。具有少于90小时的平均细胞年龄的细胞培养物表现出约1:10、或约1:15、或约1:20、或约1:25的2,3-丁二醇：乙醇比率。具有高于100小时的细胞平均年龄的细胞培养物表现出有利于2,3-丁二醇的显著改善，比率为1:6、或约1:5、或约1:4、约1:3、约1:2或约1:1。

在本发明的一个实施方案中，通过使用细胞保留装置来增加所述生物反应器中的细胞的平均年龄。细胞保留装置在本领域中是众所周知的，而示例性细胞保留装置包括错流膜和/或中空纤维膜。

微生物

在一个实施方案中，所述一种或多种微生物选自一氧化碳营养产乙酸细菌。在某些实施方案中，所述微生物选自自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei）、食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans）、Clostridium drakei、粪味梭菌（Clostridiumscatologenes）、Clostridium coskatii、淤泥丁酸杆菌（Butyribacteriumlimosum）、甲基营养丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、Alkalibaculum bacchii、Blautiaproducta、粘液真杆菌（Eubacterium limosum）、热醋穆尔氏菌（Moorellathermoacetica）、热自养穆尔氏菌（Moorella thermautotrophica）、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii）和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacterkiuvi）。

在本发明的实施方案中，用于所述发酵的一种或多种微生物为自产乙醇梭菌。在优选实施方案中，所述自产乙醇梭菌为具有以鉴定保藏号19630保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心（German ResourceCentre for Biological Material，DSMZ）的菌株的鉴定特征的自产乙醇梭菌。在另一个实施方案中，所述自产乙醇梭菌为具有DSMZ保藏号DSMZ23693的鉴定特征的自产乙醇梭菌。

本发明方法中使用的细菌的培养可使用本领域知晓的任意数量的使用厌氧细菌培养和发酵底物的方法进行。示例性技术在本文件“实施例”部分提供。举例来说，可使用以下使用气态底物进行发酵的文章中一般性描述的那些方法：K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausenand J.L.Gaddy(1991).Bioreactors for synthesis gas fermentationsresources.Conservation and Recycling,5;145-165；K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1991).Bioreactor design forsynthesis gas fermentations.Fuel.70.605-614；K.T.Klasson,M.D.Ackerson,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1992).Bioconversion ofsynthesis gas into liquid or gaseous fuels.Enzyme and MicrobialTechnology.14;602-608；J.L.Vega,G.M.Antorrena,E.C.Clausenand J.L.Gaddy(1989).Study of Gaseous Substrate Fermentation:Carbon Monoxide Conversion to Acetate.2.Continuous Culture.Biotech.Bioeng.34.6.785-793；J.L.Vega,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1989).Study of gaseous substrate fermentations:Carbonmonoxide conversion to acetate.1.Batch culture.Biotechnology andBioengineering.34.6.774-784；和J.L.Vega,E.C.Clausen and J.L.Gaddy(1990).Design of Bioreactors for Coal Synthesis GasFermentations.Resources,Conservation and Recyling.3.149-160。在含碳水化合物的底物上培养细菌的方法在本领域中也是众所周知的。

底物

在本发明的一个实施方案中，通过使用自产乙醇梭菌对含碳水化合物的底物进行微生物发酵来生产2,3-丁二醇。应理解，有很多本领域已知的适于发酵的碳水化合物的实例，以及许多用于发酵所述碳水化合物底物的方法类型的实例。举例来说，适合的底物可包括但不限于单糖例如葡萄糖和果糖、低聚糖例如蔗糖或乳糖、多糖例如纤维素或淀粉。虽然可预计到所有这些碳水化合物底物（及其混合物）都适用于本发明中，但优选的碳水化合物底物为葡萄糖、果糖和蔗糖（及其混合物）。

本领域技术人员应理解，可发酵糖可依例如US20070031918中所述通过预处理和糖化的过程从纤维素生物质和木质纤维素生物质得到。生物质是指任何纤维素或木质纤维素材料，包括包含纤维素并任选还包含半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖的材料。生物质包括但不限于生物能作物、农业残留物、都市固体废物、工业固体废物、来自制纸业的污泥、庭院废物、木材和林业废物。

然而，在本发明的优选实施方案中，可商购的果糖被用作所述发酵的碳源和能量来源。

在优选实施方案中，本发明的方法使用含一氧化碳或含一氧化碳和氢气的底物，优选含一氧化碳或含一氧化碳和氢气的气态底物。所述气态底物优选为废气，所述废气作为工业过程的副产品获得，或获自一些其他来源例如内燃机（例如汽车）废气。在某些实施方案中，所述工业过程选自铁金属产品制造例如钢铁厂、有色金属产品制造、石油精炼过程、煤炭气化、电力生产、炭黑生产、氨生产、甲醇生产和焦炭制造。在这些实施方案中，可使用任何合适的方法，在所述底物被排放到大气之前将其从所述工业过程中捕获。取决于所述气态底物的组成，还可能需要在将其引入所述发酵之前，对其进行处理以去除任何不需要的杂质，例如尘粒。例如，可利用已知方法过滤或洗涤所述气态底物。

在本发明的其他实施方案中，所述气态底物可来自生物质的气化。所述气化过程涉及生物质在限制供应的空气或氧气中部分燃烧。所得的气体一般主要包含CO和H₂，以及微量体积的CO₂、甲烷、乙烯和乙烷。例如，可将在粮食的提取和加工过程得到的生物质副产品（如从甘蔗中得到糖、从玉米或谷物中得到淀粉）或由林业产业产生的非食物生物质废物气化，以产生适用于本发明的含CO气体。

所述底物一般含有大比例的CO，例如至少约20体积%到约100体积%的CO、40体积%到95体积%的CO、40体积%到60体积%的CO和45体积%到55体积%的CO。在具体实施方案中，所述底物含有约25体积%、或约30体积%、或约体积35%、或约40体积%、或约45体积%、或约50体积%的CO，或约55体积%的CO、或约60体积%的CO。含有更低浓度（例如6%）的CO的底物，也可以是合适的，尤其是当H₂和CO₂也存在时。

在具体实施方案中，CO以足够发生2,3-丁二醇生产的水平提供。在具体实施方案中，提供CO使具体的摄取速率维持在至少0.4mmol/g/min、或至少0.5mmol/g/min、或至少0.6mmol/g/min、或至少0.7mmol/g/min、或至少0.8mmol/g/min、或至少0.9mmol/g/min、或至少1.0mmol/g/min、或至少1.2mmol/g/min、或至少1.5mmol/g/min。本领域技术人员应理解供应CO特别是气态CO以达到所需的摄取速率的方法。然而，举例来说，一些因素例如增加发酵培养基中的气体滞留（gas hol-up）会增加可被所述微生物培养物用于转化成产物的CO的量。此外，以更快的速率或更高的分压供应CO也会增加发酵液中的CO可用性。

为了改善2,3-丁二醇发酵的效率，所述底物一般含有小比例的H₂，例如少于20体积%的H2、少于15体积%的H2、少于10体积%的H2、少于5体积%的H2、少于2体积%的H2或基本上没有H₂。

已经证明，过量的H₂对2,3-丁二醇生产率有抑制作用。已经表明，H₂摄取量高于0.10mmol/g/min、或高于0.11mmol/g/min、或高于0.12mmol/g/min、或高于0.15mmol/g/min会抑制2,3-丁二醇生产率。

在具体实施方案中，以耗尽的水平供应H₂以提高2,3-丁二醇生产率。在具体实施方案中，供应H₂使具体摄取速率为少于0.09mmol/g/min、或少于0.08mmol/g/min、或少于0.07mmol/g/min、或少于0.05mmol/g/min、或少于0.01mmol/g/min。

所述气态底物还可含有一些CO₂，例如约1体积%到约80体积%，或1体积%到约30体积%。在一个实施方案中，其含有约5体积%到约10体积%。在另一个实施方案中，所述气态底物含有约20体积%的CO₂。

一般地，将所述一氧化碳以气态加入到所述发酵反应中。但是，不应认为本发明受限于以该状态加入所述底物。例如，所述一氧化碳可以以液体提供。例如，可用含有一氧化碳的气体使液体饱和，然后将该液体加入到生物反应器中。这可用标准方法实现。举例来说，可以使用微气泡分散发生器（Hensirisak et.al.Scale-up of microbubble dispersiongenerator for aerobic fermentation;Applied Biochemistry and Biotechnology Volume101,Number3/October,2002）。

在本发明的一个实施方案中，发明人已经确定，可通过发酵第一底物和第二底物生产2,3-丁二醇。在本发明的一个具体实施方案中，当提供第一底物（优选碳水化合物，更优选果糖）和第二底物（优选含CO的底物）时，将产生2,3-丁二醇。

在另一个实施方案中，发明人已经确定，可通过第一底物产生2,3-丁二醇，并且当所述第一底物被完全消耗时，可将所述第一底物用第二底物代替，继续产生2,3-丁二醇。在优选实施方案中，所述第一底物为果糖，并且当所述果糖被完全消耗时，可提供含CO的底物。发明人已惊奇地发现，2,3-丁二醇仍继续产生。发明人还考虑，如果需要，可交替所述第一底物和第二底物。例如，如果第一底物不可用，可使用变换的底物，直至所述第一底物的可用性改善。

培养基

应理解，为了发生细菌生长和底物到丁二醇的发酵，除了所述底物外，需要向所述生物反应器进料合适的营养培养基。营养培养基会含有足以使所用的微生物生长的组分，例如维生素和矿物质。适于自产乙醇梭菌生长的厌氧培养基在本领域是已知的，如例如Abrini等所描述（Clostridium autoethanogenum,sp.Nov.,An Anaerobic BacteriumThat Produces Ethanol From Carbon Monoxide;Arch.Microbiol.,161:345-351(1994)）。下文“实施例”部分提供了合适的培养基的其他实例。

发酵条件

为了发生所述底物到丁二醇的发酵，所述发酵应需要在适当的条件下进行。应考虑的反应条件包括温度、培养基流速、pH、培养基氧化还原电势、搅拌速率（如果使用连续搅拌釜式反应器）、接种物水平、确保底物水平不成为限制而将所述底物引入所述反应器的最大底物浓度和速率、以及为避免产物抑制的最大产物浓度。

发明人已经确定，在一个未控制pH的实施方案中，未出现对2,3-丁二醇产生的有害影响。

生物反应器

发酵反应可在如上文所述的任何合适的生物反应器中进行。在本发明的一些优选实施方案中，所述生物反应器可包括在其中培养所述微生物的第一生长反应器，和向其中进料来自所述生长反应器的发酵液并在其中产生大部分发酵产物（例如2,3-丁二醇）的第二发酵反应器。

细胞保留装置

根据本发明的一个实施方案，所述生物反应器被配置为能够积累细胞，从而增加所述反应器中所述细胞的平均年龄。细胞保留装置在本领域是众所周知的，而示例性细胞保留装置包括错流膜和/或中空纤维膜。

产物回收

所述发酵会产生在营养培养基中含有所需产物（例如丁二醇）和/或一种或多种副产物（例如乙醇、乙酸、丁酸）以及细菌细胞的发酵液。在优选实施方案中，所述发酵产物包括2,3-丁二醇。

可通过本领域已知的方法，例如分馏或蒸发、全蒸发和萃取发酵从所述发酵液回收2,3-丁二醇或者含有2,3-丁二醇和一种或多种其他醇的混合醇流。也可使用本领域中已知的方法从所述发酵液中回收副产物例如酸，包括乙酸和丁酸。例如，可使用包括活性炭过滤器或电渗析的吸附系统。

在本发明的某些优选实施方案中，通过以下方式从所述发酵液回收2,3-丁二醇和副产物：将一部分所述发酵液从所述生物反应器连续移出，从所述发酵液中分离微生物细胞（例如，通过过滤方便地），以及从所述发酵液回收2,3-丁二醇和任选的其他醇和酸。醇可通过例如蒸馏而方便地回收，酸可通过例如吸附在活性炭上而回收。将所分离的微生物细胞优选返回到所述发酵生物反应器中。还优选将去除所述一种或多种醇和一种或多种酸后剩下的无细胞渗透液返回到所述发酵生物反应器中。可将另外的营养素（例如B族维生素）加入到所述无细胞渗透液中以补充所述营养培养基，然后将其返回至所述生物反应器。

并且，如果在回收2,3-丁二醇和/或副产物的过程中调整了所述发酵液的pH，那么应将pH重新调整至与所述发酵生物反应器中的发酵液的pH相似，然后再将其返回至所述生物反应器。

现将参考以下非限制性实施例，更详细地描述本发明。

实施例

实施例1

材料和方法

表1：

生物反应器培养基制备：

将Stem溶液3、Stem溶液4、乙酸铵、刃天青、磷酸、反渗水加入至用N₂气鼓泡的2L发酵容器中。将培养基连续搅拌，加热至37℃，用NH₄OH（5M）调pH至5.3。然后加入金属溶液1、金属溶液2、钨酸钠溶液和复合B-维生素，并用N₂气鼓泡>2h。然后将所述培养基用含有H₂（3%）、N₂（30%)、CO（47%)、和CO₂（20%）的钢铁厂气体鼓泡，并用Cr²⁺溶液还原至氧化还原电势（ORP）为约200mV（Ag/AgCl电极）。

细菌：

自产乙醇梭菌获得自德国微生物和细胞培养物保藏微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）。给予所述细菌的登记号是DSMZ10061。

在生物反应器中发酵：

将来自于分裂活跃培养物的细菌接种至制备好的培养基，并且通过加入Na₂S（0.5M）提供硫源。在整个所述发酵过程中，使用NH₄OH（5M）保持pH为5.0，发酵液温度设定为37℃。对应于培养物需求或实验目的，调整气体输入速率和组成以及培养基的进料速率。该发酵还利用细胞再循环膜以连续地抽走发酵液渗透液，而保留细菌细胞。

取样和分析步骤：

在41天的时间内，以不同的间隔采集液体培养物样品。将这些样品用于确定600nm下的光密度（分光光度计）以及底物和产物的水平（高效液相色谱-HPLC）。常规地使用HPLC以定量乙酸、乙醇和2,3-丁二醇的水平。使用气相色谱仪（GC）分析输入气体和输出气体的组成，使得可测量所述培养物的CO和H₂消耗量和CO₂生产量。

图1至6证明了通过改变所述生物反应器中H₂的摄取量控制2,3-丁二醇生产率的能力。图1和图3显示以约3000mmol/L/天的速率相当稳定地摄取氢气，所形成的2,3-丁二醇浓度少于1g/L，2,3-丁二醇生产率少于7g/L/天。图2和4显示氢气摄取量为约400mmol/L/天-约0mmol/L/天的生物反应器。所形成的2,3-丁二醇浓度为2g/L-9g/L，2,3-丁二醇生产率增加至10g/L/天。图4证明了2,3-丁二醇生产率增加至约45g/L/天。

图5显示具有稳定增加的氢气摄取速率的生物反应器和与增加的氢气摄取量成线性稳定降低的2,3-丁二醇的水平。图4显示了进行42天的生物反应器实验，其清晰地表明氢气摄取量降低与2,3-丁二醇水平增加之间的相关性。

实施例2

图7-8和表2证明了根据本发明的一个实施方案的双反应器系统中的2,3-丁二醇和乙醇水平。

图7使双反应器系统第一发酵罐中的2,3-丁二醇与细胞年龄的关系相关联。图7显示随着所述第一发酵罐中所述细胞的年龄的增加，所述第一反应器中的2,3-丁二醇产生速率稳定增加。

图8显示双反应器系统第二发酵罐中的2,3-丁二醇的产生速率和浓度。图8证明了随着所述发酵罐中细胞年龄的增加，所述发酵液中的2,3-丁二醇的浓度增加，并且2,3-丁二醇的产生速率增加。

表2证明了细胞年龄与2,3-丁二醇之间的相关性以及双反应器系统中高乙醇产生率的效应。表2显示，双反应器系统的第一反应器中的高乙醇生产率与整个系统的高2,3-丁二醇生产量有关，而当所述第一反应器中的生产率低且所述细胞平均年龄低时，所述整个系统的2,3-丁二醇的生产率较低。

表2

已经参照某些优选实施方案描述了本发明，以便能够使读者实施本发明而无需过度实验。然而，本领域普通技术人员会容易地认识到，在不背离本发明的范围的情况下，可以一定程度地变化或改进或用已知的等价物取代多个所述组分和参数。应理解，这样的改进或等价物被纳入本文，如同其被单独提出一样。提供题目、标题及其类似物用于增强读者对本文件的理解，并不应被解释为限制本发明的范围。

上文和下文中引用的所有申请、专利和出版物的整个公开内容（如果存在的话），以引用的方式纳入本说明书。然而，在本申请书中的对任何申请、专利和出版物的引用不是，也不应被视为，承认或任何形式的暗示其在全球任何国家构成有效的现有技术或形成公知常识的一部分。

整个说明书和以下的任何权利要求中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”、“包含”以及类似词语应以与排除意义相反的包括意义来解释，也就是说，是“包括但不限于”的意思。

Claims

1.一种控制通过微生物发酵至少含CO和H₂的底物的2,3-丁二醇生产速率的方法，所述方法包括：

a.将所述底物传送至包含至少一种一氧化碳营养细菌的培养物生物反应器中，厌氧发酵所述至少含CO和H₂的底物，以产生2,3-丁二醇和至少一种副产物；和

b.控制所述底物中的氢气浓度，控制2,3-丁二醇的产生。

2.权利要求1的方法，其中所述副产物选自醇、酸及其混合物。

3.权利要求2的方法，其中所述醇是乙醇。

4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中将所述底物中的氢气浓度限制为少于20%的H₂而增加2,3-丁二醇的生产量。

5.根据权利要求1至4任一项的方法，其中将所述底物中的氢气浓度维持为高于20%的H₂而降低2,3-丁二醇的生产量。

6.权利要求4的方法，其中2,3-丁二醇的生产量为至少15g/L/天。

7.权利要求6的方法，其中2,3-丁二醇的生产量是至少30g/L/天。

8.根据权利要求1至7任一项的方法，其中所述一氧化碳营养细菌选自自产乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）、扬氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei）、食一氧化碳梭菌（Clostridium carboxidivorans）、Clostridium drakei、粪味梭菌（Clostridium scatologenes）、Clostridium coskatii、淤泥丁酸杆菌（Butyribacterium limosum）、甲基营养丁酸杆菌（Butyribacteriummethylotrophicum）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、Alkalibaculum bacchii、Blautia producta、粘液真杆菌（Eubacteriumlimosum）、热醋穆尔氏菌（Moorella thermoacetica）、热自养穆尔氏菌（Moorella thermautotrophica）、普氏产醋杆菌（Oxobacter pfennigii）和凯伍热厌氧菌（Thermoanaerobacter kiuvi）。

9.权利要求8的方法，其中所述一氧化碳营养细菌是自产乙醇梭菌。

10.权利要求8的方法，其中所述一氧化碳营养细菌为以登记号DSM23693保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）的自产乙醇梭菌菌株。

11.权利要求4的方法，其中所述氢气组成为少于5体积%的H₂。

12.权利要求4的方法，其中提供所述底物使得维持所述培养物的具体氢气摄取速率为少于0.09mmol H₂/克细菌细胞干量/分钟。

13.权利要求12的方法，其中维持所述培养物的具体氢气摄取速率为少于0.05mmol H₂/克细菌细胞干重/分钟。

14.权利要求12的方法，其中维持所述培养物的具体氢气摄取速率为少于0.01mmol H₂/克细菌细胞干重/分钟。

15.权利要求1的方法，其中所述生物反应器还包括细菌细胞保留装置，从而增加所述细胞的平均年龄并增加2,3-丁二醇的生产量。

16.权利要求15的方法，其中所述细菌细胞保留装置选自错流膜和中空纤维膜。

17.权利要求5的方法，其中提供所述底物使得维持所述培养物的具体氢气摄取速率为高于0.10mmol H2/克细菌细胞干重/分钟。